專利名稱：擬珊瑚素生產(chǎn)細(xì)菌及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋微生物學(xué)、天然產(chǎn)物化學(xué)和萜烯生產(chǎn)方法的領(lǐng)域。更 加具體地，本發(fā)明涉及擬珊瑚素生產(chǎn)細(xì)菌以及使用這種細(xì)菌生產(chǎn)擬珊瑚素 的方法。
背景技術(shù)：
許多具有潛在商業(yè)應(yīng)用的生物活性化合物已從海洋生物得到。在這之 中，擬珊瑚素是 一 組分離于加勒比海萄更柳珊瑚尸化w^ 尸fcragorg/a efea6"/we的二薛糖香。擬珊瑚素代表抗炎和止痛代謝物的重要結(jié)構(gòu)類型， 并且與諸如消炎痛的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品比較，其表現(xiàn)出優(yōu)越的止痛活性。目前， 用于商業(yè)產(chǎn)品和臨床試驗的擬珊瑚素是通過提取從珊瑚礁收獲的柳珊瑚P WsaZ)C/^而獲得。
概述本發(fā)明依據(jù)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)來自柳珊瑚i^ewc/c^eragorg/a efo^"/we的細(xì)菌的分離克隆菌林能夠在體外培養(yǎng)物中制備擬珊瑚素，且 不需要具有正常存在于柳珊瑚P e/w"Z^/we的其他的細(xì)菌、藻類或動物細(xì) 胞。這是重要的，因為一般認(rèn)為生產(chǎn)諸如擬珊瑚素的天然產(chǎn)物以輔助促進(jìn) 生產(chǎn)有機(jī)體在復(fù)雜生態(tài)環(huán)境中的生存，并因此這種天然產(chǎn)物的生產(chǎn)需要存 在多種有機(jī)體。參見例如Angeii等人，2006. Chem. Biol. 13:1349-59 (生產(chǎn) 綠膿素需要兩種海洋源的細(xì)菌)。
在制作本發(fā)明中，從巴拿馬群島的比米尼群島附近水域收集的柳珊瑚 P e/"Y^"/ ae樣品中分離了富含蟲黃藻的部分。將這一部分接種于培養(yǎng)基 以產(chǎn)生混合細(xì)菌培養(yǎng)物。數(shù)次傳代培養(yǎng)后，將產(chǎn)生的培養(yǎng)物稀釋，并置于 固體瓊脂培養(yǎng)基上。顯示固體培養(yǎng)基上生長的數(shù)個菌落當(dāng)隨后在液體培養(yǎng) 基中培養(yǎng)時，生產(chǎn)擬珊瑚素。
這一發(fā)現(xiàn)是重要的，因為其首次允許以可控的標(biāo)準(zhǔn)化方式制備無限 量的擬駙瑚素，而不需要從環(huán)境敏感的珊瑚礁收集?？捎捎谰美鋬鲈N培 養(yǎng)的良好表征的細(xì)菌的單一克隆生產(chǎn)擬珊瑚素，這允許開發(fā)有效的和標(biāo)準(zhǔn) 化的生產(chǎn)方法。例如，可使用發(fā)酵以生產(chǎn)大量的擬珊瑚素，且不受與從自 然界收集相關(guān)的限制(例如有限的供應(yīng)、禁止收獲珊瑚的法律)。對于基 于擬珊瑚素的藥物(以及其他的生物產(chǎn)物)，這種標(biāo)準(zhǔn)化方法應(yīng)該促進(jìn)適 應(yīng)生產(chǎn)管理規(guī)范，諸如美國聯(lián)邦法典的標(biāo)題21,第211部分所述的現(xiàn)行良 好生產(chǎn)實踐管理規(guī)范。
單一細(xì)菌還可通過突變或遺傳修飾進(jìn)行改良，從而提高產(chǎn)率。這些相
足商業(yè)市場。開環(huán)擬珊瑚素是擬珊瑚素的生物合成中的中間體。這些分子 已經(jīng)顯示出超越擬珊瑚素的抗炎活性，但發(fā)現(xiàn)其在柳珊瑚P efcaZ^f/we中 含量較低。引起擬珊瑚素通路的截短的簡單突變可產(chǎn)生能夠產(chǎn)生開環(huán)擬珊 瑚素的細(xì)菌培養(yǎng)物?？色@得源自寬地理分布的所有26種已知擬珊瑚素的 個體菌抹，而目前僅在單一區(qū)域允許商業(yè)收獲野生柳珊瑚P e/,似&欲"e。
已知細(xì)菌的混合群體是流動的穩(wěn)定狀態(tài)，因為群體的各種成員為有限 的營養(yǎng)物而試圖竟?fàn)庍^其他成員。這產(chǎn)生細(xì)菌的亞穩(wěn)定群體，其中負(fù)責(zé)生
5產(chǎn)二級代謝物的群體成員可能被竟?fàn)幪蕴簦瑢?dǎo)致生產(chǎn)的損失。由于混合 培養(yǎng)物的內(nèi)在不穩(wěn)定性，它們經(jīng)常受到它們的環(huán)境變化影響，這種變化太 過細(xì)微而不能有效地控制。沒有正常用于發(fā)酵生產(chǎn)的生產(chǎn)控制應(yīng)用于混合 培養(yǎng)物，所述生產(chǎn)控制諸如確保菌林純度和身份。
因此，本發(fā)明以擬珊瑚素生產(chǎn)細(xì)菌培養(yǎng)物為特征，其包括在培養(yǎng)基(例 如包含營養(yǎng)物和海水的培養(yǎng)基)中的分離的擬珊瑚素生產(chǎn)克隆細(xì)菌菌林的 培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)基支持細(xì)菌菌抹的生長。該菌抹能是從柳珊瑚尸.
