專利名稱：二酯化合物的化學(xué)選擇性酶水解以制備單酸單酯化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從二酯衍生物合成4-羧曱基-2-烷氧基苯曱酸 (4-carboxymethyl-2-alkyloxybenzoic acid )》克基酉旨書亍生4勿的方法。更特別地，是制備4-羧曱基-2-乙氧基苯曱酸乙酯，它是工業(yè)生產(chǎn)用于治療糖尿病的藥物活性成分瑞才各列奈 (repaglinide )的關(guān)4建合成中間體。瑞格列奈
背景技術(shù)：
現(xiàn)有4支術(shù)公開的作者為P. MUller等人發(fā)表在J. Med. Chem.， 1998, 41 (26), P.5219的文章，其描述了合成4 -羧曱基-2 -乙 氧基苯甲酸，乙酯的方法，其特征是相應(yīng)二酯衍生物的選4奪性水解 反應(yīng)。
選4奪性水解反應(yīng)是在乙醇中在25。C并有強石威，例如氫氧化鈉水 溶液的條件下進(jìn)4亍的。
該方法用于工業(yè)應(yīng)用的限制是形成不可忽略量的副產(chǎn)物，特別 是難于除去的二酸化合物，需要幾次萃取和洗滌處理，或幾次再結(jié) 晶從而分離產(chǎn)品，且最終目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量低。
而且，現(xiàn)有4支術(shù)沒有iJt明用相應(yīng)二酯化合物的化學(xué)選才奪性酶水 解反應(yīng)制備包括在芳香環(huán)上的酯官能團(tuán)(ester function)的苯乙酸 (phenylacetic acid ) 4匕合4勿的4壬4可方〉去。
特別地，現(xiàn)有^支術(shù)沒有說明化合物上苯乙酸的酯官能團(tuán)相對苯 甲酸的酯官能團(tuán)在包括這兩個功能團(tuán)的化合物上的化學(xué)選擇性酶 K解方法。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的
本發(fā)明的主要目的是解決新的技術(shù)問題，該技術(shù)問題涉及提供 用于制備4-羧曱基-2-乙氧基苯曱酸乙酯，同時避免形成副產(chǎn)物并增 加產(chǎn)量的殺斤方法。本發(fā)明的另一個主要目的是解決新的技術(shù)問題，該新的技術(shù)問
題涉及以最小^:生產(chǎn)成本的方式l是供該壽斤方法。
本發(fā)明的另一個主要目的是按照一種新方法來解決上述新問 題，該新方法能夠以與藥物生產(chǎn)相稱的工業(yè)量和質(zhì)量制備所述合成 中間體。
具體實施例方式
發(fā)明概要
本申請人現(xiàn)在開發(fā)了合成如下定義的分子式(i)的化合物的新 方法。
更具體地，該方法是按照下面示意圖A進(jìn)4亍的
示意圖A
(II ) ( I )
其中Rl, R2和R3相同或不同，分別并獨立地表示》克基基團(tuán)。
4安照一個具體實施例，每個基團(tuán)Rl, R2和R3同時是相同的， 有利地是乙基。
在本發(fā)明中，分子式(I)的化合物是通過兩個酯官能團(tuán)中的一 個酯官能團(tuán)的化學(xué)選擇性酶水解反應(yīng)獲4尋的。
按照本發(fā)明方法的特征是酶水解反應(yīng)，其包括使分子式(II) 的化合物與酶接觸，從而獲得分子式(I)的化合物，該酶〗又化學(xué)選 擇性水解分子式(II)的化合物的兩個酯官能團(tuán)中的一個。在本發(fā)
7明中，為了制備瑞格列奈，對中間體的位置4的酯官能團(tuán)進(jìn)行化學(xué)選擇性水解。
按照該方法的另 一個有利的實施例，酶水解反應(yīng)是在存在有機助溶劑或者沒有有機助溶劑的情況下在pH值受控制的溶液中進(jìn)行的。在反應(yīng)過程中，控制溶液pH值以〗更酶活性不受該值影響，具體而言，反應(yīng)過禾呈中，該pH值4呆持在6和8之間。
