專利名稱：：在轉(zhuǎn)基因單子葉植物中產(chǎn)生重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-ⅰ(igf-ⅰ)和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在單子葉植物中產(chǎn)生哺乳動(dòng)物，特別是人的蛋白質(zhì)。通過在轉(zhuǎn)基因稻中成功產(chǎn)生IGF-I和IGFBP-3加以說明。
背景技術(shù)：
：胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-3(IGFBP-3)是調(diào)節(jié)細(xì)胞和組織的存活、生長(zhǎng)和分化的重要蛋白質(zhì)。人IGF-I是70個(gè)氨基酸殘基的單鏈多肽，它由染色體12上的一個(gè)基因編碼。它與胰島素原和胰島素具有48%氨基酸序列相同性。IGF-I含有三個(gè)鏈內(nèi)二硫橋鍵，位于A20-B18、A6-A11和A7-B6，但沒有糖基化位點(diǎn)。大部分循環(huán)IGF-I在肝臟中合成，并且受生長(zhǎng)激素(GH)、胰島素和營(yíng)養(yǎng)攝取的調(diào)節(jié)。循環(huán)IGF-I水平相對(duì)穩(wěn)定，主要由于其組成型的分泌模式和IGF-I與高親和結(jié)合4蛋白的結(jié)合。然而，IGF-I調(diào)節(jié)異?？赡茉谝葝u素耐受和其它代謝異常的發(fā)生中起到一定作用。IGF-I在糖代謝調(diào)節(jié)中的確切作用尚不清楚，但在調(diào)節(jié)代謝中非常重要。在健康志愿者中，重組的人IGF-I(rMGF-I)可行使急性低血糖作用，但rhIGF-I比相同劑量的胰島素的強(qiáng)度低10倍。相反，與胰島素相比IGF-I對(duì)蛋白質(zhì)代謝的作用更明顯，與相同的葡萄糖劑量的胰島素相比，它能降低整體凈氨基酸流。而且，IGF-I是胰腺釋放胰島素的強(qiáng)效抑制劑。在1型糖尿病患者中，使用rhIGF-I導(dǎo)致循環(huán)IGF-I水平上升、GH分泌過多的逆轉(zhuǎn)、胰島素需求下降和血糖控制的改善。在2型糖尿病患者中，需要較高劑量的rhIGF-I來降低禁食后的血漿葡萄糖、胰島素和C-肽水平。此外，rhIGF-I治療與脂肪質(zhì)量降低相關(guān)聯(lián)，這可部分解釋上述對(duì)胰島素敏感性的有益影響。已鑒定到六種人IGF-結(jié)合蛋白。在這六種結(jié)合蛋白中，IGFBP-3結(jié)合血漿中95%以上的IGF-I。它含有264個(gè)氨基酸殘基，計(jì)算分子量約為29kD。有三個(gè)可能的N-糖基化位點(diǎn)(Asn-X-Ser/Thr)，分別位于IGFBP-3中心區(qū)的Asn89、Asn譜和Asnm上，但糖單位似乎對(duì)IGF結(jié)合并不重要。IGF-I/IGFBP-3二聚體與"酸不穩(wěn)定性亞基"形成三元絡(luò)合物，這能延長(zhǎng)IGF-I的半衰期并滴定IGF-I對(duì)其受體的供應(yīng)。IGFBP-3是許多組織中局部產(chǎn)生的40-45kDa的糖蛋白，在這些地方其用作調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)物。IGFBP-3通過結(jié)合IGF抑制細(xì)胞增殖和存活，防止它們激活靶細(xì)胞上的IGF-I受體。還發(fā)現(xiàn)，IGFBP-3能以IGF依賴方式負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡。不存在IGF-I時(shí)，IGFBP-3能夠與多種生長(zhǎng)抑制性蛋白質(zhì)和物質(zhì)如p53、視黃酸、腫瘤壞死因子-a和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-卩相互作用。IGFBP-3的過度表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞增殖并減少腫瘤形成，但對(duì)正常器官的生長(zhǎng)抑制作用很小。近年來的研究表明，IGFBP-3會(huì)抑制乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌和結(jié)直腸癌，因此IGFBP-3能用作有效的抗癌劑。因此，人IGF-I和人IGFBP-3均有藥用價(jià)值。使用IGF-I和IGFBP-3的主要障礙是其生產(chǎn)成本。這些蛋白質(zhì)主要由微生物，如大腸桿菌(五^/zeWc/n'aco//)重組產(chǎn)生；或者由肉瘤細(xì)胞系或紅細(xì)胞樣細(xì)胞提取和/或在轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生。這些系統(tǒng)不適合大規(guī)模生產(chǎn)，因?yàn)樵O(shè)備和生產(chǎn)成本很高并且可能被病原體污染。