專利名稱：：核酸分子的生成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明在廣義上涉及在增強(qiáng)型固相多核苷酸擴(kuò)增后生成單鏈核酸分子的方法。本發(fā)明還提供了以單鏈及雙鏈核酸分子標(biāo)記固體基質(zhì)的方法。用于生成單鏈核酸分子及用于進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的試劑盒也形成本發(fā)明的一部分。本發(fā)明還提供了用于生成任選地以報(bào)告分子標(biāo)記的單鏈核酸分子的擴(kuò)增體系，以及它們尤其作為標(biāo)簽、引物和探針的用途。
背景技術(shù)：
：在本說(shuō)明書中參考的任何現(xiàn)有技術(shù)不是并且不能被認(rèn)為是承認(rèn)或以任何形式暗示，該現(xiàn)有技術(shù)在任何國(guó)家組成公知常識(shí)的一部分。通過(guò)將鏈分開(kāi)或者通過(guò)去除雙鏈體的一條鏈，可以將雙鏈DNA(dsDNA)轉(zhuǎn)換成單鏈DNA(ssDNA)。通過(guò)熱方式或化學(xué)方式石皮壞鏈間鍵可以將雙鏈體的鏈分開(kāi)。去除一條鏈?zhǔn)沟盟桄湵换厥詹⑾浠パa(bǔ)鏈，例如Nikiforov"a/.(美國(guó)專利No.5，518，卯0)，其描述了通過(guò)以下方式修飾用于擴(kuò)增的一個(gè)或多個(gè)引物在待修飾引物的5，端整合硫代磷酸核苷酸衍生物，使得它抗外切核酸酶降解。在使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增靶序列后，將dsDNA進(jìn)行外切核酸酶降解。未保護(hù)的鏈優(yōu)選地被通過(guò)5，至3'的外切核酸酶消化，剩下包含另一條鏈的單鏈產(chǎn)物。類似策略4吏用了抗外切核酸酶的分枝引物(branchedprimer)(Shch印inovW"/，iVwc.X"血及"25:4441-44541997)或k外切核酸酶的攜帶5，磷酸的底物偏好性(Higuchi"iV"c/.^"Vfo及仏25:5685，1989)。非對(duì)稱PCR(GyllenstenandErlich，iVarf.C/5^4S5:7652-76561998;美國(guó)專利5，066，584)通過(guò)應(yīng)用不平衡的引物對(duì)濃度使得一個(gè)引物處于限制濃度，在熱循環(huán)過(guò)程中生成ssDNA。這有利于由過(guò)量引物引發(fā)的ssDNA產(chǎn)物。該方法具有的問(wèn)題是持續(xù)合成能力(processivity)方面的固有限制，這是因?yàn)樗褂玫囊锉仨毺幱谙?對(duì)低的濃度。竟?fàn)幮砸锓菍?duì)稱PCR(Gillespie，1997;美國(guó)專利申請(qǐng)08/628,417)采用在PCR熱循環(huán)后及進(jìn)一步熱循環(huán)之前分開(kāi)地添加竟?fàn)幮砸铮陨蓅sDNA。照這樣，該方法需要繁瑣的操作，這在特別是診斷環(huán)境下是不利的，因?yàn)槲廴撅L(fēng)險(xiǎn)、使用者的錯(cuò)誤以及處理時(shí)間和成本增加。Kaltenboeck"/，5/otec/iw/《MMH164-171，1992描述了一種通過(guò)以下方式產(chǎn)生ssDNA的方法最初進(jìn)行PCR以生成dsDNA，隨后的分開(kāi)反應(yīng)是使用第一次PCR的產(chǎn)物作為模板并且釆用一個(gè)引物進(jìn)行第二次線性擴(kuò)增。同樣，該方法需要繁瑣的操作。固相基質(zhì)已經(jīng)被以PCR產(chǎn)物標(biāo)記，使用的是其中使一個(gè)引物綴合于固體表面上的對(duì)稱PCR或非對(duì)稱PCR，或者是通過(guò)其中使正向和反向引物直接綴合于固體表面上的"橋"PCR。這些方法中的每種由于動(dòng)力學(xué)限制(有或無(wú)竟?fàn)幮砸种菩?yīng)的低效率底物濃度)均是相對(duì)低效率的。根據(jù)需要，綴合于固相上的dsDNA產(chǎn)物可以被相對(duì)簡(jiǎn)單地通過(guò)化學(xué)或熱變性轉(zhuǎn)換為結(jié)合于固相上的ssDNA產(chǎn)物。美國(guó)專利6，277，604描述了在非對(duì)稱PCR中使用一個(gè)固定的引物和兩個(gè)水相引物。至少一個(gè)所提供的水相引物的濃度是受限制的，以促進(jìn)固定引物引發(fā)延伸事件。然而，這會(huì)導(dǎo)致低效率。明顯需要開(kāi)發(fā)更有效的方法，用于生成特定的單鏈核酸分子及用于標(biāo)記固相載體。
發(fā)明內(nèi)容在本說(shuō)明書通篇及隨后的權(quán)利要求書中，除非上下文中另外要求，否則詞語(yǔ)"包含(comprise)"及變體如"包含(comprises)"或"包含(comprising)"應(yīng)被理解為意指包括所述整數(shù)或者整數(shù)或步驟組，但不排除任何其他整數(shù)或整數(shù)組。本發(fā)明定義了一種用于生成單鏈(ss)多核苷酸，特別是特定ssDNA分子并且增強(qiáng)固相多核苷酸擴(kuò)增的方法。甚至更具體地，本發(fā)明采用了一種使用在特定退火條件下具有差異引發(fā)特性的引物的擴(kuò)增反應(yīng)。在存在允許的退火條件下進(jìn)行一段時(shí)間的指數(shù)擴(kuò)增之后，改變退火條件以有利于差異引發(fā)，有效地生成ssDNA或包含其形式的核苷酸類似物。差異引物退火特性還可通過(guò)提供動(dòng)力學(xué)優(yōu)點(diǎn)的特定引物設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)，或者通過(guò)允許的/非允許的退火及引物設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)。因此，與水相引物相比，引發(fā)中固體支持引物的參與通過(guò)引物設(shè)計(jì)而得以提高。因此，以損害敏感性進(jìn)行的非對(duì)稱擴(kuò)增對(duì)于在固相載體上獲得高載量的擴(kuò)增子不是必需的。本發(fā)明有利于無(wú)損失的且更敏感的固相擴(kuò)增。擴(kuò)增子相關(guān)信號(hào)在固相載體上的高加栽被實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的方法可以在擴(kuò)增反應(yīng)器中進(jìn)行，不需要另外的樣品操作或處理。方便地(雖然不是必須地)，至少一個(gè)引物被以能夠提供識(shí)別信號(hào)的報(bào)告分子標(biāo)記。本文的方法被稱為增強(qiáng)型固相PCR(EnhancedSolidPhase-PCR)("ESP國(guó)PCR，，)。因此，本發(fā)明考慮到了一種用于核酸的固相擴(kuò)增的方法，其包括在實(shí)現(xiàn)固定引物延伸的反應(yīng)條件下，將其上具有以連接子方式結(jié)合的引物的固相栽體與包含至少一種核酸分子的樣品接觸，其中所述固定引物選自(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和(ii)嵌套于兩個(gè)水相引物之間的引物。在引物的上下文中提到"嵌套的"包括完全地或部分地嵌套的引物。所形成的固定核酸可以是ss或ds。然后，可以將所述固定ds核酸分子進(jìn)行變性，以生成固定的ss核酸分子和水相ss核酸分子中的一種或兩者。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種在反應(yīng)器中生成單鏈多核苷酸的方法，所述方法包括通過(guò)以下方式將雙鏈的靶多核苷酸或其單鏈的衍生物進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增在實(shí)現(xiàn)固定引物延伸的反應(yīng)條件下，將其上具有以連接子方式結(jié)合的引物的固體基質(zhì)與包含至少一種核酸分子的樣品接觸，其中所述固定引物選自(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和(ii)嵌套于兩個(gè)水相引物之間的引物；以有利于生成固定于所述固體基質(zhì)的雙鏈多核苷酸，然后使固定的多酸。擴(kuò)增反應(yīng)可以是對(duì)稱的、非對(duì)稱的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、鏈替代擴(kuò)增(SDA)、連接酶鏈反應(yīng)、切口限制性內(nèi)切核酸酶(切口RE)，尤其是SDA或全基因組擴(kuò)增。方便地，至少一個(gè)水相引物被以能夠提供識(shí)別信號(hào)的報(bào)告分子標(biāo)記。上述在本文中被稱為ESP-PCR的方法是一種形式的分步擴(kuò)增反應(yīng)。這種分步的方案依賴于第一及第二退火條件或者引物設(shè)計(jì)，可以是"逐級(jí)上升的"或"逐級(jí)下降的"。差異退火條件的實(shí)例包括不同退火溫度、引物和靶互補(bǔ)多核苷酸之間錯(cuò)配程度、無(wú)關(guān)或補(bǔ)足序列的存在，以及在靶核苷酸序列上不同互補(bǔ)位點(diǎn)內(nèi)的引物設(shè)計(jì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或兩個(gè)引物攜帶在同源性上與靶多核苷酸序列相關(guān)或不相關(guān)的"尾"核香酸序列或"頭"核苷酸序列，提供不同于另一個(gè)引物的熔解溫度。因此，本發(fā)明還可以使用攜帶一種或多種無(wú)關(guān)或補(bǔ)足序列的引物進(jìn)行，以協(xié)助降低核酸擴(kuò)增偏差。本發(fā)明的方法具有許多應(yīng)用，其中包括生成雜交反應(yīng)的探針(例如RNA印跡、DNA印跡、克隆庫(kù)篩選、原位雜交、熒光原位雜交(FISH)和微陣列(如芯片、珠子或其他基于固體基質(zhì)的分析))。本方法還可以與另一種改良的擴(kuò)增方法結(jié)合^f吏用，其中dsDNA靶經(jīng)5'至3，外切核酸酶的消化以生成在本方法中使用的ssDNA模板。本發(fā)明還考慮一種用于固相基質(zhì)的直接多核苷酸標(biāo)記的方法，例如在高通量測(cè)序方案或珠子微陣列應(yīng)用之前的微陣列特征生成、用于基于非凝膠電泳的核酸分析的微滴定板標(biāo)記、用于非基于凝膠電泳的遺傳分析(如基于FACS的遺傳分析)的珠子標(biāo)記以及乳液PCR中。包含反應(yīng)器及試劑的試劑盒也是本發(fā)明的一部分。"標(biāo)記"包括以報(bào)告分子例如化學(xué)發(fā)光分子或生物發(fā)光分子標(biāo)記，以及/或者以核酸分子標(biāo)記。因此，本發(fā)明還涉及這樣的擴(kuò)增體系，即其包含試劑組件、核酸組件、硬件組件和說(shuō)明組件。該體系的組件相互之間相互作用，以生成單鏈多核苷酸產(chǎn)品。本發(fā)明還用于固相基質(zhì)的直接多核苷酸標(biāo)記，例如在高通量測(cè)序方案或珠子微陣列應(yīng)用之前的微陣列或固體陣列特征生成、用于非基于凝膠電泳的核酸分析(如基于FACS的遺傳分析)的微滴定板標(biāo)記以及乳液擴(kuò)增中。本發(fā)明還可以被用于在變性固定的ds核酸分子之后，生成固定于固相載體上的或者在水相中的ss核酸分子。