按照該方法的又一個有利實施例，為了制備合成瑞^"列奈的中間體，酶水解反應(yīng)是在通過^f吏用緩沖溶液進(jìn)行控制的受控的pH值下進(jìn)行的，該緩沖溶液是基于磷酸鹽，^碳酸鹽或石克酸鹽的水溶液，pH值控制在6和8之間。更一般地，緩沖溶液的pH值不影響所用酶的活性。
特別地，緩沖溶液是pH值約等于7.2的水溶液。
按照本發(fā)明一個具體實施例，該1￡沖水溶液可通過<吏用基于磷酉交鹽，,友酸鹽或石克酸鹽的7jc溶液來獲^尋，其初始pH^f直調(diào)節(jié)在6和8之間。這樣的緩沖水溶液商業(yè)上可獲得。
按照一個實施例的變型，使用特別基于磷酸鉀的初始pH值約為7.2的緩沖水溶液。
*按照本發(fā)明另 一個特定實施例，該方法特4正為通過添力。強石咸如石咸金屬的氫氧化物或醇鹽的水溶液，在方法過程中控制pH值維持在6和8之間。
強堿溶液的濃度(normalit6,當(dāng)量濃度)要實現(xiàn)pH值的令人滿意的調(diào)節(jié)，使得能夠保持酶的活性。按照一個有利的實施例，為了確保保持酶活性并避免在制備瑞才各列奈中具體在位置1的第二酯官能團(tuán)的顯著水解，通過添加強石咸，如石威金屬的氫氧〗匕物或醇鹽實3見反應(yīng)介質(zhì)pH 4直的纟空制。
優(yōu)選地，pH值的控制是通過添加氫氧化鈉卩容液，更具體是氫氧化鈉水溶液執(zhí)行的。堿溶液的濃度要實現(xiàn)pH值的令人滿意的調(diào)節(jié)，使得能夠保持酶活性。
4安照本發(fā)明該方法的 一個有利實施例，其特4正為酶水解反應(yīng)是在l(TC到70。C之間的溫度，優(yōu)選在約45。C進(jìn)4亍。
按照本發(fā)明另一個有利實施例，起始物質(zhì)的初始濃度在1 kg/1和50 g/1之間，并優(yōu)選在500 g/1和50 g/1之間，且初始濃度非常優(yōu)選在約400 g/l。
更一般地，起始物質(zhì)的初始濃度有利地在基本最大值，以便既提供產(chǎn)物在所選溶劑中的溶解性又不削弱酶活性。
在用來實現(xiàn)選擇性酶水解的酶中，包括脂肪酶，酯酶，蛋白酶，固定化脂肪酶(chirazymes ),和胰酶。
所用的酶可以是固體形式，在溶液中，在懸浮液中或在惰性載體上固定^f匕。
可以以商業(yè)購買的形式直^妾使用酶，或提純后使用。
示例性的而非限制性的，本發(fā)明中可使用的酶是從脂肪酶中選擇的，脂肪酶是從曲霉菌(Aspergillus)(黑曲霉(Aspergillus niger )，蟲奪蜜曲霉(Aspergillus melleus)， 宇佐美曲霉(Aspergillus usamii))獲得的，乂人才艮霉(Rhizopus )(米才艮霉(Rhizopus oryzae )，雪白才艮霉(Rhizopus niveus ),才艮酵菌(Rhizopus sp.)， 爪口圭才艮審(Rhizopus
9javenicus ), Rhizopus delegar， 戴爾才艮霉(Rhizopus delemar ))荻得的，乂人青霉菌(婁地青霉(Penicillium roquefortii),卡門柏青霉(Penicillium camembertii), 圓弧青霉(Penicillium cyclopium ))獲得的，從毛霉(凍干的或承載的米黑毛霉(Mucor miehei)(固定化月旨肪酶L9), 爪哇毛霉(Mucor Javanicus )， Mucor Javenicus )獲得的，從，i絲酵母(南極々支絲酵母(Candida antarctica), A型凍干的或承載的南極假絲酵母(固定化脂肪酶L5 ), B型凍干的或承載的南極假絲酵母(固定化脂肪酶L2)，圓柱念珠菌(Candidacylindraceae),解脂假絲酵母(Candida lipolytica),鈹褶作i絲酵母(Candida mgosa))獲得的，^M叚單胞菌(Pseudomonas)(熒光W支單月包菌 (Pseudomonas fluorescens )， 洋蔥假單胞菌 (Pseudomonascepacia), 纟錄膿片干菌 (Pseudomonas aeruginosa), 