IGF-I和IGFBP-3也出現(xiàn)在其他哺乳動(dòng)物中，起到類似功能。可工程改造植物細(xì)胞以接受和表達(dá)來自各種生物體的遺傳信息，包括來自原核和真核來源的基因。因?yàn)橹参锛?xì)胞是真核細(xì)胞，所以它們能夠產(chǎn)生哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)，對(duì)于合適的蛋白質(zhì)或酶功能而言常常需要適當(dāng)?shù)姆g后修飾(如糖基化、異戊烯化和形成二硫橋)。此外，許多植物的種子是可以食用的，并且可能在種子中富集重組蛋白質(zhì)。在一些情況下，重組蛋白質(zhì)可能不需要進(jìn)一步加工和純化就能口服遞送，只要控制劑量水平和頻率，因?yàn)槊糠N蛋白質(zhì)具有特征性的酸和蛋白酶抗性?？衫眠f送運(yùn)載體如生物包囊和植物組織來防止蛋白質(zhì)在胃和內(nèi)臟中降解(Daniell，H.等，7>e"A尸/a""c/.(2001)6:219-226)。已經(jīng)開發(fā)基于種子的平臺(tái)，用于藥用蛋白質(zhì)的生物組裝和生產(chǎn)(Sardana，R.K.，等，rrawg^/c/^.(2002)11:521-531)。他們的結(jié)果提示，使用植物種子作運(yùn)載體通過"種子藥丸(seedaspill)"產(chǎn)生和遞送生物藥品是一種可行的選擇。已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因煙草中產(chǎn)生重組人IGF-I和重組人IGFBP-3，第五屆香港糖尿病和心血管風(fēng)險(xiǎn)因素東西方交流大會(huì)，2003年10月上的三個(gè)海報(bào)演講中報(bào)道了這些結(jié)果("在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)人胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(IGFBP-3)"(ExpressionofHumanInsulin-likeGrowthFactorI(IGFI)andInsulin-likeGrowthFactorBindingProtein3(IGFBP3)inTransgenicTobacco));第64屆美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)科學(xué)會(huì)議，2004年6月("植物作為表達(dá)人胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-3(IGFBP-3)的生物反應(yīng)器，，(PlantsasBioreactorsforExpressingHumanInsulin-likeGrowthFactorI(IGFI)andInsulin-likeGrowthFactorBindingProtein3(IGFBP3));和2004年美國(guó)植物生物學(xué)家協(xié)會(huì)年會(huì)，2004年7月("人胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-3(IGFBP-3)在煙草中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)"(TransgenicExpressionofHumanInsulin-likeGrowthFactorBindingProtein3(IGFBP3)inTobaccoSeeds))。在煙草植物中產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)無法提供在諸如玉米、稻、小麥和大麥等可食用單子葉植物中產(chǎn)生的優(yōu)點(diǎn)。單子葉植物也包括諸如甘蔗、菠蘿、椰棗和香蕉等重要的食用作物。這些單子葉植物代表可食用物質(zhì)的多產(chǎn)來源。每天超過40%的世界人口消耗的稻是世界上農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中良好鑒定的，被認(rèn)為是產(chǎn)生藥用和市售的重要蛋白質(zhì)和疫苗的模式生物反應(yīng)器(Fischer，R.6等，rramgem'ciw.(2000)9:279-299)。它不含有害的化學(xué)物質(zhì)，如煙草所含的煙堿和毒性生物堿，并且具有較低的變應(yīng)原性。稻中重組蛋白質(zhì)可以占到粒重的1%。使用特異性啟動(dòng)子和信號(hào)序列靶向重組蛋白質(zhì)在稻胚乳區(qū)(至多占全部種粒的9％)中的生產(chǎn)和儲(chǔ)存，蛋白質(zhì)累積可以提高至粒重的2.7。/。(Liu，Q.Q.，T7zew;sDe/aWme"fo/Ao/ogy(2002)中國(guó)揚(yáng)州大學(xué)(YangzhouUniversity)和香港的香港中文大學(xué)(theChineseUniversityofHongKong)。