專利名稱：：一種轉(zhuǎn)sck/cry1Ac雙價(jià)抗蟲基因水稻品系科豐8號外源插入片段旁側(cè)序列及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是一種生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的基因序列。具體的說，涉及一種轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的外源插入片段的旁側(cè)序列。
背景技術(shù)：
：水稻是我國最重要的糧食作物之一，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)在水稻中的廣泛研究和應(yīng)用，己經(jīng)有多個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻品系進(jìn)行了環(huán)境釋放，申請商業(yè)化種植。對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行品系特異性的檢測是對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行監(jiān)督管理，保障其健康發(fā)展的重要技術(shù)基礎(chǔ)。而轉(zhuǎn)基因植物的外源插入片段的旁側(cè)序列是轉(zhuǎn)基因植物品系最重要的分子特征之一，因此，外源插入片段的旁側(cè)序列是建立轉(zhuǎn)基因植物品系特異性檢測方法的重要技術(shù)資料。目前己經(jīng)有部分專利和文獻(xiàn)報(bào)道了轉(zhuǎn)基因植物外源插入載體旁側(cè)序列，例如張大兵等人于2006年利用TAIL-PCR方法分析了玉米品系MON863的外源插入片段的旁側(cè)序列，建立了轉(zhuǎn)基因MON863玉米的品系特異性檢測方法，謝家建等人于2007年利用TAIL-PCR、genomewalking和LD-PCR等方法獲得了轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻、Bt油優(yōu)63和科豐6號的外源插入片段的旁側(cè)序列，并建立了品系特異性的檢測方法。然而，在對現(xiàn)有的專利和文獻(xiàn)的分析中發(fā)現(xiàn)，還沒有任何關(guān)于轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的外源插入片段的旁側(cè)序列的文章和專利報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容針對上述領(lǐng)域中的空白，提供了一種轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的外源插入片段的旁側(cè)序列。進(jìn)一步，本發(fā)明還提供該轉(zhuǎn)基因品系特異性的PCR檢測方法。一種轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的外源插入片段的旁側(cè)序列，所述旁側(cè)序列為5'端旁側(cè)序列，其特征在于5'端旁側(cè)序列如SEQIDN01所示。一種轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的外源插入片段的旁側(cè)序列，所述旁側(cè)序列為3'端旁側(cè)序列，其特征在于3'端旁側(cè)序列如SEQIDN02所示。5'端旁側(cè)序列的制備方法，其特征在于提取轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號植物基因組DNA，通過TAIL-PCR擴(kuò)增得到。3'端旁側(cè)序列的制備方法，其特征在于提取轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號植物基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增得到。轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的外源插入片段的旁側(cè)序列的定性PCR檢測方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)中的兩條引物組合為5'端旁側(cè)序列的特異性引物一條引物為依據(jù)SEQIDNOl中1-1110位序列設(shè)計(jì)的正向引物，另一條引物為依據(jù)SEQIDN01的1111-1747位序列設(shè)計(jì)的反向引物。所述正向引物為K8P1:5，-ATATTCTGAAGTGGCCTGTT-3，，所述反向弓I物為K8P2:5，-TAATAGCGAAGAGGCCCGCA畫3'。轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的外源插入片段的旁側(cè)序列的定性PCR檢測方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)中的兩條引物組合為3'端旁側(cè)序列的特異性引物一條引物依據(jù)SEQIDN02中l(wèi)-583位序列設(shè)計(jì)的正向引物，另一條引物依據(jù)SEQIDNO2的584-650位序列設(shè)計(jì)的反向引物。所述正向序列為K8P3:5'-TGCAAGTCCAGGGATGAAGA-3'，所述反向序列為G3-PI:5，-TTTATTTGTATAGTGGCGACC-3，。轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的外源插入片段的旁側(cè)序列定性PCR檢測方法，所述PCR反應(yīng)中同時(shí)含有下列引物，正向引物為K8P15，-ATATTCTGAAGTGGCCTGTT-3，，反向引物為K8P2:5'-TAATAGCGAAGAGGCCCGCA-3';正向序歹U為K8P3:5'-TGCAAGTCCAGGGATGAAGA-3，，反向序列為G3-P1:5'-TTTATTTGTATAGTGGCGACC陽3'。