專利名稱：：改善的制粉性能的遺傳基礎(chǔ)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明大體上涉及植物遺傳學(xué)。更特別地，本發(fā)明涉及遺傳選擇具有改善的谷物研磨質(zhì)量和面粉產(chǎn)率的植物的方法。
背景技術(shù)：
：研磨質(zhì)量取決于三個主要特征，其依次受小麥的遺傳種源和植物發(fā)育過程中的環(huán)境條件影響，三個主要特征是被認(rèn)為是小麥研磨行為中的重要因素的谷粒硬度，應(yīng)該盡可能高的胚乳與糠的比例，以及糠的分離的簡易性(Haddad等人1999)。通常認(rèn)為硬小麥更容易研磨，因?yàn)闂l件作用后較容易將糠與胚乳分離開，并且釋放的面粉流動性更強(qiáng)，更容易篩分。因此，研究主要著眼于解釋在硬表型內(nèi)的硬度變異(硬度變異又導(dǎo)致制粉性能變異)的遺傳機(jī)理。硬度或胚乳內(nèi)聚性被認(rèn)為主要受特定的嘌呤吲哚(Puroindoline)基因型和嘌呤卩引哚蛋白的分布所影響(Greenwell和Schofield，1986;Giroux等人2003;C即parelli等人2003;Hogg等人2004;Gedye等人2005;Day等人2006;Swan等人2006)。與染色體5D的短臂上的Ha基因座緊密相連的Pina-Dl和Pinb-Dl等位基因決定硬度表型(Turnball和Rahman，2002)。但是，這不能完全解釋所觀察到的硬度的遺傳變異，特別是在每個硬度類別內(nèi)的硬度變異，人們認(rèn)為還有其它的修飾基因負(fù)責(zé)硬或軟類別內(nèi)的硬度范圍(Martin等人，2001;Osborne等人2001;Turnball等人2000)。幾個研究小組已經(jīng)研究了嘌呤吲哚在解釋硬度的類別內(nèi)變異中的作用。在硬小麥中，相對于Pina-Dlb等位基因來說，Pina-Dlb等位基因與更硬的質(zhì)地相關(guān)聯(lián)(Giroux和Morris，1997)。Martin等人(2001)報道，在硬紅春小麥中，Pinb-Dlb(較軟質(zhì)地)等位基因與更高的面粉產(chǎn)率相關(guān)聯(lián)。
發(fā)明內(nèi)容常規(guī)培育策略和研磨技術(shù)已經(jīng)達(dá)到了面粉研磨產(chǎn)率的平臺期。因此，即使是植物研磨質(zhì)量特性上的最小的改進(jìn)也具有極大地影響商業(yè)制粉性能的潛力。因此，本發(fā)明人鑒定有確定不同農(nóng)作物包括小麥的制粉性能的新的和改善的方法的需要。本發(fā)明廣泛涉及來自谷類種子的分離的核酸序列，其與改善的制粉性能相關(guān)，并可用于選擇、預(yù)測和/或工程化具有改善的制粉能力的農(nóng)作物。在第一個方面，本發(fā)明提供了一種選擇具有改善的制粉能力的谷物或產(chǎn)生谷物的植物的方法，包括以下步驟確定谷物或產(chǎn)生谷物的植物中存在的與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸的相對數(shù)量，從而確定谷物或產(chǎn)生谷物的植物是否具有改善的制粉能力的傾向。在第二個方面，本發(fā)明提供了一種確定谷物或產(chǎn)生谷物的植物是否遺傳傾向于改善的制粉能力的方法，包括以下步驟檢測與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸。在一個優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸編碼包含選自以下的氨基酸序列的多肽:SEQIDNO:49至56，SEQIDNO:190，SEQIDNO:2845或SEQIDNO:290至295，或其片段。優(yōu)選地，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸編碼包含選自以下的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:49或SEQIDN0:190，或其片段。根據(jù)這些具體實(shí)施方式，片段包含選自以下的氨基酸序列SEQIDNO:107至117或SEQIDNO:235至251。在另一個優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸包含選自以下的核苷酸序列:SEQIDNO:15，SEQIDNO:26，SEQIDNO:159至169，SEQIDNO:188至189，SEQIDNO:194至202，SEQIDNO:285至289或SEQIDNO:296至301，或其片段。更優(yōu)選地，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸包含選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:26或SEQIDNO:285。優(yōu)選地，片段包含選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:57至60，SEQIDNO:72至74，SEQIDNO:95至99，SEQIDNO:215至224，SEQIDNO:102，SEQIDNO:162，SEQIDNO:163，SEQIDNO:164，SEQIDNO:165，SEQIDNO:166，SEQIDNO:167，SEQIDNO:168或SEQIDNO:169。