一個(gè)稻植株可以具有高達(dá)IOO個(gè)分蘗，產(chǎn)生超過10,000個(gè)谷粒，能夠快速生產(chǎn)大量種子和重組蛋白質(zhì)。此外，快速生長(zhǎng)(每年3-4輪)的稻日本亞種可用作生產(chǎn)的生物反應(yīng)器植物。干燥種子的儲(chǔ)存和銷售很簡(jiǎn)單，在室溫下儲(chǔ)存5個(gè)月以上后，谷粒中的產(chǎn)率和重組蛋白質(zhì)活性沒有明顯降低(Stoger,E.，等，尸/a"/Mo/.所o/.(2000)42:583-590)。在水分含量低的條件下，谷粒可儲(chǔ)存3-5年而不損失活性(Huang，N.，所oiVoce^/"fema〃o"a/(2002)1月54-59)。如果蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)用于家畜，那么在其他谷物，如燕麥中生產(chǎn)可能更合適。以前的研究證明，密碼子使用偏見與基因表達(dá)水平強(qiáng)烈相關(guān)。高表達(dá)的基因優(yōu)選使用一小組稱為"優(yōu)化"密碼子的密碼子(Moriyama，E.N.，等，J.Mo/￡vo/(1997)45:514-523)。而且，這些優(yōu)化密碼子對(duì)應(yīng)于最豐富的tRNA，導(dǎo)致翻譯的準(zhǔn)確率和效率提高(Marais，G.，等'JMo/￡vo/:275-280)。在以下實(shí)施例中，根據(jù)兩種種子貯藏蛋白質(zhì)所用的植物優(yōu)選密碼子修飾人IGF-I和IGFBP-3的DNA序列，以便提高這些蛋白質(zhì)在稻中的產(chǎn)量。選擇來自四菱豆的富含賴氨酸的蛋白質(zhì)(LRP)和來自捉猴果堅(jiān)果(Pamdisenut)的富含甲硫氨酸的2S清蛋白(PN2S)的密碼子用法作為修飾基礎(chǔ)，因?yàn)樵谙惹暗难芯恐杏^察到它們?cè)谵D(zhuǎn)基因擬南芥G4ra&Wo;w的中高表達(dá)和穩(wěn)定累積(LRP和PN2S分別占可提取種子蛋白總量的3-10%和3-15%)。另一種提高以下實(shí)施例所用的靶蛋白產(chǎn)率的方案是將重組蛋白質(zhì)導(dǎo)向特定部位，以防止被細(xì)胞的蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)降解。已報(bào)道，連接信號(hào)肽序列導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)分泌，通常需要作為外來基因的N-和C-末端的ER保留信號(hào)的四肽KDEL以便高水平地累積產(chǎn)物(Wandelt，C丄等，尸/a""(1992)2:181-192;和Herman,E.M.等，尸/她(1990)182:305-312)。KDEL四肽通過與高爾基復(fù)合物和ER之間循環(huán)的受體相互作用，進(jìn)行蛋白質(zhì)定位。KDEL信號(hào)對(duì)于可溶性7蛋白質(zhì)在植物ER中的累積而言是足夠的(Wandelt，C丄等，同上；Frigerio，L.等，尸/fl^Ce〃(2001)13:1109-1126;禾卩Napier，J.等，尸/awto(1997)203:488-494)。已發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于不含KDEL的構(gòu)建物，含有KDEL的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中scFv水平為6-14倍(Conrad，U.等，尸/a"ZMo/.5/o/.(1998)38:101-109)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了兩種重要的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)-IGF-I和IGFBP-3的經(jīng)濟(jì)實(shí)用的來源。優(yōu)選產(chǎn)生人形式。通過在單子葉植物中產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)，本發(fā)明第一次提供能夠產(chǎn)生足量的適合人類治療應(yīng)用或獸醫(yī)應(yīng)用的形式的有用來源。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及經(jīng)修飾產(chǎn)生人IGF-I和/或人IGFBP-3的單子葉植物細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明涉及含有這類細(xì)胞的植物或植物部分。附圖簡(jiǎn)要說明圖1顯示編碼人IGF-I的核苷酸序列(SEQIDNO:l)，如Jansen，M.等，Atowre(1983)306:609-611所述。