專利名稱：益生雙歧桿菌菌株的制作方法
益生雙歧桿菌菌株
引言
本發(fā)明涉及雙歧桿菌菌株及其作為益生菌具體是作為免疫調(diào)節(jié)生物治 療劑的用途。
保護(hù)人類(lèi)胃腸道免受腸道細(xì)菌定植的防御機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜并涉及到免疫
學(xué)和非免疫學(xué)的領(lǐng)域(l)。先天防御機(jī)制包括胃的低pH，膽汁鹽，蠕動(dòng)，黏 蛋白層以及抗微生物化合物，例如溶菌酶(2)。免疫學(xué)機(jī)制包括分布于整個(gè) 小腸和結(jié)腸的特發(fā)性淋巴集結(jié)，基礎(chǔ)性M細(xì)胞，又稱為派伊爾淋巴集結(jié)(3)。 腔內(nèi)抗原在這些位點(diǎn)上的提呈導(dǎo)致了對(duì)適當(dāng)T和B細(xì)胞亞型的刺激，從而 建立了細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)并將抗體分泌至胃腸道中去(4)。此外，可通過(guò)上皮細(xì) 胞將抗原提呈至上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞以及基礎(chǔ)粘膜固有層免疫細(xì)胞(5)。因此， 宿主相當(dāng)程度地依賴于胃腸道的免疫防御。然而，由于胃腸道粘膜是宿主 與外界環(huán)境相互作用的最大表面，發(fā)生于其上的具體控制機(jī)制必需能夠適 當(dāng)?shù)貙?duì)平均壽命期間由胃腸道處理的上百噸食物進(jìn)行免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。不 僅如此，消化道定植有超過(guò)500種的細(xì)菌，在結(jié)腸中的數(shù)量為10U-10力g。 因此，這些控制機(jī)制必需能夠從對(duì)宿主引起明顯傷害的侵襲性病原體中區(qū) 別出非致病性的附著細(xì)菌。事實(shí)上，通過(guò)與新攝入的潛在致病性微生物競(jìng) 爭(zhēng)，腸道菌群對(duì)宿主的防御大有裨益。
存在于人類(lèi)胃腸道中的細(xì)菌能夠引起炎癥。對(duì)固有微生物菌群的異常 免疫應(yīng)答可涉及到某些疾病狀態(tài)，例如炎性腸病。與正常菌群相關(guān)的抗原 通常會(huì)導(dǎo)致免疫耐受，而不能達(dá)到這樣的耐受是粘膜發(fā)炎的主要機(jī)制(6)。 在患有炎性腸病(IBD)的患者中，其耐受被破壞的證據(jù)包括針對(duì)于所述腸道 菌群的抗體水平升高。
本發(fā)明涉及雙歧桿菌菌株，其可通過(guò)調(diào)制細(xì)胞因子水平或通過(guò)抗拮以 及排除來(lái)自胃腸道的促炎癥微生物從而表現(xiàn)出具有免疫調(diào)節(jié)的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了雙歧桿菌菌株AH1205(NCIMB41387)或其突變株或變異株。所述突變株是遺傳修飾的突變株。所述變異株是天然存在的雙歧桿菌 變異株。
所述菌株是益生菌。其是生物學(xué)純培養(yǎng)物的形式。
本發(fā)明還提供了雙歧桿菌NCIMB41387的分離株。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，雙歧桿菌菌株是活性細(xì)胞的形式。或者
雙歧桿菌菌株是以非活性細(xì)胞形式存在的
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙歧桿菌菌株是從嬰兒糞便中分離
的，所述雙歧桿菌菌株在口服之后在人中具有明顯的免疫調(diào)節(jié)性。 本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明所述雙歧桿菌菌株的制劑。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑包括其他的益生性物質(zhì)。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑包括有益生元物質(zhì)。 優(yōu)選地，所述制劑包括可攝取的載體。所述可攝取的載體可以是藥用
的可接受載體，例如膠囊、片劑或粉末。優(yōu)選地，所述可攝取的載體可以
是食物制品，例如酸化乳、酸奶、冷凍酸奶、奶粉、濃縮奶、軟干酪、調(diào)
料或飲料。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述制機(jī)還包含有蛋白和/或肽， 特別是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白和/或肽、脂類(lèi)、碳水化合物、維生素、 礦物質(zhì)和/或痕量元素。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，雙歧桿菌菌株在每克遞送系統(tǒng)中以大于 10^fU的量存在于所述制劑中。優(yōu)選地，所述制劑包括一種或多種佐劑、細(xì) 菌成分、藥物實(shí)體或生物學(xué)化合物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑可用于免疫和接種方案。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的雙歧桿菌菌株或制劑，其可用作食物，用作 藥物，用于預(yù)防和/或治療不良炎性活性，用于預(yù)防和/或治療不良呼吸道炎 性活性(例如哮喘)，用于預(yù)防和/或治療不良胃腸道炎性活性(例如炎性腸病 如克羅恩氏病或潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征、慢性腸炎、或感染后結(jié)腸 炎)，用于預(yù)防和/或治療胃腸道癌癥，用于預(yù)防和/或治療系統(tǒng)性疾病例如類(lèi) 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，用于預(yù)防和域治療由不良炎性活性所引起的自身免疫失調(diào)， 用于預(yù)防和/或治療由不良炎性活性所引起的癌癥，用于預(yù)防癌癥，用于預(yù) 防和/或治療由不良炎性活性所引起的腹瀉疾病(例如與艱難梭菌 (Clostridium difficile)相關(guān)的腹瀉、與輪狀病毒相關(guān)的腹瀉或感染后腹瀉)，用于預(yù)防和/或治療由感染性因子例如大腸桿菌所引起的腹瀉疾病。
本發(fā)明還提供了用于制備一種抗炎生物治療劑以預(yù)防和/或治療不良炎
性活性，或用于制備多種抗炎生物治療劑以預(yù)防和/或治療不良炎性活性的
本發(fā)明所述雙歧桿菌菌株或制劑。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述菌株可通過(guò)抗拮以及從胃腸
道中排除促炎癥反應(yīng)的微生物來(lái)發(fā)揮作用。
本發(fā)明還提供了用于制備抗炎生物治療劑從而降低促炎癥細(xì)胞因子水
平的本發(fā)明所述雙歧桿菌菌株或制劑。
本發(fā)明還提供了用于制備抗炎生物治療劑從而調(diào)節(jié)IL-10水平的本發(fā)
明所述雙歧桿菌菌株。
由于雙歧桿菌菌株具有拮抗致病物種生長(zhǎng)的能力，本發(fā)明還提供了將 雙歧桿菌菌株作為抗感染益生菌的用途。
發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)特定的雙歧桿菌菌株能夠在體外引起免疫調(diào)節(jié)的效果。
本發(fā)明因此在預(yù)防或治療失調(diào)免疫應(yīng)答，例如不良炎癥反應(yīng)(如哮喘) 時(shí)具有極大的潛在治療價(jià)值。
雙歧桿菌是共生性微生物。其是從人體胃腸道內(nèi)的微生物菌群中分離 得到的。由于其導(dǎo)致的炎性活性同樣會(huì)破壞宿主細(xì)胞及組織的功能，所以 胃腸道內(nèi)的免疫系統(tǒng)并不會(huì)對(duì)這類(lèi)菌群的成員產(chǎn)生明顯的反應(yīng)。因此，存 在一些機(jī)制，憑借著所述的機(jī)制免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別與致病性生物體所不同 的胃腸道菌群中的共生性非致病成員。這確保了對(duì)宿主組織的損傷是被限 制的并依然保留了防御性的屏障。
長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)菌株AH1205在2006年5月11日 被保藏于NCIMB，其記錄的保藏號(hào)碼為NCIMB41387。
所述長(zhǎng)雙歧桿菌可以是遺傳修飾的突變株，或者可以是天然存在的變 異株。
