專利名稱：用胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白－4水解酶檢測(cè)急性冠狀動(dòng)脈綜合征的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種用胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4(即Insuline Growth Factor Binding Protein-4，簡(jiǎn)稱IGFBP-4)水解酶檢測(cè)急性冠狀動(dòng)脈綜合征的試劑盒，這種試劑盒可以用于急性冠狀動(dòng)脈綜合征的診斷，尤其可用于發(fā)生急性心肌梗塞的危險(xiǎn)性評(píng)估，本發(fā)明還涉及該試劑盒的制作方法和測(cè)定方法。
急性冠狀動(dòng)脈綜合征(Acute Coronary Syndrome，ACS)在歐美國(guó)家具有很高的死亡率，我國(guó)近年來(lái)有明顯增加的趨勢(shì)。ACS是指動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脫落、血小板聚集、血栓形成，致使冠狀動(dòng)脈狹窄、阻塞，引起心肌缺血和心肌梗死的病理現(xiàn)象。臨床表現(xiàn)可以癥狀不明顯、穩(wěn)定心絞痛、或不穩(wěn)定心絞痛及急性心肌梗死。典型病例可以根據(jù)病史、癥狀及心電圖的特殊改變進(jìn)行診斷，然而臨床實(shí)踐表明約有25％的急性心肌梗死病人早期沒(méi)有典型的臨床癥狀，約有50％病人缺乏心電圖的特異性改變。當(dāng)冠狀動(dòng)脈發(fā)生急性病變時(shí)，梗塞部位的心肌細(xì)胞受到損傷，會(huì)將一些化學(xué)物質(zhì)釋放到外周血液中去。因此檢測(cè)血液中的這些生化標(biāo)志物對(duì)于診斷ACS具有非常重要的意義。目前臨床上應(yīng)用的生化標(biāo)志物包括心肌酶譜和心肌損傷蛋白標(biāo)志物。心肌酶譜是過(guò)去30年中臨床應(yīng)用的重要指標(biāo)，包括天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、α-羥丁酸脫氫酶(α-HBDH)等，其中CK-MB曾在八十年代被認(rèn)為是診斷急性心肌梗死的金標(biāo)準(zhǔn)。然而酶學(xué)指標(biāo)的特異性較差，它們?cè)谌梭w其它組織中尤其是骨骼肌中亦大量存在；而且酶學(xué)指標(biāo)一般在發(fā)病后一段時(shí)間才出現(xiàn)升高，因而對(duì)早期診斷不敏感。心肌酶譜雖然目前仍在臨床上被使用，但已存在被蛋白標(biāo)志物取代的趨勢(shì)。目前臨床上使用的心肌損傷蛋白標(biāo)志物主要有肌鈣蛋白I(Tn I)和肌鈣蛋白T(Tn T)，雖然它們的特異性和敏感性都明顯優(yōu)于酶學(xué)指標(biāo)，但是由于肌鈣蛋白在血液中極易被蛋白酶降解，因此影響了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。而且不論是TnI還是Tn T，它們對(duì)不穩(wěn)定心絞痛的檢測(cè)敏感性都不夠高。本發(fā)明的目的正是為了克服上述已有檢測(cè)指標(biāo)的缺點(diǎn)和不足，將IGFBP-4蛋白水解酶作為一種新的蛋白標(biāo)志物用于急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)的檢測(cè)；同時(shí)發(fā)明了IGFBP-4蛋白水解酶的酶免定量檢測(cè)試劑盒和測(cè)定方法，從而可以提高ACS診斷的敏感性，尤其提高對(duì)不穩(wěn)定心絞痛診斷的敏感性，并可對(duì)急性心肌梗死的危險(xiǎn)性進(jìn)行評(píng)估。
因此，本發(fā)明的目的是提供了一種用胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4(IGFBP-4)水解酶檢測(cè)急性冠狀動(dòng)脈綜合征的試劑盒。
本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)施的一種IGFBP-4蛋白水解酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于它由IGFBP-4蛋白水解酶標(biāo)準(zhǔn)品、多克隆抗體包被板、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IGFBP-4蛋白水解酶單克隆抗體、質(zhì)控品和輔助試劑組成。
本發(fā)明試劑盒的制作方法包括標(biāo)準(zhǔn)品的制備、多克隆抗體包被板的制作、酶標(biāo)單克隆抗體的制備、質(zhì)控品的制備以及輔助試劑的配制。