efoa6ef/we分離的菌抹。其還能是假單胞菌種(Pseudomonas species)。細(xì)菌 培養(yǎng)物能包括由細(xì)菌菌林生產(chǎn)的至少一種擬珊瑚素，濃度超過約5微克/ 升(例如超過約5毫克/升)。其還能包括誘導(dǎo)細(xì)菌菌抹突變的試劑。
另一方面，本發(fā)明以分離的擬珊瑚素生產(chǎn)克隆細(xì)菌菌林為特征。分離 的菌抹可以是冷凍的，例如用于保藏，和/或用作原種以接種將來的培養(yǎng)物。
細(xì)菌菌^^文庫也屬于本發(fā)明，其包括至少第 一分離的擬珊瑚素生產(chǎn)克 隆細(xì)菌菌林，和不同于第一菌林的第二分離的擬珊瑚素生產(chǎn)克隆細(xì)菌菌 抹。在文庫的一種變化形式中，第一菌林生產(chǎn)第一擬珊瑚素，而第二菌林 產(chǎn)生具有不同于第一擬珊瑚素的化學(xué)結(jié)構(gòu)的第二擬珊瑚素。
本發(fā)明還以生產(chǎn)擬珊瑚素的方法為特征。該方法能包括以下步驟提 供分離的擬珊瑚素生產(chǎn)克隆細(xì)菌菌抹的至少一種培養(yǎng)物；用所述培養(yǎng)物接 種培養(yǎng)基；將被接種的培養(yǎng)基置于促進(jìn)細(xì)菌生產(chǎn)擬珊瑚素的條件下；以及 從培養(yǎng)基純化擬珊瑚素。提供分離的擬珊瑚素生產(chǎn)克隆細(xì)菌菌林的至少一 種培養(yǎng)物的步驟能包括融化分離的擬珊瑚素生產(chǎn)克隆細(xì)菌菌林的冷凍樣 品。將被接種的培養(yǎng)基置于促進(jìn)細(xì)菌生產(chǎn)擬珊瑚素的條件下的步驟能包括 在約30。C下孵育被接種的培養(yǎng)基和/或孵育被接種的培養(yǎng)基至少22天。從 培養(yǎng)基純化擬珊瑚素的步驟包括用有機(jī)溶劑提取至少 一部分培養(yǎng)基以產(chǎn) 生包含擬珊瑚素的提取物的步驟，以及任選地使該提取物經(jīng)受色譜分離的 步驟。
在又一個方面中，本發(fā)明以生產(chǎn)至少第 一擬珊瑚素和第二擬珊瑚素的 混合物的方法為特征，所述第一擬珊瑚素具有不同于第二擬珊瑚素的化學(xué) 結(jié)構(gòu)，并且該混合物包括預(yù)先確定的摩爾比的第 一擬珊瑚素和第二擬珊瑚素。這一方法能包括以下步驟從包括第一擬珊瑚素但沒有第二擬珊瑚素
的第一細(xì)菌培養(yǎng)物中純化第一擬珊瑚素；從包括第二擬珊瑚素但沒有第一 擬珊瑚素的第二細(xì)菌培養(yǎng)物中純化第二擬珊瑚素；并以預(yù)先確定的比例混 合第 一純化的擬珊瑚素和后來的第二擬珊瑚素。
除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員所通常理解的同樣的含義。分子生物學(xué)術(shù)語的定義可參見，例 3口 Rieger等人，Glossary of Genetics: Classical and Molecular (遺4專學(xué)i司、J匚 表分類和分子)，第5版，Springer-Verlag: New York, 1991;和Lewin, Genes V (基因V) , Oxford University Press: New York, 1994。有才幾化學(xué)和 酶學(xué)的定義可參見例如R. B. Silverman等人，The Organic Chemistry of Enzyme-Catalyzed Reactions(酶^BM匕反應(yīng)的有才幾4b學(xué))，Academic Press: San Diego, Calif, 2000;以及R.T. Morrisson等人，Organic Chemistry (有機(jī)化 學(xué))，第6版,Addison- Wesley Publishing Co.: Boston, Mass., 1992。
如本文所用，短語"克隆細(xì)菌菌抹，，指(i)具有第一基因型的單一細(xì)菌 細(xì)胞或(ii)由該單一細(xì)菌細(xì)胞繁衍并具有第一基因型的細(xì)胞群體。盡管 與本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料能用于本發(fā)明的實踐 或檢測，但下文描述了合適的方法和材料。本文提及的所有的出版物、專 利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)通過引用以其整體并入。在沖突的情況下， 將以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外，下文討論的具體實施方案僅為示 例，且無意限制。
