專利名稱：：一種放線菌菌株及其在制備芳香羥胺中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一株放線菌(Str印tomycesthioluteus)菌株及其用途。
背景技術(shù)：
：芳香羥胺是一類重要的化合物，它們是許多精細(xì)化學(xué)品的關(guān)鍵性合成中間體(TetrahedronLett，2003，44:849-851)及生命活性化合物(Bioorg.Med.Chem.，2000,8:405-412)。此外，芳香羥胺本身也具有很高的藥理及生理活性(Biochem.Pharmacol,1991，42:1691-1697)。迄今，已知的制備芳香羥胺的方法包括如下幾種(1)化學(xué)制備法"傳統(tǒng)"的化學(xué)還原方法主要是通過催化轉(zhuǎn)移加氫或金屬還原相應(yīng)的硝基化合物達(dá)到制備芳香羥胺的目的(J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1986，1655-1656.)。但這些"傳統(tǒng)"的還原方法的選擇性比較差，即在這些硝基還原條件下，生成的羥胺能被迅速地再被還原為胺，并且容易生成偶氮、氫化偶氮和氧化偶氮等副產(chǎn)物。而且，這些制備反應(yīng)條件也比較苛刻，需要使用危險(xiǎn)的高壓裝置、易燃的氫氣、有毒的重金屬或有害的化學(xué)試劑等。中國(guó)專利(ZL200410094645.2)提供一種還原取代硝基苯類化合物的改進(jìn)方法，即以硒為催化劑，在水或有機(jī)溶劑中還原取代硝基苯類化合物。該改進(jìn)改進(jìn)方法雖改善了反應(yīng)條件(使其更溫和)，但其在操作安全性方面尚有改進(jìn)余地(使用的催化劑毒性較大)。St印haneUng等報(bào)道了一種采用微波還原硝基來制備芳香羥胺類化合物的方法(TetrahedronLetters.2005,46(2005):5913-5917)，此方法以鋅粉和氯化銨以水和乙醇為溶劑制成混懸液，在有微波存在及室溫條件下完成制備。該方法一個(gè)顯著的特點(diǎn)是制備周期短。但其不適用于規(guī)?；苽?。(2)生物制備法FengLi，JingnanCui，XuhongQian，andRongZhang揭示了——禾中用面包酵母禾口植物細(xì)胞來催化制備芳香羥胺的方法(Chem.Common.，2004,2338-2339)。盡管面包酵母和植物細(xì)具有較高的催化活性和選擇性，但是面包酵母和植物細(xì)胞在工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)上還存在較大問題，重現(xiàn)性較差。鑒于此，探索一種制備條件溫和、制備步驟簡(jiǎn)單，且選擇性高和適合規(guī)?；虡I(yè)制備的制備芳香羥胺類化合物的方法，成為本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的發(fā)明人從土壤中經(jīng)初篩、復(fù)篩，獲得一株能夠高效還原由硝基取代的芳香類化合物(簡(jiǎn)稱硝基芳香類化合物)的放線菌菌株——Str印tomycesthioluteus511199。將所篩得的菌株還原硝基芳香類化合物能獲得相應(yīng)的芳香羥胺類化合物，底物(硝基芳香類化合物)轉(zhuǎn)化率和選擇性均較高，整個(gè)制備過程操作簡(jiǎn)單、安全且易于商業(yè)化3規(guī)模制備。本發(fā)明的發(fā)明人所篩得的放線菌菌株(Str印tomycesthioluteus511199)于2008年10月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCCNo.2725。CGMCCNo.2725菌株的特性如下1、形態(tài)在高氏培養(yǎng)基上，菌落整齊，基內(nèi)菌絲體無橫隔，不斷裂，氣生菌絲體分支，生長(zhǎng)豐盛。孢子絲微波曲，孢子呈長(zhǎng)柱型，表面有凹陷。屬于鏈霉菌Str印tomycesthioluteus屬。