優(yōu)選地，所述長(zhǎng)雙歧桿菌是活性細(xì)胞的形式。
或者，所述長(zhǎng)雙歧桿菌可以是非活性細(xì)胞的形式。
應(yīng)該理解，本發(fā)明的特定雙歧桿菌菌株可以口服攝入的形式以常規(guī)的
制劑例如膠囊、微膠囊、片劑、顆粒、粉末、錠劑、丸劑、栓劑、懸液和 糖漿對(duì)動(dòng)物(包括人類(lèi))進(jìn)行給藥。適合的制劑可通過(guò)使用常規(guī)的有機(jī)和無(wú)機(jī) 添加劑采用常規(guī)方法來(lái)制備。藥物組合物中的活性成分量可根據(jù)所需要的治療效果來(lái)進(jìn)行操作。
所述制劑還可包含細(xì)菌成分、藥物實(shí)體或生物學(xué)化合物。 此外，還可使用任意適合的公知方法，并可包含藥物可接受的載體或 佐劑來(lái)制備含有本發(fā)明所述菌株的疫苗。
在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)突變株，變異株以及遺傳修飾的突變株包括與親 本菌株相比，其基因型和/或表現(xiàn)型性質(zhì)都發(fā)生改變的雙歧桿菌菌株。天然 存在的長(zhǎng)雙歧桿菌變異株包括對(duì)所分離到所選定靶向性質(zhì)的自發(fā)改變。對(duì) 親本菌株性質(zhì)的故意改變是通過(guò)常規(guī)(體外)遺傳操作技術(shù)，例如基因破壞，
接合轉(zhuǎn)移等來(lái)實(shí)現(xiàn)的。遺傳修飾包括例如通過(guò)載體(包括質(zhì)粒DNA或噬菌 體)向細(xì)菌菌株的基因組進(jìn)行插入而將外源和/或內(nèi)源DNA序列導(dǎo)入雙歧桿 菌菌株的基因組。
天然或誘導(dǎo)的突變包括至少單個(gè)堿基的改變，例如缺失、插入、轉(zhuǎn)換 或其他DNA修飾，其可導(dǎo)致由所述DNA序列所編碼氨基酸序列的改變。
術(shù)語(yǔ)突變株，變異株以及遺傳修飾的突變株還包括這樣的雙歧桿菌菌 株，其經(jīng)歷了遺傳改變，所述遺傳改變以對(duì)于自然界中的所有微生物一致 的速率在基因組中累積，和/或所述遺傳改變通過(guò)自發(fā)突變和/或基因的獲取 和/或基因的丟失而發(fā)生，其不是通過(guò)對(duì)基因組進(jìn)行故意(體外)操作實(shí)現(xiàn)的， 而是通過(guò)當(dāng)暴露于環(huán)境壓力例如抗生素時(shí)能夠提供選擇性優(yōu)勢(shì)從而支持細(xì) 菌生存的對(duì)變異株和/或突變株的自然選擇來(lái)實(shí)現(xiàn)的?？梢酝ㄟ^(guò)向基因組中 故意(體外)插入特定基因來(lái)產(chǎn)生突變株，其并沒(méi)有在根本上改變所述生物體 生物體的生物化學(xué)功能，但其產(chǎn)物可用來(lái)對(duì)細(xì)菌的例如抗生素抗性進(jìn)行鑒 定或篩選。
本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員應(yīng)該理解雙歧桿菌的突變株或變異株可通過(guò)與親 本菌株的DNA序列同源性分析進(jìn)行鑒定。與親本菌株具有接近序列一致性 的雙歧桿菌菌株被認(rèn)為是突變株或變異株。與親本菌株具有96%或更高序 列一致性(同源性)，例如97%或更高，或98%或更高，或99%或更高的雙 歧桿菌菌株被認(rèn)為是突變株或變異株。可使用在線同源性算法"BLAST"程 序，公開(kāi)于http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，來(lái)確定序列的同源性。
親本菌株的突變株還包括得自與所述親本菌株的16s-23s基因間間隔子 多核苷酸序列具有至少85%序列同源性，例如至少90%序列同源性，或至 少95%序列同源性的雙歧桿菌菌株。這些突變株還包含在細(xì)菌基因組中其他DNA序列的DNA突變。 附圖簡(jiǎn)述


圖1為長(zhǎng)雙歧桿菌AH1205的BOX PCR(生物分析儀)條形碼圖。使用 Agilent2100軟件確定堿基對(duì)大小。
圖2圖示了在8天飼喂階段中長(zhǎng)雙歧桿菌AH1205的糞便回收，并證 實(shí)了 AH1205能夠在鼠胃腸道中轉(zhuǎn)移的能力。
圖3為條線圖，顯示長(zhǎng)雙歧桿菌AH1205對(duì)于人PBMC的IL-10細(xì)胞 因子產(chǎn)生的影響。結(jié)果表示為平均值+ASE(r^6)。
圖4A和B圖示了益生菌株AH1205(A)和安慰劑(B)對(duì)于經(jīng)卵清蛋白 (OVA)攻擊之后的致敏動(dòng)物的支氣管肺泡灌洗液中總、細(xì)胞數(shù)的影響(1^10/ 組，相對(duì)于單獨(dú)的OVA*=p<0.05)。
圖5A和B圖示了益生菌株AH1205(A)和安慰劑(B)對(duì)醋甲膽堿氣道反 應(yīng)性的影響，其通過(guò)在使用OVA或鹽水鼻內(nèi)攻擊24小時(shí)之后卵清蛋白 (OVA)致敏的小鼠中增加的停頓(Penh)的改變來(lái)進(jìn)行評(píng)估。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都代 表平均值士SEM(i^lO/組，相對(duì)于單獨(dú)的OVA*=p<0.05)。
圖6A至B為來(lái)自卵清蛋白(OVA)敏化的小鼠的支氣管肺泡灌洗液 (BAL)中IL-10(A)， INFy(B)， TNF(C)， IL-6(D)和CCL2(e)細(xì)胞因子水平的 示意圖。每個(gè)柱代表平均值士SEM(1^10，相對(duì)于OVA攻擊的鹽水出的對(duì)照 *p<0.05)。
圖7圖示了來(lái)自AH1205飼喂小鼠的CD4+CD25+細(xì)胞明顯降低了響應(yīng) CD4T細(xì)胞的增殖(n-7)。
圖8為在CD4+群(同樣為CD25+)中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估的派伊爾淋 巴集結(jié)細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
圖9A與B所示為在攝取AH1205的無(wú)菌小鼠中，表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 的CD4/CD25+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯上調(diào)。(A"脾細(xì)胞，(B)=MLNC細(xì)胞(對(duì)脾分 析而言n-4/組，對(duì)MLNC分析而言r^2/3)。
圖10為當(dāng)無(wú)菌小鼠攝取了長(zhǎng)雙歧桿菌AH1205之后，在CD3/CD28刺 激的MLNC培養(yǎng)物中所分泌的細(xì)胞因子IL-6， MCP-1和INF-y水平降低。 結(jié)果表示為每組平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差(11=4/組)。
圖11為當(dāng)無(wú)菌小鼠攝取了長(zhǎng)雙歧桿菌AH1205之后，在CD3/CD28剌激的脾細(xì)胞培養(yǎng)物中所分泌的細(xì)胞因子IL-6和INF-cx水平降低。結(jié)果表示 為每組平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差(11=4/組)。
圖13所示為與乳桿菌(Lactobacillus)GG相比較，3個(gè)月后益生菌株 AH1205的穩(wěn)定性。
發(fā)明詳述
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)雙歧桿菌菌株AH1205不僅是酸和膽汁耐受性的并可 在胃腸道中轉(zhuǎn)移(transit)，還可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平或通過(guò)抗拮并排除來(lái) 自胃腸道的促炎癥或免疫調(diào)節(jié)微生物，從而另人吃驚的具有免疫調(diào)節(jié)作用。