因此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮一種以單鏈多核苷酸標(biāo)記固體基質(zhì)的方法，所述方法包括使用在第一組退火條件下具有相似退火特性但在第二組退火條件下具有差異退火特性的正向及反向引物進(jìn)行雙鏈的靶多核苷酸或其單鏈的衍生物的指數(shù)擴(kuò)增，將擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物與其上固定有至少一種這樣的引物的固體基質(zhì)或固體基質(zhì)組合物接觸，即該引物能夠在第二組退火條件下與擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈退火，并且將退火條件轉(zhuǎn)換成所述第二組條件，從而有利于基于單引物的擴(kuò)增以生成固定于所述固體基質(zhì)上的單鏈多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種以單鏈多核苷酸標(biāo)記固體基質(zhì)的方法，所述方法包括使用在第一組退火條件下具有相似退火特性但在第二組退火條件下具有差異退火特性的一對(duì)正向和反向引物對(duì)雙鏈的靶多核苷酸或其單鏈的衍生物進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，將擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物與其上固定有至少一種這樣的引物的固體基質(zhì)或固體基質(zhì)組合物接觸，即該引物能夠在第二組退火條件下與擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈退火生成雙鏈的多核苷酸，然后將雙鏈的多核苷酸變性以生成固定于所述基質(zhì)上的單鏈多核苷酸。還提供了一種用于標(biāo)記固體基質(zhì)的方法，其包括在實(shí)現(xiàn)固定引物延伸的反應(yīng)條件下，將其上具有以連接子方式結(jié)合的引物的固相載體與包含至少一種核酸分子的樣品接觸，其中所述固定引物選自(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和(ii)嵌套于兩個(gè)水相引物之間的引物。提及"固體基質(zhì)"包括可以固定核酸分子的固相、載體或者其他表面或珠子。上述方法包括這樣的任選項(xiàng)，即將退火條件變成第一組條件，以使得"加入"單鏈多核苷酸以生成固定于固體基質(zhì)上的雙鏈多核苷酸。因此，本發(fā)明可擴(kuò)展至一種生成用雙鏈多核苷酸標(biāo)記的固體基質(zhì)或固體基質(zhì)組合物的方法，所述方法包括使用在第一組退火條件下具有相似退火特性但在第二組退火條件下具有差異退火特性的一對(duì)正向和反向引物對(duì)雙鏈的靶多核苷酸或其單鏈的衍生物進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，將擴(kuò)增的產(chǎn)物與其上固定有至少一種這樣的引物的固體基質(zhì)或固體基質(zhì)組合物接觸，即該引物能夠在第二組退火條件下與擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈退火，并且將退火條件轉(zhuǎn)換成第二組以生成固定于所述固體基質(zhì)上的單鏈的多核苷酸；轉(zhuǎn)換成第一組退火條件，借此在存在另一條引物的情況下，該單鏈的固定多核苷酸生成互補(bǔ)鏈，且所述固體基質(zhì)包含固定的雙鏈體多核苷酸。在又一實(shí)施方案中，所迷雙鏈體多核苷酸被通過(guò)例如化學(xué)熱方式變性，以生成水相的單鏈多核苷酸或固定的單鏈多核苷酸。還提供了一種方法用于生成具有雙鏈多核苷酸的固體基質(zhì)或固體基質(zhì)組合物，所述方法包括在實(shí)現(xiàn)固定引物延伸的反應(yīng)條件下，通過(guò)將具有其上以連接子方式結(jié)合的引物的固相載體與包含至少一種核酸分子的樣品接觸，對(duì)雙鏈的靶多核苷酸或其單鏈的衍生物進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，其中所述固定引物選自(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和(ii)嵌套于兩個(gè)水相引物之間的引物。還可以使用嵌套的引物及允許的和非允許的條件。本說(shuō)明書中使用的縮寫在表l中被定義。表1縮寫定義dsDNA雙鏈的DNAFACS熒光活化的細(xì)胞分揀FISH熒光原位雜交PCR聚合酶鏈反應(yīng)SDA鏈替代擴(kuò)增ssDNA單鏈DNA本文使用的序列標(biāo)識(shí)符的總結(jié)顯示于表2中表2_^，標(biāo)識(shí)秀序列標(biāo)識(shí)符|序列10SEQIDNO:l寡核苷酸(Transprobe)SEQIDNO:2Cto3模板生成正向引物SEQIDNO:3Cto3模板生成反向引物SEQIDNO:4Ngo模板生成正向引物SEQIDNO:5Ngo模板生成反向引物SEQIDNO:6Ngps才莫板生成正向引物SE()IDNO:7Ngps模板生成反向引物SEQIDNO:8Cto3"水相"正向引物SEQID隱9Cto3"水相"反向引物SEQIDNO:IOCto3SP-PCR固相載體引物SEQIDNO:11Cto3ESP-PCR固相載體引物SEQIDNO:12Ngo"水相"正向引物SEQIDNO:13Ngo"水相"反向引物SEQIDNO:14NgoSP-PCR固相載體引物SEQIDNO:15NgoESP-PCR固相載體引物SEQIDNO:16Ngps"水相"正向引物SEQIDNO:17Ngps"水相"反向引物SEQIDNO:18NgpsSP-PCR固相載體引物SE()IDNO:19NgpsESP-PCR固相載體引物SEC)IDNO:20、淋病奈瑟菌<7/7fl引物SEQIDNO:21淋病奈瑟菌反向引物SEQIDNO:22沙眼衣原體隱蔽性質(zhì)粒引物SEQIDNO:23沙眼衣原體反向引物某些附圖包含彩色的表示或部分。彩色照片可以通過(guò)請(qǐng)求從專利所有人或者可以從合適的專利局獲得。如果從專利局獲得可能會(huì)收取費(fèi)用。圖1(i)和(ii)的圖式表示為(i)增強(qiáng)型固相PCR(ESP-PCR)方案，用于將單鏈的或雙鏈的擴(kuò)增子加載至具有(ii)固相載體引物設(shè)ii計(jì)(l至4)的固相栽體上。參考實(shí)施例1的詳細(xì)描述，(i):a"戈表"正向"PCR引物；b-代表"反向"引物；c-使用例如正向和反向引物的指數(shù)擴(kuò)增(如PCR);d-固相載體引物[見(jiàn)(ii)；e-許多ds拷貝/固相載體；f-許多ss拷貝/固相載體;'g-(可選)具有不允許引物a和b的"分步的，，退火條件的循環(huán)；h-(可選)"加入，，；(ii):a-代表"正向"PCR引物；b-表"反向"引物；c-現(xiàn)有技術(shù)固相PCR固相載體引物設(shè)計(jì)；d-例如3-引發(fā)的延伸、較高Tm;e-增強(qiáng)型固相PCR固相載體引物設(shè)計(jì)；f-例如嵌套的或部分嵌套的；g-例如嵌套的或部分嵌套的、較高Tm。圖2的圖式表示為于使用標(biāo)準(zhǔn)(A)SP-PCR相比，使用(B)ESP-PCR提高固相栽體引發(fā)的機(jī)制。各反應(yīng)混合物中所包括的"水相"正向(箭頭)及反向引物的濃度不受限制，同時(shí)包含固相載體引物(連接于箭頭上的球)。用"水相，，引物進(jìn)行常規(guī)PCR以生成擴(kuò)增子(虛線)。在這些循環(huán)中固相栽體引物也引發(fā)延伸反應(yīng)，使得將產(chǎn)物加載至所述固相載體表面上。然而，在標(biāo)準(zhǔn)SP-PCR中，固相載體引物的參與受到匹配序列(A)的"水相，，引物的竟?fàn)幰种?，以產(chǎn)生相對(duì)弱的擴(kuò)增子加栽。(A)中的垂直線指示受抑制的延伸。ESP-PCR(B)可通過(guò)應(yīng)用具有相對(duì)高7^的嵌套固相載體引物避免這種抑制。虛線代表延伸事件。(A)在標(biāo)準(zhǔn)SP-PCR固相載體引物序列中的固相載體引發(fā)可匹配其對(duì)應(yīng)的"水相"引物；(a)-固相載體引發(fā)被其"水相"引物對(duì)應(yīng)物竟?fàn)幍簦?b)-單鏈擴(kuò)增子；(B)ESP-PCR引物中的固相載體引發(fā)被嵌套，以通過(guò)利用不同的結(jié)合位點(diǎn)及"水相"引物結(jié)合及聚合酶結(jié)合之間的滯后，降低它和"水相"引物之間對(duì)于與擴(kuò)增子結(jié)合的竟?fàn)?。而且有較高的Tw以升高其有效濃度(a)-固相載體引發(fā)是竟?fàn)幮缘模?b)-單鏈的擴(kuò)增子。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種改良的擴(kuò)增反應(yīng)，該反應(yīng)有利于生成單鏈的(ss)多核苷酸，特別是固定于固相載體的ssDNA,或者從固定的雙鏈(ds)多核苷酸生成的固定形式或水相形式的ssDNA。本發(fā)明被預(yù)測(cè)的部分用途是擴(kuò)增反應(yīng)中的引物，所述引物在一組退火條件(其中所述引物被認(rèn)為是"平衡的"并且所述退火條件被認(rèn)為是"互相允許的")下具有相似的退火特征，并且在另一組退火條件(其中所述引物被認(rèn)為是"不平衡的"并且所述退火條件被認(rèn)為是"差異允許的")下具有不同的或差異的或不相似的退火特征。此外或另外，不同的退火條件可源自引物^L計(jì)，所述引物設(shè)計(jì)對(duì)固相載體引發(fā)賦予優(yōu)于水相寡核苷酸引發(fā)的不同動(dòng)力學(xué)優(yōu)點(diǎn)。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面考慮一種用于固相擴(kuò)增的方法，其包括在實(shí)現(xiàn)固定引物延伸的反應(yīng)條件下，將具有以連接子方式結(jié)合于固相載體的引物的固相載體與包含至少一種核酸分子的樣品接觸，其中所述固定引物選自(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和(ii)嵌套于兩個(gè)水相引物之間的引物。在引物的上下文中提到"嵌套的"包括完全地或部分地嵌套的引物。提及"共有序列同一性"包括基本上同一的，以及至少80%的序列同一性，例如至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。如上文指出的，正向引物和反向引物就退火特性而言可以被描述為"平衡的"或"非平衡的"，退火條件就對(duì)引物的效應(yīng)而言可以被i^為互相允許的或差異允許的。類似地，引物設(shè)計(jì)可有利于差異允許的引物。因此，平衡引物或非平衡引物是指，在給定的一組條件或給定的一組引物——即互相允許的退火條件或互相允許的引物下，兩個(gè)引物均結(jié)合或者雜交以形成具有類似效率的雙鏈體。而引物在差異允許的退火條件下(即在另一組條件下)是非平衡的，這是因?yàn)樵摋l件可能有利于雙鏈體形成及引發(fā)。因此，本發(fā)明可以被進(jìn)一步限定為一種在反應(yīng)器中生成固定于固相載體上的單鏈多核苷酸的方法，所述方法包括通過(guò)在互相允許的條件下使用一對(duì)平衡的正向引物和反向引物來(lái)在所述容器中進(jìn)行固定于固相載體上的靶多核苷酸的擴(kuò)增反應(yīng)，然后將退火條件轉(zhuǎn)變成差異允許的條件借此引物變?yōu)榉瞧胶獾?，并且繼續(xù)該反應(yīng)以生成單鏈的多核苷酸產(chǎn)物，然后失活聚合酶活性以基本上阻止雙鏈多核苷酸的形成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在固相載體上生成ds多核苷酸，然后使所述ds多核苷酸處于變性條件(例如通過(guò)化學(xué)途徑或熱途徑)以生成固定的ss多核苷酸或水相多核苷酸。