2、生理生化特性明膠液化完全，脫脂牛奶中脫脂牛奶中不凝固不胨化，淀粉水解完全，H2S產(chǎn)生陽(yáng)性，能利用的碳源為D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇、L-肌醇、L-鼠李糖、棉子糖、L-鼠李糖、蔗糖、纖維素。不能利用D-果糖、L-阿拉伯糖。本發(fā)明所篩得的菌株CGMCCNo.2725可用于制備芳香羥胺類化合物。即以芳香類硝基化合物為原料，經(jīng)所述的菌株CGMCCNo.2725進(jìn)行選擇性還原后得相應(yīng)的芳香羥胺類化合物。在本發(fā)明中，所說的芳香類硝基化合物，其結(jié)構(gòu)如式I或式II所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中&，R2分別選自H、鹵素(F、Cl、Br或I)、_N02、_CN、_0H、QC6烷基、-CHO、-C00H或-C0CH3中一種；i)R3，R4，和R5分別選自H、鹵素(F、Cl、Br或I)、_N02、_CN、_0H、QC6烷基、-CHO、-C00H或-C0CH3中一種；或ii)R3為H、卣素(F、Cl、Br或I)、-N02、-CN、-0H、QC6烷基、-CH0、-C00H或-C0CH3，R4與R5的結(jié)合(即R4+R5)為式III所示基團(tuán)(曲線表示取代位)；或<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>iii)R3，R4，和R5的結(jié)合(即R3+R4+R5)為式IV所示基團(tuán)(曲線表示取代位)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>在本發(fā)明中一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所說的芳香類硝基化合物具有式I所示結(jié)構(gòu)，其中R"R2分別選自H、鹵素(F、Cl、Br或1)、-N02、-CN或-C0CH3中一種；更優(yōu)選的技術(shù)方案是^，I^分別選自H或鹵素(F、Cl、Br或I)中一種，且1^和12中至少有一個(gè)不為H。在本發(fā)明中另一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所說的芳香類硝基化合物具有式II所示結(jié)構(gòu)，其中R3，&，和15分別選自H、鹵素(F、Cl、Br或1)、-N02、-CN或-C0CH3中一種，且尺3，尺4，和R5中至少有一個(gè)不為H。具體實(shí)施例方式1、CGMCCNo.2725菌株的培養(yǎng)，包括如下步驟(1)斜面培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基可溶性淀粉2wt%，KN030.lwt%，NaCl0.05wt%，K2HP043H200.05wt%，MgS047H200.05wt%，F(xiàn)eS047H200.001wt^，瓊月旨1.8%，余量為水；斜面培養(yǎng)基pH值為7.2;將菌株接種到上述斜面培養(yǎng)基上，2『C恒溫培養(yǎng)7天。(2)搖瓶培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)基可溶性淀粉lwt%，葡萄糖2wt%，黃豆粉2.5wt%，酵母粉0.4wt%，牛肉膏0.lwt%，NaCl0.2wt%，K2HP040.005wt%，余量為水；搖瓶培養(yǎng)基pH值為7.07.2;將經(jīng)斜面培養(yǎng)基的菌株接種到上述搖瓶培養(yǎng)基上，搖瓶裝液量為所用搖瓶總體積的10%30%，培養(yǎng)溫度20°C40。C，搖床轉(zhuǎn)速150rpm250rpm，搖瓶培養(yǎng)時(shí)間2天至5天。2、還原芳香類硝基化合物制備相應(yīng)的芳香羥胺類化合物(目標(biāo)物)，包括如下步驟(A)將上述培養(yǎng)的含CGMCCNo.2725菌株的發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，取其上清液(菌絲體)為酶源。將由酶源、芳香類硝基化合物(式I或式II所示化合物，以下簡(jiǎn)稱為"底物")和有機(jī)溶劑組成的反應(yīng)液置于反應(yīng)器中，在20°C5(TC條件下反應(yīng)0.25小時(shí)至6小時(shí)，得含目標(biāo)物的混合液。