專利名稱：人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的高效制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和蛋白表達領(lǐng)域，涉及一種用生物工程高效制備人的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)的方法。
背景技術(shù)：
生命體中內(nèi)源性化學(xué)小分子N0、C0、H2S、H202等作為細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)中有非常重要的生理功能?；谶@些化學(xué)小分子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機制及其與疾病診斷治療和創(chuàng)新藥物開發(fā)研究是近幾年來化學(xué)生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的一個前沿?zé)狳c。可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)作為信使分子NO的受體，是由a和|3兩個亞基組成的含有血紅素的異源二聚體。當(dāng)NO與sGC的heme結(jié)合后可以激活sGC催化GTP轉(zhuǎn)化為二級信使分子cGMP，進而介導(dǎo)一系列的生物級聯(lián)反應(yīng)。 對于NO如何激活sGC提出了較多的模型，但是其確切機理仍然不清楚，原因主要是由于不能得到足量的高純度的sGC蛋白，另一方面sGC全蛋白比較大(a約80kDa和P約70kDa)，從而阻止了人們對于其結(jié)構(gòu)_功能_性質(zhì)_反應(yīng)的深入研究。
目前sGC蛋白的獲得途徑主要有兩種一是從組織當(dāng)中提取，但是這種方法提取得到的量很少( 2mg/kg牛肺)，對于人的sGC蛋白來說更是由于組織來源的限制而變得幾乎不可能。第二種途徑是從真核細胞中表達這種方法蛋白產(chǎn)率低( 130ii g/25ml細胞提取液)，成本相當(dāng)高。雖然有細菌體的sGC血紅素結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中表達的報道，但是它們與真核生物的血紅素結(jié)構(gòu)域同源性很低。對于真核生物的sGC蛋白，只有Marietta等人在大腸桿菌中表達了小鼠的13 1亞基的血紅素結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域，但是他們所得到的可溶性蛋白的產(chǎn)量相當(dāng)?shù)汀５侥壳盀橹惯€沒有人的sGC蛋白在大腸桿菌中表達的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種操作簡單，成本低，產(chǎn)率高，純度高的人的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)的制備方法。 本發(fā)明提供了一種人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的高效制備方法，該方法包括以下步驟 (1)將人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶核苷酸編碼序列裝入表達載體，并轉(zhuǎn)化表達用大腸桿菌菌株； (2)將(1)所得菌株接種于改進后的TB培養(yǎng)液，IPTG誘導(dǎo)表達過夜； (3)將(2)所得菌體破菌，離心，過Ni-NTA柱，tev酶酶切，過Ni-NTA柱，heme重
組即可。本發(fā)明的方法中，(1)中所述表達載體可以是pMAL-c2x、pET28b或者pET22b。
本發(fā)明的方法中，所述表達載體可以為MBraT-mCherry2質(zhì)粒。
本發(fā)明的方法中，(1)中所述大腸桿菌菌株可以是BL21 (DE3)pLysS、Rosetta(DE3)pLysS或者Rosetta(DE3)。
本發(fā)明的方法中，(3)中破菌方法可以是超聲、反復(fù)凍融或者溶菌酶酶解。
本發(fā)明的方法中，"人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶核苷酸編碼序列"是指編碼具有人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的核苷酸序列(GENBANK登陸號NM_000857)，如序列中開放閱讀框位置核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于NM_000857序列的編碼框開放閱讀框位置核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與NM_000857序列的編碼框開放閱讀框位置核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出NM_000857所述的序列。 在本發(fā)明中，術(shù)語"人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶核苷酸編碼序列"指具有人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶活性的如上述序列對應(yīng)的多肽。該術(shù)語還包括具有與上述蛋白具有相同功能的變異形式。這些變異形式包括若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的活性片段和活性衍生物。 