因此，本發(fā)明提供了一種以單鏈的多核苷酸標(biāo)記固體基質(zhì)的方法，所述方法包括使用在第一組退火條件下具有相似退火特性但在第二組退火條件下具有差異退火特性的正向及反向引物進(jìn)行雙鏈的靶多核苷酸或其單鏈的衍生物的指數(shù)擴(kuò)增，將擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物與其上固定有至少一種這樣的引物的固體基質(zhì)或固體基質(zhì)組合物接觸，即該引物能夠在第二組退火條件下與擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈退火生成雙鏈的多核苷酸，然后將雙鏈的多核苷酸變性以生成固定于所述固體基質(zhì)上的單鏈多核苦酸。變性可通過(guò)包括化學(xué)途徑或熱途徑的任何途徑進(jìn)行。另一方面提供了一種在反應(yīng)器中生成單鏈多核苷酸的方法，所述數(shù)擴(kuò)增在實(shí)現(xiàn)固定ii物延伸的反應(yīng):件下:;其上具有以連接子方式結(jié)合的引物的固體基質(zhì)與包含至少一種核酸分子的樣品接觸，其中所述固定引物選自(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和(ii)嵌套于兩個(gè)水相引物之間的引物；以有利于生成固定于所述固體基質(zhì)上的雙鏈多核苷酸，然后使固定的多核苷酸處于變性條件下以生成固定的單鏈多核苦酸及液相的單鏈多核普酸。然后可以進(jìn)行另一步驟，該步驟是使所產(chǎn)生的混合物經(jīng)受相分離途徑處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種在反應(yīng)器中生成單鏈的多核苷酸的方法，所述方法包括在實(shí)現(xiàn)固定引物延伸的反應(yīng)條件下，將其上具有以連接子方式結(jié)合的引物的固相載體與包含至少一種核酸分子的樣品接觸，其中所述固定引物選自(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和(ii)嵌套于兩個(gè)水相引物之間的引物。優(yōu)選地，所述多核苷酸為DNA，因此本發(fā)明具體地涉及ssDNA的生成。然而，雖然起始材料優(yōu)選地是dsDNA,本發(fā)明還可以〗吏用mRNA(所述mRNA被轉(zhuǎn)換成dsDNA或ssDNA)或者使用ssDNA。再者，可以在固相載體上生成dsDNA，然后使其處于變性條件下以生成固定的ssDNA或水相ssDNA。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種在反應(yīng)器中生成ssDNA的方法，所述方法包括使用在笫一組退火條件(互相允許條件)下具有相似的(平衡的)退火引物但在第二組退火條件(差異允許條件)下具有差異退火特性的一對(duì)正向和反向引物在反應(yīng)器中進(jìn)行從dsDNA或mRNA耙標(biāo)到固定的靶ssDNA模板的擴(kuò)增反應(yīng)，其中所述擴(kuò)增被允許在互相允許的退火條件下進(jìn)行；將條件轉(zhuǎn)換成差異允許條件以使引物失去平衡，從而在基本上僅存在單引物的情況下促進(jìn)線性擴(kuò)增，以生成ssDNA產(chǎn)物；并且使任何聚合酶活性失活以基本上降低或者阻止dsDNA形成。本發(fā)明的又一方面為一種在反應(yīng)器中生成ssDNA的方法，所述方法包括在實(shí)現(xiàn)固定引物延伸的反應(yīng)條件下，將其上具有以連接子方式結(jié)合的引物的固相載體與包含至少一種核酸分子的反應(yīng)器中的樣品接觸，其中所述固定引物選自(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和(ii)嵌套于兩個(gè)水相引物之間的引物。差異允許的與互相允許的退火條件或引物與例如以下因素有關(guān)錯(cuò)配程度、在引物上存在"頭"或"尾"無(wú)關(guān)核苷酸序列、在靶模板上形成雙鏈體的雜交位點(diǎn)或者存在其他使得能夠逐級(jí)上升或逐級(jí)下降以生成非平衡的引物條件的特征。本發(fā)明的方法可以被認(rèn)為是對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的改良以生成特定產(chǎn)物。所述改良為使用這樣的引物，即所述引物依賴于退火條件的允許水平^:差異地或互相地平衡。因此，本發(fā)明考慮一種改良的擴(kuò)增反應(yīng)，其中使用正向引物及反向引物指數(shù)地?cái)U(kuò)增從雙鏈多核苷酸例如dsDNA生成的或者直接地從mRNA生成的或者經(jīng)由cDNA模板生成的單鏈多核苷酸例如ssDNA，其中所述改良包括選擇在第一組退火條件下具有相似退火特性且在第二組退火條件下具有差異退火特性的引物，使得將退火條件轉(zhuǎn)變成第二組有助于在存在單引物的情況下的擴(kuò)增，使得產(chǎn)生大量單鏈多核苷酸例如ssDNA。此外或另外，引物設(shè)計(jì)被用于將固定引物嵌套于兩個(gè)水相引物之間。本發(fā)明還提供了一種在反應(yīng)器中生成單鏈多核苷酸的方法，所述方法包括通過(guò)以下方式將雙鏈的靶多核苷酸或其單鏈的衍生物進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增在實(shí)現(xiàn)固定引物延伸的反應(yīng)條件下，將其上具有以連接子方式結(jié)合的引物的固體基質(zhì)與包含至少一種核酸分子的樣品接觸，其中所述固定引物選自(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和(ii)嵌套于兩個(gè)水相引物之間的引物；以有利于生成固定于所述固體基質(zhì)上的雙鏈多核苷酸，然后使所述固多核苷酸。本發(fā)明的該方面通過(guò)整合一種綴合于3'模板結(jié)合區(qū)上的非引物結(jié)合區(qū)5，無(wú)關(guān)核苦酸序列，解決了潛在的擴(kuò)增偏差的問(wèn)題。這樣的一個(gè)或兩個(gè)引物整合了5，外來(lái)序列(尾序列)，所述外來(lái)序列作為鎖止(damp)使擴(kuò)增同系物間的擴(kuò)增效率趨于平均。所述尾序列在同源性上可以與靶序列相關(guān)或不相關(guān)。又一方面還提供了一種在反應(yīng)器中生成單鏈多核苷酸的方法，包括在實(shí)現(xiàn)固定引物延伸的反應(yīng)條件下，將其上具有以連接子方式結(jié)合的引物的固相載體與包含至少一種核酸分子的樣品接觸，其中所述固定引物選自(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和(ii)嵌套于兩個(gè)水相引物之間的引物。對(duì)本文的方法的變化包括使用嵌套的引物及差異熔解條件。本發(fā)明具有多項(xiàng)應(yīng)用，包括生成用于雜交反應(yīng)(例如RNA印跡、DNA印跡、克隆文庫(kù)篩查、原位雜交、熒光原位雜交(FISH)及微陣列分析例如使用芯片、珠子或其他固體基質(zhì))的單鏈核苷酸探針。所述引物還可以被能夠提供可識(shí)別信號(hào)的報(bào)告分子標(biāo)記。例如，可以將熒光劑、發(fā)磷光劑、化學(xué)發(fā)光劑或放射性標(biāo)記物整合至引物中。另外的標(biāo)i己物包括但不限于生物素-dUTP、藻紅蛋白-dUTP、熒光素-dUTP和[a-32Pl-dUTP，包括它們所有可能的異構(gòu)體。還可以應(yīng)用基于酶的檢測(cè)法或化學(xué)檢測(cè)法。本發(fā)明的方法還可以與其他擴(kuò)增改良結(jié)合使用。例如應(yīng)用外切核酸酶特別是5，至3，外切核酸酶以從dsDNA靶生成ssDNA才莫板的擴(kuò)增體系。因此，本發(fā)明的另一方面提供了一種在反應(yīng)器中生成ssDNA的方法，所述方法包括獲得其中包含凹的5'端或平端的待擴(kuò)增的dsDNA靶標(biāo)或dsDNA靶標(biāo)的區(qū)域，將所述dsDNA和5，至3，外切核酸酶與DNA等溫?cái)U(kuò)增所需試劑一塊孵育，其中所述5，至3，外切核酸酶產(chǎn)生包含dsDNA每條鏈的3，至5，ssDNA片段的ssDNA模板，所述ssDNA模板被用作擴(kuò)增的模板；使用在第一組退火條件(互相允許條件)下具有相似的(平衡的)退火引物但在第二組退火條件(差異允許條件)下具有差異退火特性的一對(duì)正向和反向引物在所述ssDNA上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，其中所述擴(kuò)增被允許在互相允許的退火條件下進(jìn)行；將所述條件轉(zhuǎn)換成差異允許條件以使引物失去平衡，從而在基本上僅存在單引物的情況下促進(jìn)線性擴(kuò)增以生成ssDNA產(chǎn)物；并且使任何聚合酶活性失活以基本上降低或者阻止dsDNA形成。本發(fā)明的另一方面提供了一種在反應(yīng)器中生成ssDNA的方法，所述方法包括獲得其中包含凹的5，端或平端的待擴(kuò)增的dsDNA靶標(biāo)或dsDNA靼標(biāo)的區(qū)域，將所述dsDNA和5，至3，外切核酸酶與DNA等溫?cái)U(kuò)增所需試劑一塊孵育，其中所述5，至3'外切核酸酶產(chǎn)生包含dsDNA每條鏈的3，至5，ssDNA片段的ssDNA模板，所述ssDNA模板被用作擴(kuò)增的模板；并且通過(guò)以下方式在所述ssDNA上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)在實(shí)現(xiàn)固定引物延伸的反應(yīng)條件下，將其上具有以連接子方式結(jié)合的引物的固相載體與包含至少一種核酸分子的樣品接觸，其中所述固定引物選白(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和(ii)嵌套于兩個(gè)水相引物之間的引物。又再者，本文描述的方法可以與降低擴(kuò)增偏差的方法結(jié)合使用。17因此，另一方面提供了一種在反應(yīng)器中生成單鏈多核苷酸的方法，所述方法包括使用在第一組退火條件下具有相似退火特性但在第二組退火條件下具有差異退火特性的一對(duì)正向和反向引物在反應(yīng)器中進(jìn)行靶多核苷酸的擴(kuò)增反應(yīng)，其中所述擴(kuò)增被允許在所述第一組退火奈件下進(jìn)行；將退火條件轉(zhuǎn)換成第二組退火條件，以在基本上僅存在所述引物對(duì)中的一個(gè)引物的情況下促進(jìn)線性應(yīng)用，然后使擴(kuò)增反應(yīng)中的聚合酶活性失活以基本上阻止雙鏈多核苦酸形成，其中所述擴(kuò)增步驟包括使用正向引物及反向引物將所述多核苷酸靶標(biāo)的核酸模板進(jìn)行擴(kuò)增，其中至少一個(gè)引物包含綴合于3，模板結(jié)合引物區(qū)上的5'無(wú)關(guān)核苦^列，其中所述無(wú)關(guān)核苷酸序列在引發(fā)起始后被整合至擴(kuò)增產(chǎn)物中。該步驟可降低擴(kuò)增差異。如上文指出的，所述5，外來(lái)序列與所述靶序列可以相關(guān)或不相關(guān)。本發(fā)明還用于固相基質(zhì)的直接多核苷酸標(biāo)記，例如在高通量測(cè)序方案或珠子微陣列應(yīng)用之前的微陣列或固體陣列特征生成、用于基于非凝膠電泳的核酸分析的微滴定板標(biāo)記、用于基于非凝膠電泳的核酸分析(如基于FACS的遺傳分析)的珠子標(biāo)記以及乳液擴(kuò)增中。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮一種以單鏈多核苷酸標(biāo)記固體基質(zhì)的方法，所述方法包括使用在第一組退火條件下具有相似退火特性但在第二組退火條件下具有差異退火特性的正向及反向引物進(jìn)行雙鏈的靶多核苷酸或其單鏈的衍生物的指數(shù)擴(kuò)增；將擴(kuò)增的擴(kuò)增子產(chǎn)物與其上具有至少一種這樣的引物的固體基質(zhì)或固體基質(zhì)組合物接觸，即該引物能夠在第二組退火條件下與擴(kuò)增子產(chǎn)物的鏈退火；并且將退火條件轉(zhuǎn)換成所述第二組條件，從而有利于基于單引物的擴(kuò)增以生成固定于所述固體基質(zhì)上的單鏈多核苷酸。