附圖筒述


圖1是PS 137培養(yǎng)物提取物的UHPLC-MS的結(jié)果圖。A )提取的445.2 m/z的離子色譜圖。B ) 445.2 m/z的碎片產(chǎn)生的299.2 m/z離子的碎片產(chǎn)生 的MSS質(zhì)譜。三個譜的平均范圍是4.97-5.03分鐘。
圖2是已鑒定的擬珊瑚素G的UHPLC-MS的結(jié)果圖。A)提取的445.2 m/z的離子色譜圖。B ) 445.2 m/z的碎片產(chǎn)生的299.2 m/z離子的碎片產(chǎn)生 的MSS質(zhì)譜。三個譜的平均范圍是4.93-4.99分鐘。圖3是顯示PS 137的三份重復(fù)培養(yǎng)物中以3天為間隔的所述培養(yǎng)物 的擬珊瑚素G含量的圖。
詳述
本發(fā)明涵蓋分離的擬珊瑚素生產(chǎn)細(xì)菌菌抹，這種菌抹的文庫，這種菌 抹的培養(yǎng)物和生產(chǎn)擬珊瑚素或擬珊瑚素的混合物而沒有大量破壞珊瑚礁 的方法。以下描述的優(yōu)選的實施方案闡明這些菌林的適應(yīng)、文庫、培養(yǎng)物 和方法。然而，根據(jù)下文提供的描述，由這些實施方案的描述可進(jìn)行和/ 或?qū)嵺`本發(fā)明的其他方面。
擬珊瑚素生產(chǎn)細(xì)菌菌抹。用于本發(fā)明的細(xì)菌能是生產(chǎn)擬珊瑚素的任何 細(xì)菌。如本文所描述，合適的這種細(xì)菌能從常見于熱帶大西洋(包括加勒 比海區(qū)域，包括巴拿馬群島的比米尼群島附近)的淺水礁體的柳珊瑚 gorgonian的柳珊瑚i3 efeWd/we紫色褶邊海扇分離。例如，柳珊瑚i5 e/z^Z^/7"e的活體樣品能從環(huán)境收獲，然后進(jìn)行收集并繁衍其中存在的擬 珊瑚素細(xì)菌。在示例性的方案中，將活體柳珊瑚P efoaZ)"/we樣品切成較 小片，并在混合器中勻化?？赏ㄟ^粗過濾除去大珊瑚片，并將含有細(xì)菌的 濾液重復(fù)洗滌，并離心。然后，可通過密度離心分離產(chǎn)生的團(tuán)塊(例如使 用不連續(xù)PercolM)梯度，并收集30%和70% Percoll⑧界面處的材料帶)。 這一富含蟲黃藻的部分能在約37°C (例如約25-40°C,諸如在24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40和41°C ) 下，在其中支持細(xì)菌生長的培養(yǎng)基(例如在由海水制備的營養(yǎng)肉湯[NB] 培養(yǎng)基)中，在寬杠\封蓋的培養(yǎng)瓶中，在環(huán)境條件下，且不振蕩地培養(yǎng)。 培養(yǎng)物能在任何階段重復(fù)地傳代培養(yǎng)和冷凍(例如在-80。C或更低的溫度 下在甘油或DMSO中)?？赏ㄟ^在固體細(xì)菌生長培養(yǎng)基上劃線分離一份培 養(yǎng)物，然后挑取產(chǎn)生的單個細(xì)菌菌落，來從這些混合的培養(yǎng)物中分離克隆 細(xì)菌菌林。這些分離的克隆細(xì)菌菌抹能用于接種無菌液體細(xì)菌生長培養(yǎng)基 以制備單個分離的克隆細(xì)菌菌抹的培養(yǎng)物。能分析每個培養(yǎng)物的一種或多 種擬珊瑚素(或其合成中間體；參見美國專利6,780,622)的存在以鑒別產(chǎn) 生一種或多種擬珊瑚素(或其合成中間體)的那些菌抹。分離的擬珊瑚素和 Malpartida和Hopwood 1984, Nature,第309巻，第462-464頁。
例如，分離的擬珊瑚素生產(chǎn)克隆細(xì)菌菌抹的樣品能暴露于誘變劑諸如 甲磺酸乙酯或亞硝基胍，以誘導(dǎo)菌株的基因組DNA的隨機(jī)突變。能通過 單個菌落的劃線分離和挑取來分離樣品中的單個細(xì)菌。產(chǎn)生的單個菌落能 ^皮培養(yǎng)，并檢測擬珊瑚素的生產(chǎn)。能選擇表現(xiàn)出預(yù)期特征(例如產(chǎn)生高水 平的擬珊瑚素，產(chǎn)生特定的擬珊瑚素、其衍生物、其合成中間體[諸如開 環(huán)擬珊瑚素]或以上所述物質(zhì)的混合物)的那些菌落以進(jìn)一步使用。
文庫。兩種或更多種(例如2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 20、 30、 50、 100或更多)不同的擬珊瑚素生產(chǎn)菌抹能合并以形成具有不同特征的 不同菌^^的文庫(例如第一菌抹生產(chǎn)第一擬珊瑚素或擬珊瑚素的混合物， 第二菌林生產(chǎn)不同于第 一菌林的第二擬珊瑚素或擬珊瑚素的混合物，且第 三菌抹產(chǎn)生不同于第一菌抹和第二菌抹的第三擬珊瑚素或擬珊瑚素的混 合物)。優(yōu)選的文庫是包括至少26種不同菌抹的文庫，其中每種菌林生產(chǎn) 不同的擬珊瑚素，以致該文庫能用于生產(chǎn)26種已知類型的擬珊瑚素，以 便于在篩選測定中使用。兩種或更多種不同的菌林能在例如-8(TC冷藏室 或在液氮中，在分離的小瓶中儲存?？蛇x地，能使用具有各自裝有單一菌 ;昧的多個孔或儲存單無的單個容器。