益生菌一般是以活性細(xì)胞的形式。然而其還可擴(kuò)展至非活性細(xì)胞，例 如殺死的培養(yǎng)物或含有由益生菌所表達(dá)有益因子的組合物。這可包括熱殺 死的微生物或通過(guò)暴露于改變的pH或施加壓力而被殺死的微生物?？紤]到 非活性細(xì)胞產(chǎn)品制劑要更簡(jiǎn)單一些，可將這樣的細(xì)胞輕松地整合入藥品中 且儲(chǔ)藏要求也比活性細(xì)胞要寬松的多。干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9018提供了有效使用熱殺死細(xì)胞作為治療和/或預(yù)防腫瘤生長(zhǎng)的方法的一 個(gè)示例，參見(jiàn)美國(guó)專利第4，347，240號(hào)。 尚不清楚是否實(shí)施免疫調(diào)節(jié)作用需要完整的細(xì)菌，或者是否本發(fā)明的 個(gè)體活性成分能夠被單獨(dú)的利用。某些細(xì)菌菌株的促炎成分已被鑒定出來(lái)。 革蘭氏陰性細(xì)菌的促炎癥作用是通過(guò)脂多糖(LPS)介導(dǎo)的。LPS單獨(dú)可誘導(dǎo) 促炎網(wǎng)絡(luò)，部分是由于LPS可結(jié)合于單核細(xì)胞上的CD14受體。由于整個(gè) 細(xì)胞的作用， 一般都認(rèn)為益生菌的成分擁有免疫調(diào)節(jié)活性。直到對(duì)這些成 分進(jìn)行了分離，才能夠期待制藥級(jí)別的操作。
IL-10是由T細(xì)胞，B細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的。這種細(xì)胞因 子能夠增強(qiáng)B細(xì)胞向抗體分泌細(xì)胞的增殖與分化。IL-10具有最主要的抗炎 性活性。其可通過(guò)單核細(xì)胞上調(diào)IL-1RA的表達(dá)，并抑制大多數(shù)單核細(xì)胞的 炎性活性。通過(guò)反饋機(jī)制IL-10能夠抑制單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，具有反應(yīng) 活性氧和氮中間體，II類(lèi)MHC的表達(dá)，寄生蟲(chóng)殺死，以及IL-10產(chǎn)生(7)。 這種細(xì)胞因子還表現(xiàn)出可通過(guò)干擾PGE2-cAMP依賴的代謝途徑從而封閉 單核細(xì)胞產(chǎn)生腸膠原酶和IV型膠原酶，因此可作為慢性炎癥疾病中可見(jiàn)的 結(jié)締組織破壞的一種重要調(diào)節(jié)物。
宿主對(duì)感染的反應(yīng)可被描述為先天和獲得性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，旨在限制冒犯性生物體的散布以及重建器官的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。然而，為了限制
對(duì)宿主組織繼發(fā)傷害的攻擊性，可激活一系列調(diào)節(jié)限制。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (Tregs)就可實(shí)現(xiàn)一個(gè)這樣的機(jī)制。這些細(xì)胞可來(lái)自胸腺但也可在外周器官, 包括在消化道粘膜中進(jìn)行誘導(dǎo)。Treg細(xì)胞的故意給藥能夠在較廣范圍的小 鼠模型中抑制炎癥疾病，包括試驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎，炎性腸病，細(xì)菌 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎，膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎，I型糖尿病，氣道嗜酸性炎癥，移植物 -宿主疾病以及器官移植。叉頭轉(zhuǎn)錄因子Foxp3(叉頭盒P3)可在Treg細(xì)胞中 選擇性表達(dá)，其是Treg發(fā)育及功能所必需的，并足以在常規(guī)CD4細(xì)胞中誘 導(dǎo)Treg表現(xiàn)型(19)。在Foxp3中的突變可在人和小鼠中引起嚴(yán)重的多器官 自身免疫。發(fā)明人了描述能夠在體內(nèi)產(chǎn)生CD25陽(yáng)性/Foxp3陽(yáng)性T調(diào)節(jié)細(xì) 胞的雙歧桿菌菌株。
本發(fā)明可從以下實(shí)施例中獲得更明確的理解。
實(shí)施例h對(duì)從嬰兒糞便中分離的細(xì)菌進(jìn)行表征。益生性狀的證明。 益生菌的分離
從母乳喂養(yǎng)的3日齡男嬰獲得新鮮糞便并進(jìn)行連續(xù)稀釋，接種于添加 有0.05。/。半胱氨酸和莫匹羅星(mupirocin)的TPY(酪蛋白胰酶水解物，蛋白 胨和酵母汁)和MRS(deMann, Rogosa和Sharpe)培養(yǎng)基中。使用C02產(chǎn)生試 劑盒(Anaerocult A， Merck)將平板保溫于厭氧罐(BBL， Oxoid)中37。C培養(yǎng) 2-5天。將革蘭氏陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶陰性的桿狀形狀或分叉/多態(tài)細(xì)菌分離物 在復(fù)合非選擇性培養(yǎng)基(MRS和TPY)上進(jìn)行劃線純化。除非另有聲明，將 分離物常規(guī)培養(yǎng)于MRS或TPY培養(yǎng)基中，在37。C在厭氧條件下。將假定 的雙歧桿菌保存于40%甘油并儲(chǔ)存于-20°0和-80。C。
在分離到純雙歧桿菌菌株之后，指定其名稱為AH1205，對(duì)其微生物學(xué) 特征進(jìn)行評(píng)價(jià)并總結(jié)于下表l。 AH1205是革蘭氏陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶陰性的 多態(tài)型細(xì)菌，其是果糖-6-磷酸磷酸酮酶陽(yáng)性的，確證了其為雙歧桿菌。使 用加入單一碳源的基本培養(yǎng)基時(shí)，AH1205能夠生長(zhǎng)于所檢測(cè)的全部碳源 (葡萄糖、乳糖、核糖、阿拉伯糖、半乳糖、棉子糖、果糖、麥芽膏、甘露 糖、麥芽糖、蔗糖)中。
表1長(zhǎng)雙歧桿菌AH1205的生化特征
菌株特征長(zhǎng)雙歧桿菌AH1205
革蘭氏染色+
過(guò)氧化氫酶-
運(yùn)動(dòng)性-
F6PPK*+
牛奶凝集+
45°C厭氧培養(yǎng)-
45°C需氧培養(yǎng)-
CHO發(fā)酵
葡萄糖+
乳糖+
核糖+
阿拉伯糖+
半乳糖+
果糖+
麥芽膏+
甘露糖+
麥芽糖+
蔗糖+
*是指果糖-6-磷酸磷酸酮酶分析
品種鑒定
進(jìn)行了 16s基因間間隔子(IGS)序列測(cè)定從而鑒定了所分離到的雙歧桿 菌。簡(jiǎn)言之，使用lOOpl提取液和25pl組織制備液(Sigma， XNAT2試劑盒) 從AH1205中提取DNA。將樣本于95°C保溫5分鐘，然后加入100^1中和 液(XNAT2試劑盒)。使用Nanodrop分光光度計(jì)對(duì)基因組DNA溶液進(jìn)行定 量并儲(chǔ)存于4°C 。 使用基于 SEQ ID NO.l的IGS L: 5，-GCTGGATCACCTCCTTTC-3，(SEQ ID N0.3)'和基于SEQ ID NO.2的 IGS R: 5，-CTGGTGCCAAGGCATCCA-3，(SEQ ID N0.4)的IGS引物進(jìn)行 PCR。循環(huán)條件為94°C 3分鐘(l個(gè)循環(huán))，94°C 30秒，53°C 30秒，72°C 30秒(28個(gè)循環(huán))。所述PCR反應(yīng)含有4pl(50ng)DNA， PCR混合物(XNAT2試 劑盒)，0.4|iM IGS L和R引物(MWGBiotech,德國(guó))。PCR反應(yīng)在Eppendorf 熱循環(huán)儀上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物(10(il)與分子量標(biāo)記(100bp梯度標(biāo)記，Roche) 一起在2%染有EtBr的瓊脂糖凝膠中電泳，從而確定IGS圖譜。使用Promega Wizard PCR純化試劑盒對(duì)雙歧桿菌的PCR產(chǎn)物(單條帶)進(jìn)行純化。使用針 對(duì)于基因間間隔子區(qū)域的引物序列(如上所述)對(duì)純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。 隨后將序列數(shù)據(jù)在NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索從而根據(jù)核苷酸同源性 確定所述菌株。將所得DNA序列數(shù)據(jù)提交NCBI標(biāo)準(zhǔn)核苷酸-核苷酸同源性 BLAST搜索引擎(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。鑒定出與所述序列 最接近的匹配，然后使用DNASTARMegAlign軟件將所述序列進(jìn)行比較比 對(duì)。在序列表中可見(jiàn)到所得序列(SEQ ID NO.l [IGS正向序列]和SEQ ID NO.2 [IGS反向序列])。檢索NCIMB數(shù)據(jù)庫(kù)可發(fā)現(xiàn)AH1205具有獨(dú)特的 IGS(SEQIDNO.l [正向序列]和SEQ ID NO.2 [反向序列])序列，其具有與長(zhǎng) 雙歧桿菌的最接近的序列同源性。