圖2顯示編碼人IGFBP-3的核苷酸序列(SEQIDNO:2)，如Wood，W丄等，Mo/.五"^cn'朋/.(1988)2:1176-1185所述。圖3顯示根據(jù)植物中的密碼子優(yōu)選性修飾的編碼人IGF-I的核苷酸序列(SEQIDNO:3)。圖4顯示根據(jù)植物中的密碼子優(yōu)選性修飾的人IGFBP-3的核苷酸序列(SEQIDNO:4)。圖5顯示人IGF-I的氨基酸序列(SEQIDNO:5)。圖6顯示人IGFBP-3的氨基酸序列(SEQIDNO:6)。圖7是顯示稻中產(chǎn)生的人IGF-I在L6細(xì)胞中造成邊緣波動(dòng)的能力和這種作用對(duì)市售人IGFBP-3的易感性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖8顯示稻中產(chǎn)生的人IGFBP-3抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的有效性。本發(fā)明實(shí)施方式如下所述，第一次在單子葉植物中產(chǎn)生了兩種重要的人蛋白質(zhì)IGF-I和IGFBP-3。因?yàn)閱巫尤~植物包括主要營(yíng)養(yǎng)來源且不含有害化合物，所以非常適合產(chǎn)生用于人類治療的蛋白質(zhì)。它們也非常適合產(chǎn)生用于治療食草性或雜食性哺乳動(dòng)物的相應(yīng)蛋白質(zhì)。通過適當(dāng)設(shè)計(jì)包含表達(dá)系統(tǒng)的DNA構(gòu)建物來提高這些蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，所述表達(dá)系統(tǒng)具有操作性連接于合適控制序列以便表達(dá)的編碼這些蛋白質(zhì)的核苷酸序列。對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾和重建完整植株的技術(shù)已經(jīng)為本領(lǐng)域熟知一段時(shí)間。參見例如，Gelvin等，《植物分子生物學(xué)手冊(cè)》(TlantMolecularBiologyManual),(1990));Dashek，《植物生物化學(xué)和分子生物學(xué)中的方法》(MMll^inPlantBiochemistryandMolecularBiology)(CRC出版社，1997)。本領(lǐng)域在這個(gè)方面的發(fā)展?fàn)顟B(tài)的有用小結(jié)可參見2004年1月14日公開的美國(guó)專利公開2004/0009476，將該文獻(xiàn)中有關(guān)植物遺傳操作的技術(shù)內(nèi)容通過引用納入本文。一旦獲得含有重組構(gòu)建物的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，則可由其重新產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，評(píng)價(jià)所需蛋白質(zhì)的產(chǎn)量水平?？衫脦追N技術(shù)優(yōu)化非天然核苷酸序列在植物中的表達(dá)。如以下實(shí)施例的進(jìn)一步描述，可按照植物細(xì)胞中表達(dá)的密碼子優(yōu)選性修飾編碼的核苷酸序列。這種修飾基于描述植物密碼子優(yōu)選性的公開數(shù)據(jù)。其次，可延伸編碼核苷酸序列以加入信號(hào)和保留序列，并將編碼蛋白質(zhì)導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并實(shí)現(xiàn)保留。這也對(duì)產(chǎn)率產(chǎn)生有益的影響。通常，在所需蛋白質(zhì)的N末端產(chǎn)生信號(hào)傳導(dǎo)肽，在其C末端產(chǎn)生保留信號(hào)。使用這些技術(shù)能顯著提高所需的IGF-I和IGFBP-3的產(chǎn)率。使用合適啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)表達(dá)也是有用的。例如，合適啟動(dòng)子包括35SCaMV、稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、泛素啟動(dòng)子或胭脂堿合酶(NOS)啟動(dòng)子。提高種子中的產(chǎn)量的組織特異性啟動(dòng)子包括種子特異性谷蛋白啟動(dòng)子(GWpr。)，但也可采用其他種子特異性啟動(dòng)子。也可使用終止信號(hào)，例如胭脂堿合酶終止信號(hào)。如下所述設(shè)計(jì)兩組構(gòu)建物，以驅(qū)動(dòng)植物優(yōu)化的編碼序列并通過土壤桿菌C4gra^cteWwm)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化引入稻中。一組構(gòu)建物僅含有谷蛋白信號(hào)肽(SP)，而另一組含有SP以及靶向的四肽KDEL信號(hào)。