其中"底物"在反應(yīng)液中的濃度為10mg/l900mg/l(1為反應(yīng)液總體積)；所說的有機(jī)溶劑選自乙醇、二甲基亞砜、四氫呋喃、1，4-二氧雜環(huán)己烷、1，2-二甲氧基乙烷或N，N-二甲基甲酰胺等中一種、二種或二種以上混合物。(B)在由步驟(A)所得的混合液中加入硅藻土，攪拌、過濾。所得濾液用乙酸乙酯萃取，得萃取液(有機(jī)相)；濾餅用乙酸乙酯數(shù)洗滌數(shù)次。合并洗滌液和萃取液得含目標(biāo)物的混合液，將所得的含目標(biāo)物的混合液依次經(jīng)干燥、蒸除有機(jī)溶劑和柱層析后得目標(biāo)物。本發(fā)明所述的放線菌菌株(CGMCCNo.2725)易得且容易培養(yǎng)，菌株細(xì)胞體內(nèi)存在完整的輔酶再生系統(tǒng)，只需加入適量的輔底物(如葡萄糖或乙醇等)，即可進(jìn)行輔酶的自發(fā)循環(huán)再生，無須額外添加價(jià)格昂貴的還原型輔酶，并且整細(xì)胞的使用可以免去酶的提取純化過程，更適合于規(guī)模化商業(yè)應(yīng)用。本發(fā)明所說的制備芳香羥胺類化合物的方法，通過下面實(shí)施例詳述本發(fā)明，其目的是為了更好理解本發(fā)明的內(nèi)容，但所舉的實(shí)施例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例14-硝基苯羥胺的合成將CGMCCNo.2725菌株經(jīng)斜面培養(yǎng)所得的發(fā)酵液以轉(zhuǎn)述8000rpm離心15分鐘，取其上清液(菌絲體)用pH值為7.5的緩沖液(磷酸鹽緩沖液)重懸，再加入5g/L(此處的"L"是指緩沖液的體積)的葡萄糖，得菌懸液。其中斜面培養(yǎng)基可溶性淀粉2%，KN030.lwt%，NaCl0.05wt%，K2HP043H200.05wt%，MgS047H200.05wt%，F(xiàn)eS047H200.001wt^，瓊月旨1.8wt^，余量為水；斜面培養(yǎng)基pH值為7.2。斜面培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為7天。取上述菌懸液6ml與14ml的緩沖液(磷酸鹽緩沖液，pH值為7.5)及含10mg1，4-二硝基苯的二甲基亞砜(DMSO)溶液組成反應(yīng)液，且使1，4-硝基苯在反應(yīng)液中的溶度為10mg/l(1為反應(yīng)液總體積)。并在20°C5(TC條件下進(jìn)行反應(yīng)，通過高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行跟蹤反應(yīng)，每隔一小時(shí)檢測(cè)反應(yīng)液。取1ml的反應(yīng)液，再加入3ml的乙酸乙酯，劇烈震蕩5分鐘，靜置10分鐘，取上清液，用HPLC進(jìn)行檢測(cè)(AgilentXDB-C18，5ii，4.6X250mm)，結(jié)果見表1。HPLC的檢測(cè)條件流動(dòng)相水(含lg/L檸檬酸)和甲醇(含lg/L檸檬酸)，甲醇從30%到60%進(jìn)行梯度洗脫26min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，流速0.8ml.min—、對(duì)照羥胺標(biāo)準(zhǔn)物，保留時(shí)間la，19.9分鐘；lc，11.3分鐘；ld，12.4分鐘。實(shí)施例22-硝基苯羥胺的合成除以1，2-二硝基苯替代實(shí)施例1中的1，4-二硝基苯，及"底物"在反應(yīng)液中的溶度控制在900mg/(1為反應(yīng)液總體積)夕卜，其它條件(包括測(cè)試條件)均與實(shí)施例1中所述相同。所得結(jié)果見結(jié)果見表l。對(duì)照羥胺標(biāo)準(zhǔn)物，保留時(shí)間2a，20.0分鐘；2c，15.9分鐘；2d，19.0分鐘。實(shí)施例33-硝基苯羥胺的合成除以1，3_二硝基苯替代實(shí)施例1中的1，4_二硝基苯外，其它條件(包括測(cè)試條件)均與實(shí)施例1中所述相同。