該多肽的變異形式還包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶核苷酸的融合蛋白、以及利用抗人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶核苷酸血清獲得的多肽或蛋白。 本發(fā)明的方法中采用的表達載體和菌株可以采用該領(lǐng)域常用的表達載體和宿主菌，例如MBPHT-mCherry2載體和大腸桿菌Rosetta (DE3) pLysS， pMAL-c2x和BL21 (DE3)pLysS， pET28b禾口 Rosetta(DE3)pLysS， pET22b禾口 Rosetta(DE3)。 把人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶編碼序列裝入載體并轉(zhuǎn)化菌株可以采用常規(guī)的方法。例如，先將人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶編碼序列裝入pBluescriptR等載體中擴增，然后再構(gòu)建表達載體；再如，在人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶編碼序列5 '和3'加入載體上已有的酶切位點，從而將編碼序列插入載體的多克隆位點處。轉(zhuǎn)化采用熱激轉(zhuǎn)化。 改進后的TB培養(yǎng)基包括5-10g/L蛋白胨，5-10g/L酵母提取物，2_10ml/L甘油，O. 01-0. 02mol/L KH2P04，0. 1-0. 2mol/L K2HP04， l_2g/L MgS04， l_4g/LNaN03， 10_30mMGlucose (葡萄糖)。 IPTG誘導(dǎo)可以采用市售的IPTG和常規(guī)的誘導(dǎo)條件。誘導(dǎo)過夜是指誘導(dǎo)時間在10-16小時。 本發(fā)明的方法中，步驟(3)主要是分離純化蛋白?？梢圆捎贸Ｒ?guī)方法分離純化，本發(fā)明還采用效果較好的Ni-NTA柱等技術(shù)分離純化。由于表達的融合蛋白是帶有麥芽糖融合蛋白(MBP)標(biāo)簽和組氨酸(His)標(biāo)簽的，本發(fā)明用Ni-NTA柱來純化，Ni-NTA柱是組氨酸(His)標(biāo)簽的親和柱，其親和性和特異性都比較高，所以純化效果比較好。而Amylose(淀粉多糖)柱是麥芽糖融合蛋白(MBP)標(biāo)簽的親和柱，可以用它來純化蛋白，但是它的親和力相對比較差，柱效比較低。本發(fā)明所用的tev酶是特異識別ENLYFQG肽段的一種酶，在構(gòu)建質(zhì)粒時我們把這個七肽序列加在了MBP和目的蛋白序列之間，所以可以用tev酶來酶切?？梢杂肍actor-Xa來切割，但是比較貴。 本發(fā)明中，使用了 heme重組。這是因為sGC是一種血紅素蛋白，血紅素蛋白是指由
4血紅素(heme)輔基和脫輔基蛋白(即o-protein)組成的一大類蛋白。 一般血紅素輔基是其活性中心。sGC在人體內(nèi)是以heme結(jié)合的形式存在的，但是由于我們是將質(zhì)粒在大腸桿菌中表達，所以經(jīng)常會出現(xiàn)只表達脫輔基蛋白，而heme不能在大腸桿菌中重組上去，另外，在蛋白純化過程中也容易出現(xiàn)heme從蛋白的血紅素腔中脫離出來，變成脫輔基蛋白。所以需要在得到純的即o-protein后再將heme重組至血紅素腔內(nèi)。 本發(fā)明的一個實施例中，采用下述方法具體制備了人sGC。首先，將人sGC-P 1基因(可以從復(fù)能基因公司購得，可從genbank搜索到)?？寺≈罬BraT-mCherry2載體，并抽提得到含有目的基因的表達質(zhì)粒。然后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達用基因工程菌，接種于改進的TB (含50 g/mL氨芐青霉素)培養(yǎng)液，37"培養(yǎng)至0D6。。 0. 6后加IPTG并降溫至20°C誘導(dǎo)表達 12h后收菌。上述菌體超聲破菌離心，過Ni-NTA柱，tev酶酶切，過Ni-NTA柱，heme重組即可得到90%以上純度的目的蛋白。 本發(fā)明的表達載體是MBraT-mCherry2質(zhì)粒；表達用基因工程菌是大腸桿菌Rosetta(DE3)pLysS。 本發(fā)明用的培養(yǎng)液為改進后的TB培養(yǎng)液，具體為在TB培養(yǎng)液中加入1. 25g/LMgS04，2g/L NaN03，20mM Glucose。本改進可以大幅度提高蛋白產(chǎn)量。 本發(fā)明首次從大腸桿菌中表達了人的13 l亞基的sGC蛋白，并且蛋白可溶性很好。取破菌后的上清和沉淀樣品，用SDS-PAGE凝膠電泳檢測，其結(jié)果顯示目的蛋白基本都在上清中。利用本發(fā)明得到的人sGC蛋白產(chǎn)量高達20mg/L以上，純度達90%以上的人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶蛋白，是目前產(chǎn)量最高的低成本表達方法。本發(fā)明在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有重大應(yīng)用價值。
具體實施例方式
首先，我們從廣州復(fù)能基因公司買來人sGC-P 1基因，然后通過基因工程手段將其成功克隆至MBraT-mCherry2載體內(nèi)。基因測序結(jié)果表明我們成功構(gòu)建了 human sGC-P 1表達質(zhì)粒。 以Rosetta(DE3)pLysS為宿主菌轉(zhuǎn)化，挑斑于LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，然后按照