合成這些構(gòu)建物以提高蛋白質(zhì)表達(dá)并使蛋白質(zhì)靶向儲(chǔ)存部位，以及提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。利用種子特異性谷蛋白啟動(dòng)子(G^/pJ驅(qū)動(dòng)IGF-I和IGFBP-3在轉(zhuǎn)基因稻中的表達(dá)，分析轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。由轉(zhuǎn)基因稻谷粒產(chǎn)生的rhIGF-I和rhlGFBP-3有生物活性。也可修飾該構(gòu)建物以包含純化輔助物，如組氨酸標(biāo)簽或FLAG序列，和/或包含標(biāo)記物，如熒光蛋白質(zhì)，以便隨后進(jìn)行純化。也可在編碼蛋白質(zhì)和純化標(biāo)簽和/或標(biāo)記物之間工程設(shè)計(jì)切割位點(diǎn)。如果需要可采用標(biāo)準(zhǔn)的純化技術(shù)，或者在某些情況下，可口服給予植物組織，以利用植物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和其低毒的優(yōu)點(diǎn)。在1型或2型糖尿病患者中，利用重組產(chǎn)生的IGF-I降低胰島素需求和提高血糖控制水平。IGFBP-3能實(shí)施凋亡，并可用于治療惡性腫瘤。因此，加果需要，可將重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)配制到給予需要用這些蛋白質(zhì)治療的對(duì)象的組合物中。配制蛋白質(zhì)和其他藥物的通用方法可參見《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington'sPharmaceuticalSciences),最親jf版，馬克出版公司(MackPublishingCo.),賓夕法尼亞州伊斯頓(Easton，PA)，通過參考納入本文。該蛋白通常通過注射或透皮或跨粘膜遞送途徑以胃腸道外的方式全身給藥，或者在某些情況下可以口服給藥?？墒褂酶鶕?jù)特定給藥方式設(shè)計(jì)的不同劑型，包括脂質(zhì)體制劑和含有脂質(zhì)或聚合物基納米顆粒的制劑等。提供以下實(shí)施例是為了說明而非限制本發(fā)明。實(shí)施例1用IGF-I和IGFBP-3構(gòu)建物轉(zhuǎn)化土壤細(xì)菌根據(jù)兩種種子貯藏蛋白質(zhì)所用的優(yōu)選密碼子修飾人IGF-I(圖l)和IGFBP-3(圖2)的DNA序列。選擇來自四菱豆的富含賴氨酸的蛋白質(zhì)(LRP)和來自捉猴果堅(jiān)果的富含甲硫氨酸的2S清蛋白(PN2S)的密碼子用法(表1)作為修飾基礎(chǔ)，因?yàn)樵谙惹暗难芯恐杏^察到它們?cè)谵D(zhuǎn)基因擬南芥C4m&Wo戸W中高表達(dá)和穩(wěn)定累積(LRP和PN2S分別占可提取種子蛋白總量的3-10%和3-15%)。與初始對(duì)應(yīng)物編碼相同氨基酸序列(圖5和6)的經(jīng)修飾的IGF-I(圖3)和IGFBP-3(圖4)基因由MWG生物技術(shù)公司(MWGBiotechnologyCompany)獲得。IGF-I和IGFBP-3的密碼子改變分別為28.6%和14.8%。10表1:根據(jù)LRP和PN2S序列優(yōu)先化的密碼子優(yōu)選性的小結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>設(shè)計(jì)構(gòu)建物，以提高rhlGF-I和rhlGFBP-3的穩(wěn)定性和產(chǎn)率，并控制其糖基化。加入兩種蛋白質(zhì)靶向信號(hào)，以將靶蛋白導(dǎo)向稻谷粒的特定部位中，它們或者是谷蛋白信號(hào)肽(SP)用于在高爾基體中糖基化，或者是四肽KDEL用于在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中穩(wěn)定累積(無糖基化)。由種子特異性谷蛋白啟動(dòng)子(GWpJ驅(qū)動(dòng)該表達(dá)構(gòu)建物。嵌合基因構(gòu)建物的詳情如下，IGF-I:1)(G"pro)+SP+IGF-I*+NOSter2)(G"pro)+SP+IGF-I*+KDEL+NOSIGFBF-3:3)(G"pro)+SP+IGFBP-3*+NOSter4)(G"pro)+SP+IGFBP-3*+KDEL+NOSter其中*表示IGF-I或IGFBP-3的經(jīng)修飾的cDNA，NOSter表示胭脂堿合酶終止子。將該嵌合基因盒插入超級(jí)二元載體pSB130中，并轉(zhuǎn)化到土壤桿菌菌株EHA105中，該菌株非常適合感染稻愈傷組織。利用簡(jiǎn)單的凍融方法來轉(zhuǎn)化土壤桿菌(如Chen，H.，等，B/o7^c/zm々w^(1994)16:664-668，670所述)。