上述方法還可任選地包括將退火條件轉(zhuǎn)換成第一組條件，以使得"加入"ss多核苷酸以便生成固定于所述固體基質(zhì)上的ds多核苷酸。換句話說(shuō)，所述條件被變成允許條件。然后可以將雙鏈多核苷酸變性，以生成固定的ss多核苷酸及水相的ss多核苷酸。因此，本發(fā)明可擴(kuò)展至一種生成以雙鏈多核苦酸標(biāo)記的固體基質(zhì)或固體基質(zhì)組合物的方法，所述方法包括使用在第一組退火條件下具有相似退火特性但在第二組退火條件下具有差異退火特性的正向及反向引物進(jìn)行雙鏈的靶多核苷酸或其單鏈的衍生物的指數(shù)擴(kuò)增；將擴(kuò)增的擴(kuò)增子產(chǎn)物與其上固定有至少一種這樣的引物的固體基質(zhì)或固體基質(zhì)組合物接觸，即該引物能夠在第二組退火條件下與擴(kuò)增子產(chǎn)物的鏈退火；并且將退火條件轉(zhuǎn)換成所述第二組條件，從而有利于基于單引物的擴(kuò)增以生成固定于所述固體基質(zhì)上的單鏈的多核苷酸；將退火條件轉(zhuǎn)換成第一組退火條件，借此在存在另一條引物的情況下，該單鏈的固定多核苷酸生成完整鏈或與所述固定鏈雜交的鏈以生成雙鏈體多核苷酸標(biāo)記的固體基質(zhì)。在又一實(shí)施方案中，提供了一種方法用于生成以雙鏈多核普酸標(biāo)記的固體基質(zhì)或固體基質(zhì)組合物，所述方法包括在實(shí)現(xiàn)固定引物延伸的反應(yīng)條件下，將其上具有以連接子方式結(jié)合的引物的固相載體與包含至少一種核酸分子的樣品接觸，其中所述固定引物選自(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和(ii)嵌套于兩個(gè)水相引物之間的引物。在描述本發(fā)明時(shí)，以下術(shù)語(yǔ)和內(nèi)容被定義或者被闡明。本文提及的所有科學(xué)引文、專利、專利申請(qǐng)及制造商的技術(shù)說(shuō)明書都通過(guò)引用的方式全文納入本文。應(yīng)理解的是，除非另外指出，否則本發(fā)明不限于具體的試劑、方法步驟或應(yīng)用等，這是因?yàn)檫@些可以有變化。還應(yīng)理解的是，本文使用的術(shù)語(yǔ)僅是為了描述具體實(shí)施方案的目的并且不是意欲進(jìn)行限制。除非上下文中明確地聲明相反，否則本說(shuō)明書中使用的單數(shù)形式的"一""一種"和"該"包括復(fù)數(shù)的方面。因此，例如提及"一個(gè)耙標(biāo)"包括單個(gè)的靶標(biāo)，以及兩個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)；提及"一次擴(kuò)增，，包括單次擴(kuò)增，以及多次擴(kuò)增步驟；提及"該擴(kuò)增子"包括單個(gè)的或多個(gè)的或復(fù)合體的擴(kuò)增子；等等。本文使用的核酸化學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的術(shù)語(yǔ)及符號(hào)遵循該領(lǐng)域中的那些標(biāo)準(zhǔn)的論文及教科書，例如KornbergandBaker,ie/7//c^ort，SecondEdition(W.H.Freeman,NewYork,1992);Lehninger,Biochemistry,SecondEdition(WorthPublishers,NewYork,1975);StrachanandRead,/Tw附fl"Mo/ecw/arG^wWcs,SecondEdition(Wiley-Liss，NewYork,1999);Eckstein(Ed)，0//go聰c/eo,/cfeyarfJwa/ogsvJ尸m"/cflM/7/7fwcA(OxfordUniversityPress,NewYork,1991);Gait(Ed)，(7//go簡(jiǎn)c/eC/flfejy"幼es/s..j尸mC/cfl/々praac/e(IRLPress,Oxford,1984);等等。"擴(kuò)增子"是指多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物。即，它是從一個(gè)或多個(gè)起始序列復(fù)制的一組多核苷酸，通常但不必需是雙鏈的。所述一個(gè)或多個(gè)起始序列可以是相同序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝，或者它可以是不同序列的混合物。擴(kuò)增子的產(chǎn)生可以是通過(guò)其產(chǎn)物為一種或多種靶核酸的多復(fù)制物的多種擴(kuò)增反應(yīng)。一般而言，產(chǎn)生擴(kuò)增子的擴(kuò)增反應(yīng)是"模板驅(qū)動(dòng)的"，原因;l^應(yīng)物(核苷酸或寡核苷酸)的堿基配對(duì)在用于形成反應(yīng)產(chǎn)物所需的模板多核苷酸中有互補(bǔ)物。在一個(gè)方面，模板驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)是用核酸聚合酶的引物延伸，或者用核酸連接酶的寡核苷酸連接。這些反應(yīng)包括但不限于PCR、線性聚合酶反應(yīng)、NASBA、滾環(huán)擴(kuò)增等，它們被公開(kāi)于通過(guò)引用的方式納入本文的以下參考文獻(xiàn)Mullis""/，美國(guó)專利4，683，195、4，965，188、4,683,202、4，800，159(PCR);Gelfand一，美國(guó)專利5,210,015(使用"taqman"探針的實(shí)時(shí)PCR);Wittwer""/，美國(guó)專利6,174,670;Kaciane"/,美國(guó)專利5，399，491("NASBA");Lizardi，美國(guó)專利5，854，033;AonoCfl/,日本專利公開(kāi)JP4-262799(滾環(huán)擴(kuò)增)；等等。擴(kuò)增反應(yīng)可以是"實(shí)時(shí)，，擴(kuò)增，其中檢測(cè)化學(xué)使得反應(yīng)產(chǎn)物隨擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)^f亍而^^測(cè)量。所述擴(kuò)增可以為非對(duì)稱擴(kuò)增或?qū)ΨQ擴(kuò)增。本文使用的術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增"是指進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。"反應(yīng)混合物"或"反應(yīng)器"是指包含進(jìn)行反應(yīng)的所有必需反應(yīng)物的溶液或容器，所述反應(yīng)物包括但不限于在反應(yīng)過(guò)程中將pH保持在選定水平的緩沖劑、鹽、輔因子、清除劑等。"互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)"是指在核苷酸或核酸之間的雜交、堿基配對(duì)或雙鏈體的形成，例如在dsDNA分子的兩條鏈之間或者在寡核苷酸引物與單鏈核酸上的引物結(jié)合位點(diǎn)之間?；パa(bǔ)的核苷酸通常為A與T(或A與U)或者C與G。在以下情形下兩個(gè)單鏈的RNA或DNA分子被認(rèn)為是基本互補(bǔ)的即當(dāng)一條鏈的核苷酸與另一條鏈的核苷酸(最佳地比對(duì)、比較并具有合適的核苷酸插入或刪除)的配對(duì)至少為約80%時(shí)，通常至少約卯％-95%，并且更優(yōu)選地約98%-100%?；蛘?，如果DNA鏈例如在選擇性雜交條件下與其互補(bǔ)物雜交，那么基本互補(bǔ)是存在的。一般地，在以下情形下會(huì)出現(xiàn)選擇性雜交當(dāng)在具有至少14至25個(gè)核苷酸的一段上有至少約65%的互補(bǔ)時(shí)，優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少約90%的互補(bǔ)。見(jiàn)KanehisaiVMc/"'c^"VfoiM.":203，1984，其凈皮通過(guò)引用的方式納入本文。"雙鏈體"是指至少兩條這樣的寡核苷酸及/或多核苷酸，即它們的核苷酸的所有的或大多數(shù)按照Watson-Crick型堿基配對(duì)完全地或部分地互補(bǔ)使得形成穩(wěn)定的復(fù)合體。術(shù)語(yǔ)"退火"及"雜交"可互換使用，是指形成穩(wěn)定的雙鏈體。在言及雙鏈體時(shí)"完全匹配的"是指，組成雙鏈體的多核苷酸鏈或寡核苷酸鏈兩者之間形成雙鏈結(jié)構(gòu)，使得每條鏈中的每個(gè)核苷酸與另一條鏈中的核苷酸進(jìn)行Watson-Crick堿基配對(duì)。在言及基因組或靶多核苷酸時(shí)"遺傳位點(diǎn)"或"位點(diǎn)"是指，基因組或耙多核苷酸的鄰近的亞區(qū)域或片段。本文中使用的遺傳位點(diǎn)或位點(diǎn)可以指基因組中的基因位置或基因部分，或者它可以指基因組序列的任意鄰近部分，而不管它是否位于基因內(nèi)或者是否與基因相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選地，遺傳位點(diǎn)是指從數(shù)十個(gè)核苷酸(例如長(zhǎng)度10-30或10-100),至數(shù)百個(gè)核苷酸(例如長(zhǎng)度100-1000或100-500)，至數(shù)千個(gè)核苷酸(例如長(zhǎng)度1000-10,000或1000-3000)的基因組序列的任意部分。在一些上下文中，遺傳位點(diǎn)可以指核苷酸在基因組中的位置。"試劑盒"是指用于送遞用于進(jìn)行本發(fā)明的方法的材料或試劑的任何送遞體系。在反應(yīng)測(cè)定的上下文中，這種送遞體系包括使得可以從一個(gè)位置至另一個(gè)位置保存、運(yùn)輸或送遞反應(yīng)試劑(例如在合適的容器中的探針、酶等)及/或支持材料(例如緩沖物、用于實(shí)施測(cè)定的書面說(shuō)明書等)。例如，試劑盒包括包含相關(guān)反應(yīng)試劑及/或支持材料的一個(gè)或多個(gè)外殼(例如盒子)。這些內(nèi)含物可以被一起或分別地送遞至目標(biāo)受體。例如，第一容器可包含在測(cè)定中使用的酶，而第二容器包含探針。這些試劑盒還可以包含適宜于包含所述試劑的容器。在一個(gè)實(shí)例中，一個(gè)容器包含具有固定于其上的寡核苷酸、引物或多核苷酸的固體基質(zhì)，所述寡核普酸、引物或多核普酸參與擴(kuò)增反應(yīng)。固體基質(zhì)的一個(gè)實(shí)例為微陣列。因此，試劑盒可以是這樣的整個(gè)擴(kuò)增體系的一部分，即該擴(kuò)增體系具有試劑組件、核酸組件、硬件組件和說(shuō)明組件。言及"固體基質(zhì)"包括用于進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的任意結(jié)構(gòu)形式。因此，例如乳液PCR被看作一種形式的固體基質(zhì)，其中在不同相的乳液中進(jìn)行PCR。"微陣列"是指具有平坦表面的固相載體，所述表面攜帶核酸陣列，陣列的每個(gè)成員均包含固定于空間確定區(qū)域或位點(diǎn)上的寡核苷酸或多核苷酸的相同拷貝，所述區(qū)域或位點(diǎn)不與陣列其他成員的那些區(qū)域或位點(diǎn)重疊；即，這些區(qū)域或位點(diǎn)是空間上不連續(xù)的?？臻g確定的雜交位點(diǎn)可以另外被"尋址"，這是因?yàn)槠湮恢眉捌涔潭ǖ墓押塑账岬纳矸菰诶缡褂盟笆且阎幕蝾A(yù)先確定的。一般地，所述寡核苷酸或多核苷酸是單鏈的，并且通常通過(guò)5，端或3'端共價(jià)地連接于固相載體上。微陣列上包含核酸的非重疊區(qū)的密度通常每ci^超過(guò)100,更優(yōu)選每《112超過(guò)1000。微陣列技術(shù)在通過(guò)引用納入的以下參考文獻(xiàn)中被公開(kāi)Schena(Ed)，Microarrays:APracticalApproach(IRLPress,Oxford,2000);Southern,C"atc"/Qp/".C7^附.倫/"么.404-410,1998。"隨機(jī)微陣列"是指這樣的微陣列，即其寡核苷酸或多核苷酸的空間上不連續(xù)區(qū)域不是空間上可尋址的。即，至少在開(kāi)始時(shí)，所連接的寡核苷酸或多核苷酸的身份從其位置是不可辨別的。在一個(gè)方面，隨機(jī)微陣列是微珠的平面陣列，其中每個(gè)微珠連接單一類型的雜交標(biāo)簽互補(bǔ)物，所述互補(bǔ)物例如來(lái)自最低限度相互雜交的一組寡核苷酸。同樣地，在形成之后，隨機(jī)陣列上的微珠或其寡核苷酸可以多種方式確定，包括通過(guò)光標(biāo)記物例如熒光染料比率或量子點(diǎn)、形狀、序列分析等。本文使用的"核苷"包括天然核苷，包括2，-脫氧形式及T-羥基形式，，J如如KornbergandBaker,DNAReplication,2ndEd.(Freeman,SanFrancisco,1992)中所述。"聚合酶鏈反應(yīng)"或"PCR"是指這樣的反應(yīng)，即通過(guò)DNA互補(bǔ)鏈的同時(shí)引物延伸體外擴(kuò)增特定的DNA序列。換句話說(shuō)，PCR反應(yīng)可用于制備側(cè)序列為引物結(jié)合位點(diǎn)的靶核酸的多個(gè)拷貝或復(fù)制物，這種反應(yīng)包括以下步驟的一次或多次重復(fù)(i)將靶核酸變性；(ii)將引物退火至所述引物結(jié)合位點(diǎn)，并且(iii)在存在三磷酸核苷的情況下通過(guò)核酸聚合酶延伸所述引物。通常地，所述反應(yīng)在熱循環(huán)儀器中循環(huán)經(jīng)歷為每一步驟最佳化的不同溫度。每一步驟的具體溫度、持續(xù)時(shí)間以及步驟之間變化的速率依賴于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的多種因素，例如以下參考文獻(xiàn)示例的McPhersonW(Eds)，爿尸rfl"/c"/J/7/;ra"c^and尸C/2.'」iVfl"/cfl/4p/7ra"c/i(IRLPress,Oxford,分別于1991年和1995年)。例如，在使用TaqDNA聚合酶的常規(guī)PCR中，可以將雙鏈的靶核酸在〉90。C的溫度下變性，將引物在35-卯。C的溫度范圍退火。術(shù)語(yǔ)"PCR"涵蓋該反應(yīng)的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、實(shí)時(shí)PCR、嵌套PCR、定量PCR、多重PCR等。反應(yīng)體積從數(shù)百納升例如200nL至數(shù)百//L例如200^L。"逆轉(zhuǎn)錄PCR"或"RT-PCR"是指通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進(jìn)行的PCR,所述PCR將靶RNA轉(zhuǎn)換成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后該單鏈DNA被擴(kuò)增，例如Tecott"a/，美國(guó)專利5,168,038,該專利通過(guò)引用的方式納入本文。"實(shí)時(shí)PCR"是指隨反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)其反應(yīng)產(chǎn)物即擴(kuò)增子的量的PCR。有多種形式的實(shí)時(shí)PCR，區(qū)別主要在于用于監(jiān)測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)化學(xué)，例如GelfandW，美國(guó)專利5,210,015("taqman");Wittwer"fl/,美國(guó)專利6，174，670和6,569,627(增補(bǔ)染料)；Tyagi"美國(guó)專利5，925，517(分子信標(biāo)(molecularbeacons));這些專利通過(guò)引用的方式納入本文。實(shí)時(shí)PCR的檢測(cè)化學(xué)被綜述于Mackay"tf/，iV"c/e/cJc油30:1292-1305，2002,該文獻(xiàn)也通過(guò)引用的方式納入本文。"嵌套PCR"是指一種兩階段PCR,其中第一次PCR的擴(kuò)增子變成使用一組新引物的第二次PCR的樣品，至少一個(gè)所述新引物可與所述第一擴(kuò)增子的內(nèi)部位置結(jié)合。"多核苷酸"或"寡核苷酸"可互換使用，均是指核苷酸單體的線性聚合物。組成多核苷酸和寡核普酸的單體能夠通過(guò)常規(guī)的單體-單體相互作用模式特異地結(jié)合成天然多核苷酸，所述單體-單體相互作用例如Watson-Crick型堿基配對(duì)、堿基堆積、Hoogsteen堿基配對(duì)、反Hoogsteen械基酉己對(duì)等。在多核苷酸或寡核苷酸通過(guò)字母序列(大寫字母或小寫字母)例如"ATGCCTG"表示的任何時(shí)候，應(yīng)理解的是除非在上下文中另外指出或是顯而易見(jiàn)的，否則核苷酸從左至右的順序?yàn)?'至3',并且"A"表示脫氧腺苷、"C"表示脫氧胞苷、"G"表示脫氧鳥(niǎo)苷且"T"表示胸苷、'T，表示脫氧肌苷、"U"表示尿苷。"引物"為這樣的天然的或合成的寡核苷酸，即其在與多核苷酸模板形成雙鏈體時(shí)能夠作為核酸合成的起始點(diǎn)，并沿模板從其3'端延伸使得形成延伸的雙鏈體。引物的延伸通常是以核酸聚合酶例如DNA聚合酶或RNA聚合酶進(jìn)行。在延伸過(guò)程中添加的核普酸的序列是由模板多核苷酸的序列確定。引物通常利用DNA聚合酶延伸。引物的長(zhǎng)度范圍通常從14個(gè)核苷23酸至40個(gè)核苦酸，或者從18個(gè)核苷酸至36個(gè)核苷酸。引物可被應(yīng)用于多種核酸擴(kuò)增反應(yīng)，例如使用單引物的線性擴(kuò)增反應(yīng)或者應(yīng)用兩個(gè)或多個(gè)引物的PCR。用于為特定應(yīng)用的引物選擇長(zhǎng)度和序列的指導(dǎo)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的，這被通過(guò)引用方式納入的以下參考文獻(xiàn)證實(shí)Dieffenbach(Ed)，/V/附e/v爿丄"6or"ZwjMawrni/,2ndEdition(ColdSpringHarborPress,NewYork,2003)。"樣品"是指來(lái)自生物、環(huán)境、醫(yī)學(xué)或患者的一些材料，在其中進(jìn)行耙核酸的檢測(cè)或測(cè)量。在一方面，它是指包括試樣或培養(yǎng)物(例如微生物培養(yǎng)物)。在另一方面，它是指同時(shí)包括生物樣品和環(huán)境樣品。樣品可以包括合成來(lái)源的試樣。生物樣品可以是動(dòng)物包括人的流體、固體(例如糞便)或組織，還可以是液體和固體的食物和飼料產(chǎn)品及拼料，例如乳制品、蔬菜、肉或肉副產(chǎn)物以及廢料。生物樣品可包括取自患者的材料，包括但不限于培養(yǎng)物、血液、唾液、腦脊液、胸腔液、乳、淋巴、痰、精液、穿刺抽出物等。生物樣品可以獲自所有不同科的家養(yǎng)動(dòng)物，以及野生家畜(feralanimal)或野生動(dòng)物，包括但不限于有蹄動(dòng)物、熊、魚、嚙齒動(dòng)物等這樣的動(dòng)物。環(huán)境樣品包括環(huán)境材料例如表面物質(zhì)、土壤、水和工業(yè)樣品，以及來(lái)自食物和乳加工設(shè)備、器具、裝置、器皿、一次性(disposable)產(chǎn)品和非一次性產(chǎn)品的樣品。這些實(shí)例不能被解釋為對(duì)本發(fā)明適用的樣品類型的限制。"固體載體"、"載體"、"固相載體"和"固體基質(zhì)"可互換使用，是指一種具有一個(gè)或多個(gè)硬或半硬表面的材料或一組材料。在許多實(shí)施方案中，所述固相載體的至少一個(gè)表面基本上應(yīng)是平的，但是在一些實(shí)施方案中對(duì)于不同化合物可能需要具有例如孔、凸起區(qū)域、針、蝕刻溝等的物理上分開(kāi)的合成區(qū)域。根據(jù)另一些實(shí)施方案，所述固相載體為珠子、樹(shù)脂、凝膠、微球或其他幾何構(gòu)型的形式。如以上指出的，乳相被看作"固相載體"或"固體基質(zhì)"。微陣列通常包含至少一種平面的固相載體，例如玻璃顯微鏡載玻片。所述載體還可以具有多個(gè)尺寸以使得可進(jìn)行分揀。固相載體上的核酸分子/引物可以是被直接地固定或者通過(guò)化學(xué)鍵或核苷酸鍵固定。所有這種偶聯(lián)化學(xué)被術(shù)語(yǔ)"連接子方式"涵蓋。實(shí)施例124為、,W樹(shù)游戶c/才黃圖1(i)提供的示意表示為增強(qiáng)型固相PCR,用于將單鏈擴(kuò)增子或雙鏈擴(kuò)增子加載至固相支持物上。待擴(kuò)增的DNA區(qū)域及來(lái)自其的擴(kuò)增子以實(shí)線表示。虛線表示靶區(qū)域之外的序列。引物(以箭頭表示)a表示"正向"PCR引物，b代表"反向，，引物。在該實(shí)施例中，固相載體以圓圈表示。需要注意的是，固相載體綴合有多個(gè)拷貝的固相栽體引物，但是為了示意圖的簡(jiǎn)化僅給出了一條固相載體引物。波浪線表示非靶特異的連接子序列。較長(zhǎng)、較寬的箭頭表示較高靶特異性Tm的引物。引物b可選地包含用于直接在檢測(cè)體系中使用的標(biāo)記分子，例如熒光(fluor)(以星號(hào)表示)?？梢匀芜x地包括標(biāo)記分子作為反應(yīng)底物，例如熒光標(biāo)記的dNTP。引物b任選地被設(shè)計(jì)，使得在給定溫度范圍內(nèi)，引物b與耙序列的結(jié)合以及從該引物的聚合酶延伸的引發(fā)比引物a更有效。實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)的設(shè)計(jì)方法的一個(gè)實(shí)例包括的引物b具有比引物a更高的靶特異性熔解溫度，使得在提高的退火溫度下引物b結(jié)合并引發(fā)，而引物a不結(jié)合及引發(fā)。另一個(gè)實(shí)例為其中引物a在一特定溫度下呈現(xiàn)"平鍋柄抑制"，使得在該溫度下引物b結(jié)合并引發(fā)，而引物a不結(jié)合及引發(fā)。引物a和引物b被應(yīng)用為包括固相載體引物在內(nèi)的常規(guī)PCR或非對(duì)稱PCR的一部分。在允許所有引物的熱循環(huán)條件下以包括引物a、引物b和固相載體綴合引物進(jìn)行常規(guī)PCR。固相載體引物被設(shè)計(jì)，使得在給定的溫度范圍內(nèi)從所述引物引發(fā)的聚合酶延伸比從引物a引發(fā)的聚合酶延伸更有竟?fàn)幜?。圖1:(ii)2、(ii)3和(ii)4中描述的固相載體引物的設(shè)計(jì)，由于例如較高的Tm及/或是被嵌套的或部分嵌套的，而提供了優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)((ii)1)的改良的固相載體參與?，F(xiàn)有技術(shù)(ii)1使用同一地匹配相應(yīng)"7jc相"引物的靶特異性序列以及5-端連接子序列。在本文描述的實(shí)施例中，(ii)2包括3-端序列延伸，以相對(duì)于(ii)l提高Tm;(ii)3包括這樣的靶特異性序列，即該序列相對(duì)于(ii)l是嵌套的或部分嵌套的，但靶特異性Tm類似于(ii)1;并且(ii)4包括這樣的靶特異性序列，即該序列相對(duì)于(ii)l是嵌套的或部分嵌套的，且具有比(ii)l高的靶特異性Tm。