擬珊瑚素生產(chǎn)細(xì)菌培養(yǎng)物。 一種或多種(例如l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 20或更多)擬珊瑚素生產(chǎn)細(xì)菌菌抹能與支持其生長的培養(yǎng)基混 合以形成擬珊瑚素生產(chǎn)細(xì)菌培養(yǎng)物。可使用任何合適的培養(yǎng)基。在實施例 中，使用以下描述的在海水中的營養(yǎng)肉湯(每升3 g牛肉提取物和5 g蛋 白胨；"NB，，)。培養(yǎng)物能置于促進(jìn)細(xì)菌生長和/或擬珊瑚素的生產(chǎn)的任何合 適條件。(例如在環(huán)境大氣條件；在約25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39或40。C下；在培養(yǎng)瓶中，且不振蕩)?？蓪?其他因子，諸如一種或多種細(xì)胞密度感受分子、宿主因子(即由柳珊瑚P efcaZ)W/we產(chǎn)生的、調(diào)節(jié)細(xì)菌生產(chǎn)擬珊瑚素的試劑)和增強(qiáng)萜烯生產(chǎn)的其 他因子(例如植物生長因子，諸如水楊酸甲酯)，加入到培養(yǎng)物中。諸如編碼抗生素耐受性的核酸的可選擇標(biāo)志物可引入擬珊瑚素生產(chǎn)細(xì)菌的菌 抹中，例如以防止純培養(yǎng)物的污染。
生產(chǎn)擬珊瑚素和/或其合成中間體的方法。 一種或多種擬珊瑚素(或其 合成中間體)能通過將細(xì)菌的擬珊瑚素生產(chǎn)培養(yǎng)物置于促進(jìn)細(xì)菌生長和/ 或一種或多種擬珊瑚素的生產(chǎn)的條件下而制備。擬珊瑚素和/或諸如開環(huán)擬 珊瑚素的其合成中間體能通過修改已知程序從培養(yǎng)物中純化，所述程序諸
如Look等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 6238-6240, 1986; Look等人，丄 Org. Chem. 51: 5140-5145, 1986; Look等人，Tetrahedron 43:3363-3370, 1987; Roussis等人，J. Org. Chem. 55:4916-4922, 1990;和美國專利第 4,849,410、 4,745,104和5,624,911號描述的方案。此外，為了高度回收(例 如超過約90%),可使用諸如HP20、 AmberliteXAD2、 XAD7、 XAD1180 或C-18的樹脂從培養(yǎng)物中純化擬珊瑚素。例如，將HP20樹脂加入到擬珊 瑚素生產(chǎn)細(xì)菌的培養(yǎng)物(例如以1 mL樹脂/5 mL培養(yǎng)物的比例)，并混合 (例如，持續(xù)至少約30分鐘)。然后過濾樹脂，并用水洗滌，然后用曱醇 洗滌。然后，在HPLC純化(或UHPLCMS分析)前，經(jīng)C-l8柱分出曱 醇部分。含有擬珊瑚素的產(chǎn)物能根據(jù)具體應(yīng)用的需要，包含不同量的擬珊 瑚素。例如，產(chǎn)物可含有按重量計約0.001%-100%的擬珊瑚素(例如按重 量計0.0009%、 0.001%、 0.01%、 0.1%、 1%、 2%、 3%、 4%、 5%、 6%、 7%、 8%、 9%、 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%、 99.5%、 99.9%、 99.99%或99.999%的擬珊瑚素)。藥用級擬珊瑚素將是無菌的，并缺少明 顯量的熱原。
生產(chǎn)擬珊瑚素的混合物的方法。 一次生產(chǎn)的各種純化的擬珊瑚素能混 合到一起以產(chǎn)生所需的產(chǎn)物。例如，至少第一擬珊瑚素和第二擬珊瑚素(能 是例如2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25或26種不同的擬珊瑚素)能以預(yù)先確定的 摩爾比(例如l:l、 1:2、 1:3、 1:4、 1:5、 1:6、 1:7、 1:8、 1:9、 1:10、 1:20、 1:50、 1:100、 1:250、 1:500或1:1000)混合到一起以制備所需的產(chǎn)物，其 中第一擬珊瑚素具有不同于第二擬珊瑚素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。這一方法能包括以