1 : 100比例將菌液轉(zhuǎn)接至250ml modified TB培養(yǎng)基(TB中加入1. 25g/LMgS04， 2g/L
NaN03，20mM Glucose) ， 37 °C ， 250rpm培養(yǎng)至0D6。。 0. 6，然后加IPTG(終濃度O. ImM)，同
時溫度降至20。C表達 12h后收菌。將菌體按5ml/g濕菌重懸于buffer A(50mM Na-Pi，
500mM NaCl，5mM P -巰基乙醇，20X甘油，PH8. 0)，加入少量的溶菌酶、DNase和PMSF(終濃
度lmM)，4。C攪拌均勻后超聲破菌，然后14， 000rpm，4。C離心15min，取出上清過Ni-NTA柱，
用buffer B(bufferA中加入10mM咪唑)洗滌，然后用buffer C (buffer A中加入200mM
咪唑)洗脫，收集洗脫液，蛋白洗脫液透析除去咪唑后加tev酶及終濃度5mM的DTT，于室溫
酶切過夜。酶切產(chǎn)物超濾濃縮后過G-25柱除去DTT，然后再過一次Ni-NTA柱，收集蛋白流
出液，這樣就可以得到90%以上純度的human sGC-P 1脫輔基蛋白。 然后通過heme重組，成功得到了高純度，高產(chǎn)率的含有heme的全蛋白。 本發(fā)明中使用的試劑和生物材料來源如下 MBraT-mCherry2載體由復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院丁滪博士贈予 human sGC-P 1基因購自廣州復(fù)能基因公司
宿主菌Rosetta (DE3) pLysS購自Novagen公司
Hemin :購自sigma公司 Ni-NTA樹脂，質(zhì)粒抽提試劑盒和凝膠回收試劑盒購自Qiagen公司溶菌酶(lysozyme) ，DNaseI，氨節(jié)西林(Ampicillin)，苯甲基磺酰氟(PMSF)，異丙
基-13 -D硫代半乳糖苷(IPTG) ， |3 -巰基乙醇，DTT購自上海生工公司(Sangon， Shanghai,
China) Pfu DNA聚合酶，T4 DNA連接酶，dNTPs與限制性內(nèi)切酶BamHI， EcoRI， HindIII， Xhol購自New England Biolabs公司； S印hadex G—25葡聚糖湊走月交柱購自Pharmacia Biotech公司(Uppsala, Sweden)。
蛋白胨，酵母提取物購自0X0ID公司。
權(quán)利要求
人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的高效制備方法，其特征是，該方法包括以下步驟(1)將人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶核苷酸編碼序列裝入表達載體，并轉(zhuǎn)化表達用大腸桿菌菌株；(2)將(1)所得菌株接種于改進后的TB培養(yǎng)液，IPTG誘導(dǎo)表達過夜；(3)將(2)所得菌體破菌，離心，過Ni-NTA柱，tev酶酶切，過Ni-NTA柱，heme重組即可。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備方法，其特征是，(1)中所述表達載體是pMAL-c2x、 pET28b或者pET22b。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，所述表達載體為MBraT-mCherry2質(zhì)粒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備方法，其特征是，(l)中所述大腸桿菌菌株是BL21(DE3) pLysS、 Rosetta (DE3) pLysS或者Rosetta (DE3)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是，(2)中改進后的TB培養(yǎng)液含有5-10g/ L蛋白胨，5-10g/L酵母提取物，2-10ml/L甘油，O. 01-0. 02mol/L KH2P04，0. 1-0. 2mol/L K2HP04， l-2g/L MgS04， l-4g/LNaN03， 10_30mM葡萄糖。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備方法，其特征是，(3)中破菌方法是超聲、反復(fù)凍融或者 溶菌酶酶解。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)的高效制備方法。本發(fā)明方法通過如下步驟(1)將人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶核苷酸編碼序列裝入表達載體，并轉(zhuǎn)化表達用大腸桿菌菌株；(2)將(1)所得菌株接種于改進后的TB培養(yǎng)液，IPTG誘導(dǎo)表達過夜；(3)將(2)所得菌體破菌，離心，過Ni-NTA柱，tev酶酶切，過Ni-NTA柱，heme重組。制得純度達90％以上的人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶蛋白，產(chǎn)量達20mg/L以上，本方法能克服目前人可溶性鳥苷酸環(huán)化酶產(chǎn)量較低，成本較高，不能滿足對sGC的應(yīng)用需求的缺陷，是目前產(chǎn)量最高的低成本表達方法。
文檔編號C12N15/70GK101736022SQ20081020292
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月18日
發(fā)明者王紅艷, 譚相石, 鐘方芳, 黃仲賢 申請人:復(fù)旦大學(xué)