所得結(jié)果見結(jié)果見表1。對(duì)照羥胺標(biāo)準(zhǔn)物，保留時(shí)間3a，22.3分鐘；3c，13.1分鐘；3d，14.2分鐘。實(shí)施例44-羥胺苯乙酮的合成除以4-硝基苯乙酮替代實(shí)施例1中的1，4-二硝基苯外，其它條件(包括測(cè)試條件)均與實(shí)施例1中所述相同。所得結(jié)果見結(jié)果見表1。對(duì)照羥胺標(biāo)準(zhǔn)物，保留時(shí)間4a，21.8分鐘；4c，8.2分鐘；4d，9.5分鐘；4-硝基苯6基乙醇，20.2分鐘。實(shí)施例54-氰基苯羥胺的合成除以4-氰基硝基苯替代實(shí)施例1中的1，4-二硝基苯外，其它條件(包括測(cè)試條件)均與實(shí)施例1中所述相同。所得結(jié)果見結(jié)果見表1。對(duì)照羥胺標(biāo)準(zhǔn)物，保留時(shí)間5a，15.7分鐘；5c，8.2分鐘；5d，9.7分鐘。實(shí)施例62-氯4-羥胺基吡啶的合成除以2-氯，4-硝基吡啶替代實(shí)施例1中的1，4-二硝基苯外，其它條件(包括測(cè)試條件)均與實(shí)施例1中所述相同。所得結(jié)果見結(jié)果見表1。對(duì)照羥胺標(biāo)準(zhǔn)物，保留時(shí)間6a，17.1分鐘；6c，13.9分鐘；6d，10.2分鐘。實(shí)施例74-羥胺基鄰苯二甲腈的合成除以4-硝基鄰苯二甲腈替代實(shí)施例1中的1，4-二硝基苯外，其它條件(包括測(cè)試條件)均與實(shí)施例1中所述相同。所得結(jié)果見結(jié)果見表1。對(duì)照羥胺標(biāo)準(zhǔn)物，保留時(shí)間7a，12.5分鐘；7c，10.2分鐘；7d，11.7分鐘。實(shí)施例84-羥胺基鄰苯二甲酰亞胺的合成除以4-硝基鄰苯二甲酰亞胺替代實(shí)施例1中的1，4-二硝基苯外，其它條件(包括測(cè)試條件)均與實(shí)施例1中所述相同。所得結(jié)果見結(jié)果見表1。對(duì)照羥胺標(biāo)準(zhǔn)物，保留時(shí)間8a，14.3分鐘；8c，6.5分鐘；8d，7.7分鐘。實(shí)施例9將CGMCCNo.2725菌株于28t:條件下，在搖瓶中培養(yǎng)2天至5天，8000rpm離心15分鐘，菌絲體(上清液)用pH值為7.5的緩沖液(磷酸鹽緩沖液)重懸，得菌懸液。在250ml的三角燒瓶中，加入上述60毫升的菌懸液，再加入40ml的pH7.5值為緩沖液(磷酸鹽緩沖液)，把100mg的1，4-二硝基苯溶解在少量的匿SO中加入，于2(TC條件下，反應(yīng)一個(gè)小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加硅藻土(20g)，再攪拌IO分鐘，減壓抽濾，濾餅用乙酸乙酯洗滌，濾液用3X200ml乙酸乙酯萃取。合并有機(jī)相，無水硫酸鎂干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，硅膠柱層析提純，得到產(chǎn)物，產(chǎn)率達(dá)到85%，高效液相轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%，羥胺與胺的比例為95:5。硅膠柱層析(展開劑石油醚/乙酸乙酯二10/l，v/v)，熔點(diǎn)(mp):106-107。C。力NMR(400MHz，DMS0-d6)S9.67(s，-NH)，9.13(S，-OH)，8.08(d，J=7.59Hz，2H)，6.85(d，J=7.59，Hz，2H)。其中搖瓶培養(yǎng)基可溶性淀粉lwt^，葡萄糖2wt^，黃豆粉2.5wt^，酵母粉0.4wt^，牛肉膏0.lwt%，NaCl0.2wt%，K2HP040.005wt^，余量為水；搖瓶培養(yǎng)基pH值為7.07.2;實(shí)施例10將CGMCCNo.2725菌株于28t:條件下，在搖瓶中培養(yǎng)2天至5天，8000rpm離心15分鐘，菌絲體(上清液)用pH值為7.5的緩沖液(磷酸鹽緩沖液)重懸，得菌懸液。