根據(jù)彭海英(彭海英.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)雙價(jià)抗蟲基因秈稻的獲得.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文.2003)報(bào)道的用于轉(zhuǎn)化的載體pCDMARUBAC-Hyg的結(jié)構(gòu)(見圖l)，用于轉(zhuǎn)化的目的基因(c^L4c基因和SCX基因)和選擇標(biāo)記基因(*堪因)位于兩個(gè)獨(dú)立的T-DNA區(qū)域，其結(jié)構(gòu)見圖l。其中一個(gè)T-DNA由選擇標(biāo)記基因/7/^基因表達(dá)盒組成；另一個(gè)T-DNA由oyL4c基因表達(dá)盒和SCK基因表達(dá)盒組成。本發(fā)明釆用常規(guī)方法，提取植物基因組DNA，利用TAIL-PCR分離法得到5'端旁側(cè)序列1755bp，其核苷酸序列如SEQIDN01所示。通過分析，該5'端旁側(cè)序列包括水稻基因組序歹ij，位于水稻ll號染色體(GenBank登記號AP008217)的13191855-13192963位，其核苷酸序列與SEQIDNO.l中從l-1110位的核苷酸序列完全相同；轉(zhuǎn)化載體pCDMARUBAC-Hyg部分序列，其核苷酸序列與SEQIDN0.1中1111-1747位的核苷酸序列完全相同；利用PCR擴(kuò)增得到3'端旁側(cè)序列650bp，其核苷酸序列如SEQIDN02所示。通過分析，該3，端旁側(cè)序列包括轉(zhuǎn)化載體pCUBAC-HYG部分序列，其核苷酸序列與SEQIDN0.2中的1-583位的核苷酸序列完全相同；水稻基因組序列，位于水稻ll號染色體(GenBank登記號AP008217)的13192994-13193060位，其核苷酸序列與SEQIDNO.2中從584-650位的核苷酸序列完全相同。轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的外源插入片段的旁側(cè)序列的定性PCR檢測方法，以5'端旁側(cè)序列和/或3'端旁側(cè)序列作為目的DNA擴(kuò)增片段。根據(jù)5'端旁側(cè)序列設(shè)計(jì)特異性引物，其正向引物可根據(jù)1-1110位的核苷酸序列設(shè)計(jì)，即是按照水稻基因組序列設(shè)計(jì)，位于水稻ll號染色體(GenBank登記號:AP008217)的13191855-13192963位，反向引物可根據(jù)1111-1747位的核苷酸序列設(shè)計(jì)，即是按照轉(zhuǎn)化載體pCDMARUBAC-Hyg部分序列設(shè)計(jì)，本發(fā)明設(shè)計(jì)的正向引物為K8P1:5，-ATATTCTGAAGTGGCCTGTT-3，，反向引物為K8P2:5'-TAATAGCGAAGAGGCCCGCA-3'。根據(jù)3'端旁側(cè)序列設(shè)計(jì)特異性引物，其正向引物可根據(jù)l-583位的核苷酸序列設(shè)計(jì)，即是按照轉(zhuǎn)化載體pCDMARUBAC-Hyg部分序列設(shè)計(jì)，反向引物可根據(jù)584-650位的核苷酸序列設(shè)計(jì)，即是按照水稻基因組序列，位于水稻ll號染色體(GenBank登記號AP008217)的13192994-13193060位，本發(fā)明設(shè)計(jì)的正向序列為K8P3:5，-TGCAAGTCCAGGGATGAAGA-3，，反向序列為G3-Ph5'-TTTATTTGTATAGTGGCGACC-3，。本發(fā)明首次克隆了轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的外源插入片段的旁側(cè)序列，并且明確了轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的外源插入片段的旁側(cè)序列可以用作目的DNA擴(kuò)增片段，建立靈敏、特異性的轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的品系特異性定性、定量PCR檢測。本發(fā)明所克隆、分離的外源插入片段的旁側(cè)序列可以進(jìn)一步用于建立轉(zhuǎn)基因品系特異性PCR檢測方法。圖1pCDMARUBAC-Hyg的T-DNA結(jié)構(gòu)示意圖，圖2科豐8號5'端邊界TAIL-PCR擴(kuò)增圖譜，M:DNAMarkerDL2000,大小依次為2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp;1，3，5，7,9:引物AD2AD6的TAIL-PCR第二級擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物；2，4，6，8，10:引物AD2AD6的TAIL-PCR第三級擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物圖3科豐8號3'端旁側(cè)序列PCR擴(kuò)增圖譜，M:DNAMarkerDL2000;1:引物組合G3-P1/Cptl-pl擴(kuò)增，圖4轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的5'端旁側(cè)序列特異性引物K8P1/K8P2檢測，M:markerDL2000;1,2:轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號；3,4:對照明恢86，圖5轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的3'端旁側(cè)序列特異性引物K8P3/G3-P1檢測。