為了開(kāi)發(fā)AH1205的條碼PCR圖譜，使用了 BOX引物進(jìn)行PCR(8)。 循環(huán)條件為94°C 7分鐘(l個(gè)循環(huán))，94。Cl分鐘，65°C 8分鐘(30個(gè)循環(huán))， 以及65。C 16分鐘。所述PCR反應(yīng)含有50ng DNA， PCR混合物(XNAT2試 齊U盒)， 0.3pM BOXA1R 弓| 物
(5，-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3，)(SEQ ID N0.5)(MWG Biotech,德 國(guó))。PCR反應(yīng)在Eppendorf熱循環(huán)儀上進(jìn)行。使用DNA 7500 LabChip⑧在 Agilent 2100生物分析儀(Agilent，德國(guó))對(duì)PCR產(chǎn)物(lpl)與分子量標(biāo)記 (7500bp梯度標(biāo)記，Agilent,德國(guó))一起進(jìn)行操作。使用Agilent生物分析儀 軟件確定條碼圖(PCR產(chǎn)物圖譜、)，并確定峰數(shù)量(PCR產(chǎn)物)和大小(圖1)。
抗生素敏感性圖譜
使用"紙片敏感性"分析方法確定長(zhǎng)雙歧桿菌的抗生素敏感性圖譜。將生 長(zhǎng)于適當(dāng)肉湯培養(yǎng)基中24-48小時(shí)的培養(yǎng)物(100pl)傾倒鋪板于瓊脂培養(yǎng)基 上，并將含有已知濃度抗生素的紙片放置于瓊脂上。在厭氧條件下在37。C 保溫1-2天之后檢測(cè)菌株的抗生素敏感性。如果可見(jiàn)到1mm或更大的抑菌 圈則考慮所述菌株是敏感的。獨(dú)立的評(píng)估每種抗生素的最低抑制濃度 (MIC)?？肆置顾?、萬(wàn)古霉素和甲硝唑的MIC分別為0.032、 0.75和>256。腸道轉(zhuǎn)移
為確定長(zhǎng)雙歧桿菌能否在相當(dāng)于胃中發(fā)現(xiàn)的低pH值條件下存活，從新 鮮的過(guò)夜培養(yǎng)物中收集細(xì)菌細(xì)胞，用磷酸緩沖液(pH6,5)洗滌2次并重懸于 (采用1M HC1)將pH調(diào)節(jié)至2.5的TPY肉湯培養(yǎng)基中。將細(xì)胞保溫于37°C 并使用平板計(jì)數(shù)法在5， 30， 60和120分鐘測(cè)定存活情況。AH1205在pH2.5 的條件下可在5分鐘內(nèi)存活良好，但在30分鐘之后則不能回收到具有活性 的細(xì)胞。
從胃排出之后，推定的益生菌將暴露于小腸中的膽汁鹽。為了確定長(zhǎng) 雙歧桿菌暴露于膽汁條件下的存活能力，將培養(yǎng)物劃線于添加有0.3%(w/v)、 0.5%、 1%、 2%、 5%、 7.5%或10。/。豬膽汁的TPY瓊脂平板上。在含有高至 0.5%膽汁的平板上都觀察到了長(zhǎng)雙歧桿菌的生長(zhǎng)。
在鼠模型中，對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌AH1205在胃腸道中的轉(zhuǎn)移能力進(jìn)行了評(píng) 估。對(duì)每日攝入lxl09AH1205的小鼠以及糞便顆粒進(jìn)行了飼喂微生物存在 的檢測(cè)。對(duì)AH1205的檢測(cè)是通過(guò)分離自發(fā)形成的雙歧桿菌利福平抗性變 異株來(lái)輔助的-將利福平加入用于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)移的TPY平板，確保僅有所飼喂的 利福平抗性雙歧桿菌得以培養(yǎng)。每日收集糞便樣本并確認(rèn)長(zhǎng)雙歧桿菌轉(zhuǎn)移 通過(guò)胃腸道(圖2)。
抗微生物活性
將用于本研究中的指示性致病微生物在以下生長(zhǎng)條件下在下述培養(yǎng)基 中進(jìn)行擴(kuò)增鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)(37。C，需氧)在添加 有0.6。/。酵母汁(TSAYE， Oxoid)的胰蛋白胨大豆肉湯/瓊脂培養(yǎng)基中，空腸 彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)(37。C，厭氧)和大腸桿菌0157: H7(37。C， 厭氧)在血瓊脂培養(yǎng)基中，艱難梭菌(Clostridium difficile)(37。C，厭氧)在加 強(qiáng)梭菌培養(yǎng)基(RCM， Oxiod)中。所有菌株都接種于新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基并于 實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行過(guò)夜生長(zhǎng)。
使用延遲的方法(9)來(lái)檢測(cè)抗微生物活性。簡(jiǎn)言之，將長(zhǎng)雙歧桿菌 AH1205保溫36-48小時(shí)。將10倍連續(xù)稀釋液涂平板(100^il)于TPY瓊脂培 養(yǎng)基上。在過(guò)夜保溫之后，將指示細(xì)菌覆蓋于具有完全分開(kāi)菌落的平板上。 指示菌苔是通過(guò)向已接種TPY平板的表面傾倒接種有2。/。(v/v)過(guò)夜指示培養(yǎng)物的融化覆蓋物來(lái)制備的。所述平板在適合指示細(xì)菌(indicatorbacterium) 生長(zhǎng)的條件下再次保溫過(guò)夜。抑菌圈半徑大于lmm的指示培養(yǎng)物可被考慮 為對(duì)所述檢測(cè)細(xì)菌敏感。長(zhǎng)雙歧桿菌AH1205能夠抑制所有檢測(cè)的致病性 生物體的生長(zhǎng)，所測(cè)定的透明圈對(duì)鼠沙門(mén)氏菌，空腸彎曲桿菌，大腸桿菌 0157: H7和艱難梭菌分別為8.67、 >80、 4.33和11.67 mm。
實(shí)施例2: PBMC對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌反應(yīng)產(chǎn)生細(xì)胞因子
通過(guò)密度梯度離心從健康供體分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。用益生菌 菌株在37。C對(duì)PBMC剌激72小時(shí)。在此時(shí)，收集培養(yǎng)物上清液，離心， 分裝并保存于-70。C直到使用流式微珠陣列(BDBioSciences)來(lái)對(duì)IL-10的水 平進(jìn)行分析。AH1205誘導(dǎo)人PBMC顯著分泌IL-10，提示這一益生菌株能 夠在體內(nèi)誘導(dǎo)抗炎癥應(yīng)答(圖3)。
實(shí)施例3:在鼠哮喘模型中長(zhǎng)雙歧桿菌AH1205能夠減輕呼吸道疾病
本研究調(diào)査了是否益生菌長(zhǎng)雙歧桿菌AH1205能否抑制過(guò)敏性氣道炎 癥的卵清蛋白(OVA)致敏小鼠模型中的過(guò)敏反應(yīng)。簡(jiǎn)言之，通過(guò)在0天和6 天腹腔注射OVA致敏成年雄性BALBZc小鼠。在12天和14天用OVA進(jìn) 行鼻內(nèi)攻擊。在最后一次攻擊(第15天)的24小時(shí)之后，測(cè)定小鼠的氣道反 應(yīng)性之后進(jìn)行BAL程序。OVA/alum致敏的、鹽水攻擊的小鼠用作對(duì)照。 整個(gè)試驗(yàn)期間動(dòng)物都接受益生菌或安慰劑。采用支氣管肺泡(BAL)灌洗液中 的炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)對(duì)氣道炎癥(細(xì)胞因子和細(xì)胞計(jì)數(shù))進(jìn)行分析。還采用 Buxco整體體積描記圖測(cè)定氣道反應(yīng)性。還從OVA致敏的小鼠中分離脾細(xì) 胞，并在存在抗CD-3和抗CD-28抗體的條件下進(jìn)行保溫，之后通過(guò)流式 細(xì)胞術(shù)測(cè)定上清液中的細(xì)胞因子水平。
與肉湯飼喂的動(dòng)物相比，在OVA攻擊之后，長(zhǎng)雙歧桿菌AH1205并未 導(dǎo)致從BAL液中回收的細(xì)胞數(shù)明顯降低(圖4)。測(cè)定氣道反應(yīng)性，且與鹽 水刺激的小鼠相比時(shí)，用OVA對(duì)致敏小鼠進(jìn)行的攻擊增加了對(duì)醋甲膽堿的 AHR。正如通過(guò)變長(zhǎng)的停頓的變化所測(cè)定的那樣，AH1205并不能調(diào)節(jié)對(duì)于 醋甲膽堿的這種增高的氣道反應(yīng)性(圖5)。
