專利名稱：：一種鑒別新棉33B和GK12的PCR方法及所依賴的Bt基因表達(dá)框的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。特別是涉及一種鑒別轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B和GK12的PCR方法及其依賴的Bt基因表達(dá)框。
背景技術(shù)：
：自從第一個(gè)商業(yè)化轉(zhuǎn)基因栽培品種——延遲成熟的番茄FlavrSavrTM誕生以來(lái)，轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化種植已經(jīng)步入了人類生活的第13年。目前，全球種植轉(zhuǎn)基因作物的國(guó)家共有23個(gè)，種植面積總計(jì)達(dá)1.143億公頃。我國(guó)是轉(zhuǎn)基因作物的主要種植國(guó)家之一，已經(jīng)批準(zhǔn)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因植物包括轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花和楊樹、抗木瓜環(huán)斑病毒的轉(zhuǎn)基因番木瓜、抗病毒辣椒和延遲成熟的番茄等。其中，轉(zhuǎn)Bt基因(Sfla7/^Aw〃'"g/em^)抗蟲棉是我國(guó)種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物，2007年種植面積達(dá)380萬(wàn)公頃，占我國(guó)棉花種植總面積的69%。我國(guó)目前廣泛種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉中，以Motisanto公司的Mon531轉(zhuǎn)化體(如新棉33B等)和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所研制的國(guó)抗系列(如GK-12等)為兩大重要的主栽品系，建立一種區(qū)分兩大轉(zhuǎn)基因棉花品系的快速檢測(cè)方法，不僅可以為兩品系的檢測(cè)提供技術(shù)支撐，同時(shí)對(duì)了解兩品系轉(zhuǎn)基因棉花的全國(guó)分布情況，明晰各自所占的市場(chǎng)份額，都具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。Yang等(Yangetal，2005,TransgenicResearch,14:817-831)報(bào)道的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉MON531的外源DNA整合結(jié)構(gòu)(圖l)，其中Bt基因(oyL4c基因)的表達(dá)框由35S啟動(dòng)子、cr少"c基因和7S終止子組成，但沒(méi)有報(bào)道具體的序列信息。在對(duì)現(xiàn)有的專利和文獻(xiàn)的分析中發(fā)現(xiàn)，還沒(méi)有任何關(guān)于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B和GK12的Bt基因表達(dá)框序列和對(duì)其鑒別方法的文章和專利報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述領(lǐng)域中的空白，提供了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B和GK12的Bt基因表達(dá)框序列以及鑒別這兩種轉(zhuǎn)基因棉花品種的PCR方法，該P(yáng)CR方法能利用普通的PCR儀器、試劑快速準(zhǔn)確鑒別出新棉33B和GK12,以及以新棉33B或/和GK12為親本的棉花品系。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B的Bt基因表達(dá)框序列，如SeqIDNo.l所示，其中啟動(dòng)子的序列位于l-277bp，外源基因c^lAc的基因序列位于278-3811bp，終止子的序列位于3812-4074bp。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉GK12的Bt基因表達(dá)框序列，如SeqlDNo.2所示，其中啟動(dòng)子的序列位于l-277bp，外源基因cr;;L4c的基因序列位于278-2197bp，終止子的序列位于2198-2471bp。一種鑒別新棉33B和GK12的PCR方法，所述PCR體系中包括正向引物33B-P或/和正向引物GK12-P，一條反向弓I物MG-P，其特征在于33B-P設(shè)計(jì)在SeqIDNo.1的278bp-381lbp位置，GK12-P設(shè)計(jì)在SeqIDNo.2的278bp-2197bp位置，反向引物MG-P設(shè)計(jì)在SeqIDNo.l或SeqIDNo.2的后257bp上；所述的兩條正向引物設(shè)計(jì)的位置應(yīng)該使兩種檢測(cè)產(chǎn)物的長(zhǎng)度差異在50bp以上。所述33B-P設(shè)計(jì)在SeqIDNo.l的2198bp-3782bp位置。所述33B-P設(shè)計(jì)在SeqIDNo.l的3765bp-3782bp位置；所述GK12-P設(shè)計(jì)在SeqIDNo.2的2016bp-2036bp位置；所述MG-P設(shè)計(jì)在SeqIDNo.l的4055bp-4074bp位置。所述PCR方法的反應(yīng)條件中延伸時(shí)間為30秒。上述PCR方法的應(yīng)用于鑒定以新棉33B/或GK12為親本的棉花品系。