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸是與前述的本發(fā)明的分離的核酸具有至少60%序列同一性的變體。優(yōu)選地，變體與選自SEQIDNO:26或SEQIDNO:285的核苷酸序列具有至少70%的序列同一性。優(yōu)選地，變體包括選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:41，SEQIDNO:42，SEQIDNO:43，SEQIDNO:44，SEQIDNO:45，SEQIDNO:46，SEQIDNO:47，SEQIDNO:48或SEQIDNO:194。優(yōu)選地，與參考樣品相比，谷物或產(chǎn)生谷物的植物具有減少的相對數(shù)量的與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸。在第三個方面，本發(fā)明提供了研磨面粉的方法，包括以下步驟根據(jù)第一個方面的方法選擇可研磨的谷物或可研磨的產(chǎn)生谷物的植物以便于后續(xù)將所述谷物研磨產(chǎn)生面粉。在第四個方面，本發(fā)明提供了鑒定與谷物的或產(chǎn)生谷物的植物的改善的制粉能力相關(guān)的一個或多個植物遺傳基因座的方法，包括以下步驟確定一個或多個植物遺傳基因座是否與面粉研磨產(chǎn)率相關(guān)或相聯(lián)。優(yōu)選地，一個或多個植物遺傳基因座是選自SEQIDNO:15或SEQIDNO:159至169的核苷酸序列的多態(tài)性。更優(yōu)選地，一個或多個植物遺傳基因座是選自SEQIDNO:15或SEQIDNO:159的核苷酸序列的多態(tài)性。在第五個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)具有改善的制粉能力的產(chǎn)生谷物的植物的方法，包括以下步驟選擇性調(diào)節(jié)與改善的制粉能力相關(guān)的基因，從而與所述基因沒有被調(diào)節(jié)的產(chǎn)生谷物的植物相比，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的所述基因的相對數(shù)量較低。預(yù)想到，在特定的具體實(shí)施方式中，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因可以通過常規(guī)植物培育被調(diào)節(jié)。在替代的具體實(shí)施方式中，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因的調(diào)節(jié)可以通過重組DNA方法學(xué)實(shí)現(xiàn)，從而產(chǎn)生"遺傳修飾的"或"轉(zhuǎn)基因的"植物。在第六個方面，本發(fā)明提供了根據(jù)第五個方面的方法生產(chǎn)的具有改善的制粉能力6的產(chǎn)生谷物的植物。在第七個方面，本發(fā)明涉及研磨面粉的方法，包括以下步驟從根據(jù)第五個方面的方法生產(chǎn)的產(chǎn)生谷物的植物獲得谷物以用于后續(xù)研磨產(chǎn)生面粉。在第八個方面，本發(fā)明提供了用于改善谷物制粉能力的遺傳構(gòu)建體，其包括如前所述的與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸。在第九個方面，本發(fā)明提供了具有改善的制粉能力的產(chǎn)生谷物的植物，其中與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因被選擇性調(diào)節(jié)從而與基因沒有被調(diào)節(jié)的植物相比，具有與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因的較低相對數(shù)量。優(yōu)選地，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因編碼包含選自以下的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:49至56，SEQIDNO:190，SEQIDNO:284或SEQIDNO:290至295，或其片段。在一個優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因編碼包含選自以下的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:49或SEQIDNO:190，或其片段。根據(jù)這些具體實(shí)施方式，片段包含選自以下的氨基酸序列SEQIDNO:107至117或SEQIDNO:235至251。在另一個優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因包含選自以下的核苷酸序列:SEQIDN0:15，SEQIDN0:26，SEQIDNO:159至169，SEQIDNO:188至189，SEQIDNO:193至202，SEQIDNO:285至289或SEQIDNO:296至301，或其片段。