用抗生素潮霉素(50mg/L)選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，通過PCR進(jìn)一步確認(rèn)靶基因的DNA轉(zhuǎn)化。實(shí)施例2稻的轉(zhuǎn)化、選擇和培育切開日本稻(/fl;o"/ca)9983成熟種子的盾片，在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N6基礎(chǔ)培養(yǎng)基，2mg/12,4-D，0.5g/l酪蛋白水解，30g/l蔗糖，2.5g/1Phytagef，pH5.8)上培養(yǎng)，以誘導(dǎo)愈傷組織。在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-7天后，衍生自未成熟胚胎的愈傷組織立即用于與含有靶基因的土壤桿菌EHA105共同培養(yǎng)。首先將土壤桿菌接種到含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的3mlLB肉湯中，28。C過夜，然后在25mlAB培養(yǎng)基(3g/lK2HP04、1g/lNaH2P04、1g/1NH4C1、0.3g/1MgS04-7H20、0.15g/1KCl、10mg/1CaCl2'2H20、2.5mg/1FeSCV7H20、5g/1葡萄糖、pH7.2)中再次培養(yǎng)5小時(shí)，接著離心，并重懸于15-25mlAAM培養(yǎng)基(AA基礎(chǔ)培養(yǎng)基，68.5g/l蔗糖，36g/1葡萄糖，0.5g/1酪蛋白水解物，pH5.2，100|imol/l乙酰丁香酮)。將稻愈傷組織浸入土壤桿菌培養(yǎng)物中，室溫下靜置10-20分鐘，間歇地振蕩。然后，將感染的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有100pmol/l乙酰丁香酮的N6D2C培養(yǎng)基(N6D2，10g/l葡萄糖，pH5.2)中，26-28。C避光靜置3天。共同培養(yǎng)后，將愈傷組織放置在N6D2S培養(yǎng)基(N6D2，50mg/l潮霉素B，500mg/1頭孢噻肟，pH5.8)上，在26'C避光選擇耐受性愈傷組織2周，接著在新N6D2S培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到出現(xiàn)新形成的耐受性愈傷組織。然后，將耐受性愈傷組織放在HGPR培養(yǎng)基(Higrow稻培養(yǎng)基12(GIBCO-BRL)、50mg/l潮霉素B、200mg/1頭孢噻肟)上，避光靜置7天，并在光照和26"C的條件下靜置7天。預(yù)先再生后，將耐受性愈傷組織轉(zhuǎn)移到MSR培養(yǎng)基(MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基、30g/1蔗糖、0.5g/1酪蛋白水解物、2mg/16-BA、0.5mg/1NAA、0.5mg/IKT、pH5.8、50mg/1潮霉素B、500mg/1頭孢噻月虧、2.5g/1Phytagel)中，在26X:和光照的條件下靜置16小時(shí)/避光靜置8小時(shí)以便再生。出現(xiàn)再生的新芽后，將它們放在1/2MSH培養(yǎng)基(1/2MS大分子鹽(macrosalt)、Fe-EDTA和小分子鹽(microsalt)、MS維生素、30g/1蔗糖、0.5mg/1NAA、pH5.8、50mg/l潮霉素B、500mg/1頭孢噻肟、2.5g/1Phytagef)上以便生根。最后，將轉(zhuǎn)基因稻苗轉(zhuǎn)移至土壤中，在溫室中生長(zhǎng)。實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因稻的分析Southern印跡分析分析轉(zhuǎn)基因稻植株，以確認(rèn)靶基因整合到稻基因組中。通過溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)法提取葉基因組DNA(Doyle，J.D.等，F(xiàn)oc^(19卯)12:13-15)。甩BamHI將15嗎基因組DNA消化過夜，在0.8%瓊脂糖凝膠上分離，并利用VacuGeneXL真空印跡系統(tǒng)(法瑪西亞生物科技公司(PharmaciaBiotech))轉(zhuǎn)移到帶正電的尼龍膜(羅氏公司(Roche))上。按照DIG核酸檢測(cè)試劑盒(羅氏公司)所述的方法進(jìn)行雜交和檢測(cè)。利用DIGDNA標(biāo)記試劑盒(羅氏公司)，通過PCR制備雙鏈DIG-標(biāo)記的DNA探針(IGF-I和IGFBP-3)。臨用前99。C加熱探針以變性。結(jié)果證實(shí)，稻基因組中存在該構(gòu)建物。Western印跡分析通過將種子研磨成粉末并與蛋白質(zhì)提取緩沖液(50mMTris-HClpH6.8，0.1MNaCl和10%SDS)混合，由成熟的稻種子提取總種子蛋白質(zhì)。離心后，將澄清的上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，儲(chǔ)存為種子總蛋白提取物。