IGFBP-4蛋白水解酶標(biāo)準(zhǔn)品可外購(gòu)(比如，DSL公司)，也可自行制備。本發(fā)明試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品是從人血清中提取制備的。一種制備步驟包括收集孕周大于36周的孕婦靜脈血，及時(shí)分離血清，低溫貯存?zhèn)溆?；上述血清?jīng)離子交換層析、親和層析、分子篩三步層析進(jìn)行IGFBP-4蛋白水解酶的分離純化，三步層析的順序可以變換，本發(fā)明試劑盒使用的一種順序依次為離子交換層析、親和層析、分子篩層析；將獲得的IGFBP-4蛋白水解酶純品按試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點(diǎn)濃度進(jìn)行稀釋，然后進(jìn)行分裝、冷凍干燥，即獲得IGFBP-4蛋白水解酶標(biāo)準(zhǔn)品。
本發(fā)明試劑盒中的多克隆抗體包被板可用IGFBP-4蛋白水解酶純品對(duì)兔或鼠免疫而獲得的多克隆抗體包被酶標(biāo)板而制作。本發(fā)明試劑盒中的多克隆抗體包被板是用經(jīng)三次層析分離純化得到的IGFBP-4蛋白水解酶純品對(duì)小鼠免疫而獲得的鼠抗人多克隆抗體包被酶標(biāo)板而制作的。酶標(biāo)板可選用國(guó)產(chǎn)板或進(jìn)口板；規(guī)格可以是96孔平板或12×8、6×8可拆條板。本發(fā)明試劑采用一種進(jìn)口酶標(biāo)板(Costar公司產(chǎn)品)。一種多克隆抗體包被酶標(biāo)板的制作步驟如下a)制備多克隆抗體用IGFBP-4蛋白水解酶純品按常規(guī)對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行免疫后，再在腹腔內(nèi)注射小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0；收集腹水經(jīng)重組Protein G預(yù)裝層析柱純化后即獲得IGFBP-4蛋白水解酶多克隆抗體；b)包被將上述多克隆抗體用0.05M碳酸鹽緩沖液稀釋后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100ul，吸附過(guò)夜，用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用吐溫磷酸鹽緩沖液封閉過(guò)夜，甩干后晾干，即獲得多克隆抗體包被酶標(biāo)板。
本發(fā)明試劑盒中的酶標(biāo)單克隆抗體是用IGFBP-4蛋白水解酶純品免疫小鼠、獲取脾細(xì)胞、在體外經(jīng)過(guò)與骨髓瘤細(xì)胞融合等步驟獲得單克隆抗體，再將單克隆抗體用辣根過(guò)氧化和酶(HRP)標(biāo)記而制備的。一種酶標(biāo)單克隆抗體的制備步驟如下a)獲取免疫小鼠脾細(xì)胞用IGFBP-4蛋白水解酶純品作為抗原免疫Balb/c小鼠，免疫程序結(jié)束后獲取脾細(xì)胞，在二氧化碳孵育箱中按常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)；b)細(xì)胞融合和細(xì)胞篩選將上述脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，在IMDM甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)；篩選陽(yáng)性融合細(xì)胞，進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，可獲得強(qiáng)陽(yáng)性單克隆雜交瘤細(xì)胞株；c)獲取腹水和腹水純化將上述雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔，獲得小鼠腹水；使用重組Protein G親和層析預(yù)裝柱從小鼠腹水中純化IGFBP-4蛋白水解酶單克隆抗體。
d)HRP酶標(biāo)在純化好的IGFBP-4單抗隆抗體溶液中加入稀釋好的SATA(即N-羥基琥珀酰亞胺-S-乙酰硫代乙酯)溶液，在室溫反應(yīng)后加入去乙?；芤?，室溫孵育2小時(shí)；用脫鹽柱分離出去乙?；疭ATA衍生物(即單抗)和副產(chǎn)品(鹽酸羥胺)；將上述單抗溶液與用馬來(lái)酰胺(Maleimide)活化的HRP在室溫反應(yīng)1小時(shí)，即獲得HRP酶標(biāo)IGFBP-4蛋白水解酶單克隆抗體。