本發(fā)明基于MON531是新棉33B的親本，根據(jù)Yang等(Yangetal,2005,TransgenicResearch,14:817-831)報(bào)道的MON531外源DNA整合結(jié)構(gòu)，本發(fā)明分別在35S啟動(dòng)子、cr;;L4c基因和7S3'終止子區(qū)域設(shè)計(jì)引物，采用PCR和長(zhǎng)鏈PCR擴(kuò)增出包括啟動(dòng)子區(qū)域的5'端序列，以及包括終止子區(qū)域的3'端序列，經(jīng)過(guò)拼接獲得新棉33B的外源Bt基因的表達(dá)框序列，其長(zhǎng)度為4074bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.l所示，通過(guò)序列分析得出，該序列的l-277bp位置為啟動(dòng)子區(qū)域；278-3811bp位置為外源基因即Bt基因片段區(qū)域；3812-4074bp位置為7S終止子區(qū)域。并以同樣的方法獲得GK12的Bt基因表達(dá)框序列，其長(zhǎng)度為2471bp，如SeqlDNo.2所示，通過(guò)序列分析得出，該序列的l-277bp位置為啟動(dòng)子區(qū)域；278-2197bp位置為外源基因即Bt基因片段區(qū)域；2198-2471bp位置為7S終止子區(qū)域。本發(fā)明對(duì)兩個(gè)品種的Bt基因表達(dá)框序列SeqlDNo.l與SeqlDNo.2進(jìn)行序列比較，發(fā)現(xiàn)兩條序列在前2130bp和后257bp是完全一致的，僅在SeqIDNo.—1的2131-3817bp位置與SeqIDNo.2的2131-2214bp位置是不同的，根據(jù)兩個(gè)品種的Bt基因表達(dá)框序列SeqIDNo.1、SeqIDNo.2的長(zhǎng)短及序列差異，提供了一種準(zhǔn)確鑒別和檢測(cè)出兩個(gè)品種的PCR方法，該P(yáng)CR方法的PCR體系中包括正向引物33B-P或/和GK12-P，反向引物MG-P，33B-P設(shè)計(jì)在SeqlDNo.l的278-3811bp位置，GK12-P設(shè)計(jì)在SeqIDNo.2的278bp-2197bp位置，反向引物MG-P設(shè)計(jì)在SeqIDNo.l或SeqIDNo.2的后257bp位置上，該P(yáng)CR方法既可以檢測(cè)出其中任一品種，當(dāng)兩種品種混淆不清時(shí)，也可以用本方法進(jìn)行鑒別，如果需要在一群棉花植株中檢測(cè)出新棉33B，該方法的PCR體系中可以僅包括33B-P和MG-P兩條引物；而需要在一群植株中檢測(cè)出GK12時(shí)，該方法的PCR體系中可以只包括GK12-P和MG-P兩條引物；當(dāng)需要鑒別兩種品種、雜合體或者作為排除兩種品種的檢測(cè)時(shí)，體系中需要包括三條引物，此時(shí)為便于用普通的瓊脂糖凝膠分辯出產(chǎn)物條帶，要求兩種品種的檢測(cè)產(chǎn)物序列的長(zhǎng)短應(yīng)該有明顯的區(qū)別，一般要求差異在50bp以上，即引物組合33B-P/MG-P的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度與GK12-P/MG-P擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度相差50bp以上。本發(fā)明的方法為目前新棉33B與GK12的檢測(cè)方法彌補(bǔ)了空白，能快速準(zhǔn)確地鑒別出目的轉(zhuǎn)基因品種，是一種快速了解兩品系轉(zhuǎn)基因棉花的全國(guó)分布及應(yīng)用情況，明晰各自所占的市場(chǎng)份額的有效手段。本發(fā)明的方法主要依賴于PCR技術(shù)，為了提高檢測(cè)效率以及準(zhǔn)確性，將正向引物33B-P設(shè)計(jì)在SeqIDNo.l與SeqIDNo.2的差異區(qū)域內(nèi)即SeqIDNo..l的2198-3811bp位置，更優(yōu)選地將33B-P設(shè)計(jì)在SeqlDNo.l的3765bp-3782bp位置，序列如SeqIDNo.3所示，命名為33B-P!;而GK12-P設(shè)計(jì)在SeqIDNo.2的2016bp-2036bp位置，序列如SeqIDNo.4所示，命名為GK12-Pi;反向引物MG-P設(shè)計(jì)在SeqIDNo.l的4055bp-4074bp位置，序列如SeqIDNo.5所示，命名為MG-P,，優(yōu)選的引物所擴(kuò)增出來(lái)的新棉33B的檢測(cè)產(chǎn)物與GK12的檢測(cè)產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為310bp、456bp，能夠在瓊脂糖膠上快速分開(kāi)。這樣一方面由于檢測(cè)產(chǎn)物序列較短，對(duì)于PCR儀器及試劑的要求也不會(huì)很高，使本發(fā)明的PCR方法更易于推廣應(yīng)用，另一方面，既提高了該檢測(cè)方法的特異性和準(zhǔn)確性，又因?yàn)榭s短了正向引物與反向引物之間的距離，使檢測(cè)時(shí)采用的PCR程序的延伸時(shí)間可以縮短很多，從而提高了檢測(cè)效率。本發(fā)明的PCR檢測(cè)方法中，PCR程序延伸時(shí)間為30秒即可。本發(fā)明提供的新棉33B、GK12的Bt基因表達(dá)框序列以及依賴其建立的PCR方法可作為一種鑒定新棉33B、GK12，以及以這兩個(gè)品種為親本的轉(zhuǎn)基因棉品系的有效手段，由于我國(guó)目前廣泛種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉中，以Monsanto公司的Mon531轉(zhuǎn)化體(如新棉33B等)和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所研制的國(guó)抗系列(如GK-12等)為兩大主要栽培品系，因此本發(fā)明為區(qū)分兩大轉(zhuǎn)基因棉花品系以及調(diào)査兩品系轉(zhuǎn)基因棉花的全國(guó)分布情況，明晰各自所占的市場(chǎng)份額，提供了便利，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、靈敏度高、特異性好、所需實(shí)驗(yàn)條件不高，因此有非常高的實(shí)用價(jià)值。