這些設(shè)計(jì)差異為固相載體引物參與提供了優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的動(dòng)力學(xué)優(yōu)點(diǎn)，使得有利于擴(kuò)增子的固相栽體加載。在后面的熱循環(huán)過(guò)程中，退火步驟相對(duì)于前面的循環(huán)可以任選地具有升高的或降低的溫度，使得固相栽體引物仍退火以有效地靶向，但竟?fàn)幷?水相"引物a不退火。例如，如果固相載體引物在升高的溫度下呈現(xiàn)出比引物a更高的靶特異性Tm，那么固相載體引物可引發(fā)但引物a不引發(fā)。另一個(gè)實(shí)施例為，引物a在低于一個(gè)特定溫度的溫度下呈現(xiàn)"平鍋柄抑制"，使得低于該溫度時(shí)固相載體引物結(jié)合并引發(fā)，而引物a不結(jié)合及引發(fā)。引物b可以被設(shè)計(jì)以具有與引物a或固相載體引物類似的引發(fā)特性。多次后面的這些循環(huán)的應(yīng)用(其中引物b不能有效地結(jié)合靶)使得能夠生成單鏈的固相栽體擴(kuò)增子。后面的這些循環(huán)的應(yīng)用(其中引物b不能有效地結(jié)合靶)使得能夠生成雙鏈的固相栽體擴(kuò)增子。后面的這些循環(huán)的應(yīng)用(其中引物b不能有效地結(jié)合靶)和隨后的允許b結(jié)合的條件使得能夠生成雙鏈的固相載體擴(kuò)增子。任選地，通過(guò)例如熱變性或化學(xué)變性以及洗去溶液相或者例如外切核酸酶處理，可以在隨后將雙鏈的固相載體擴(kuò)增子轉(zhuǎn)換成單鏈的固相載體擴(kuò)增子。實(shí)施例2絲為、,財(cái)考參OJ才黃增強(qiáng)型固相PCR(ESP-PCR)是本文設(shè)計(jì)的一種機(jī)制，該機(jī)制將高敏感的無(wú)損失對(duì)稱"水相"PCR與有效的固相栽體加載結(jié)合。ESP-PCR通過(guò)通過(guò)消除"水相"引物和固相載體引物之間的竟?fàn)幐淖兞藢U(kuò)增子加載至固相載體上的機(jī)制，以增加固相載體引物的引發(fā)(圖2)。"水相"引物不是必須被限制，因此使得體系更敏感。再者，ESP-PCR固有的引物設(shè)計(jì)提供了這樣的任選的可能性，即在專門允許固相栽體引物結(jié)合的退火溫度下進(jìn)行后面的熱循環(huán)。該實(shí)施例詳細(xì)地描述了使用恒定固相載體材料、引物表面密度和"連接子"序列進(jìn)行的ESP-PCR，其范圍和意圖為剖析ESP-PCR相對(duì)于SP-PCR的機(jī)制優(yōu)點(diǎn)。寡核苷酸購(gòu)自IntegratedDNATechnologies(CoraMlle，USA)。模板生成寡核苷酸以及ESP-PCR和SP-PCR寡核苷酸在下文列出。綴合效率測(cè)量寡核苷酸(Transprobe)序列為/5AmMC6/GTCCATAGCTGTCCTCCCT(SEQIDNO:l)。所有寡核苷酸序列以5-端至3-端的方向列出。/5Phos/、/5AmMC6/、/5Acryd/和/1AmMC6T/分別表示5-端磷酸、5-端胺修飾物、5-端亞磷酰胺(acrydite)和內(nèi)部胺修飾物基團(tuán)。Ngo、Ngps和Cto3分別是指淋病奈瑟菌(iVe/Men'"^mo/r/^^i)o/7fl、'淋病奈瑟菌/75和沙目艮衣原體(C似flffij^'")隱蔽性質(zhì)粒or/3。下劃線區(qū)域表示包括在固相載體引物的5-端部分中以有利于在"擴(kuò)增子加載"過(guò)程中呈現(xiàn)靶特異性部分的非靶"連接子"序列。SP-PCR和ESP-PCR固相載體引物共有的這種"連接子，，序列還被用作Transprobe雜交把標(biāo)，用于評(píng)估在綴合后至固相載體上的引物加載。差凝茅^凝合f二真化^微承在4吏直4圣6,8nm的二氧4匕硅微球(BangsLaboratories,Fishers,USA)與寡核苷酸綴合之前將其經(jīng)巰基(sulphydryl)功能化。整合DNA技術(shù)產(chǎn)品的文獻(xiàn)詳細(xì)描述了固相栽體硫醇(thiol)和5-端亞磷酰胺基團(tuán)修飾的寡核苷酸之間的相互作用(可在線獲自網(wǎng)站gies/b/*/4/toc/VigO//go/zf/c/goZ/<festo5V>/zV/SuDDorts.Ddf)。在綴合后，微球經(jīng)一系列的5個(gè)離心/洗滌步驟處理以去除任何未結(jié)合的寡核苷酸，然后懸浮于緩沖液中至1mg/ml。通過(guò)以下方式評(píng)估寡核苷酸與微球的綴合水平將1nl的均質(zhì)微球懸液與5pi的含50mM氯化鈉的緩沖液和0.5pi的10jiMAlexafluor647標(biāo)記的Transprobe(以比例為2:1的總Transprobe:Alexafluor647標(biāo)記的Transprobe)混合。Alexafluor647購(gòu)自MolecularProbes(MountWaverley，Australia)。使雜交混合物經(jīng)過(guò)以下"雜交，，熱曲線90。C下30秒，然后以1。C/10秒的速率冷卻至20°C。在雜交后，在用FACS陣列(BectonDickinson,NorthRyde，Australia)分析前添加120jil緩沖液。本研究中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)來(lái)自該流水線的測(cè)定方案。微球可以在PCR后經(jīng)受更嚴(yán)格的洗滌，其效應(yīng)為降低"非模板對(duì)照"的背景熒光，同時(shí)不改變模板ESP-PCR或SP-PCR樣品的信號(hào)強(qiáng)度。將微球在以以下電壓參數(shù)運(yùn)行的同一臺(tái)儀器上平行地評(píng)估3次FCS550、SSC400、FarRed100、Yellow650、NIR200、Red700、FCS閾值20000。*.fcs文件經(jīng)FCSExpressv.3分析，以確定紅色熒光的中值。Student'sT-檢驗(yàn)4皮應(yīng)用于證明ESP-PCR和SP-PCR靶標(biāo)對(duì)之間固相載體引物-微球結(jié)合相等。沙眼衣原體血清變型EDNA被用作使用Cto3模板生成正向及反向引物的PCR的模板，以產(chǎn)生包括ESP-PCR/SP-PCR寡核苷酸靶區(qū)域的擴(kuò)增子。擴(kuò)增子是使用Qiaquick(注冊(cè))凝膠提取試劑盒(Qiagen,Doncaster，Australia)純化的瓊脂糖膠。通過(guò)以HyperladderIVDNA標(biāo)準(zhǔn)品(Bioline，Alexandria,Australia)為參照的產(chǎn)物凝膠電泳評(píng)估確定產(chǎn)率的大約值。類似地，淋病奈瑟菌ATCC林43069被用作PCR模板，以使用它們各自的耙生成引物生成Ngo和Ngps靶標(biāo)。所有ESP-PCR和SP-PCR均在使用1個(gè)單位HotStarTaq注冊(cè)(Qiagen，Doncaster,Australia)的20pi反應(yīng)體積中進(jìn)行。向HotStarTaq(注冊(cè))反應(yīng)緩沖液補(bǔ)充Mg2+和dNTP(NewEnglandBiolabs,Genesearch，Arundel,Australia)，以分別產(chǎn)生2mM和200jiM的反應(yīng)物濃度。在反應(yīng)中包含有1fil的5jiM"水相"正向引物、1pi的5jiM"水相"反向引物(以2:1的總寡核苷酸:熒光-標(biāo)記的寡核苷酸比率用Alexafluor647標(biāo)記)和1jil的1mg/ml固相載體引物綴合的微球的懸液。綴合SP-PCR或ESP-PCR固相載體引物的微球分別被包括在SP-PCR和ESP-PCR反應(yīng)中。ESP-PCR和SP-PCR為使用同一種主混合物(mastermix)平行地進(jìn)行3次。在每種情況下，將引物和微球依照靶和模板進(jìn)行分組。反應(yīng)分別包含40000拷貝的Cto3、40000拷貝的Ngo和400000拷貝的Ngps模板。應(yīng)用的熱曲線如下94°C15分鐘，然后[90°C30秒、44°C1分鐘、72°C1分鐘的30個(gè)循環(huán)，然后[90。C、44°C2分鐘、72。C2分鐘]的5個(gè)循環(huán)。在固相PCR后，將底部的5nl轉(zhuǎn)移至96-孔微滴定板中的120jil的緩沖液中。氣fcs文件是以與前文所述相同的儀器設(shè)置通過(guò)FACS陣列生成。使用FCSExpress^3確定紅色熒光圖像的中值。流式細(xì)胞術(shù)取樣后，將8nl的殘留PCR產(chǎn)物使用3V。瓊脂糖/TAE凝膠以1.5pg的NewEnglandBiolabs100bp的梯狀標(biāo)準(zhǔn)物(Genesearch，Arundel，Australia)為參照進(jìn)4亍分沖斤。模板生成寡核苦酸Cto3模板生成正向引物GATGCGGAAAAAGCTTACCAGCto3模板生成反向引物GGGCTTAGAATCACCTTCTCGNgo模板生成正向引物GCGGATTAACAAAAATCAGGACAANgo模板生成反向引物TAATCTGCCGCTATCCTCCAGNgps模板生成正向引物TnTTTGCCGGCGTGGCATCCNgps模板生成反向引物ATCGATATATTATTTCCACCGGAACESP-PCR和SP-PCR寡核苷酸Cto3"水相"正向引物/5Phos/ACAGACCCTTCTCTAGGTCto3"水相"反向引物/5AmMC6/AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTnTGGGTGTGACTGTGCto3SP-PCR固體支持物引物/5Acrvd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGCTATGGACACAGACCCTTCTCTAGGTCto3ESP-PCR固體支持物引物/5Acrvd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGCTATGGACCACTAATAAAATTCAATGCAACGGGTTATTCACTCNgo"水相"正向引物/5Phos/GCCATATTGTGTTGAAACACNgo"水相"反向引物/5AmMC6/AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTTTGACCGGTTAAAAAAAGANgoSP-PCR固體支持物引物/5Acrvd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGCTATGGACGCCATATTGTGTTGAAACACNgoESP-PCR固體支持物《1物/5Acrvd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGCTATGGACCCCGATATAATCCGCCCTTCAACATCAGTGNgps"水相"正向引物/5Phos/AATGAGGCAAATTAGGCCTNgPs"水相"反向引物/5AmMC6/AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTTGCAAACCCTTAAAAGACNgpsSP-PCR固體支持物引物/5Acrvd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGCTATGGACAATGAGGCAAATTAGGCCTNgpsESP-PCR固體支持物引物/5Acrvd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGGACAGCTATGGACAAATCAAGCGGTAAGTGATTTCCCACGGC遞^f5P-戶Ci絲;^遼紗,,狹稀#趁麟,f縱將以上列出的NgoESP-PCR和Cto3ESP-PCR固相載體引物分別與直徑5.6nm和直徑6.8jim的二氧化硅微球(BangsLaboratories)綴合，洗滌并以每珠子群lmg/ml進(jìn)行混合。