本發(fā)明試劑盒中的質(zhì)控品是用混合的足月孕婦血清經(jīng)非孕婦女血清稀釋，并按照本試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍要求而調(diào)配制備的。本發(fā)明試劑盒采用的一種質(zhì)控品制備方法包括如下步驟a)收集足月孕婦靜脈血(經(jīng)HIV、肝類病毒、AIDS、梅毒等測(cè)定均為陰性者)，經(jīng)離心后收集血清于-20℃保存；b)將積累的各個(gè)血清混合，用ELISA方法測(cè)定IGFBP-4蛋白水解酶濃度，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線要求，用非孕婦女血清將兩份混合血清的濃度分別調(diào)至6±2mIU/L、20±4mIU/L范圍；c)將步驟b)所獲得的兩份血清按每個(gè)試劑盒的需要量分裝，冷凍干燥，即制備成低、高值質(zhì)控品。
本發(fā)明試劑盒中的輔助試劑包括酶聯(lián)反應(yīng)底物溶液，顯色液，反應(yīng)終止液和清洗緩沖液。一種配制輔助試劑的方法如下a)底物溶液磷酸-檸檬酸緩沖液(pH5.0)配制的3％過(guò)氧化氫溶液；b)顯色液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)甲醇溶液，濃度為0.1mg/ml；c)反應(yīng)終止液2M硫酸d)清洗緩沖液(20倍濃縮液，20X)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐溫20溶液。
本發(fā)明試劑盒的測(cè)定方法，其特征在于它依次按下述步驟進(jìn)行
a)抗原-抗體反應(yīng)在試劑盒提供的抗體包被板的微孔中分別加入100μl已稀釋好的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品，或待測(cè)血清樣品，37℃水浴保溫60分鐘，然后用清洗緩沖液(1X)重復(fù)洗板4次。
b)酶聯(lián)反應(yīng)將HRP-單克隆抗體溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保溫60分鐘。重復(fù)洗板操作4次。
c)顯色反應(yīng)每孔依次加入底物溶液、顯色液各50μl，37℃水浴保溫10分鐘，每孔再加入50μl反應(yīng)終止液結(jié)束反應(yīng)。
d)比色以空白對(duì)照孔的吸光值調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定OD值并記錄。
e)結(jié)果計(jì)算A.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定的OD值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線；計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)R2，當(dāng)R2＞0.98時(shí)本次測(cè)定有效；B.評(píng)判質(zhì)控品濃度根據(jù)質(zhì)控品的OD值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取相應(yīng)的濃度值；當(dāng)?shù)椭蒂|(zhì)控品、高值質(zhì)控品的濃度均在給定范圍內(nèi)時(shí)，本次測(cè)定判為有效；C.計(jì)算待測(cè)血清樣品濃度當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控品均被判定有效時(shí)，根據(jù)待測(cè)樣本的OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)血清樣品的濃度。
本發(fā)明試劑盒在檢測(cè)急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)時(shí)與已有的檢測(cè)指標(biāo)和技術(shù)相比較具有以下優(yōu)點(diǎn)a)與心肌酶譜的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)相比較，IGFBP-4蛋白水解酶在急性冠狀動(dòng)脈綜合征發(fā)病早期就有改變，克服了心肌酶譜指標(biāo)一般在發(fā)病后一段時(shí)間才出現(xiàn)升高的缺點(diǎn)。本發(fā)明試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)法(ELISA)比心肌酶譜指標(biāo)常用的瓊脂糖凝膠電泳法或免疫抑制法在操作上更加簡(jiǎn)便、快速；b)與肌鈣蛋白指標(biāo)相比較，IGFBP-4蛋白水解酶對(duì)于急性心肌梗塞發(fā)病前期的不穩(wěn)定心絞痛的檢測(cè)敏感度明顯提高，比肌鈣蛋白I(Tn I)提高2-3倍，比肌鈣蛋白T(Tn T)提高3-4倍。本發(fā)明試劑盒采用的ELISA固相載體為微孔板，比肌鈣蛋白測(cè)定常用的試管ELISA法減少了血清用量，在操作上更加簡(jiǎn)便、快速，適合大樣本量的檢測(cè)。