圖1轉(zhuǎn)基因抗蟲棉MON531的外源DNA整合結(jié)構(gòu)圖2Bt基因表達(dá)框啟動(dòng)子端片段擴(kuò)增檢測(cè)電泳圖其中M:MarkerDL2000;1、2:GK12;3、4:33B;5:空白對(duì)照?qǐng)D3Bt基因表達(dá)框終止子端片段擴(kuò)增檢測(cè)電泳圖其中M:Marker入/HindlII;1、2:GK12;3、4:33B;5:空白對(duì)照?qǐng)D4本發(fā)明的PCR方法鑒別新棉33B和GK12。其中M:MarkerDL2000;1-10、21:GK12;11-20、22:GK12;23:空白對(duì)照?qǐng)D5本發(fā)明的PCR方法鑒別新棉33B和GK12的驗(yàn)證其中M:MarkerDL2000;N:陰性對(duì)照；B:空白對(duì)照；P:33B和GK12的雜合體；1-20:鑒別樣品，泳道l-6、8-12、15、17和20為33B;泳道13、14為GK12;泳道7、18為33B和GK12的雜合；泳道16、19不是33B或GK12。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)中所述的條件，或按照儀器或者試劑制造廠商所建議的條件。實(shí)施例l轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B和GK12的Bt基因表達(dá)框序列的克隆1實(shí)驗(yàn)材料1.1植物材料轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B和GK12。1.2酶與試劑分子生物學(xué)試劑，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker、A/HindlllMarker等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。1.3實(shí)驗(yàn)儀器PCR牛廣增f義Mastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸電泳儀DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)DNA測(cè)序儀(AppliedBiosystem377型全自動(dòng)熒光序列分析儀)DNA電泳分析系統(tǒng)KodakEDAS290(Kodakco.)其它儀器包括離心機(jī)，恒溫加熱板，電子天平，培養(yǎng)箱等。2實(shí)驗(yàn)方法和過(guò)程2.1棉花基因組DNA提取與檢測(cè)2丄1棉花基因組DNA提取取子葉期的幼嫩棉花葉片做為DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout試劑盒(天澤基因公司)的操作手冊(cè)，進(jìn)行棉花材料總DNA的提取。2.1.4DNA翻取5)al提取的DNA溶液，以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)其亮度和帶型來(lái)初步判斷提取DNA的質(zhì)量。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定所提取的DNA的濃度和純度。2.2新棉33B和GK12的Bt基因表達(dá)框啟動(dòng)子端序列的獲得參照《農(nóng)業(yè)部953號(hào)公告-6-2007轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)抗蟲水稻定性PCR方法》，選取CaMV35S啟動(dòng)子的正向引物35S-F1和Bt基因的反向引物Bt-Rl，引物序列如表1所示，用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B和GK12的Bt基因表達(dá)框啟動(dòng)子端序列。反應(yīng)體系0.25pLrTaq(5U4iL)，5pL10xPCRBuffer(Mg2+Plus),4j^LdNTP(各2.5mM)，引物各2pLU0pM)，模板各2pL(20ng/pL)，加滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積至50pL，擴(kuò)增程序94。C預(yù)變性4min;94。C變性30sec,55'C退火30sec,72°。延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；72。C10min。2.3抗蟲棉新棉33B和GK12的Bt基因表達(dá)框終止子端序列的獲得本實(shí)施例中采用LD-PCR方法擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B和GK12的Bt基因表達(dá)框終止子端序列。參照《農(nóng)業(yè)部953號(hào)公告-6-2007轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)抗蟲水稻定性PCR方法》中Bt基因的檢測(cè)引物，選取其正向引物(引物序列見(jiàn)表1);從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載7S3'終止子序列(登錄號(hào)為J01293)，并設(shè)計(jì)引物MG-P1作為反向引物，如SeqlDNo.5或者表1所示。