M:markerDL2000;1,2:轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號；3,4:對照明恢86。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例l轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的外源插入載體的旁側(cè)序列的克隆一、，實(shí)驗(yàn)材料1、植物材料轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號。2、酶與試劑分子生物學(xué)試劑，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker購自大連寶生物生物工程有限公司。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。3、實(shí)驗(yàn)儀器PCR擴(kuò)增儀EppendorfMastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸電泳儀DYY-m型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)DNA測序儀(AppliedBiosystem377型全自動熒光序列分析儀)DNA電泳分析系統(tǒng)KodakEDAS290(Kodakco.)其它儀器包括離心機(jī)，恒溫加熱板，電子天平，培養(yǎng)箱等。二、實(shí)驗(yàn)方法和過程1、水稻基因組DNA提取與檢測1)水稻基因組DNA的提取取苗期水稻葉片做為DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout試劑盒(天澤基因公司)的操作手冊，進(jìn)行水稻材料總DNA的提取。2)水稻基因組DNA檢測取5n展取的DN—Al液，以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)其亮度和帶型來初步判斷提取DNA的質(zhì)量。采用紫外分光光度計(jì)測定所提取的DNA的濃度和純度。2、科豐8號旁側(cè)序列的分離1)TAIL-PCR分離科豐8號5'端旁側(cè)序列TAIL-PCR用于擴(kuò)增己知區(qū)域的側(cè)翼序列。根據(jù)科豐8號T-DNA邊界區(qū)域設(shè)計(jì)三個(gè)巢式特異性PCR引物P1、P2和P3，依次與5個(gè)簡并引物AD2AD6分別組合進(jìn)行三次PCR擴(kuò)增，引物序列見表l。PCR反應(yīng)條件見表2。表l用于TAIL-PCR擴(kuò)增的簡并引物和特異性引物primerssequencePl5，-CATCTTCACTCGGTAACATCG-3'P25，-GAGTTCATTCCAGTTACTGCAAC-3'P35'-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3'AD25'-AGTGNAGAANCAAAGG-3'AD35'-CATCGNCNGANACGAA-3，AD45，陽TG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(G/C)AGA-3，AD55，-TCGTNCGNACNTAGGA-3'AD65，-NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT-3，表2TAIL-PCR反應(yīng)程序和條件<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2)科豐8號3'端旁側(cè)序列的分離根據(jù)已測定的科豐8號5'端旁側(cè)水稻基因組序列，在其下游設(shè)計(jì)引物G3-P1(序列為5言隱TTTATTTGGATAGTGGCGACC-3'，載體序列中SC《基因上的引物(序列為Cptl-pl:5'-AAAATGAAGAGCACCATCTTC-3，)組合進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系0.25(xLrTaq(5U/nL)，5pL10xPCRBuffer(Mg2+Plus),4nLdNTP(各2.5mM)，引物各2pL(10nM)，模板各2^iL(20ng爾L)，加滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積至50pL，擴(kuò)增程序94。C預(yù)變性4min;94。C變性30sec,55。C退火30sec，72'C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；72。C10min。3、序列測定和分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳，采用QIAquickGelExtractionkit回收擴(kuò)增片段，連接到pGEM-Teasy(Promega,Madison,Wis.),采用ABIPRISM1300GeneticAnalyzer進(jìn)行序列測定。采用vectorNTI0.0(Invitrogen)比較和分析測定的序列與載體序列相似性，在NCBI數(shù)據(jù)庫(http:Wwww.ncbi.nlm.nih.gov/)中用BLASTN檢索相似的水稻基因組序列。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、科豐8號的5'端旁側(cè)序列科豐8號T-DNA邊界的TAIL-PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，6個(gè)AD引物中只有AD5的第二、第三級擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶單一，且片斷大小相近(圖2)?