然后，在17%TricineSDS-PAGE上分析不同量的總蛋白，并印到PVDF膜上。利用抗-人IGF-I或IGFBP-3多克隆抗體進(jìn)行Western印跡分析。最后，如AuroraWestern印跡化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)(ICN)手冊(cè)所述，用化學(xué)發(fā)光Starlight底物(ICN)對(duì)該印跡進(jìn)行非放射性檢測(cè)。結(jié)果證實(shí)，種子提取物中存在IGF-I和IGFBP-3蛋白。實(shí)施例4稻中產(chǎn)生的rhIGF-I的生物學(xué)活性類似于胰島素，IGF-I能引起肌肉細(xì)胞的膜邊緣波動(dòng)和葡萄糖攝入。IGFBP-3可結(jié)合于IGF-I形成ALS復(fù)合物，該復(fù)合物會(huì)抑制IGF-I引起的膜邊緣波動(dòng)作用。稻中產(chǎn)生的重組hIGF-I與胰島素平行檢測(cè)，以比較其生物學(xué)活性。在成肌細(xì)胞單層培養(yǎng)物中培養(yǎng)表達(dá)c-myc表位標(biāo)記的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)的大鼠L6骨骼肌細(xì)胞(L6myc細(xì)胞)，其培養(yǎng)是在含有1()n/。(v/v)胎牛血清(FBS)和1%(v/v)抗生素-抗真菌藥溶液(100U/ml青霉素G、10mg/ml鏈霉素和25mg/ml兩性霉素B)的a-極限必需培養(yǎng)基中、5%<:02氣氛下、37'C進(jìn)行的。用0.25%胰蛋白酶消化亞鋪滿的培養(yǎng)物，以便亞培養(yǎng)細(xì)胞。為了分化成肌管，將成肌細(xì)胞接種到含有2%(v/v)FBS的培養(yǎng)基中，細(xì)胞密度約為4x104個(gè)細(xì)胞/毫升，以便進(jìn)行自發(fā)融合。每48小時(shí)更換一次培養(yǎng)基，接種后5-7天使用肌管。然后使大鼠L6肌肉細(xì)胞在置入六孔板的25-mm-直徑的蓋玻片上生長(zhǎng)至肌管階段。使肌管失去血清3小時(shí)，用不同濃度和組合的提取自轉(zhuǎn)基因稻的rhIGF-I和rhlGFBP-3于37'C處理10分鐘。培育后，肌管用冰冷的3M(v/v)多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，然后用0.1M甘氨酸的PBS溶液洗滌10分鐘，用0.1%(v/v)曲通X-100的PBS溶液通透3分鐘，然后用PBS洗滌。肌管在0.1%BSA中封閉1小時(shí)，然后在鬼筆環(huán)肽(1:500稀釋于0.1%(w/v)BSA)中培育。培育后，用？88洗滌細(xì)胞，加入？『01^1^@不變色溶液中滴在載玻片上。用蔡司(2^53)Axioplan2成像顯微鏡和蔡司LSM510META激光掃描共聚焦顯微鏡(德國(guó)耶拿的卡爾蔡司公司(CarlZeiss，Jena，Germany))檢測(cè)樣品。轉(zhuǎn)基因IGF-I稻的粗蛋白引起L6細(xì)胞的膜邊緣波動(dòng)，該邊緣波動(dòng)作用可被市售的MGFBP-3顯著降低。這些結(jié)果見圖7。如圖7所示，1.25mg和5mg的IGF-1以劑量依賴方式在稻中產(chǎn)生邊緣波動(dòng)作用。這種活性被12nM濃度的市售IGFBP-3所抑制。實(shí)施例5稻中產(chǎn)生的rhlGFBP-3蛋白的抗癌活性人IGFBP-3能抑制雌激素-依賴性和-非依賴性乳腺癌細(xì)胞的增殖。為了檢測(cè)稻中產(chǎn)生的rhlGFBP-3是否具有抗癌功能，使用MCF-7人乳腺癌細(xì)胞。MCF-7人乳腺癌細(xì)胞通常在添加有1%青霉素和鏈霉素、0.1%兩性霉素B和5。/。胎牛血清(FBS)的Eagle極限必需培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是37t:和5%C02濕氣氛。對(duì)于rhlGFBP-3處理，將MCF-7細(xì)胞接種到含有含血清培養(yǎng)基的96孔板中。1天后將不同濃度的由含有rhlGFBP-3的稻轉(zhuǎn)化體提取的粗蛋白加入細(xì)胞中。每3天用新鮮的蛋白質(zhì)提取物替代粗蛋白提取物，共替換兩次。處理7天后，收集細(xì)胞進(jìn)行MTT測(cè)定。簡(jiǎn)要說，將20|ilMTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)溶液(5mg/mlMTT的HPBS溶液，pH7.4)加入各孔中，再于37t:培育2小時(shí)。將100pl酸化異丙醇加入各孔中，以分解細(xì)胞并溶解結(jié)晶紫。用微孔板分光光度計(jì)測(cè)定OD57Q，以確定各孔中的紫色強(qiáng)度。