表l用于PCR和LD-PCR擴(kuò)增的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>LD-PCR擴(kuò)增體系為總體系50pL，ExTaq(Takaraco.,Dalian),1.25U10xExTaqBuffer5jaL，dNTP(各2.5mM)4|aL，水稻DNA2pLU0ng/^L)，引物各2pL(25^M)。LD陽(yáng)PCR擴(kuò)增程序94。C4min;(98°C10s，68°C15min)，30cycles;72°C10min。2.4序列測(cè)定和分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳，采用QIAquickGelExtractionkit回收擴(kuò)增片段，連接到pGEM-Teasy(Promega,Madison,Wis.)，采用ABIPRISM1300GeneticAnalyzer進(jìn)行序列測(cè)定。采用軟件vectorNTI10.0(Invitrogen)對(duì)測(cè)定的序列進(jìn)行拼接和分析。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B的Bt基因表達(dá)框的序列采用PCR和LD-PCR方法分別獲得了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B的Bt基因啟動(dòng)子端和終止子端序列長(zhǎng)度分別為878bp和3497bp，見(jiàn)圖2和圖3。經(jīng)拼接獲得了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B的Bt基因表達(dá)框的序列，其長(zhǎng)度為4074bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.l所示。通過(guò)序列分析得出，該序列的l-277bp位置為啟動(dòng)子區(qū)域；278-3811bp位置為外源基因即Bt基因片段區(qū)域；3812-4074bp位置為7S終止子區(qū)域。3.2轉(zhuǎn)基因抗蟲棉GK12的Bt基因表達(dá)框的序列采用PCR和LD-PCR方法分別獲得了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉GK12的Bt基因啟動(dòng)子端和終止子端序列長(zhǎng)度分別為878bp和1894bp，見(jiàn)圖2和圖3。經(jīng)拼接獲得了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉GK12的Bt基因表達(dá)框的序列，其長(zhǎng)度為2471bp，其核苷酸序列如SeqlDNo.2所示。通過(guò)序列分析得出，該序列的l-277bp位置為啟動(dòng)子區(qū)域；278-2197bp位置為外源基因即Bt基因片段區(qū)域；2198-2471bp位置為7S終止子區(qū)域。3.3轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B和GK12的Bt基因表達(dá)框序列的比較對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B和GK12的Bt基因表達(dá)框序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩條序列在前2130bp和后257bp是完全一致的，僅在轉(zhuǎn)基因抗蟲棉33B的Bt基因表達(dá)框序列(SeqIDNo.l)的2131-3817位與轉(zhuǎn)基因抗蟲棉GK12的Bt基因表達(dá)框序列(SeqIDNo.2)的2131-2214位是不同的。實(shí)施例2本發(fā)明的PCR方法應(yīng)用于鑒別轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B和GK12的PCR實(shí)驗(yàn)及驗(yàn)證1實(shí)驗(yàn)材料1.1植物材料轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B和GK12。1.2酶與試劑分子生物學(xué)試劑，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、Marker等購(gòu)自大連寶生物生物工程有限公司。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。1.3實(shí)驗(yàn)儀器PCR擴(kuò)增儀Mastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸電泳儀DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)DNA電泳分析系統(tǒng)KodakEDAS290(Kodakco.)其它儀器包括離心機(jī)，恒溫加熱板，電子天平，培養(yǎng)箱等。2實(shí)驗(yàn)方法和過(guò)程2.1棉花基因組DNA提取與檢測(cè)見(jiàn)實(shí)施例1中2.1棉花基因組DNA提取與檢測(cè)。2.2鑒別轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B和GK12的PCR方法實(shí)驗(yàn)及驗(yàn)證本發(fā)明的PCR方法鑒別新棉33B實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)施例1中測(cè)定的序列SeqIDNo.l,在新棉33B的Bt基因表達(dá)框序列如SeqIDNo.l所示的3765-3782bp位序列設(shè)計(jì)正向引物33B-Pp如SeqIDNo.3所示，在4055-4074bp位置序列設(shè)計(jì)的反向引物MG-P!