下面用實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明中的百分?jǐn)?shù)是重量百分?jǐn)?shù)。
實(shí)施例一IGFBP-4蛋白水解酶定量酶免檢測(cè)試劑盒制作方法的使用實(shí)例IGFBP-4蛋白水解酶定量酶免檢測(cè)試劑盒(48人份)，其組成包括IGFBP-4蛋白水解酶凍干標(biāo)準(zhǔn)品1瓶；IGFBP-4蛋白水解酶多克隆抗體包被板(48孔)1塊；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IGFBP-4蛋白水解酶單克隆抗體1瓶，6ml/瓶；凍干低值質(zhì)控品1瓶；凍干高值質(zhì)控品1瓶；底物溶液1瓶，3ml/瓶；顯色液(TMB)1瓶，3ml/瓶；反應(yīng)終止液1瓶，3ml/瓶；清洗緩沖液(20X濃縮)1瓶，15ml/瓶。
具體操作如下1.制備IGFBP-4蛋白水解酶標(biāo)準(zhǔn)品1)收集血清從產(chǎn)房獲得健康足月孕婦靜脈血，3000rpm離心15分鐘，分離血清于-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 2)IGFBP-4蛋白水解酶的分離純化使用AKTA蛋白純化儀(Pharmacia公司產(chǎn)品，型號(hào)Purifier 100)從上述血清中分離純化IGFBP-4蛋白水解酶。選用的操作步驟依次為a)DEAE離子交換層析，緩沖液為0.02M Tris-HCl(PH7.2)，1M NaCl，流速3ml/min；b)Heparin親和層析，緩沖液為0.02MTris-HCl(PH7.2)，1M NaCl，流速1.5ml/min；c)分子篩S-200層析，緩沖液為0.02M Tris-HCl，(PH7.2)，流速2ml/min。層析過(guò)程中用UNICRN V400軟件控制NaCl的濃度梯度及蛋白峰的紫外吸收監(jiān)測(cè)。每一步層析所獲蛋白峰的活性檢測(cè)采用ELISA法。最后將活性蛋白洗脫峰合并，裝透析袋，透析除鹽后濃縮，貯存于-70℃。
3)IGFBP-4蛋白水解酶純品按試劑盒說(shuō)明書(shū)中標(biāo)準(zhǔn)曲線第一點(diǎn)所需要濃度分裝(64mIU/L)、冷凍干燥、貯存于4℃。
2.制作IGFBP-4蛋白水解酶多克隆抗體包被板1)IGFBP-4蛋白水解酶多克隆抗體制備選用體重為20-22g的Balb/c雄性小鼠10只(購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，每只用含100μg IGFBP-4蛋白水解酶純品的生理鹽水與2倍體積的弗氏完全佐劑制成0.5ml乳劑，注射于小鼠腹腔內(nèi)。兩周后用含50μg IGFBP-4蛋白水解酶純品的生理鹽水與2倍體積的弗氏不完全佐劑制成0.5ml乳劑作加強(qiáng)注射；再過(guò)2周重復(fù)加強(qiáng)注射一次。重復(fù)加強(qiáng)注射后的次日，每只小鼠腹腔內(nèi)注射小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 2×106/0.5ml。一周后小鼠產(chǎn)生腹水，用9號(hào)針頭從小鼠腹腔采集腹水。數(shù)日內(nèi)連續(xù)收集腹水2-3次，直至小鼠死亡。將所有收集的腹水合并后，分裝成15ml/支存于-20℃?zhèn)溆?。小鼠腹水?jīng)重組Protein G親和層析柱(Parmacia公司)純化后獲得鼠抗人IGFBP-4蛋白水解酶多克隆抗體。親和層析時(shí)緩沖液為0.02M磷酸緩沖液，pH7.0；洗脫液為0.1M甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH 2.7。
2)包被酶標(biāo)板采用Costar公司生產(chǎn)的6×8可拆條板。將步驟1)所獲多克隆抗體用0.05M碳酸鹽緩沖液稀釋為20μg/ml后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100ul，吸附過(guò)夜，用1X清洗緩沖液洗板，再用該緩沖液封閉過(guò)夜，甩干后晾干，即獲得多克隆抗體包被酶標(biāo)板。按48孔/塊用錫箔紙包裝、真空封閉。