施氏作支單月包菌(Pseudomonas stutzed )，布I單月包菌物種)獲4尋的，/人產(chǎn)石威讒干菌(Alkaligenes )(產(chǎn)石成桿菌物種)獲得的，乂人腐質(zhì)霉(Humicola )(柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa ),柔毛腐質(zhì)霉脂肪酶(Humicola sp.Lipase ))獲4尋的，乂人;也絲菌(Geotrichum )(白i也霉(Geotrichumcandidum))獲得的，從胰腺(山羊胰腺，豬胰&泉)獲得的，從無色才干菌(Achromobacter )(無色才干菌沖勿種(Achromobacter sp.))獲得的，/人嗜熱真菌(Thermomyces )(棉毛嗜熱真菌(Thermomyceslanuginosus))獲得的，和從伯克霍爾德菌(Burkholderia)(洋蔥伯克霍爾《急菌(Burkholderia cepacia ))獲4尋的。
在其他脂肪酶中，還包括，示例性的而非限制性的，脂肪酶F14，脂肪酶FIO,脂肪酶F12，脂肪酶Al,脂肪酶F7，脂肪酶F13,月旨^r^F8，月旨^r,F2，月旨^r^F3， Amano 6,月旨^^AP15，月旨^r,F, Amano 50,月旨*^ G，月旨^i^F4，月旨Wi^F6,月旨^r^Bl，月旨肪酶PS-D1,脂肪酶PS-C2，脂肪酶1,脂肪酶1 ，脂肪酶2， Euroform脂肪酶4，脂肪酶4，脂肪酶6，脂肪酶7，脂肪酶10,脂肪酶ll,脂肪酶12,脂肪酶13,脂肪酶14,脂肪酶15,脂肪酶18,脂肪酶20，月旨肪酶PGE， Ap-6和麗〉皮月旨肪酶(LipoIase)。
作為非限制性例子中，本發(fā)明也可以4吏用從酯酶，豬肝酯酶(PLE)，阿魏酸酯酶，帕羅西汀(paroxetine)酯酶和皺褶々i絲酵母酯酶中選4奪的酶。
作為非限制性例子，本發(fā)明也可以使用從下列酶中選^^的酶，即蛋白酶，乂人《連霉菌(灰色《連霉菌(Streptomyces griseus ),嗜熱4連王求菌(Streptomyces serine ))、枯草桿菌蛋白酶、(枯草溶菌素(Subtilisin carlsberg ))，沖干狀菌(芽孑包4干菌(Bacillus sp.),豆形才干菌 (Bacillus lantus ),月旨肪嗜熱芽孑包 一干菌 (Bacillusstearothermophilus ))和番木瓜屬(番木瓜(Carica papaya))的混合物中獲得的酶。
作為非限制性例子，4安照另一個實施例變型，也可以〗吏用/人固定化脂肪酶，固定化脂肪酶L-8，固定化脂肪酶L-2，固定4匕脂肪酶L-2，固定化脂肪酶L-5，固定化脂肪酶L-10和固定化脂肪酶E1中
選擇的酶。
作為非限制性例子，4姿照另一個實施例變型，也可以4吏用乂人另——類酵中選才奪的酵，即Deamizye 50000,月夷酵，Depol ( Depol 222P,Depol454P, Depol 39， Depol 112L， Depol40L， Depol 165L, Depol239P, Depol260P， Depol 333P, D印ol276P, Depol 39P )， Promod(Promod215P， Promod 31L， Promod 192P, Promod 144P, Promod194P ), Combizyme( Combizyme 261P， Combizyme 274P, Combizyme108， Combizyme 23, Combizyme 209 ), Flavopro ( Flavopro 192P，F(xiàn)lavopro 373P， Flavopro 373P(X) ), Macer8 ( Macer8 O, Macer8 R，Macer8 W, Macer8 FJ ),果月交酶(Pectinase )(果月交酶62L,果月交酶444L)， Lipomod 29P ， 肽酶433P (Peptidase 433P)，月旨氧酶(Lipoxygenase ) L583P,纖維素酶(Cellulase ) 13L,氨基酰4匕酶