l微升混合的珠子懸液被包含于下述ESP-PCR反應(yīng)中，所述ESP-PCR反應(yīng)包含淋病奈瑟菌29物5，-GGCAACGMCGTACCGGTTT-3，(SEQIDNO:20)和5-端Alexafluor647國(guó)標(biāo)記的5，-ACGTCACAGTTTACGCGTTTGACCGGTTAAAAAAAGATTTTCAC-3，(SEQIDNO:21)，以及沙眼衣原體隱蔽性質(zhì)粒0/^3引物5，-AGCTTTTAACAACTTTCCAATCACTA-3，(SEQID122)和5-端Alexafluor647-標(biāo)記的5，-ACGACTCACTATAGGGTCCCAGAGCTTTTGGGTGTG-3，(SEQID123)。攜帶上面列出(見(jiàn)模板生成)涵蓋沙眼衣原體隱蔽性質(zhì)粒o/^的擴(kuò)增子區(qū)域的淋病奈瑟菌ATCC林43069基因組DNA或質(zhì)粒被用作PCR模板(包含5ngJurkat人基因組DNA)，作為對(duì)比的是僅人基因組DNA或水對(duì)照。反應(yīng)是以使用2個(gè)單位PlatinumTaq[商標(biāo)](Invitrogen)的20jil總體積進(jìn)行，使用了以下的循環(huán)參數(shù)94。C2分鐘，然后[9(TC30秒，55°C1分鐘，72°C1分鐘]的50個(gè)循環(huán)，然后72°C5分鐘。將二氧化珪微球以緩沖液離心/洗滌2次，然后使用上文列出的儀器設(shè)置進(jìn)行FACS陣列分析。在綴合后將微球徹底洗滌，然后懸浮于緩沖液中至1mg/ml。寡核苷酸與微球綴合的水平的評(píng)估是通過(guò)以下方式進(jìn)行的將Alexafluor647(MolecularProbes)標(biāo)記的"Transprobe"雜交至固相栽體引物連接子序列上，然后進(jìn)行流式細(xì)胞分析。將微球在以以下電壓參數(shù)運(yùn)行的同一臺(tái)儀器上平行地評(píng)估3次FCS550、SSC400、FarRed100、Yellow650、NIR200、Red700、FCS閾值20000。*.fcs文件經(jīng)FCSExpressv.3分析，以確定紅色焚光的中值。Student'sT-檢驗(yàn)4皮應(yīng)用于證明ESP-PCR和SP-PCR耙對(duì)之間固相載體引物-微球綴合相等(iVgo/m,P=0.919;TVg/m/S,P-0.759;CVCPw/5，P=0.829)。照這樣，與應(yīng)用SP-PCR后相比，在應(yīng)用ESP-PCR后出現(xiàn)的擴(kuò)增子加載方面的l壬何增加均應(yīng)歸因于改良的固相載體引發(fā)，而不能歸因于不同的固相載體引物綴合水平。ESP-PCR和SP-PCR之間的比較實(shí)驗(yàn)是在使用1個(gè)單位HotStarTaq[注冊(cè)(Qiagen)的20pi反應(yīng)體積中進(jìn)行。向HotStarTaq(注冊(cè))反應(yīng)緩沖液補(bǔ)充Mg2+和dNTP(NewEnglandBiolabs)，以分別產(chǎn)生2mM和200nM的反應(yīng)物濃度。在反應(yīng)中包含的有1nl的5jiM"水相"正向引物、1nl的5fiM"水相"反向引物(以2:1的總寡核苷酸:熒光-標(biāo)記的寡核普酸比率用Alexafluor647標(biāo)記)和1pi的1mg/ml固相載體引物綴合的微球的懸液。綴合SP-PCR或ESP-PCR固相載體引物的微球分別被包括在SP-PCR和ESP-PCR反應(yīng)中。ESP-PCR和SP-PCR為使用同一種主混合物平行地進(jìn)行3次。在每種情況下，將引物和微球依照靶和模板(包含引物結(jié)合區(qū)域的線性dsDNA)進(jìn)行分組。反應(yīng)分別包含40000拷貝的沙眼衣原體隱蔽性質(zhì)粒wy5、40000拷貝的和400000拷貝的淋病奈瑟菌戶/W模板，或者無(wú)模板對(duì)照物(以顯示背景熒光水平)，并且應(yīng)用以下的熱曲線94°C15min,然后[^)。C30s，44°C1min，72°C1min]的30個(gè)循環(huán)，然后[90。C,44°C2min,72°C2min的5個(gè)循環(huán)。在固相PCR后，將底部的5jil轉(zhuǎn)移至96-孔孩i滴定板中的120jil的緩沖液中。氣fcs文件是以與前文所述相同的儀器設(shè)置通過(guò)FACS陣列生成。使用FCSExpressv.3確定紅色熒光圖像的中值。ESP-PCR在所有3個(gè)靶標(biāo)評(píng)估中都產(chǎn)生比SP-PCR顯著提高的固相載體擴(kuò)增子加栽(表3)，有強(qiáng)的統(tǒng)計(jì)顯著性iVgo/m(9.89-倍，P-0.00000661)、iVg/H7S(2.14-倍，P-0.001095)及CVCPo/^(1.41-倍，P=0.000935)。P值與ESP-PCR和SP-PCR之間擴(kuò)增子加載無(wú)差異的零假設(shè)有關(guān)。倍數(shù)增加是指ESP-PCRRFU/SP-PCRRFU。倍數(shù)增加在靶標(biāo)之間的變化不是不可預(yù)知的，這是由于寡核苷酸之間雜交效率的內(nèi)在差異以及其中包括復(fù)雜的竟?fàn)幮噪s交事件的事實(shí)。盡管有這種差異，ESP-PCR在所研究的靶標(biāo)中普遍是有利的。來(lái)自與用于流式細(xì)胞測(cè)量相同的反應(yīng)器的非微球結(jié)合"水相"擴(kuò)增子在ESP-PCR后與在SP-PCR后，在所有耙之間有相同的產(chǎn)率，這是通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估的。在反應(yīng)混合物中有或無(wú)微球時(shí)"水相"產(chǎn)物產(chǎn)率也是相同的，這表明二氧化硅微球與固相載體引物綴合不損害擴(kuò)增效率。ESP-PCR后，將固相載體經(jīng)多重的離心及緩沖液交換步驟徹底洗滌，并用于包含前文使用的"水相"引物及"水相"形式的固相載體引物的模板受限的循環(huán)"再擴(kuò)增"反應(yīng)。大小與源自固相載體引物及"水相"反向引物的那些預(yù)期產(chǎn)物相符合的單產(chǎn)物帶出現(xiàn)于凝膠電泳上，這表明ESP-PCR固相支持物產(chǎn)物是特異的?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明ESP-PCR以一種特定方式成功地達(dá)到了這樣的雙重目標(biāo)，即與標(biāo)準(zhǔn)SP-PCR相比不損害"水相"擴(kuò)增并且提高擴(kuò)增子的固相載體表面加載。這些出現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)可歸因于加載機(jī)制，其中(i)固相載體引物的有效濃度由于其相對(duì)高的T^而被提高。指數(shù)后線性PCR(LATE-PCR)通過(guò)非對(duì)稱PCR可提高單鏈產(chǎn)物的生成(SanchezW"/，_Prac.iVW/.4c^w/.Sd.71933-1938，2004)。在該方法中，"更緊密結(jié)合的"、限制濃度的引物被應(yīng)用以增加其在該反應(yīng)中的"有效濃度"，這基于由"最近鄰"公式所描述的引物r附和引物濃度之間的關(guān)系(SantaLucia，iVflZ/.爿c"ASd.C/SJ95:1460-1465，1998)。在ESP-PCR中，該原理,皮應(yīng)用于固相載體引物。"更緊密結(jié)合的，，固相載體引物具有提高的"有效濃度"及改良的結(jié)合和引發(fā)動(dòng)力學(xué)。(ii)固相載體引物相對(duì)于其"水相"對(duì)應(yīng)物是嵌套的。因?yàn)楣滔嘣泽w引物可識(shí)別所述"水相"正向引物的不同結(jié)合位點(diǎn)，所以對(duì)于擴(kuò)增子結(jié)合的直接竟?fàn)幈幌?。與SP-PCR不同，在ESP-PCR中為了使固相載體引發(fā)被固相栽體引物結(jié)合位點(diǎn)的"封閉"所抑制，"水相"正向引物必須結(jié)合于擴(kuò)增子模板，聚合酶必須隨后找到并結(jié)合該底物，并且聚合反應(yīng)必須在短時(shí)間范圍內(nèi)緊接著進(jìn)行。在標(biāo)準(zhǔn)SP-PCR和非對(duì)稱SP-PCR二者中，水相引物與其引物結(jié)合位點(diǎn)的簡(jiǎn)單結(jié)合足以抑制固相載體引發(fā)。在PCR鎖止(PCRClamping)的方法中，擴(kuò)增可被內(nèi)部的(嵌套的)肽核酸或鎖核酸(lockednucleicacid)探針特異地P且斷(DominguezandKolodney，Owcogewe24:6830-6834，2005;OrumCfl/，iVMc/"c^l"Vfeif饑W:5332-5336，1993)。與ESP-PCR的固相載體引物類似，PCR鎖止方法的封閉探針可在引物結(jié)合并有機(jī)會(huì)發(fā)生聚合反應(yīng)之前結(jié)合擴(kuò)增子。仍然應(yīng)用ESP-PCR原理，使用"水相"引物及熱循環(huán)參數(shù)，5個(gè)淋病奈瑟菌基因組和5個(gè)沙眼衣原體基因組等價(jià)物被每個(gè)單獨(dú)的多重ESP-PCR反應(yīng)通過(guò)FACS陣列檢測(cè)。該方法4吏用綴合于不同直徑的二氧化硅微球上的固相載體引物，以利于通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分辨。反應(yīng)以包含沙眼衣原體靶區(qū)域的淋病奈瑟菌基因組DNA和質(zhì)粒為模板(包含Jurkat人基因組DNA),作為對(duì)比的是僅Jurkat人基因組DNA或水。表3窗;^我豕i^^f>我與S戶-PO靶無(wú)模板對(duì)照SP-PCRSP-PCR無(wú)模板對(duì)照ESP-PCRESP-PCR37.18RFU52.98RFU(U2)44.91RFU523.74RFU(15.24)40.68RFU74.36RFU(1.78)39.60RFU159.09RFU(9.92)41.79RFU209.84RFU(5.10)38.89RFU295.39RFU(8.33)32與SP-PCR相比，在ESP-PCR后具有紅色熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子的二氧化硅微球的加栽增加。RFU是指相對(duì)的熒光單位。括號(hào)中的數(shù)字代表3次重復(fù)平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。與SP-PCR比較，ESP-PCR在以下的臨床相關(guān)靶點(diǎn)中應(yīng)用二氧化硅微球作為固相載體淋病奈瑟菌op"(7Vgo/m)、/7/AJ(A^/w'/51)和沙眼衣原體隱蔽性質(zhì)粒/od(Crt7Por/3)[McLeod"/m/c"/owfl/it/im附ww/j^67:3469-3480，1999;ComanducciCfl/，/.GewM/cra6,》/"9:1083-1092，1993。簡(jiǎn)言之，ESP-PCR和SP-PCR固相栽體引物的制備如下在使直徑6.8nm的二氧化硅微球(BangsLaboratories)與亞磷酰胺基團(tuán)修飾的寡核苷酸綴合之前，對(duì)其進(jìn)行巰基官能化。實(shí)施例3"^》,W，4'"^A為、步W，五5^-戶Ci和5^-戶C/針對(duì)沙眼衣原體隱蔽性質(zhì)粒^y靶，平行地建立熱分步的或非分步的方案作為實(shí)施例2中所述實(shí)驗(yàn)的一部分。