通過(guò)細(xì)胞珠陣列測(cè)定了 BAL細(xì)胞因子水平，并且證明了與OVA對(duì)照 相比，飼喂AH1205的動(dòng)物具有明顯降低的TNF-a水平(圖6C)。IL-10、INF-y、IL-6和CCL2水平?jīng)]有明顯的差異(圖6)。
實(shí)施例4: Treg效應(yīng)物模型
本研究調(diào)查了在健康小鼠中益生菌攝取對(duì)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量和活性 的影響。將BALB/c小鼠(IO只/組)飼喂長(zhǎng)雙歧桿菌AH1205或安慰劑3周。 在益生菌/安慰劑攝取之后，分離CD4+CD25+ T調(diào)節(jié)細(xì)胞，并通過(guò)使用流 式細(xì)胞術(shù)測(cè)定抗CD3/CD28刺激的CFSE-標(biāo)記的CD4+應(yīng)答T細(xì)胞的增殖來(lái) 確定其體外抑制活性。將CD4+應(yīng)答T細(xì)胞與CD4+CD25+ T細(xì)胞共保溫作 為對(duì)照。在益生菌或安慰劑詞喂小鼠的脾臟中，確定小鼠脾細(xì)胞中同樣是 FoxP3陽(yáng)性的CD4+CD25+細(xì)胞(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)的百分?jǐn)?shù)。
將與來(lái)自益生菌/安慰劑飼喂小鼠的CD4+CD25+細(xì)胞共保溫時(shí)增殖的 CD4+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)與來(lái)自相同處理小鼠的CD4+CD25-細(xì)胞共保溫時(shí)增殖 的CD4+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)進(jìn)行比較。在每種情況下，與含有單獨(dú)的CD4細(xì)胞 以及耗盡CD25+細(xì)胞的培養(yǎng)物相比，在含有CD4+CD25+細(xì)胞的培養(yǎng)物中， T細(xì)胞的增殖有所下降(圖7)。
確定了在CD4+類(lèi)群中同樣是CD25+的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(圖8)。與其安慰劑 飼喂的對(duì)應(yīng)物相比，長(zhǎng)雙歧桿菌AH1205詞喂組具有明顯更多的CD25+的 CD4+T細(xì)胞(即T-調(diào)節(jié)細(xì)胞)。這說(shuō)明通過(guò)詞喂AH1205，在CD4+類(lèi)群中的 T-調(diào)節(jié)細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)明顯增加。
還測(cè)定了益生菌或安慰劑飼喂小鼠的全部脾細(xì)胞類(lèi)群中的 CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞的數(shù)量。與飼喂安慰劑或未飼喂小鼠相比，在益生 菌詞喂的小鼠的脾臟中表達(dá)FoxP3的CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量未發(fā)生改 變。
實(shí)施例5:無(wú)菌模型
購(gòu)買(mǎi)6周齡的無(wú)菌小鼠，并保持在UCC生物服務(wù)中心的無(wú)菌單位中。 動(dòng)物攝取益生菌長(zhǎng)雙歧桿菌AH1205 9天或保持無(wú)菌狀態(tài)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù) 分析T調(diào)節(jié)細(xì)胞的誘導(dǎo)，并通過(guò)CBA定量細(xì)胞因子的水平。
通過(guò)在研究過(guò)程中測(cè)定選擇性瓊脂上的雙歧桿菌計(jì)數(shù)來(lái)分析AH1205 的轉(zhuǎn)移。即使每天給藥約口109生物體，AH1205也并未以可檢測(cè)的數(shù)量在 無(wú)菌小鼠的消化道中轉(zhuǎn)移。結(jié)果提示雙歧桿菌在消化道內(nèi)的成活需要其他的微生物或宿主因子。
盡管AH1205并未以可檢測(cè)的數(shù)量在消化道內(nèi)轉(zhuǎn)移，但所述細(xì)菌確實(shí) 與宿主的免疫系統(tǒng)相互作用。在9天飼喂之后，在AH1205飼喂的無(wú)菌動(dòng) 物腸系膜淋巴結(jié)和脾臟中的CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞數(shù)量都有明顯增加(圖 9)。總CD3/CD4或CD3/CD8計(jì)數(shù)保持不變。
使用抗CD3/CD28抗體或LPS在體外刺激分離的腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞 (MLNC)及脾細(xì)胞，或保持未刺激的狀態(tài)作為陰性對(duì)照。對(duì)小鼠預(yù)飼喂 AH1205時(shí)，在CD3/CD28刺激之后，培養(yǎng)物上清液中MLNC的IL-6和INF-y 的分泌都實(shí)質(zhì)上(substantially)降低，而MCP-1水平也明顯抑制(圖10)。在 各組之間的IL-10水平保持類(lèi)似。預(yù)飼喂AH1205時(shí)，IL-6和TNF-a的脾 細(xì)胞釋放都為實(shí)質(zhì)上但不顯著的降低(圖11)。在未刺激或LPS刺激的培養(yǎng) 物中未注意到明顯的差異，但總的說(shuō)來(lái)發(fā)明人從雙歧桿菌AH1205飼喂動(dòng) 物中觀察到了較低的促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生。
實(shí)施例6:穩(wěn)定性結(jié)果
益生菌菌株AH1205的穩(wěn)定性在30°C條件下在3個(gè)月發(fā)生了改變(圖
12)。
乳桿菌GG在所述檢測(cè)階段的表現(xiàn)不好，在3個(gè)月的時(shí)間段中有兩個(gè) bg單位的下降，而菌株AH1205在相同檢測(cè)階段中存活力下降了高達(dá)約1 個(gè)log單位。
免疫調(diào)節(jié)
人類(lèi)免疫系統(tǒng)在多種人類(lèi)疾病的病源學(xué)和病理學(xué)中起重要作用。高免 疫反應(yīng)和低免疫反應(yīng)可導(dǎo)致大部分疾病狀態(tài)，或是其組成部分。 一種生物 學(xué)實(shí)體家族，稱為細(xì)胞因子，對(duì)免疫過(guò)程的控制尤其重要。這些微妙細(xì)胞 因子網(wǎng)絡(luò)的擾動(dòng)越來(lái)越多地與多種疾病的相關(guān)。這些疾病包括但不限于， 炎性疾病、免疫缺陷、炎性腸病、腸易激綜合征、癌癥(尤其是那些胃腸和 免疫系統(tǒng)的癌癥)、腹瀉性疾病、抗生素相關(guān)的腹瀉、兒科腹瀉、闌尾炎、 自身免疫紊亂、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默氏病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、乳糜泄 (coeliac disease)、糖尿病、器官移植、細(xì)菌感染、病毒感染、真菌感染、牙 周病、泌尿生殖器疾病、性傳播疾病、fflV感染、HIV復(fù)制、HIV相關(guān)腹瀉、手術(shù)相關(guān)創(chuàng)傷、手術(shù)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移性疾病、敗血癥、體重下降、厭食癥、
發(fā)燒控制、惡病質(zhì)(cachexia)、創(chuàng)傷愈合、潰瘍、消化道屏蔽功能、過(guò)敏、 哮喘、呼吸疾病、循環(huán)疾病、冠心病、貧血、血凝系統(tǒng)疾病、腎病、中樞 神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝病、局部缺血、營(yíng)養(yǎng)不良、骨質(zhì)疏松癥、內(nèi)分泌紊亂、 表皮疾病、銀屑病和尋常痤瘡。對(duì)每一種所檢測(cè)益生菌株而言，其對(duì)于細(xì) 胞因子產(chǎn)生的效果都是特異性的。因此，可根據(jù)針對(duì)具體疾病類(lèi)型的專門(mén) 性細(xì)胞因子失調(diào)來(lái)選擇具體的益生菌株。可使用單獨(dú)的AH1205菌株或其 突變株或變異株或選定的這些菌株來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病特異性治療的定制。
免疫教育