10下步驟從包含第 一擬珊瑚素但沒有第二擬珊瑚素的第 一細(xì)菌培養(yǎng)物中純
化第一擬珊瑚素；從包含第二擬珊瑚素但沒有第一擬珊瑚素的第二細(xì)菌培 養(yǎng)物中純化第二擬珊瑚素；以及將第一純化的擬珊瑚素與此后的第二擬珊 瑚素以預(yù)先確定的比例混合。
實施例
本發(fā)明通過以下具體的實施例進(jìn)一步闡釋。提供所述實施例僅為示 例，且不應(yīng)理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍或內(nèi)容。
實施例1 -生產(chǎn)擬珊瑚素的細(xì)菌的克隆菌林的分離。 才才沖牛和方法
使用的介質(zhì)和化學(xué)品除非其中另外指出，所有的介質(zhì)和化學(xué)品購買 于Fisher Scientific。所有的淡水是二次去離子化的"超純(Nanopure)"水。 》'每7K獲自Gumbo Limbo Environmental Complex (Boca Raton, FL), 并JU吏 用前通過0.22 的無菌濾器過濾。通過加入每升水36 g Instant Ocean 牌合成海鹽，隨后通過高壓滅菌來滅菌而制備人工海水。通過加入每升水 5g蛋白胨和3g肉提取物，隨后通過高壓滅菌來滅菌而制備營養(yǎng)肉湯(NB) 培養(yǎng)基。通過加入每升水36 g Instant Ocean 、 5 g蛋白胨和3 g肉提取物， 隨后通過高壓滅菌來滅菌而制備海水NB培養(yǎng)基。通過向先前描述的液體 制品加入每升水10 g瓊脂來制備固體瓊脂培養(yǎng)基。
擬珊瑚素測定將HP20樹脂(5 mL)加入到25 mL培養(yǎng)物，并將樣 品以150rpm攪拌30分鐘。然后，過濾樹脂，并用水(15 mL )和甲醇(15 mL )洗滌。曱醇提取物經(jīng)C-18柱分成四個部分1 ) H20, 2 ) H20:MeOH (1:1 )， 3 ) MeOH和4 ) CH2C12。將第三部分蒸發(fā)，溶解于lOO)iL甲醇， 并通過LC-MS分析20 pL。諸如Amberlite XAD2、 XAD7、 XAD1180、 C-18的其他樹脂和諸如凍干、隨后提取的其他純化策略也能用于從培養(yǎng)物 中純化擬珊瑚素。
擬珊瑚素含量分析在裝有Hypersil Gold C-18柱(50 mm x 2.1 mm,1.9 pm粒徑)的Thermo Scientific Accela-LXQ UHPLC-MS上分析樣品。 注射的樣品量是1.5 nL。流動相是400 pL/分鐘的水和甲醇的梯度。梯度 按照以下設(shè)計用50%水50%曱醇洗脫，l分鐘；梯度漸變至100%甲醇， 4分鐘；100%曱醇，5分鐘；以及用50%甲醇50%水再次平衡，1分鐘。 通過Accela PDA檢測器掃描200-800 nm，并監(jiān)測229 nm、 276 nm和286 nm而監(jiān)測洗脫液。還通過LXQ離子阱質(zhì)譜儀以陰離子模式進(jìn)行如下的6 個順序掃描事件來分析洗脫液掃描事件l:掃描50.0-800.0 m/z;掃描事 件2: 445.2 m/z的MS2，掃描150.0-500.0 m/z;掃描事件2: 445.2 m/z的 299.2 m/z碎片的MS3，掃描80.0-300.0 m/z;掃描事件4: 487.2 m/z的 MS2,掃描130.0-500.0 m/z;掃描事件5: 487.2 m/z的445.2 m/z碎片的 MS3，掃描150.0-500.0 m/z;掃描事件6: 487.2的445.2 m/z碎片的299.2 m/z石卒片的MS4，掃描80.0-300.0 m/z。
已鑒定的擬珊瑚素的提取人工使用SCUBA在巴拿馬群島的比米尼 群島附近的水域中收集活體柳珊瑚P efc^"/ ae試樣。試樣在太陽下千 燥，并在室溫下儲存，直至提取。用乙酸乙酯、二氯曱烷和50:50乙酸乙 酯:二氯甲烷各600 mL順序提取干燥的柳珊瑚P e/waZ^/we。合并這些提 取物，并將溶劑減壓蒸發(fā)，產(chǎn)生粗提取物。將粗材料溶解于甲醇/水(9:l), 并用己烷分配以獲得無極性提取物。將甲醇水的比例調(diào)節(jié)至1:1，并將水 層用二氯甲烷分配。二氯曱烷部分作為篩選實驗中的擬珊瑚素G、 H、 I 和J的標(biāo)準(zhǔn)混合物。