對(duì)于"非分步的"PCR，采用熱曲線44-44:94。Cl5min,然后[30個(gè)循環(huán)90°C30秒、44。Cl分鐘、72。Cl分鐘，然后[5個(gè)循環(huán)卯。C、44。C2分鐘、72。C2分鐘j。對(duì)于"分步的"PCR，采用熱曲線44-60:94。C15min,然后[30個(gè)循環(huán)90°C30秒、44°C1分鐘、72°C1分鐘]，然后5個(gè)循環(huán)90。C、60°C2分鐘72'C2分鐘I。結(jié)果顯示于表4中。在固相PCR后，將底部的5jil轉(zhuǎn)移至96-孔微滴定板中的120jil的緩沖液中。*.fcs文件是以與實(shí)施例2中所述相同的儀器設(shè)置通過(guò)應(yīng)用BDFACS陣列生成。使用FCSExpress^3確定紅色萸光圖像的中值。流式細(xì)胞術(shù)取樣后，將8pl的殘留PCR產(chǎn)物使用3。/。w/v瓊脂糖/TAE凝膠以1.5ng的NewEnglandBiolabs100bp的梯狀標(biāo)準(zhǔn)物為對(duì)照(Genesearch，Arundel,Australia)進(jìn)行電泳。研究了作為ESP-PCR方案一部分的最佳"熱步驟"的潛在優(yōu)點(diǎn)(44-60)。與"非分步的"熱ESP-PCR方案(44-44)相比，在后面的PCR循環(huán)過(guò)程中較高的退火溫度提高了沙眼衣原體隱蔽性質(zhì)粒擴(kuò)增子的表面加載((增加1.15倍)(Student'sT-檢驗(yàn)，結(jié)果相同的可能性P=0.0124))。來(lái)自同一反應(yīng)器的非微球結(jié)合擴(kuò)增子的凝膠電泳圖被通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行評(píng)估。在所有情況下，觀察到可比較的"水相"PCR產(chǎn)物產(chǎn)率則表明微球擴(kuò)增子加載的差異不受"水相"PCR產(chǎn)物產(chǎn)率的影響。在反應(yīng)混合物中包含有或者無(wú)微球的情況下，水相產(chǎn)物產(chǎn)率之間沒(méi)有可辨別的不同。表4趟<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>與"非分步的"ESP-PCR相比，"熱分步的，，ESP-PCR后，具有紅色熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子的二氧化硅微球的加載增加。Ctorf3是指沙眼衣原體隱蔽性質(zhì)粒orf3。RFU是指相對(duì)的熒光單位。括號(hào)中的數(shù)字代表3次重復(fù)平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，本文所述的發(fā)明允許除了被明確描述的那些之外的變化及修改。應(yīng)理解的是，本發(fā)明包括所有這種變化及修改。本發(fā)明還單獨(dú)地或綜合地包括本說(shuō)明書中提及或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及任何兩種或多種所述步驟或特征的任意及所有組合。參考文獻(xiàn)McPhersonefa/.(Eds),jPC/:爿戶racf!'ca/乂/ip"oacAand尸C及2..yi/Vac"oz/^Pproac/t:IRLPress,OxfoTd，腦McPherson"<2/.(Eds)，尸C及/Vacrica/yip/roac/andPCR2:爿/Vac"'caZ/4/,oacA,IRLPress,Oxford,1995Mackayefa/，油ctec4c!W5ie鄉(xiāng)ArA,30:1292-1305，2002Oram"a/，Wwc/e!c/lcVfc":5332-5336，1993SanchezWa/，尸wc.層.爿c^/.Sci,固廳1933-1938，2004SantaLucia,/Voc.Wa".ytcad.Scf.(7&495:1460-1465,1998Schena(Ed),Microarrays:APracticalApproach(IRLPress,Oxford,2000);Southern,CKrre/if6>/'.Oie/n.5/o/.，么404-410，1998Shch印inov"fl/,M/c.力c油.25:4447-44541997StrachanandRead,T/u/nanMb/ecw/arGene"'"，SecondEdition,Wiley-Liss，NewYork:1999Tecotta/,U.S.PatentNo.5,168,038權(quán)利要求1.一種用于在反應(yīng)器中生成單鏈多核苷酸的方法，所述方法包括通過(guò)以下方式將雙鏈的靶多核苷酸或其單鏈的衍生物進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增在實(shí)現(xiàn)固定引物延伸的反應(yīng)條件下，將其上具有以連接子方式結(jié)合的引物的固體基質(zhì)與包含至少一種核酸分子的樣品接觸，其中所述固定引物選自(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和(ii)嵌套于兩個(gè)水相引物之間的引物；以有利于生成固定于所述固體基質(zhì)上的雙鏈多核苷酸，然后使所述固定的多核苷酸處于變性條件以生成一條固定的單鏈多核苷酸及一條液相的單鏈多核苷酸。2.權(quán)利要求1的方法，還包括一個(gè)相分離步驟，以分離固定的單鏈多核苷酸或水相的單鏈多核苷酸。3.—種用于核酸分子的固相擴(kuò)增的方法，其包括在實(shí)現(xiàn)固定引物延伸的反應(yīng)條件下，將其上具有以連接子方式結(jié)合的引物的固相載體與包含至少一種核酸分子的樣品接觸，其中所述固定引物選自(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和(ii)嵌套于兩個(gè)水相引物之間的引物。4.權(quán)利要求1或3的方法，其中所述不同熔解溫度是由于以下因素中的一種或多種不同退火溫度、引物和靶互補(bǔ)多核苷酸之間錯(cuò)配程度以及/或者外來(lái)序列的存在。5.權(quán)利要求4的方法，其中一個(gè)或兩個(gè)所述引物包含在同源性列「從而提供^于所述另一個(gè);l物、的熔解溫』。、，\^、6.權(quán)利要求l、3、4或5的方法，其中所述待擴(kuò)增的靶標(biāo)包含凹的5，端或平端，將所述靶標(biāo)與一種5，至3，外切核酸酶一塊孵育以生成單鏈的多核苷酸模板。7.—種以單鏈多核苷酸標(biāo)記固體基質(zhì)的方法，所述方法包括使用在第一組退火條件下具有相似退火特性但在第二組退火條件下具有局部t匕f曰數(shù)擴(kuò)增，將擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物與其上固定有至少一種這樣的引物的固體基質(zhì)或固體基質(zhì)組合物接觸，即該引物能夠在第二組退火條件下與所述擴(kuò)增產(chǎn)物的鏈退火，并且將退火條件轉(zhuǎn)換成所述第二組條件，從而有利于基于基于單引物的擴(kuò)增以生成固定于所述固體基質(zhì)上的單鏈多核苷酸。8.—種用于標(biāo)記固體基質(zhì)的方法，其包括在實(shí)現(xiàn)固定引物延伸的反應(yīng)條件下，將其上具有以連接子方式結(jié)合的引物的固相載體與包含至少一種核酸分子的樣品接觸，其中所迷固定引物選自(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和(ii)嵌套于兩個(gè)水相引物之間的引物。9.權(quán)利要求7或8的方法，其中所述不同退火條件或不同熔解溫度是由于以下因素中的一種或多種不同退火溫度、引物和靶互補(bǔ)多核苷酸之間錯(cuò)配程度以及/或者外來(lái)序列的存在。10.權(quán)利要求9的方法，其中一個(gè)或兩個(gè)所述引物包含在同源性列，從而提供高于所述另一個(gè)引物的熔解溫度。11.權(quán)利要求7、8、9或10的方法，其中所述待擴(kuò)增的靶標(biāo)包含凹的5，端或平端，將所述耙標(biāo)與一種5，至3，外切核酸酶一塊孵育以生成單鏈的多核苷酸模板。12.權(quán)利要求7、8、9或10的方法，還包括在所述反應(yīng)經(jīng)受所述第二組退火條件后，轉(zhuǎn)換回一組允許的退火條件，以有利于在固定的單鏈多核苷酸上生成互補(bǔ)鏈以形成固定于固體基質(zhì)上的雙鏈體多核苷酸。13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中所述多核苷酸為DNA。14.一種在反應(yīng)器中生成ssDNA的方法，所述方法包括使用在第一組退火條件(互相允許條件)下具有相似的(平衡的)退火引物但在第二組退火條件(差異允許條件)下具有局部退火特性的一對(duì)正向和反向引物在反應(yīng)器中進(jìn)行從dsDNA或mRNA靶標(biāo)到固定的靶ssDNA模板的擴(kuò)增反應(yīng)，其中所述擴(kuò)增被允許在互相允許的退火條件下進(jìn)行；將條件轉(zhuǎn)換成差異允許條件以使引物失去平衡，從而基本上在僅存在單引物的情況下有利于線性擴(kuò)增，以生成ssDNA產(chǎn)物；并且使任何聚合酶活性失活以基本上減少或者阻止dsDNA形成。15.—種用于生成以雙鏈多核苷酸標(biāo)記的固體基質(zhì)或固體基質(zhì)組合物的方法，所述方法包括在實(shí)現(xiàn)固定引物延伸的反應(yīng)條件下，通過(guò)將其上具有以連接子方式結(jié)合的引物的固相載體與包含至少一種核酸分子的樣品接觸，對(duì)雙鏈的靶多核苷酸或其單鏈的衍生物進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，其中所述固定引物選自(i)與水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解溫度的引物；和(ii)嵌套于兩個(gè)水相引物之間的引物。16.權(quán)利要求14或15的方法，其中所述待擴(kuò)增的靶標(biāo)包含凹的5'端或平端，將所述靶標(biāo)與一種5，至3，外切核酸酶一塊孵育以生成單鏈的多核苷酸模板。17.權(quán)利要求6、11或16的方法，其中將所述外切核酸酶與等溫?cái)U(kuò)增所需的試劑一塊孵育。全文摘要本發(fā)明在廣義上涉及在增強(qiáng)型固相多核苷酸擴(kuò)增后生成單鏈核酸分子的方法。本發(fā)明應(yīng)用使用這樣的引物的擴(kuò)增反應(yīng)，即在特定退火條件下具有不同引發(fā)特性的引物或者嵌套于兩個(gè)水相引物之間的固定引物。因此，通過(guò)引物設(shè)計(jì)，與水相引物相比提高了固相載體引物的參與。本發(fā)明還提供了以單鏈及雙鏈核酸分子標(biāo)記固體基質(zhì)的方法。用于生成單鏈核酸分子及用于進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的試劑盒也形成本發(fā)明的一部分。本發(fā)明還提供了用于生成任選地以報(bào)告分子標(biāo)記的單鏈核酸分子的擴(kuò)增體系，以及它們尤其作為標(biāo)簽、引物和探針的用途。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101680012SQ200880003836公開(kāi)日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年2月1日優(yōu)先權(quán)日2007年2月2日發(fā)明者D·J·帕克,K·F·波特,Z·卡恩申請(qǐng)人:杰納羅生物系統(tǒng)有限公司