3.制備辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IGFBP-4蛋白水解酶單克隆抗體1)獲取免疫小鼠脾細(xì)胞用IGFBP-4蛋白水解酶純品作為抗原免疫Balb/c小鼠，免疫程序結(jié)束后獲取脾細(xì)胞，在二氧化碳孵育箱中按常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)；2)細(xì)胞融合和細(xì)胞篩選將步驟1)所得脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，在IMDM甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)、陽(yáng)性融合細(xì)胞篩選，再進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，即獲得強(qiáng)陽(yáng)性單克隆雜交瘤細(xì)胞株；3)獲取腹水和腹水純化將步驟2)獲得的雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，5只小鼠在注入雜交瘤細(xì)胞前一周先注射0.5ml石蠟油，每只小鼠注射的雜交瘤細(xì)胞數(shù)為0.5～1.0×106個(gè)，約10天后可收獲小鼠腹水，每次3～5ml，每只小鼠可收集2～3次。 用重組Protein G親和層析預(yù)裝柱從小鼠腹水中純化IGFBP-4蛋白水解酶單克隆抗體，緩沖液為0.02M磷酸緩沖液，PH7.0；洗脫液為0.1M甘氨酸-鹽酸緩沖液，PH 2.7。
4)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記在一支5mg/ml純化好的IGFBP-4單抗隆抗體溶液中加入稀釋好的N-羥基琥珀酰亞胺-S-乙酰硫代乙酯(SATA)溶液20μl，室溫孵育30分鐘后；加入100μl去乙?；芤?即用馬來(lái)酰胺醋酸緩沖液溶解的鹽酸經(jīng)胺溶液)，室溫孵育2小時(shí)；用脫鹽柱分離去乙?；疭ATA衍生物(即單抗)和鹽酸羥胺；將上述單抗溶液2ml與5mg用馬來(lái)酰胺活化的HRP在室溫反應(yīng)1小時(shí)，即獲得HRP酶記IGFBP-4蛋白水解酶單克隆抗體。
5)純化HRP標(biāo)記的IGFBP-4蛋白水解酶單克隆抗體用聚丙烯酰胺預(yù)裝柱去除游離的HRP，獲得克分子比接近1∶8的酶標(biāo)IGFBP-4蛋白水解酶單克隆抗體。
6)組裝用含10％胎牛血清的緩沖液稀釋由步驟5)獲得的酶標(biāo)單克隆抗體至合適的工作濃度，按6ml/瓶分裝，貯存于4℃。
4.制備質(zhì)控品收集足月正常孕婦靜脈血(經(jīng)HIV、肝類病毒、AIDS、梅毒等測(cè)定均為陰性者)，3000rpm離心15分鐘后收集血清于-20℃保存。將積累的各個(gè)血清混合，用ELISA方法測(cè)定IGFBP-4蛋白水解酶濃度，并用非孕婦女血清將兩份混合血清的濃度調(diào)至6±2mIU/L、20±4mIU/L范圍，制備成低、高質(zhì)控品。按每個(gè)試劑盒的需要量分裝，冷凍干燥后貯存于4℃。每個(gè)試劑盒中含低濃度質(zhì)控品和高濃度質(zhì)控品各一瓶。
5.配制底物溶液磷酸-檸檬酸緩沖液(pH5.0)配制的3％過(guò)氧化氫溶液，按3ml/瓶分裝。
6.配制顯色液TMB(0.1mg/ml)甲醇溶液，按3ml/瓶分裝。
7.配制反應(yīng)終止液2M H2SO4，按3ml/瓶分裝。
8.配制清洗緩沖液(20倍濃縮液)PBS(pH7.4)配制的1％吐溫20溶液，按15ml/瓶分裝。
應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)制備IGFBP-4蛋白水解酶定量酶免檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量檢測(cè)1)準(zhǔn)確性取三份待測(cè)樣品混合后分為三份混合血清標(biāo)本，每份1ml。分別加入0、10mIU、50mIU的IGFBP-4蛋白水解酶純品，制成回收試驗(yàn)血清標(biāo)本#1、#2、#3。按說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算結(jié)果。然后按回收率計(jì)算公式計(jì)算回收率。標(biāo)本#2、#3的回收率分別為96.6％和98.1％，平均回收率為97.4％，即試劑盒的比例偏差為2.6％，準(zhǔn)確性為97.4％。
2)精密度隨機(jī)抽取20盒不同批次試劑盒，用同一份待測(cè)樣本按說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行重復(fù)測(cè)定。計(jì)算每次測(cè)定結(jié)果，求出均值、SD和變異系數(shù)CV。精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示批間CV≤15％3)線性范圍用IGFBP-4蛋白水解酶純品稀釋成一系列不同濃度的純品溶液128mIU/L、64mIU/L、32mIU/L、16mIU/L、8mIU/L、4mIU/L、2mIU/L。按照說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制曲線。線性范圍內(nèi)最高檢測(cè)上限值為64mIU/L，最低檢測(cè)下限值為4mIU/L。試劑盒的線性范圍為4～64mIU/L。