通過制備型TLC,使用50:50乙酸乙酯己烷流動相從二氯曱烷分配部 分純化擬珊瑚素G。通過UV使各個帶顯色，并用刀片移出硅膠上的相應(yīng) 區(qū)域。擬珊瑚素G用乙S交乙酯提取，并通過HPLC純化。通過NMR確認(rèn) 擬珊瑚素G的身份。
菌林分離人工使用SCUBA在巴拿馬群島的比米尼群島附近的水域 中收集活體柳珊瑚efc"^欲ae試樣，并裝入水族缸中。富含蟲黃藻的部 分獲自單一活體珊瑚試樣。將約10 g的柳珊瑚P efo"6e欲ae用剪子剪成 約lcm的片。珊瑚片在用淡水稀釋的50%海水中洗滌。將珊瑚片和約25 mL 50%海水移動轉(zhuǎn)移至無菌混合器中。使用短脈沖以最大動力混合珊瑚。通過4層無菌粗棉布過濾混合的珊瑚以除去大珊瑚碎片。濾餅用15 mL的 50%海水清洗一次。將濾液以370 x g離心3分鐘，棄去上清液，將團(tuán)塊 再次懸浮于50mL的50%海水中。將團(tuán)塊離心，并以相同的方式再次懸浮 10次。將已洗滌的團(tuán)塊在4。C下儲存過夜。通過浮力密度離心使用不連續(xù) 的Percoll⑧梯度使已洗滌的團(tuán)塊的蟲黃藻進(jìn)一步富集。通過將在50%海水 中的10 mL 30% Percol頓在7.5 mL 70% Percoll⑧上成層制備Percoll⑧梯度。 將已洗滌的團(tuán)塊覆蓋于這些制備的梯度上，隨后以105xg離心10分鐘。 收集30%和70°/。 Percoll界面處的材料帶，用50%海水稀釋至50 mL，并 以370 x g?；恋?分鐘。將團(tuán)塊再次懸浮于20 mL 50%海水中，并在4°C 下儲存。
將富含蟲黃藻的部分加入到在500 mL燒瓶中的250 mLNB培養(yǎng)基。 在37。C下，在寬松封蓋的培養(yǎng)瓶中，在環(huán)境條件且無振蕩下，使這一培養(yǎng) 物(PE8 )生長。2天后，將40 mL這一培養(yǎng)物用于接種400 mL NB培養(yǎng) 基。在37。C且無振蕩下，使這一培養(yǎng)物生長134天。將2.5毫升這一培養(yǎng) 物接種于250mLNB。在30。C且無振蕩下，使這一培養(yǎng)物(PE8-subl)生 長222天。將一份這一培養(yǎng)物(PE8-sub2)與甘油混合至30%甘油的最終 濃度，并在-8(TC下保持冷凍。
用小份(約5 )冷凍的PE8-sub2冷藏室原種接種10毫升海水NB 培養(yǎng)基。30。C且無振蕩下3天后，將10 mL培養(yǎng)物的1.5 mL接種于150 mL 海水NB(PS10)。 3(TC且無振蕩下，將這一培養(yǎng)物孵育29天。將這一培 養(yǎng)物的產(chǎn)物以1:10,000稀釋于海水NB培養(yǎng)基，然后將100 |iL稀釋的培 養(yǎng)物置于固體海水NB瓊脂板上。將板在30。C下孵育2天。挑取單個菌落， 并用于單獨地接種45 mL海水NB的等^f分試樣(培養(yǎng)物PS116至PS155 )。 3(TC下，14天后，按照先前所述，通過UHPLC-MS根據(jù)擬珊瑚素篩選培 養(yǎng)物，并將甘油原種置于-80。C。
在初次篩選中，14種不同的培養(yǎng)物顯示出擬珊瑚素生產(chǎn)。單一培養(yǎng)物 從甘油原種劃線分離至固體瓊脂海水NB培養(yǎng)基。單一菌落連續(xù)劃線分離 4次以確保菌林純度。將來自培養(yǎng)物的單一菌落接種于50 mL海水NB。 30°C下2天后，將這一培養(yǎng)物接種于各自含有45 mL海水NB和450 pL接種物的培養(yǎng)管中。3(TC且無振蕩下8天后，按照先前所述，檢測管的內(nèi) 含物中擬珊瑚素的產(chǎn)生。
16S分離16S rDNA由假單胞菌種(Pseudomonas sp.)菌林PS 137 的基因組DNA擴(kuò)增。根據(jù)生產(chǎn)商用于細(xì)菌的說明書使用Qiagen Genomic Tip 100/G試劑盒純化來自在30。C下海水NB中且無振蕩2天后的10 mL 培養(yǎng)物的團(tuán)塊假單胞菌種PS 137菌抹的gDNA。 16DrDNA通過聚合酶鏈 式反應(yīng)(PCR)在50 pL反應(yīng)中擴(kuò)增，所述反應(yīng)含有1X熱穩(wěn)定的聚合酶 緩沖液(20 mM Tris-HCl pH 8.8, 2 mM MgS04 10 mM KC1, 10 mM (NH4)2S04, 0.1% Triton X100 )、 0.025 mM各dNTP、 1 一各引物RC 1492