；厥誂D5的第三級擴(kuò)增片段，連至ljpMD18-T載體上，進(jìn)行序列測定。序列測定結(jié)果表明，擴(kuò)增片段長度為1747bp，其中1-1110位為水稻基因組序列，位于水稻ll號染色體(GenBank登記號AP008217)的13191855-13192963;1111-1747位為轉(zhuǎn)化載體pCDMARUBAC-Hyg部分序列。2、科豐8號的3'端旁側(cè)序列利用G3-Pl/Cptl-pl組合PCR擴(kuò)增得到了特異性的擴(kuò)增，見圖3。序列測定表明，擴(kuò)增片段長度為650bp，其中l(wèi)-583位為轉(zhuǎn)化載體pCUBAC-HYG部分序列，584-650位為水稻基因組序列，位于水稻ll號染色體(GenBank登記號:AP008217)的13192994-B193060位。實(shí)施例2基于轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的外源插入片段旁側(cè)序列的定性PCR檢測方法一、實(shí)驗(yàn)材料1、植物材料轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號。常規(guī)水稻明恢86。2、酶與試劑分子生物學(xué)試劑，如dNTPs、TaqDNA聚合酶、DL2000Marker購自大連寶生物生物工程有限公司。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。3、實(shí)驗(yàn)儀器PCR擴(kuò)增儀EppendorfMastercyclegradient(Eppendorfco.)核酸電泳儀DYY-III型核酸電泳儀(北京六一儀器廠)DNA電泳分析系統(tǒng)KodakEDAS290(Kodakco.)其它儀器包括離心機(jī)，恒溫加熱板，電子天平，培養(yǎng)箱等。二、實(shí)驗(yàn)方法和過程1、植物基因組DNA提取與檢測見實(shí)施例1中的"植物基因組DNA提取與檢測"2、基于5'端和3'端旁側(cè)序列的品系特異性PCR檢測根據(jù)實(shí)施例1中測定的5'端和3'端旁側(cè)序列，分別在其水稻基因組序列部分和轉(zhuǎn)化載體序列部分設(shè)計(jì)引物，見表8。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的5'端和3'端擴(kuò)增引物組合分別得到了預(yù)期的207bp和278bp的擴(kuò)增片段，而對照明恢86號均沒有相應(yīng)的擴(kuò)增片段，見圖4和圖5。表8科豐8號品系特異性PCR檢測引物<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>DOLLOmLVI漲VIOLLV0013IZ，3簡V1L0LT9S3JD0130V丄V照:)WOLV009VI8T簡imx)盟3VOLL33VJD19V，丄麗I■aim，mi0WD9D33V。W:mLVO丄VV艦V皿簡V3WOL丄WJiDWlL30LV0麗丄1891藩皿V:)V1LV，OL03W丄麗V3環(huán)333VWWJAOLW13OmiMl麗W腦層1LVmniV!3皿OLLL眉JOmiaiLL0V道皿W腦I9SI{nmOT/3磨丄，maiv，vmi3Dw:)層odilwoovoom腦:raiiLvoaL3vjdvtovjdnxmm)丄omi)v:djdovoo層aimv網(wǎng)i附vodv飄vv丄mm)vaii)v:mDVoo麗丄mooooovai:)vooauim)腦V3000W1D0OLLDW扁OOOWOSO還00000VW0D90IOD3W3D0OD脂3000VD3VWV丄OLL00V03V,:mLLimMBD0WmiLL3V麗3090W腦oammivoododvwdoddotodviivrmiDmmm。oaLra腦TOiLODvv:imm)vamamuvoovioidoloowidowdolvoiolwiw3V03WV000D09W。潔VILLO翻丄XGDVOOOLV3WOLV:m)JDV3V30L3318013VOIOLV丄WV39WOD0丄V丄W環(huán)OL兩lLVili)丄3090房01OLLV丄WWV1201nUV房丄ViLDOV丄OLIDTOWOili)lL麗:)通V3DJAOTO0V。V3丄196■V1LV\0丄W;H)環(huán)VOL00皿33V丄V:miIi)ILMiLOOVVDCGV環(huán)VI06。1L33V皿300D丄OMV麗層OO飄V，l3爾觀VD3VWDOLL00I粉1LL3DV環(huán)，眉D9OL3V腿WVJ0L3I1LV13WOLLLW丄nM，丄I8Z1DVOLW:iLL1LWf)V纖V30V丄VJDWWiLLVJiBL腦1L0DW腿VWDOL似JOLV19皿0LL麗I1L層丄WOLL丄V薦1LD層LL3V3VVODWOOD199麗amDVJOIOLWJi)V眉OLLW簡丄V節(jié)層1LDLLVD磨iLD109aL葡m)waDW丄w丄麗m)v飄wroiavooauoLilllxolv:)恥W30麗3VOLV。丄V環(huán)W譜:MWIXOODWOL30iD0V30JD簡徵微。woooai3丄axmuooD窗:mv丄v簡ioov:)丄w層idv丄wiov皿湯1D139W1L皿V30VWIO葡層W1LLKMI3VWD0飄V1LLL0LW3艦DOLLLDOLV:HD丄DOLLliOLOLLV0VODV00001LLOLL3030iOLLOLOLDI0￡,m)V390W90Qlv:)ioon)wooaom)雨cmvDO麗9DDmaii)恥丄。麗OLLL。