在帶有機(jī)械攪拌和恒溫水浴(50°C)的三頸燒瓶中，加入600毫升的上述菌懸液，再加入400ml的pH7.5緩沖液(磷酸鹽緩沖液)，把lg的1，4-二硝基苯溶解在少量的匿SO中加入，反應(yīng)一個(gè)小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加硅藻土(200g)，再攪拌10分鐘，減壓抽濾，濾餅用乙酸乙酯洗滌，濾液用10X200ml乙酸乙酯萃取。合并有機(jī)相，無水硫酸鎂干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，硅膠柱層析提純，得到產(chǎn)物，高效液相轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%，羥胺與胺的比例為(質(zhì)量比)90:io。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注序號(hào)4中的4-硝基苯基乙醇的含量為20%。權(quán)利要求一株放線菌菌株Streptomycesthioluteus511199，其保藏號(hào)為CGMCCNo.2725。2.如權(quán)利要求1所述的菌株在制備芳香羥胺中的應(yīng)用。3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，以芳香類硝基化合物為原料，經(jīng)CGMCCNo.2725菌株，在20°C5(TC條件下進(jìn)行選擇性還原后得相應(yīng)的芳香羥胺類化合物；其中芳香類硝基化合物其結(jié)構(gòu)如式I或式II所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中RpR2分別選自H、卣素、-N02、-CN、-0H、QC6烷基、-CH0、-C00H或-C0CH3中一種；i)R3，R4，和R5分別選自H、鹵素、_N02、-CN、-OH、QC6烷基、-CHO、-C00H或_C0CH3中一種；或ii)R3為H、卣素、-N02、-CN、_0H、QC6烷基、-CHO、-C00H或_C0CH3，R4+R5為式III所示基團(tuán)，曲線表示取代位<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，其中所說的芳香類硝基化合物具有式I所示結(jié)構(gòu)，其中^，R2分別選自H、鹵素、-N02、-CN或-C0CH3中一種。5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，其中Rp&分別選自H或鹵素中一種，且I^和R2中至少有一個(gè)不為H。6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，其中13，14，和15分別選自H、鹵素、-冊(cè)2、-CN或-C0CH3中一種，且R3，&，和R5中至少有一個(gè)不為H。7.如權(quán)利要求36中任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，其中所述芳香類硝基化合物在反應(yīng)液中的濃度為10mg/l9Q0mg/1。全文摘要本發(fā)明涉及一株放線菌(Streptomycesthioluteus)菌株CGMCCNo.2725及其在制備芳香羥胺中的應(yīng)用。菌株CGMCCNo.2725易得且容易培養(yǎng)，菌株細(xì)胞體內(nèi)存在完整的輔酶再生系統(tǒng)，只需加入適量的輔底物(如葡萄糖或乙醇等)，即可進(jìn)行輔酶的自發(fā)循環(huán)再生，無須額外添加價(jià)格昂貴的還原型輔酶，并且整細(xì)胞的使用可以免去酶的提取純化過程，更適合于規(guī)?；虡I(yè)應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N1/20GK101735961SQ200810203180公開日2010年6月16日申請(qǐng)日期2008年11月21日優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日發(fā)明者張琳琳,徐文平,徐曉勇,曠文豐,李忠,錢旭紅,陶黎明申請(qǐng)人:華東理工大學(xué);上海南方農(nóng)藥研究中心