，如SeqIDNo.5所示；采用引物33B-P!/MG-Pi組合，隨機(jī)選取轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B的10個(gè)單株為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果均能獲得310bp的特異擴(kuò)增片段，見(jiàn)圖4，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明通過(guò)擴(kuò)增拼接所獲得的Bt基因表達(dá)框序列SeqIDNo.l與新棉33B的Bt基因表達(dá)框序列相符。本發(fā)明的PCR方法鑒別GK12實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)施例1中測(cè)定的序列SeqlDNo.2，在轉(zhuǎn)基因抗蟲棉GK12的Bt基因表達(dá)框序列如SeqIDNo.l所示的2016-2036位序列設(shè)計(jì)正向引物GK12-P!，如SeqlDNo.4所示，在2452-2471位序列設(shè)計(jì)的反向引物MG-P,，如SeqlDNo.5所示；采用引物GK12-P,/MG-P!組合，隨機(jī)選取轉(zhuǎn)基因抗蟲棉GK12的10個(gè)單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果均能獲得456bp的特異擴(kuò)增片段，見(jiàn)圖4，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明通過(guò)擴(kuò)增拼接所獲得的Bt基因表達(dá)框序列SeqIDNo.2與GK12的Bt基因表達(dá)框序列相符。本發(fā)明的PCR方法應(yīng)用于鑒別新棉33B和GK12以及其他品種的驗(yàn)證采用引物33B-P1/MG-P1/GK12-P1組合，檢測(cè)購(gòu)自市場(chǎng)的20個(gè)棉花樣品。見(jiàn)圖5。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明本發(fā)明提供的PCR方法能很好地鑒別出33B、GK12以及兩者的雜合體，以及排除其他品種。以上PCR反應(yīng)體系均為0.25^LrTaq(5U4iL)，5pL10xPCRBuffer(Mg2+Plus),4pLdNTP(各2.5mM)，引物各2pL(10nM)，模板各2pL(20ng4iL)，加滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積至50pL，擴(kuò)增程序?yàn)?4'C預(yù)變性4min;94。C變性30sec,55。C退火30sec,72'C延伸30sec，35個(gè)循環(huán);72。C10min。表2鑒別轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B和GK12的PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>附錄:序列表SeqIDNo.1:新棉33B的Bt基因表達(dá)框序列:(4074bp)1GCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCG61ACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTC121CAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACG■181CACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGG241AGAGGACACGCTGACAAGCTGACTCTAGCAGATCTCCATGGACAACAACCCAAACATCAA301CGAATGCATTCCATACAACTGCTTGAGTAACCCAGAAGTTGAAGTACTTGGTGGAGAACG361CATTGAAACCGGTTACACTCCCATCGACATCTCCTTGTCCTTGACACAGTTTCTGCTCAG421CGAGTTCGTGCCAGGTGCTGGGTTCGTTCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATCTT481TGGTCCATCTCAATGGGATGCATTCCTGGTGCAAATTGAGCAGTTGATCAACCAGAGGAT541CGAAGAGTTCGCCAGGAACCAGGCCATCTCTAGGTTGGAAGGATTGAGCAATCTCTACCA601AATCTATGCAGAGAGCTTCAGAGAGTGGGAAGCCGATCCTACTAACCCAGCTCTCCGCGA661GGAAATGCGTATTCAATTCAACGACATGAACAGCGCCTTGACCACAGCTATCCCATTGTT721CGCAGTCCAGAACTACCAAGTTCCTCTCTTGTCCGTGTACGTTCAAGCAGCTAATCTTCA781CCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGGATTCGATGCTGCAAC841CATCAATAGCCGTTACAACGACCTTACTAGGCTGATTGGAAACTACACCGACCACGCTGT901TCGTTGGTACAACACTGGCTTGGAGCGTGTCTGGGGTCCTGATTCTAGAGATTGGATTAG961ATACAACCAGTTCAGGAGAGAATTGACCCTCACAGTTTTGGACATTGTGTCTCTCTTCCC1021GAACTATGACTCCAGAACCTACCCTATCCGTACAGTGTCCCAACTTACCAGAGAAATCTA應(yīng)TACTAACCCAGTTCTTGAGAACTTCGACGGTAGCTTCCGTGGTTCTGCCCAAGGTATCGA1141AGGCTCCATCAGGAGCCCACACTTGATGGACATCTTGAACAGCATAACTATCTACACCGA1201TGCTCACAGAGGAGAGTATTACTGGTCTGGACACCAGATCATGGCCTCTCCAGTTGGATT1261CAGCGGGCCCGAGTTTACCTTTCCTCTCTATGGAACTATGGGAAACGCCGCTCCACAACA1321ACGTATCGTTGCTCAACTAGGTCAGGGTGTCTACAGAACCTTGTCTTCCACCTTGTACAG1381AAGACCCTTCAATATCGGTATCAACAACCAGCAACTTTCCGTTCTTGACGGAACAGAGTT1441CGCCTATGGAACCTCTTCTAACTTGCCATCCGCTGTTTACAGAAAGAGCGGAACCGTTGA1501TTCCTTGGACGAAATCCCACCACAGAACAACAATGTGCCACCCAGGCAAGGATTCTCCCA1561CAGGTTGAGCCACGTGTCCATGTTCCGTTCCGGATTCAGCAACAGTTCCGTGAGCATCAT1621CAGAGCTCCTATGTTCTCTTGGATACATCGTAGTGCTGAGTTCAACAACATCATCGCATC1681CGATAGTATTACTCAAATCCCTGCAGTGAAGGGAAACTTTCTCTTCAACGGTTCTGTCAT1741TTCAGGACCAGGATTCACTGGTGGAGACCTCGTTAGACTCAACAGCAGTGGAAATAACAT1801TCAGAATAGAGGGTATATTGAAGTTCCAATTCACTTCCCATCCACATCTACCAGATATAG1861AGTTCGTGTGAGGTATGCTTCTGTGACCCCTATTCACCTCAACGTTAATTGGGGTAATTC1921ATCCATCTTCTCCAATACAGTTCCAGCTACAGCTACCTCCTTGGATAATCTCCAATCCAG1981CGATTTCGGTTACTTTGAAAGTGCCAATGCTTTTACATCTTCACTCGGTAACATCGTGGG2041TGTTAGAAACTTTAGTGGGACTGCAGGAGTGATTATCGACAGATTCGAGTTCATTCCAGT2101TACTGCAACACTCGAGGCTGAGTACAACCTTGAGAGAGCCCAGAAGGCTGTGAACGCCCT2161CTTTACCTCCACCAATCAGCTTGGCTTGAAAACTAACGTTACTGACTATCACATTGACCA2221AGTGTCCAACTTGGTCACCTACCTTAGCGATGAGTTCTGCCTCGACGAGAAGGGTGAACT2281CTCCGAGAAAGTTAAACACGCCAAGCGTCTCAGCGACGAGAGGAATCTCTTGCAAGACTC2341CAACTTCAAAGACATCAACAGGCAGCCAGAACGTGGTTGGGGTGGAAGCACCGGGATCAC2401CATCCAAGGAGGCGACGATGTGTTCAAGGAGAACTACGTCACCCTCTCCGGAACTTTCGA2461CGAGTGCTACCCTACCTACTTGTACCAGAAGATCGATGAGTCCAAACTCAAAGCCTTCAC2521CAGGTATCAACTTAGAGGCTACATCGAAGACAGCCAAGACCTTGAAATCTACTCGATCAG2581GTACAATGCCAAGCACGAGACCGTGAATGTCCCAGGTACT10GGTTCCCTCTGGCCACTTTC2641TGCCCAATCTCCCATTGGGAAGTGTGGAGAGCCTAACAGATGCGCTCCACACCTTGAGTG2701GAATCCTGACTTGGACTGCTCCTGCAGGGATGGCGAGAAGTGTGCCCACCATTCTCATCA2761CTTCTCCTTGGACATCGATGTGGGATGTACTGACCTGAATGAGGACCTCGGAGTCTGGGT2821CATCTTCAAGATCAAGACCCAAGACGGACACGCAAGACTTGGCAACCTTGAGT丁TCTCGA2881AGAGAAACCATTGGTCGGTGAAGCTCTCGCTCGTGTGAAGAGAGCAGAGAAGAAGTGGAG2941GGACAAACGTGAGAAACTCGAATGGGAAACTAACATCGTTTACAAGGAGGCCAAAGAGTC3001CGTGGATGCTTTGTTCGTGAACTCCCAATATGATCAGTTGCAAGCCGACACCAACATCGC3061CATGATCCACGCCGCAGACAAACGTGTGCACAGCATTCGTGAGGCTTACTTGCCTGAGTT3121GTCCGTGATCCCTGGTGTGAACGCTGCCATCTTCGAGGAACTTGAGGGACGTATCTTTAC3181CGCATTCTCCTTGTACGATGCCAGAAACGTCATCAAGGACGGTGGCTTCAACAATGGCCT3241CAGCCGCTGGAATGTG嵐GGTCATGTGGACGTGGAGGAACAGAACAATCAGCGTTCCGT3301CCTGGTAGTGCCTGAGTGGGAAGCTGAAGTGTCCCAAGAGGTTAGAGTCTGTCCA卩GTAG3361AGGCTACATTCTCCGTGTGACCGCTTACAAGGAGGGATACGGTGAGGGTTGCGTGACCAT3421CCACGAGATCGAGAACAACACTGACGAGCTTAAGTTCTCCAACTGCGTCGAGGAAGAAAT3481CTATCCCAACAACACCGTTACTTGCAACGACTACACTGTGAATCAGGAAGAGTACGGAGG3541TGCCTACACTAGCCGTAACAGAGGTTACAACGAAGCTCCTTCCGTTCCTGCTGACTATGC3601CTCCGTGTACGAGGAGAAATCCTACACAGACGGCAGACGTGAGAACCCTTGCGAGTTCAA3661CAGAGGTTACAGGGACTACACACCACTTCCAGTTGGCTGTGTTACCAAGGAGCTTGAGTA3721CTTTCCTGAGACCGACAAAGTGTGGATCGAGATCGGTGAAACCGAGGGAACCTTCATCGT3781GGACAGCGTGGAGCTTCTCTTGATGGAGGAATAATGAGATCTAGAGGCCTGAATTCGAGC3841TCGGTACCCGGGGATCCCGTCCTTTGTCTTCAATTTTGAGGGCTTTTTACTGAATAAGTA3901TGTAGTACTAAAATGTATGCTGTAATAGCTCATAGTGAGCGAGGAAAGTATCGGGCTATT3961TAACTATGACTTGAGCTCCATCTATGAATAAATAAATCAGCATATGATGC丁丁TTGTTT丁G4021TGTACTTCAACTGTCTGCTTAGCTAATTTGATATGGTTGGCACTTGGCACGTATID12:GK12的Bt基因表達(dá)框序列(2471bp)1GCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCG61ACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTC121CAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACG181CACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGG241AGAGGACACGCTGACAAGCTGACTCTAGCAGATCTCCATGGACAACAACCCAAACATCAA301CGAATGCATTCCATACAACTGCTTGAGTAACCCAGAAGTTGAAGTACTTGGTGGAGAACG361CATTGAAACCGGTTACACTCCCATCGACATCTCCTTGTCCTTGACACAGTTTCTGCTCAG421CGAGTTCGTGCCAGGTGCTGGGTTCGTTCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATCTT481TGGTCCATCTCAATGGGATGCATTCCTGGTGCAAATTGAGCAGTTGATCAACCAGAGGAT541CGAAGAGTTCGCCAGGAACCAGGCCATCTCTAGGTTGGAAGGATTGAGCAATCTCTACCA601AATCTATGCAGAGAGCTTCAGAGAGTGGGAAGCCGATCCTACTAACCCAGCTCTCCGCGA661GGAAATGCGTATTCAATTCAACGACATGAACAGCGCCTTGACCACAGCTATCCCATTGTT721CGCAGTCCAGAACTACCAAGTTCCTCTCTTGTCCGTGTACGTTCAAGCAGCTAATCTTCA781CCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGGATTCGATGCTGCAAC841CATCAATAGCCGTTACAACGACCTTACTAGGCTGATTGGAAACTACACCGACCACGCTGT901TCGTTGGTACAACACTGGCTTGGAGCGTGTCTGGGGTCCTGATTCTAGAGATTGGATTAG961ATACAACCAGTTCAGGAGAGAATTGACCCTCACAGTTTTGGACATTGTGTCTCTCTTCCC■1021GAACTATGACTCCAGAACCTACCCTATCCGTACAGTGTCCCAACTTACCAGAGAAATCTA1081TACTAACCCAGTTCTTGAGAACTTCGACGGTAGCTTCCGTGGTTCTGCCCAAGGTATCGA1M1AGGCTCCATCAGGAGCCCACACTTGATGGACATCTTGAACAGCATAACTATCTACACCGA1201TGCTCACAGAGGAGAGTATTACTGGTCTGGACACCAGATCATGGCCTCTCCAGTTGGATT.1261CAGCGGGCCCGAGTTTACCTTTCCTCTCTATGGAACTATGGGAAACGCCGCTCCACAACA1321ACGTATCGTTGCTCAACTAGGTCAGGGTGTCTACAGAACCTTGTCTTCCACCTTGTACAG1381AAGACCCTTCAATATCGGTATCAACAACCAGCAACTTTCCGTTCTTGACGGAACAGAGTT14.41CGCCTATGGAACCTCTTCTAACTTGCCATCCGCTGTTTACAGAAAGAGCGGAACCGTTGA1501TTCCTTGGACGAAATCCCACCACAGAACAACAATGTGCCACCCAGGCAAGGATTCTCCCA1561CAGGTTGAGCCACGTGTCCATGTTCCGTTCCGGATTCAGCAACAGTTCCGTGAGCATCAT1621CAGAGCTCCTATGTTCTCTTGGATACATCGTAGTGCTGAGTTCAACAACATCATCGCATC■1681CGATAGTATTACTCAAATCCCTGCAGTGAAGGGAAACTTTCTCTTCAACGGTTCTGTCAT1741TTCAGGACCAGGATTCACTGGTGGAGACCTCGTTAGACTCAACAGCAGTGGAAATAACAT1801TCAGAATAGAGGGTATATTGAAGTTCCAATTCACTTCCCATCCACATCTACCAGATATAG腕AGTTCGTGTGAGGTATGCTTCTGTGACCCCTATTCACCTCAACGTTAATTGGGGTAATTC192.1ATCCATCTTCTCCAATACAGTTCCAGCTACAGCTACCTCCTTGGATAATCTCCAATCCAG1981CGATTTCGGTTACTTTGAAAGTGCCAATGCTTTTACATCTTCACTCGGTAACATCGTGGG2041TGTTAGAAACTTTAGTGGGACTGCAGGAGTGATTATCGACAGATTCGAGTTCATTCCAGT2皿TACTGCAACACTCGAGGCTGAGTACAACCTCGAAAGAGCCCAGAAGGCTGTAATGCCCTC2161TTCACCTCTACAAACCAGCTTGGACTCAAGACAAATGTGACCGATTATCACTAAGATCTA2221GAGGCCTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCCGTCCTTTGTCTTCAATTTTGAGGGC2281TTTTTACTGAATAAGTATGTAGTACTAAAATGTATGCTGTAATAGCTCATAGTGAGCGAG2341GAAAGTATCGGGCTATTTAACTATGACTTGAGCTCCATCTATGAATAAATAAATCAGCAT2'101ATGATGCTTTTGTTTTGTGTACTTCAACTGTCTGCTTAGCTAATTTGATATGGTTGGCAC2461TTGGCACGTATSeqIDNo.3正向引物33B-P,5'-AGGGAACCTTCATCGTGG-3'SeqIDNo.4正向引物GK12-P,5'-CATCTTCACTCGGTAACATCG-3'SeqIDNo.5反向引物MGB-P'5'-ATACGTGCCAAGTGCCAACC-3'SeqIDNo.635S啟動(dòng)子正向引物35S-Fl5'-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3'SeqIDNo.7Bt基因正向引物Bt-Fl5'-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3'SeqIDNo.8Bt基因反向引物Bt-Rl5'-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3'權(quán)利要求1、轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B的Bt基因表達(dá)框序列，如SeqIDNo.1所示，其中啟動(dòng)子的序列位于1-277bp，外源基因crylAc的基因序列位于278-3811bp，終止子的序列位于3812-4074bp。2、轉(zhuǎn)基因抗蟲棉GK12的Bt基因表達(dá)框序列，如SeqlDNo.2所示，其中啟動(dòng)子的序列位于l-277bp，外源基因cr;;A4c的基因序列位于278-2197bp，終止子的序列位于2198-2471bp。3、一種鑒別新棉33B和GK12的PCR方法，所述PCR體系中包括正向引物33B-P或/和正向引物GK12-P，一條反向引物MG-P，其特征在于33B-P設(shè)計(jì)在SeqlDNo.l的278bp-3811bp位置，GK12-P設(shè)計(jì)在SeqIDNo.2的278bp-2197bp位置，反向引物MG-P設(shè)計(jì)在SeqIDNo.l或SeqIDNa2的后257bp上；所述的兩條正向引物設(shè)計(jì)的位置應(yīng)該使兩種檢測(cè)產(chǎn)物的長(zhǎng)度差異在50bp以上。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的PCR方法，所述33B-P設(shè)計(jì)在SeqIDNo.l的2198bp-3782bp位置。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的PCR方法，所述33B-P設(shè)計(jì)在SeqlDNo.l的3765bp-3782bp位置；所述GK12-P設(shè)計(jì)在SeqIDNo.2的2016bp-2036bp位置；所述MG-P設(shè)計(jì)在SeqIDNo.l的4055bp-4074bp位置。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的PCR方法，所述PCR方法的反應(yīng)條件中延伸時(shí)間為30秒。7、權(quán)利要求3所述的PCR方法，所述的新棉33B和GK12還包括以新棉33B與GK12為親本的棉花品系。全文摘要本發(fā)明涉及“一種鑒別轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B和GK12的PCR方法及其依賴的Bt基因表達(dá)框”，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新棉33B的Bt基因表達(dá)框序列，如SeqIDNo.1所示，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉GK12的Bt基因表達(dá)框序列，如SeqIDNo.2所示；一種鑒別新棉33B和GK12的PCR方法，該P(yáng)CR方法包括利用SeqIDNo.1與SeqIDNo.2的差異序列設(shè)計(jì)的特異性檢測(cè)引物。該P(yáng)CR方法能利用普通的PCR儀器、試劑快速準(zhǔn)確鑒別出新棉33B和GK12，以及以新棉33B或/和GK12為親本的棉花品系。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101392258SQ20081022572公開(kāi)日2009年3月25日申請(qǐng)日期2008年11月10日優(yōu)先權(quán)日2008年11月10日發(fā)明者彭于發(fā),王奕海,王錫鋒,謝家建申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所