4)檢測(cè)靈敏度根據(jù)上述線性范圍測(cè)定結(jié)果，本試劑盒的檢測(cè)靈敏度為4.0mIU/L。
5)特異性取四份待測(cè)樣品混合后分為四份混合血清標(biāo)本，每份1ml。分別加入50ng劑量的IGFBP-1、IGFBP-3或IGFBP-5后制成干擾試標(biāo)驗(yàn)血清標(biāo)本#1、#2、#3，未加任何干擾物的#4混合血清標(biāo)本作為基礎(chǔ)樣品。按說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算結(jié)果。然后按干擾試驗(yàn)計(jì)算公式計(jì)算干擾率。標(biāo)本#1、#2、#3的干擾誤差均小于2.0％。
實(shí)施例二IGFBP-4蛋白水解酶定量酶免檢測(cè)試劑盒的使用實(shí)例1.清洗緩沖液配制將試劑盒提供的濃縮清洗緩沖液加蒸餾水20倍稀釋。
2.將試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品第一點(diǎn)凍干粉(濃度64mIU/L)用500μl清洗緩沖液溶解，然后進(jìn)行倍比稀釋4次。試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)曲線由5個(gè)不同濃度的IGFBP-4蛋白水解酶標(biāo)準(zhǔn)品組成，標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度分別為64mIU/L、32mIU/L、16mIU/L、8mIU/L，4mIU/L。
3.質(zhì)控品的稀釋將試劑盒提供的低、高質(zhì)控品凍干粉分別用110μl清洗緩沖液溶解。
4.抗原-抗體反應(yīng)在試劑盒提供的抗體包被板的微孔中分別加入100μl已稀釋好的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品，或待測(cè)血清樣品，37℃水浴保溫60分鐘。然后用清洗緩沖液重復(fù)洗板4次，每次3min。
5.酶聯(lián)反應(yīng)將HRP-單克隆抗體溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保溫60分鐘。重復(fù)洗板操作4次，每次3min。
6.顯色反應(yīng)每孔依次加入底物溶液、TMB顯色液各50μl，37℃水浴保溫10分鐘，每孔再加入50μl反應(yīng)終止液結(jié)束反應(yīng)。
7.比色以空白對(duì)照孔的吸光值調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定OD平均值；記錄各孔吸光值；計(jì)算雙孔標(biāo)準(zhǔn)品OD值的平均值。
8.結(jié)果計(jì)算1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定的平均OD值為縱坐標(biāo)，繪制本次測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線；計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)R2，當(dāng)R2＞0.98時(shí)本次實(shí)驗(yàn)有效。
2)質(zhì)控品濃度的評(píng)判根據(jù)質(zhì)控品的OD值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取相應(yīng)的質(zhì)控品濃度值。當(dāng)?shù)椭蒂|(zhì)控品濃度在6±2mIU/L、高值質(zhì)控品濃度在20±4mIU/L范圍內(nèi)時(shí)，本次測(cè)定判為有效；
3)計(jì)算待測(cè)血清樣品濃度當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控品均被判定有效時(shí)，根據(jù)待測(cè)樣本的OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)血清樣品中的IGFBP-4蛋白水解酶濃度。
權(quán)利要求