(Aminoacylase),漆酶(Laccase ) L603P,乳糖酶(Lactase ) L017P，半纖維素酶(Hemicellulase) 344P, TP599P， SP398,復(fù)合多泮唐酶
(Viscozyme L )，木聚糖酶(Shearzyme ) 500L， Ultrazyme AFP-L，Peelzyme 1, Ultroflo L， Ultroflo L C809， SP525,才對脂清除酶
(Resinase ) A和Validase TR。
這些酶可/人下列司購買，即Sigma ， Amano , Europa,Biocatalysts， Boehringer， Novo-Nordisk， Biotal, Enzymatix, Fluka，Genecore, Novozymes等。
作為非限制性例子，按照另一個實施例變型，也可在本發(fā)明方
法中^f吏用測-汰的商業(yè)酶，固定4匕圓柱念J朱菌(Candida cylindracea)(Sigma),固定化B型南才及，I絲酵母(Candida Antarctica B)或
Novozyme 435 (Novozymes), 固定化米黑毛霉(Mucor miehei )(Fluka),固定化洋蔥々支單月包菌(Pseudomonas cepacia)或PSD1(Amano ),門多薩邗殳單月包菌(Pseudomonas menodicina )或Lumafast(Genecore )， 疏毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginose )或麗波月旨肪酶(Lipolase),黑曲霉或AP6 (Amano),卡門柏青霉(Peniciliium
camembertii )或月旨酵G(Lipse G)( Amano ),麥芽(Wheat germ( Fluka ))
或雪白根霉。
優(yōu)選，所選的酶是脂肪酶，如具體地，乂人B型南4及-底絲酵母獲的酶，{列^口/人Novozymes 乂>司購買的Novozyme 43 5 。
按照本發(fā)明另一個實施例，所用的酶的量與底物的量的比(表示為重量/重量值)(E/S比)在1/10000和20/100之間，并優(yōu)選在1/1000和5/100之間。
12」換照本發(fā)明又一個實施例，酶濃度可以在0.001 g/1和100 g/1 之間，并^尤選在1 g/1和10 g/1之間。
按照特定實施例變型，酶溫育時間在10分鐘到4天之間，并 優(yōu)選在0.5和24小時之間。
按照本發(fā)明又一個特定實施例變型，單獨或作為混合物可選使 用的有機助溶劑可以是，^旦不限于亞石風(fēng)，如二甲亞石風(fēng)(DMSO)，腈， 如乙腈，醇，如乙醇，^又丁醇或異丙醇(IPA)，氨基4匕合物，如二 甲基甲酰胺(DMF),醚，如乙醚，碳?xì)浠衔铮缂和?，或芳?力矣4b合物，^口曱苯。
助溶劑的濃度可以在0.01%到30%之間。
一旦在反應(yīng)過程中被除去，酶可再次在本發(fā)明方法中使用。
更一般地，酶使用的循環(huán)次數(shù)可在1次到5次之間，優(yōu)選在1 ;欠到3 ;欠之間。
為了幫助理解，基團(tuán)、試劑、溶劑或產(chǎn)品的術(shù)語是國際術(shù)語或 本領(lǐng)域才支術(shù)人員通用術(shù)語。
術(shù)語"烷基，，表示1到IO個碳原子構(gòu)成的線性或支鏈烷基鏈。
術(shù)語"烷氧基(alkoxide,醇鹽)"表示1到10個碳原子形成 的線性或支鏈烷氧基基團(tuán)。術(shù)語"堿金屬"表示鈉或鉀原子。
本發(fā)明的其他目的，特征和優(yōu)點可從下面參考本發(fā)明幾個實施 例的解釋性說明中明顯看出，這幾個實施例僅示例性給出，而非對
本發(fā)明范疇^:任何限制。
在實施例中，除非另外指出，百分?jǐn)?shù)都是重量百分?jǐn)?shù)，溫度是 攝氏溫度，壓力是大氣壓。