腸道菌群對(duì)于腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育和適當(dāng)功能具有重要的作用。在腸 道菌群缺乏的時(shí)候，腸道免疫系統(tǒng)是發(fā)育不全的，正如在無(wú)菌動(dòng)物模型中 所證明的那樣，而且某些功能性參數(shù)也降低了，例如巨噬細(xì)胞吞噬能力和 免疫球蛋白生成(IO)。消化道菌群在刺激性非傷害性免疫反應(yīng)中的重要性也 變得愈發(fā)明顯。在西方世界中過(guò)敏發(fā)生及嚴(yán)重性的增加與衛(wèi)生保健和公共 衛(wèi)生的改善以及宿主收到的感染刺激的數(shù)量和范圍的降低有關(guān)。這種免疫 刺激的缺乏可允許宿主與非致病性，但具有抗原性的因子反應(yīng)，從而導(dǎo)致 過(guò)敏或自身免疫。 一系列非致病性免疫調(diào)節(jié)細(xì)菌的故意攝取可以為宿主提 供必需和適當(dāng)?shù)慕逃载菁亩峁┟庖吖δ艿倪m當(dāng)發(fā)育和控制。
炎癥
炎癥是用來(lái)描述在承受物理傷害，感染或正在發(fā)生免疫反應(yīng)的位點(diǎn)上 液體，血漿蛋白和白細(xì)胞局部聚集的術(shù)語(yǔ)。對(duì)炎癥反應(yīng)的控制可在多個(gè)水 平中實(shí)施(ll)?？刂埔蛩匕?xì)胞因子，激素(例如氫化可的松)，前列腺素， 反應(yīng)中間體和白細(xì)胞三烯。細(xì)胞因子是低分子量的具有生物活性的蛋白，
其涉及免疫學(xué)和炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生與控制，同時(shí)還可調(diào)控發(fā)育，組織修復(fù)和 造血作用。其為白細(xì)胞自身以及與其他細(xì)胞類(lèi)型之間提供了交流的渠道。 大多數(shù)細(xì)胞因子都是多效性的并可表達(dá)多種生物學(xué)重疊的活性。控制炎癥 反應(yīng)的是細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)和網(wǎng)絡(luò)，而并非是特定細(xì)胞因子對(duì)特定細(xì)胞類(lèi) 型的作用(12)。炎癥反應(yīng)的減弱導(dǎo)致了較低濃度的適當(dāng)激活信號(hào)，而其他的 炎癥介導(dǎo)物則導(dǎo)致了炎癥反應(yīng)的停止。TNFa是一種關(guān)鍵的促炎癥細(xì)胞因子，由于其啟動(dòng)了一些列細(xì)胞因子和生物學(xué)作用，導(dǎo)致了炎癥狀態(tài)。因此，
能夠抑制TNFa的制劑目前均被用于治療炎癥疾病，例如，英利昔單抗 (infliximab)。
促炎癥細(xì)胞因子被認(rèn)為在許多炎癥疾病，包括炎性腸病(IBD)中起到重 要的作用。目前針對(duì)于治療IBD的療法都旨在降低這些促炎癥細(xì)胞因子， 包括IL-8和TNFct的水平。這樣的療法在治療系統(tǒng)性炎癥疾病例如類(lèi)風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎時(shí)也能夠具有重要的作用。
本發(fā)明所述菌株在一系列炎癥疾病的治療中都具有潛在的應(yīng)用，尤其 是與其他抗炎癥療法，例如非類(lèi)固醇抗感染藥物(NSAID)或英利昔單抗組合
使用時(shí)。
細(xì)胞因子與癌癥
跨廣譜腫瘤類(lèi)型的多功能細(xì)胞因子的產(chǎn)生提示在患有癌癥的患者中正 在進(jìn)行明顯的炎癥反應(yīng)。目前尚不清楚何種這類(lèi)應(yīng)答的保護(hù)性效果會(huì)對(duì)體 內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)于發(fā)育有不利作用。然而，這些炎癥反應(yīng)都能夠不利地 影響到帶有腫瘤的宿主。復(fù)雜的細(xì)胞因子相互作用都參與在腫瘤與正常組 織中細(xì)胞因子產(chǎn)生與細(xì)胞增殖的調(diào)控(13， 14)。長(zhǎng)期以來(lái)都認(rèn)為體重下降(惡 病質(zhì))是在癌癥患者中的單一最常見(jiàn)死亡原因，且初始的營(yíng)養(yǎng)不良也指出不 良的預(yù)后。對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)于擴(kuò)散而言，其必需誘導(dǎo)新生血管的形成并分解 細(xì)胞外基質(zhì)。炎癥反應(yīng)對(duì)以上機(jī)制的實(shí)施具有重要的作用，因此對(duì)宿主的 衰弱以及腫瘤的發(fā)展有一定作用。由于嬰兒長(zhǎng)雙歧桿菌具有的抗炎癥性質(zhì)， 這些細(xì)菌菌株能夠降低惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化的比率。此外，腸道細(xì)菌能夠從膳食 化合物中產(chǎn)生具有遺傳毒性，致癌性以及腫瘤促進(jìn)活性的物質(zhì)，而消化道 細(xì)菌則能夠活化促致癌物為DNA反應(yīng)活性制劑(15)。 一般地，與消化道內(nèi) 的其他類(lèi)群，例如擬桿菌屬，真細(xì)菌屬和梭菌綱的微生物相比，雙歧桿菌 的種類(lèi)都具有較低的異型生物質(zhì)代謝酶。因此，消化道內(nèi)雙歧桿菌屬細(xì)菌 數(shù)量的增加也能夠有益地調(diào)節(jié)這些酶的水平。
疫苗/藥物遞送
大多數(shù)致病生物體都是通過(guò)粘膜表面進(jìn)入的?？赏ㄟ^(guò)特定的傳染性制 劑對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行有效接種來(lái)保護(hù)免受侵染。迄今為止，口服疫苗策略都集中于在對(duì)活致病性生物體的減毒或純化的膠囊化抗原的使用中(16)。經(jīng)工 程化能夠從感染性制劑中產(chǎn)生抗原的益生菌，在體內(nèi)，提供了極具前景的
替代品，因?yàn)閷?duì)人類(lèi)的攝取而言，這些細(xì)菌被認(rèn)為是安全的(GRAS狀態(tài))。 小鼠的研究證明攝取表達(dá)外源抗原的益生菌能夠提高保護(hù)性的免疫應(yīng) 答?？稍谌樗釛U菌中表達(dá)編碼破傷風(fēng)毒素片段C(TTFC)的基因，并通過(guò)口 服途徑免疫小鼠。這樣的系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)抗體滴度明顯高至足以保護(hù)小鼠免 受致死性毒素的刺激。除抗原提呈外，活細(xì)菌載體也能夠在體內(nèi)產(chǎn)生具有 生物活性的化合物，例如具有免疫刺激作用的細(xì)胞因子。在鼻內(nèi)免疫的小 鼠中，乳酸桿菌分泌的具有生物活性的人IL-2或IL-6和TTFC能夠誘導(dǎo) 10-15倍以上的血清IgG滴度(17)。然而，采用這一特定的細(xì)菌菌株，通過(guò) 與這些細(xì)胞因子的共表達(dá)，總IgA水平并未升高。也對(duì)其他的細(xì)菌菌株， 例如格氏鏈球菌(Streptococcus gordonii)，進(jìn)行了其作為粘膜疫苗有用性的檢 測(cè)。定植于鼠口腔與鞘膜腔的重組格氏鏈球菌可誘導(dǎo)對(duì)于該細(xì)菌所表達(dá)抗 原的粘膜與系統(tǒng)性抗體反應(yīng)(18)。因此，使用益生菌作為載體進(jìn)行的口服免 疫不僅可以保護(hù)宿主免受感染，還能夠取代病原體正常引起的免疫刺激， 從而有益于宿主的免疫教育。
顯生兀
益生性生物體的引入是通過(guò)以適當(dāng)?shù)妮d體攝入微生物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。其益 處在于提供了能夠在大腸中促進(jìn)這些益生菌株生長(zhǎng)的介質(zhì)。 一種或多種寡 糖，多糖或其他益生菌的加入都能夠促進(jìn)在胃腸道中乳酸細(xì)菌的生長(zhǎng)。益 生元是指任意非活性的食物成分，其是由被認(rèn)為是具有陽(yáng)性價(jià)值的內(nèi)源性 細(xì)菌，例如雙歧桿菌，乳酸桿菌在結(jié)腸中特異性的發(fā)酵而成的。益生元的 類(lèi)型可包括果糖，木糖，大豆，半乳糖，葡萄糖和甘露糖。益生菌株與一 種或多種益生元化合物的組合給藥可增強(qiáng)體內(nèi)所述給藥益生菌的生長(zhǎng)，從 而導(dǎo)致更有力的健康受益，且被稱為合益作用(synbiotic)。
其他活性成分
應(yīng)該理解益生菌株可預(yù)防性給藥或以其本身或與上述的其他益生菌和/ 或益生元物質(zhì)一起作為治療方法。此外，所述細(xì)菌可作為使用其他活性物 質(zhì)的預(yù)防或治療方案的一部分，例如那些用于治療炎癥或其他病癥特別是免疫相關(guān)病癥的方案。這樣的組合可作為單一制劑給藥或在相同或不同時(shí) 間且使用相同或不同的給藥途徑作為分離的制劑給藥。