1.一種用于診斷急性冠狀動(dòng)脈綜合征的胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4水解酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于它由胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4水解酶標(biāo)準(zhǔn)品、多克隆抗體包被板、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4水解酶單克隆抗體、質(zhì)控品和輔助試劑組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的試劑盒，其中胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4水解酶標(biāo)準(zhǔn)品是用人血清經(jīng)離子交換層析、肝素親和層析、分子篩層析分離純化而獲得的胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4蛋白水解酶純品制備的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的試劑盒，其中多克隆抗體包被板是用胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4水解酶純品免疫動(dòng)物而獲得的胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4水解酶多克隆抗體包被酶標(biāo)板而制作的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的試劑盒，其中所述胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4水解酶多克隆抗體是從胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4水解酶純品免疫小鼠而獲得的腹水中純化而得到的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的試劑盒，其中所述多克隆抗體包被板的制作是將胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4水解酶多克隆抗體用碳酸鹽緩沖液稀釋后滴入酶標(biāo)板各孔內(nèi)，經(jīng)吸附、洗板、封閉、吹干等步驟處理后而制作的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的試劑盒，其中辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4水解酶單克隆抗體是用胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4水解酶純品免疫小鼠后制備的單克隆抗體，經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記而制備的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一的試劑盒，其中所述質(zhì)控品是用混合足月正常妊娠孕婦血清稀釋調(diào)配而獲得的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的試劑盒，其中所述輔助試劑包括酶聯(lián)反應(yīng)底物溶液、顯色液、反應(yīng)終止液及清洗緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一的試劑盒用于檢測(cè)和/或診斷急性冠狀動(dòng)脈綜合征的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白－4水解酶檢測(cè)急性冠狀動(dòng)脈綜合征的試劑盒，它由標(biāo)準(zhǔn)品、多克隆抗體包被板、酶標(biāo)單克隆抗體、質(zhì)控品和輔助試劑組成。本發(fā)明還涉及這種試劑盒的制作及檢測(cè)方法。本發(fā)明試劑盒可用于急性冠狀動(dòng)脈綜合征診斷，尤其可用于發(fā)生不穩(wěn)定心絞痛和急性心肌梗塞的危險(xiǎn)性評(píng)估。本試劑盒采用定量雙抗體夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)法，具有良好的精密度和靈敏度，組配合理，操作簡(jiǎn)便。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1553194SQ0313649
公開(kāi)日2004年12月8日 申請(qǐng)日期2003年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月5日
發(fā)明者馬旭, 吳爾若, 馬 旭 申請(qǐng)人:馬旭, 馬 旭