為了幫助理解，所用產(chǎn)品的術(shù)語是國際術(shù)語，且試劑或溶劑的 術(shù)語都是本領(lǐng)域^支術(shù)人員通用的。
本發(fā)明實施例1: 4-羧曱基-2-乙氧基苯曱酸乙酯的制備
分子式(I)的化合物，其中R是乙基。
月旨肪酶Novozyme435。
緩沖溶液0.2M的磷酸鉀水溶液，pH值7.2。 酶用量為10mg。
反應(yīng)是1 ml的量在4 ml玻璃燒瓶中密封進(jìn)行的。
通過相對所用起始物質(zhì)的量調(diào)整緩沖溶液容積，反應(yīng)容積被設(shè) 定為1 ml。
反應(yīng)是在45。C進(jìn)^f亍的。
實施例la): 50 mg 二酯(濃度50 g/1 )。
反應(yīng)1小時50分鐘后，獲得100%的轉(zhuǎn)化率。
14實施例1 b ): 100 mg 二酯(濃度100 g/1 )。 反應(yīng)2小時50分鐘后，獲得100 %的轉(zhuǎn)化率。 實施Y列1 c ): 200 mg 二酉旨(；農(nóng)度200 g/1 )。 反應(yīng)3小時50分鐘后，獲得80%的轉(zhuǎn)化率。 本發(fā)明實施例2: 4-羧曱基-2-乙氧基苯曱酸乙酯的制備 分子式(I)的化合物，其中R是乙基。 月旨肪酶No雨yme435。
纟爰沖溶液0.1 M的石粦酸鉀水溶液，pH值7.2。 pH值控制2.5 M NaOH水溶液。
反應(yīng)在100ml玻璃燒瓶中密封進(jìn)行的。在10ml磷酸鹽緩沖液 中力口入3.86 g ( 13.8 mmol) 二酯，并力口入0.2 g酶。
^質(zhì)凈皮力口戎A至)j 45°C。
通過有^見則地加入氫氧化鈉〉容液4巴pH值保持在7.2。
反應(yīng)1小時35分鐘后，獲得100%的轉(zhuǎn)化率。
過濾除去介質(zhì)中的酶。溫水洗滌沉積物。收集濾液，并且濾液 用20%的鹽酸(HC1)溶'液酸4b，直到pHj直為3.5。
攪動介質(zhì)然后在冰浴中冷卻1小時。形成的沉淀被濾去，然后 在45'C干燥，直到重量恒定。所獲得的產(chǎn)物是白色固體。
產(chǎn)量定量的 純度99.3%。
本發(fā)明包括構(gòu)成上述方法等效手段的所有方法及其不同組合。 根據(jù)以上包括實施例的描述，相對現(xiàn)有技術(shù)新穎的任何技術(shù)特征, 以其功能并作為一^:方法，構(gòu)成本發(fā)明的組成部分。
權(quán)利要求
1.根據(jù)下面示意圖A合成分子式(I)的化合物的方法示意圖A其中R1，R2和R3相同或不同，分別獨立表示烷基基團(tuán)，其特征在于，一種酶水解反應(yīng)包括將分子式(II)的化合物與酶接觸，所述酶僅對分子式(II)的化合物的兩個酯官能團(tuán)中的一個進(jìn)行化學(xué)選擇性水解，以便獲得所述分子式(I)的化合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述水解反應(yīng)是在 有或沒有有才幾助溶劑的情況下，在pH值受控制具體地通過利 用緩沖溶液控制的溶液中進(jìn)行的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所使用的酶選 自月旨肪酶、酯酶、蛋白酶、固定化脂肪酶和月夷酶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l、 2和3中任一項所述的方法，其特征在于， 所-使用的酶是脂肪酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項所述的方法，其特征在于，所使 用的酶以固體形式、或以溶液、或以懸浮液、或以固定在惰性 載體上的形式存在。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項所述的方法，其特征在于，所選 的酶可以商業(yè)購買的形式直接使用或在^是純后使用。