本發(fā)明并不局限于本說(shuō)明書(shū)中所述的實(shí)施方案，其可在細(xì)節(jié)中有所改變。參考文獻(xiàn)
1. McCracken V丄and Gaskins H. R. Probiotics and the immune system. In: Probiotics a critical review, Tannock， GW (ed), Horizon Scientific Press, UK. 1999， p.85-113.
2. Savage D.C. Interaction between the host and its microbes. In: Microbial Ecology of the Gut， Clark and Bauchop (eds), Academic Press, London. 1977， p.277-310.
3. Kagnoff M.F. Immunology of the intestinal tract. Gastroenterol. 1993; 105 (5):1275-80,
4. Lamm M.E. Interaction of antigens and antibodies at mucosal surfaces. Ann. Rev. Microbiol. 1997; 51: 311-40.
5. Raychaudhuri S., Rock KL. Fully mobilizing host defense: building better vaccines. Nat biotechnol， 1998; 16: 1025-31.
6. Stallmach A.， Strober W, MacDonald TT， Lochs H， Zeitz M. Induction and modulation of gastrointestinal inflammation. Immunol. Today, 1998; 19(10): 438-41.
7. de Waal Malefyt R, Haanen J， Spits H, Roncarolo MG， te Velde A， Figdor C， Johnson K, Kastelein R， Yssel H， de Vries JE. Interleukin 10 (IL-10) and viral IL-10 strongly reduce antigen-specific human T cell proliferation by diminishing the antigen-presenting capacity of monocytes via downregulation of class II major histocompatibility complex expression, J Exp Med 1991 Oct 1; 174(4):915-24.
8. Masco L, Huys G, Gevers D， Verbrugghen L, Swings J. Identification of Bifidobacterium species using rep-PCR fingerprinting. Syst Appl Microbiol. 2003 Nov;26(4):557-63. PMID: 14666984.
9. Tagg, JR, Dajani， AS, Wannamaker, LW. Bacteriocins of Gram positive bacteria. Bacteriol Rev. 1976; 40: 722-756.
10. Crabbe RA.， H. Bazin， H. Eyssen， and J. F. Heremans. The normal microbial flora as a major stimulus for proliferation of plasma cells synthesizing IgA in the gut. The germ free intestinal tract. Into. Arch. Allergy Appl Immunol,1968; 34: 362-75.
11. Henderson B., Poole, S and Wilson M. 1998. In "Bacteria誦Cytokine interactions in health and disease. Portland Press, 79-130.
12. Arai KI, Lee F， Miyajima A, Miyatake S, Ami N, Yokota T. Cytokines: coordinators of immune and inflammatory responses. Annu Rev Biochem 1990;59:783-836.
13. McGee DW, Bamberg T, Vitkus SJ， McGhee JR. A synergistic relationship between TNF-alpha, IL-1 beta, and TGF-beta 1 on IL-6 secretion by the IEC-6 intestinal epithelial cell line. Immunology 1995 Sep;86(l》6-ll.
14. Wu S， Meeker WA， Wiener JR， Berchuck A, Bast RC Jr， Boyer CM. Transfection of ovarian cancer cells with tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) antisense mRNA abolishes the proliferative response to interleukin-l (IL-I) but not TNF- alpha. Gynecol Oncol 1994 Apr; 53(1):59陽(yáng)63.
15. Rowland LR. Toxicology of the colon: role of the intestinal microflora. In: Gibson G.R. (ed). Human colonic bacteria: role in nutrition, physiology and pathology, 1995, pp 155-174. Boca Raton CRC Press.
16. M^alker， R.I. New strategies for using mucosal vaccination to achieve more effective immunization. Vaccine, 1994; 12: 387-400.
17. Steidler L.， K. Robinson, L. Chamberlain, K.M Scholfield， E. Remaut， R.W.F. Le Page and J, M. Wells. Mucosal delivery of murine interleukin-2 (IL-2) and IL-6 by recombinant strains of Lactococcus lactis coexpressing antigen and cytokine. Infect. Immun.， 1998; 66:3183-9.
18. Medaglini D.， G. Pozzi, T.P. King and V.A. Fischetti. Mucosal and systemic immune responses to a recombinant protein expressed on the surface of the oral commensal bacterium Streptococcus gordonii after oral colonization. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1995;92:6868-72 McCracken VJ. and Gaskins H.R, Trobiotics a critical review', Horizon Scientific Press, UK 1999， p.278.
19. Marson, A.， Kretschmer, K., Frampton， G.M., Jacobsen, E.S., Polansky, J,K.， Maclsaac, K.D.， Levine, S. S.， Fraenkel, E., von Boehmer, H and Young， R.A. Foxp3 occupancy and regulation of key target genes during T-cell stimulation. Letters to Nature, 2007.