如圖8所示，濃度為1.56mg和3.125mg的稻中產(chǎn)生的IGFBP-3能夠以劑量依賴方式提高對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。實(shí)施例6重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的純化用親和層析進(jìn)一步純化前一實(shí)施例中所述的粗提取物。將IGF-I和IGFBP-3各自施加于色譜柱，該柱偶聯(lián)于各抗體進(jìn)行進(jìn)一步純化。通過柱洗滌雜質(zhì)，通過調(diào)節(jié)pH和鹽濃度洗提蛋白質(zhì)。通過修飾實(shí)施例1的構(gòu)建物以包含標(biāo)記蛋白，以簡(jiǎn)化純化過程。實(shí)施例7提高重組蛋白產(chǎn)率由實(shí)施例2所述的植物獲得種子，再種植產(chǎn)生第二代和第三代作物。實(shí)現(xiàn)了重組IGF-I和IGFBP-3的產(chǎn)率提高。權(quán)利要求1.一種單子葉植物細(xì)胞，其經(jīng)修飾包含用于表達(dá)編碼胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I)的核苷酸序列或編碼胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-3(IGFBP-3)的核苷酸序列的DNA構(gòu)建物，其中所述DNA構(gòu)建物包含操作性連接于控制序列以便在單子葉植物細(xì)胞中表達(dá)的所述編碼核苷酸序列。2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其特征在于，所述IGF-I和IGFBP-3是人蛋白。3.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞，其特征在于，所述控制序列包含在單子葉植物種子中可操作的啟動(dòng)子和在單子葉植物種子中可操作的終止序列。4.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞，其特征在于，所述編碼核苷酸序列在N末端延伸有編碼導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)分泌途徑的信號(hào)肽的核苷酸序列。5.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞，其特征在于，所述編碼核苷酸序列在C末端延伸有編碼ER保留信號(hào)的核苷酸序列。6.如權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是稻細(xì)胞。7.—種轉(zhuǎn)基因植物或植物部分，其包含權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞。8.—種單子葉植物細(xì)胞，其包含IGF4或IGFBP-3。9.如權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，其特征在于，所述K3F-1和IGFBP-3是人1GF-I和人IGFBP-3。10.如權(quán)利要求8或9所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是稻細(xì)胞。11.一種植物或植物部分，其包含權(quán)利要求8或9所述的細(xì)胞。12.如權(quán)利要求ll所述的植物部分，其特征在于，所述植物部分是種子組織。13.如權(quán)利要求U所述的植物或植物部分，其特征在于，所述植物或植物部分是稻。14.如權(quán)利要求13所述的植物部分，其特征在于，所述植物部分是種子組織。15.—嚇在單子葉植物中產(chǎn)生IGF-l或IGFBP-3的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求1或2所述的植物細(xì)胞。16.—種在單子葉植物中產(chǎn)生IGF-I或IGFBP-3的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求11所述的植物。17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述植物是稻。全文摘要已經(jīng)在單子葉植物中生產(chǎn)出兩種重要的人類蛋白，即胰島素生長(zhǎng)因子I(IGF-I)和胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(IGFBP-3)。重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有天然形式的已知活性。文檔編號(hào)C12N15/82GK101675167SQ200880005298公開日2010年3月17日申請(qǐng)日期2008年2月20日優(yōu)先權(quán)日2007年2月20日發(fā)明者P·C·Y·童,張振佳,辛世文申請(qǐng)人:香港中文大學(xué)