7. 根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，在反應(yīng)過 程中控制所述pH值，以便所述酶的活性不受該pH值影響， 具體地，該pH值在反應(yīng)過程中被保持在6到8之間。
8. 々艮據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其特4正在于，所選酶的 循環(huán)使用的次數(shù)在1到5之間。
9. 才艮據(jù)前述4壬一項4又利要求所述的方法，其特;f正在于，所4吏用的 酶的量與底物的量的比(E/S比)以重量/重量Y直表示在1/10000 到20/100之間，并優(yōu)選在1/1000到5/100之間。
10. 才艮據(jù)前述4壬一項一又利要求所述的方法，其特4正在于，所述起始 4勿質(zhì)的詳?shù)?臺^農(nóng)度在1 kg/1到50 g/1之間。
11. 才艮據(jù)前述任一項一又利要求所述的方法，其特;f正在于，所述酶水 解是在10。C到70。C之間的溫度進(jìn)4亍的。
12. 根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng) 介質(zhì)的pH值的控制是通過添加強堿，特別是堿金屬氫氧化物 或醇鹽實if見的。
13. 才艮據(jù)前述任一項片又利要求所述的方法，其特4正在于，沒有有枳j 助》容劑。
14. 根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，每個基團(tuán) Rl、 R2和R3同時是乙基。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1到14中任一項所述的方法，其特征在于，所 使用的酶是從B型南極假絲酵母獲4尋的脂肪酶。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1到15中任一項所述的方法，其特征在于，緩 沖〉容液是pH值在6到8之間的基于磷酸鹽、碳酸鹽或石克酸鹽 的水溶液，特別是基于》粦酸鉀的水:容液。
17. 才艮才居一又利要求14、 15和16中任一項所述的方法，其凈爭4i在于， 所述纟爰沖溶液的初始pH值為約7.2。
18. 根據(jù)權(quán)利要求14到17中任一項所述的方法，其特征在于，所 述反應(yīng)溫度優(yōu)選為約45°C。
19. 根據(jù)權(quán)利要求14到18中任一項所述的方法，其特征在于，所 述分子式(II)的起始物質(zhì)的初始濃度為約400g/l。
20. 根據(jù)權(quán)利要求14到19中任一項所述的方法，其特征在于，所 述pH是通過添加強石威水溶液，特別是氫氧4匕鈉水溶液來控制 的。
21. 根據(jù)權(quán)利要求14到20中任一項所述的方法，其特征在于，酶 的量在1 g/l到10g/l之間。
22. 根據(jù)權(quán)利要求14到21中任一項所述的方法，其特征在于，所 述分子式(I)的化合物用作用于制備瑞格列奈的合成中間體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種合成方法。該方法涉及按照右面示意圖A合成分子式(I)的化合物，其中R1，R2和R3可以相同或不同，分別獨立表示烷基基團(tuán)，其特征是一種酶水解反應(yīng)，包括將分子式(II)的化合物與酶接觸，該酶僅化學(xué)選擇性水解分子式(II)的化合物的兩個酯官能團(tuán)中的一個，以便獲得分子式(I)的化合物。本發(fā)明允許工業(yè)制備分子式(I)的中間體，該中間體可用于制備藥物活性成分瑞格列奈。
文檔編號C12P7/62GK101652483SQ200880002850
公開日2010年2月17日 申請日期2008年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月22日
發(fā)明者米歇爾·洛蘭格拉克萊, 讓-克洛德·卡耶, 阿蘭·比爾戈斯 申請人:Zach系統(tǒng)股份公司;諾瓦克塔生物系統(tǒng)有限公司