權(quán)利要求
1.保藏號(hào)為NCIMB41387的長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)菌株AH1205或其突變株或變異株。
2. 權(quán)利要求1的雙歧桿菌菌株，其中所述突變株是遺傳修飾的突變株。
3. 權(quán)利要求1的雙歧桿菌菌株，其中所述變異株是天然存在的雙歧桿 菌變異株。
4. 權(quán)利要求1的雙歧桿菌菌株，其是益生菌。
5. 權(quán)利要求1或4的雙歧桿菌菌株，其中所述菌株是生物學(xué)純培養(yǎng)物 的形式。
6. 雙歧桿菌NCIMB41387的分離株。
7. 活性細(xì)胞形式的權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的雙歧桿菌菌株。
8. 非活性細(xì)胞形式的權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的雙歧桿菌菌株°
9. 權(quán)利要求1-8中任一權(quán)利要求所述的雙歧桿菌菌株，其中所述雙歧 桿菌是從嬰兒糞便中分離的。
10. 權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的雙歧桿菌菌株，其中所述菌株 在口服之后在人中具有明顯的免疫調(diào)節(jié)性。
11. 包含權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述雙歧桿菌菌株的制劑。
12. 權(quán)利要求ll的制劑，其還含有益生性物質(zhì)(probioticmaterial)。
13. 權(quán)利要求11或12中任一權(quán)利要求所述的制劑，其還含有益生元物 質(zhì)(prebiotic material)。
14. 權(quán)利要求11-13中任一權(quán)利要求所述的制劑，其還含有可攝取的載體。
15. 權(quán)利要求14所述的制劑，其中所述可攝取的載體是藥用的可接受 載體，例如膠囊、片劑或粉末。
16. 權(quán)利要求14所述的制劑，其中所述可攝取的載體是食物制品，例 如酸化乳、酸奶、冷凍酸奶、奶粉、濃縮奶、軟干酪、調(diào)料或飲料。
17. 權(quán)利要求11-16中任一權(quán)利要求所述的制劑，其還含有蛋白質(zhì)和/ 或肽，特別是富含谷氨酰胺/谷氨酸的蛋白質(zhì)和/或肽、脂質(zhì)、碳水化合物、 維生素、礦物質(zhì)和/或痕量元素。
18. 權(quán)利要求11-17中任一權(quán)利要求所述的制劑，其中雙歧桿菌菌株在 每克所述制劑中以大于106cfb的量存在。
19. 權(quán)利要求11-18中任一權(quán)利要求所述的制劑，其還含有佐劑。
20. 權(quán)利要求11-19中任一權(quán)利要求所述的制劑，其還含有細(xì)菌成分。
21. 權(quán)利要求11-20中任一權(quán)利要求所述的制劑，其還含有藥物實(shí)體。
22. 權(quán)利要求11-21中任一權(quán)利要求所述的制劑，其還含有生物學(xué)化合物。
23. 權(quán)利要求11-22中任一權(quán)利要求所述的制劑，其用于免疫和接種方
24. 權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的雙歧桿菌菌株或權(quán)利要求 11-23中任一權(quán)利要求所述的制劑，其用于食物中。
25. 權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的雙歧桿菌菌株或權(quán)利要求 11-23中任一權(quán)利要求所述的制劑，其用作藥物。
26. 權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的雙歧桿菌菌株或權(quán)利要求 11-23中任一權(quán)利要求所述的制劑，其用于預(yù)防和/或治療不良炎性活性。
27. 權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的雙歧桿菌菌株或權(quán)利要求 11-23中任一權(quán)利要求所述的制劑，其用于預(yù)防和/或治療不良胃腸道炎性活 性，例如炎性腸病如克羅恩氏病或潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征、慢性腸 炎、或感染后結(jié)腸炎。
28. 權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的雙歧桿菌菌株或權(quán)利要求 11-23中任一權(quán)利要求所述的制劑，其用于預(yù)防和/或治療胃腸道癌癥。
29. 權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的雙歧桿菌菌株或權(quán)利要求 11-23中任一權(quán)利要求所述的制劑，其用于預(yù)防和/或治療系統(tǒng)性疾病例如類(lèi) 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
30. 權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的雙歧桿菌菌株或權(quán)利要求 11-23中任一權(quán)利要求所述的制劑，其用于預(yù)防和/或治療由不良炎性活性所 引起的自身免疫失調(diào)。
31. 權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的雙歧桿菌菌株或權(quán)利要求 11-23中任一權(quán)利要求所述的制劑，其用于預(yù)防和/或治療由不良炎性活性所 引起的癌癥。
32. 權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的雙歧桿菌菌株或權(quán)利要求11-23中任一權(quán)利要求所述的制劑，其用于預(yù)防癌癥。
33. 權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的雙歧桿菌菌株或權(quán)利要求 11-23中任一權(quán)利要求所述的制劑，其用于預(yù)防和/或治療由不良炎性活性所 引起的腹瀉疾病，例如與艱難梭菌(Clostridiumdifficile)相關(guān)的腹瀉、與輪狀 病毒相關(guān)的腹瀉、或由感染性因子例如大腸桿菌所引起的感染后腹瀉或腹 瀉疾病。
34. 權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的雙歧桿菌菌株或權(quán)利要求 11-23中任一權(quán)利要求所述的制劑，其用于制備用于預(yù)防和/或治療不良炎性 活性的抗炎生物治療劑。
35. 權(quán)利要求34所述的雙歧桿菌菌株，其用于制備用于調(diào)節(jié)IL-10水 平的一組生物治療劑。
36. 權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求的雙歧桿菌菌株或其具活性衍生片 段或突變株在預(yù)防和/或治療炎性疾病、免疫缺陷、炎性腸病、腸易激綜合 征、癌癥(尤其是那些胃腸和免疫系統(tǒng)的癌癥)、腹瀉性疾病、抗生素相關(guān)的 腹瀉、兒科腹瀉、闌尾炎、自身免疫紊亂、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默氏病、 類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、乳糜泄(coeliac disease)、糖尿病、器官移植、細(xì)菌感染、 病毒感染、真菌感染、牙周病、泌尿生殖器疾病、性傳播疾病、HIV感染、 HIV復(fù)制、HIV相關(guān)腹瀉、手術(shù)相關(guān)創(chuàng)傷、手術(shù)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移性疾病、敗血 癥、體重下降、厭食癥、發(fā)燒控制(fever control)、惡病質(zhì)(cachexia)、創(chuàng)傷 愈合、潰瘍、消化道屏蔽功能、過(guò)敏、哮喘、呼吸疾病、循環(huán)疾病、冠心 病、貧血、血凝系統(tǒng)疾病、腎病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝病、局部缺血、 營(yíng)養(yǎng)不良、骨質(zhì)疏松癥、內(nèi)分泌紊亂、表皮疾病、銀屑病和/或?qū)こｐ畲钪?的用途。
37. 權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求的雙歧桿菌菌株，其中所述菌株可 通過(guò)抗拮以及排除來(lái)自胃腸道中的促炎微生物來(lái)發(fā)揮作用。
38. 權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述的雙歧桿菌菌株或權(quán)利要求 11-23中任一權(quán)利要求所述的制劑，其用于制備用于降低促炎細(xì)胞因子水平 的抗炎生物治療劑。
39. 權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述雙歧桿菌菌株由于其具有拮抗 致病物種生長(zhǎng)的能力從而用作抗感染益生菌株的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及口服攝取之后具有免疫調(diào)節(jié)作用且可用于預(yù)防和/或治療炎性活性，例如不良胃腸道炎性活性，例如炎性腸病的益生雙歧桿菌菌株AH1205或其突變株或變異株。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101679938SQ200880017881
公開(kāi)日2010年3月24日 申請(qǐng)日期2008年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月28日
發(fā)明者B·基利, D·歐沙利文, J·麥克謝里, L·歐馬奧尼 申請(qǐng)人:營(yíng)養(yǎng)健康有限公司