V3DV1LLV:)DTOVWWV3DJ1LLDV麗丄V丄DOL1DW:DW丄181ILLLLL菌丄W1LV,麗1LLLLLiLLW30VLLV環(huán)層丄丄VOLD3V3DV盟UVJOL099VVODOWW09TOLOimL雨303W09OLKmLVJD麗OLLDiL019JDDD麗3VilDVJDV，OmLOLLD30V廂V1LVOLLW130V1L菌環(huán)I(dqwi)，纖<S:IONCIl03S峯,:柳vw層mviovocmLDaivuvovtovooolwOLmiAODVOD丄W,L1)0，V0LV1L丄ViliIMLV30LW環(huán)3。細(xì)W1LD3V!LWDJJi)JOLILW丄V丄菌JIV。丄V000LOL000VOLL麗JLL3助兩丄VVDOOiLLO/W3iLIi)aLVf)VD9WOL。V3。WOLTODIDWOL潔V戮VOLV9W。丄V0D0V3OL0W301DOLLLV。道環(huán)。im)imii!L。WODOVDDDJLW3丄環(huán),雨ooim)aDvaLm)ilwolloov:mlv。磁ollvodolwV3而X3V3313丄V30LV:)1LVD0ODOLVODWDVOLL，V0iiaLDVaiD菌OLVOLV。纖3W0!D130V:)丄V309V3OL3V丄OLL30LLLJLOVJilimLaLamm/vViLLIimiLVOD30腦:maqloov33vau:mif)iLmDiuaomLLD皿vom(ciq0S9):師酷<S雖0I/6憲法能改0'mSS謝800Z<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>權(quán)利要求1.一種轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的外源插入片段的旁側(cè)序列，所述旁側(cè)序列為5’端旁側(cè)序列，其特征在于5’端旁側(cè)序列如SEQIDNO1所示。2.—種轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的外源插入片段的旁側(cè)序列，所述旁側(cè)序列為3'端旁側(cè)序列，其特征在于3'端旁側(cè)序列如SEQIDN02所示。3.權(quán)利要求1所述的旁側(cè)序列的制備方法，其特征在于提取轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號植物基因組DNA，通過TAIL-PCR擴(kuò)增得到。4.權(quán)利要求2所述的旁側(cè)序列的制備方法，其特征在于提取轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號植物基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增得到。5.轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的外源插入片段的旁側(cè)序列定性PCR檢測方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)中的兩條引物組合為權(quán)利要求1所述旁側(cè)序列的特異性引物一條引物為依據(jù)SEQIDNO1中1-1110位序列設(shè)計(jì)的正向引物，另一條引物為依據(jù)SEQIDNO1的1111-1747位序列設(shè)計(jì)的反向引物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，所述正向引物為K8P1:5'-ATATTCTGAAGTGGCCTGTT-3'，所述反向引物為K8P2:5'-TAATAGCGAAGAGGCCCGCA-3'。7.轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的外源插入片段的旁側(cè)序列定性PCR檢測方法，所述PCR反應(yīng)中的兩條引物組合為權(quán)利要求2所述旁側(cè)序列的特異性引物一條引物依據(jù)SEQIDN02中l(wèi)-583位序列設(shè)計(jì)的正向引物，另一條引物依據(jù)SEQIDNO2的584-650位序列設(shè)計(jì)的反向引物。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，所述正向序歹iJ為K8P3:5，-TGCAAGTCCAGGGATGAAGA-3'，所述反向序列為G3-P1:5，-TTTATTTGTATAGTGGCGACC-3'。9.轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐8號的外源插入片段的旁側(cè)序列定性PCR檢測方法，所述PCR反應(yīng)中同時(shí)含有下列引物，正向引物為K8P1:5，-ATATTCTGAAGTGGCCTGTT-3，，反向引物為K8P2:5，-TAATAGCGAAGAGGCCCGCA-3，；正向序列為K8P3:5'-TGCAAGTCCAGGGATGAAGA-3，，反向序列為G3-P1:5，-TTTATTTGTATAGTGGCGACC-3'。全文摘要本發(fā)明涉及“一種轉(zhuǎn)sck/crylAc雙價(jià)抗蟲基因水稻品系科豐8號外源插入片段旁側(cè)序列及應(yīng)用”，屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。5’端旁側(cè)序列如SEQIDNO1所示，3’端旁側(cè)序列如SEQIDNO2所示。利用該旁側(cè)序列設(shè)計(jì)特異性引物用于目的DNA擴(kuò)增，能建立靈敏、特異性的水稻品系科豐8號的品系特異性定性、定量PCR檢測。文檔編號C12N15/10GK101413005SQ20081022572公開日2009年4月22日申請日期2008年11月10日優(yōu)先權(quán)日2008年11月10日發(fā)明者彭于發(fā),王奕海,王錫鋒,謝家建申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所