GTT TGA TCC TGG CTC AG ) ( SEQ ID NO:3 )、 1-2 ng gDNA和2.5 U Taq 聚合酶(NEB )。 PCR程序在95。C持續(xù)1分鐘，隨后是30個循環(huán)95。C持 續(xù)45秒，55。C持續(xù)45秒以及72。C持續(xù)1分鐘，隨后72。C下持續(xù)3分鐘。 將約600 bp PCR產(chǎn)物凝膠純化(Qiagen)并測序(Analytical Genetics Technology Centre, Toronto, ON )。 4吏用blastn算法分4斤序列。
結(jié)果
從在巴拿馬群島的比米尼群島附近水域收集的約10 g柳珊瑚P 中分離富含蟲黃藻的部分。將這一部分接種于培養(yǎng)基以產(chǎn)生來 自與蟲黃藻緊密相關(guān)的細(xì)菌的混合細(xì)菌集聚。數(shù)次傳代培養(yǎng)后，將產(chǎn)生的 細(xì)菌集聚稀釋，并置于固體瓊脂培養(yǎng)基。從生長在固體培養(yǎng)基上的細(xì)菌菌 落篩選40個菌落用于擬珊瑚素的生產(chǎn)。
數(shù)個培養(yǎng)物顯示以不同的比例生產(chǎn)擬珊瑚素G和H-J。圖l顯示提取 的一個這種菌抹PS137的445.2 m/z的離子色譜圖。在R.T. 5.00±0.03分鐘 處的峰的MS3顯示符合已鑒定的擬珊瑚素G在相同保留時間處的峰的 MS3 (圖2)。還觀察到分子離子487.2 m/z的R.T. 5.03士0.03分鐘和 5.19±0.01分鐘處的峰。這些峰與乙?；臄M珊瑚素H、 I和J的峰一致。 比米尼群島柳珊瑚P etoW^/we的二氯甲烷提取物含有與在培養(yǎng)物提取 物中發(fā)現(xiàn)的487 m/z峰相同的峰。來自在接種時取得的培養(yǎng)物樣品的提取 物不含有可檢測的擬珊瑚素。由假單胞菌種菌抹PS 137生產(chǎn)的化合物的所有LCMS數(shù)據(jù)與來自已鑒定的Ps G、 H、 I和J的標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)據(jù)在所有 方面均相同。HPLC保留時間(RT )是相同的，且MS數(shù)據(jù)表明存在相同 的分子離子，MSS和MS"普。
重復(fù)培養(yǎng)物PS 137的生長和分析。獲得的UPLC-MS色譜圖和譜與圖 1中描述的那些相同。16SrDNA由培養(yǎng)物PS 137的5個單一菌落通過PCR 擴(kuò)增，并測序。以下SEQ ID NO: 1是5個單一序列的共有序列。這一序 列通過BLAST算法鑒別為起始于假單胞菌屬的菌種。
實施例2 -證明PS 137中擬珊瑚素G生產(chǎn)的時程研究。
以三天的時間間隔獲得三份重復(fù)培養(yǎng)物的等份試樣(如實施例1所描 述)，并通過LCMS各自分析擬珊瑚素G (PsG)含量。如圖3所示，在 第22天，在所有三份重復(fù)試樣中PsG含量明顯增加。
其它實施方案
應(yīng)理解，盡管已經(jīng)描述了本發(fā)明連同其詳細(xì)的描述，但是以上的描述 意在示例，且不限制本發(fā)明的范圍。其它的方面、優(yōu)勢和改良屬于以下權(quán) 利要求的范圍。
權(quán)利要求
1.一種擬珊瑚素生產(chǎn)細(xì)菌培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物包括在支持所述細(xì)菌菌株生長的培養(yǎng)基中的分離的擬珊瑚素生產(chǎn)克隆細(xì)菌菌株。
2. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)物，其中所述菌林可從柳珊瑚
3. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)物，其中所述菌抹是假單胞菌種。
4. 如權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)物，其中所述菌林包含含有SEQ ID NO: 1 的序列的核酸。
5. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物包含由所述細(xì)菌菌林 生產(chǎn)的至少一種擬珊瑚素，濃度大于5微克/升。
6. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物包含由所述細(xì)菌菌抹 生產(chǎn)的至少一種擬珊瑚素，濃度大于5毫克/升。
7. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)物主要由所述分離的擬 珊瑚素生產(chǎn)克隆細(xì)菌菌林和所述培養(yǎng)基組成。
8. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)物，其還包括用于誘導(dǎo)所述細(xì)菌菌抹突變 的試劑。
9. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)物，其中所述培養(yǎng)基包含營養(yǎng)物和海水。
10. —種分離的擬珊瑚素生產(chǎn)克隆細(xì)菌菌抹。
11. 如權(quán)利要求8所述的細(xì)菌菌林，其中所述菌林是冷凍的。
12. —種細(xì)菌菌一朱文庫，所述文庫包括至少第一分離的擬珊瑚素生產(chǎn) 克隆細(xì)菌菌抹和第二分離的擬珊瑚素生產(chǎn)克隆細(xì)菌菌抹，所述第一菌抹不 同于所述第二菌抹。
13. 如權(quán)利要求12所述的文庫，其中所述第一菌^f朱生產(chǎn)第一擬珊瑚 素，且所迷第二菌抹生產(chǎn)第二擬珊瑚素，所述第一擬珊瑚素具有不同于所 述第二擬珊瑚素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
14. 一種生產(chǎn)擬珊瑚素的方法，所述方法包括以下步驟 提供分離的擬珊瑚素生產(chǎn)克隆細(xì)菌菌林的至少 一種培養(yǎng)物；用所述培養(yǎng)物接種培養(yǎng)基；將被接種的培養(yǎng)基置于促進(jìn)所述細(xì)菌生產(chǎn)所述擬珊瑚素的條件下；以及從所述培養(yǎng)基純化所述擬珊瑚素。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中提供分離的擬珊瑚素生產(chǎn)克隆細(xì) 菌菌林的至少一種培養(yǎng)物的所述步驟包括融化所述分離的擬珊瑚素生產(chǎn) 克隆細(xì)菌菌4朱的冷凍 一羊品。
16. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含營養(yǎng)物質(zhì)和海水。
17. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中將被接種的培養(yǎng)基置于促進(jìn)所述 細(xì)菌生產(chǎn)所述擬珊瑚素的條件下的所述步驟包括在約30。C下孵育所述被 接種的培養(yǎng)基。
18. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中將被接種的培養(yǎng)基置于促進(jìn)所述 細(xì)菌生產(chǎn)所述擬珊瑚素的條件下的所述步驟包括孵育所述被接種的培養(yǎng) 基至少14天。
19. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中從所述培養(yǎng)基純化所述擬珊瑚素 的所述步驟包括用有機(jī)溶劑提取至少一部分所述培養(yǎng)基以產(chǎn)生包含所述 擬珊瑚素的提取物的步驟。
20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中從所述培養(yǎng)基純化所述擬珊瑚素 的所述步驟還包括使所述提取物經(jīng)受色譜分離的步驟。
21. —種生產(chǎn)至少第一擬珊瑚素和第二擬珊瑚素的混合物的方法，所 述第一擬珊瑚素具有不同于所述第二擬珊瑚素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，且所述混合物 包含預(yù)先確定的摩爾比的所述第一擬珊瑚素和第二擬珊瑚素，所述方法包 括以下步驟從包含所述第 一擬珊瑚素但沒有所述第二擬珊瑚素的第 一 細(xì)菌培養(yǎng) 物中純化所述笫 一擬珊瑚素；從包含所述第二擬珊瑚素但沒有所述第 一擬珊瑚素的第二細(xì)菌培養(yǎng) 物中純化所述第二擬珊瑚素；以及將第一純化的擬珊瑚素與所迷第二擬珊瑚素以預(yù)先確定的比例混合。
全文摘要
來自柳珊瑚Pseudopterogorgia elisabethae的細(xì)菌的克隆菌株能夠在體外培養(yǎng)物中制備擬珊瑚素，且不需要具有正常存在于柳珊瑚P.elisabethae的其他的細(xì)菌、藻類或動物細(xì)胞。
文檔編號C12N1/20GK101688172SQ200880021494
公開日2010年3月31日 申請日期2008年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日
發(fā)明者拉塞爾·克爾, 洛伊·Z·圣地亞哥-瓦茲奎茲, 蘇塔伯恩·本雅杰特彭格 申請人:愛德華王子島大學(xué);佛羅里達(dá)州大西洋大學(xué)