更優(yōu)選地，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因包含選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:26或SEQIDNO:285。優(yōu)選地，片段包含選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:57至60，SEQIDNO:72至74，SEQIDNO:95至99，SEQIDNO:215至224，SEQIDNO:102，SEQIDNO:162，SEQIDNO:163，SEQIDNO:164，SEQIDNO:165，SEQIDNO:166，SEQIDNO:167，SEQIDNO:168或SEQIDNO:169。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因是與前述的本發(fā)明的分離的核酸具有至少60%序列同一性的變體。優(yōu)選地，變體與選自SEQIDNO:26或SEQIDNO:285的核苷酸序列具有至少70%的序列同一性。優(yōu)選地，變體包括選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:41，SEQIDNO:42，SEQIDNO:43，SEQIDNO:44，SEQIDNO:45，SEQIDNO:46，SEQIDNO:47，SEQIDNO:48或SEQIDNO:194。優(yōu)選地，谷物或產(chǎn)生谷物的植物具有包含至少胚乳和糠層的谷粒。更優(yōu)選地，谷物或產(chǎn)生谷物的植物是小麥。在第十個方面，本發(fā)明提供了與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸，其包括選自以下的核苷酸序列:SEQIDNO:15，SEQIDNO:26，SEQIDNO:159至169，SEQIDNO:193至202，SEQIDNO:285至289或SEQIDNO:296至301，或其變體。在第十一個方面，本發(fā)明提供了分離的多肽，其包括選自以下的氨基酸序列SEQIDNO:49至56，SEQIDNO:190，SEQIDNO:284或SEQIDNO:290至295，或其變體。貫穿本說明書，除非上下文要求，否則單詞"包括(comprise)"、"包括(comprises)"和"包括(comprising)"將被理解為包括所述的元素或元素集合但不排除任何其它的元素或元素集合。為了使本發(fā)明更容易被理解并付諸實(shí)際效應(yīng)，現(xiàn)在將通過實(shí)施例并參考隨附的附圖而描述優(yōu)選的具體實(shí)施方式，其中參考數(shù)字代表相應(yīng)部分，其中圖1.在2005年，從兩個地點(diǎn)(N和B)收集的開花后(dpa)14天產(chǎn)的小麥種子樣品中的71個小麥品種中，面粉產(chǎn)率作為種子重量百分率的分布。在這些地點(diǎn)從最初的基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)中根據(jù)面粉產(chǎn)率選擇了10個小麥品種-5個來自分布的低端，5個來自分布的高丄山順。圖2.從來自14dpa樣品的生長于Narrabri和Biloela的小麥品種中的面粉產(chǎn)率的比較。圖3A.來自14dpa樣品的高產(chǎn)率和低產(chǎn)率小麥品種的平均面粉產(chǎn)率。每個產(chǎn)率類別由5個小麥品種組成，它們來自2005年從兩個地點(diǎn)(Biloela，Qld.和Narrabri，NSW)收獲的小麥的測定。標(biāo)明了每個產(chǎn)率類別的平均值的95%置信區(qū)間。圖3B.使用Bioanalyser(AgilentTechnologies,USA)進(jìn)行的14dpa產(chǎn)生的小麥種子的RNA的質(zhì)量檢測。圖3C.使用Bioanalyser(AgilentTechnologies,USA)進(jìn)行的30dpa產(chǎn)生的小麥種子的RNA的質(zhì)量檢測。圖4.14dpa樣品的每個芯片的表達(dá)的麥粒密度估計。圖5.14dpa樣品的每個芯片的表達(dá)的箱須圖。圖6.14dpa樣品的基因表達(dá)的MA圖。圖7.14dpa樣品的基因表達(dá)的MA圖。圖8.基于14dpa樣品的小麥品種的基因表達(dá)的主要成分圖。圖9.基于14dpa樣品的單一連接算法的聚類樹狀圖(clusterdendogram)。圖10.基于14dpa樣品的平均連接算法的聚類樹狀圖。圖11.基于14dpa樣品的完全連接算法的聚類樹狀圖。圖12.14dpa樣品的低產(chǎn)率相對于高產(chǎn)率品種的ROC曲線。圖12A.14pda的高面粉產(chǎn)率和低面粉產(chǎn)率的小麥品種之間的非重疊(分離的基因)基因表達(dá)。圖12B.顯示30dpa的高面粉產(chǎn)率和低面粉產(chǎn)率的小麥品種之間的非重疊(分離的基因)基因表達(dá)信號的虛像。圖13A.ESTTA.28688.1.A1_AT(SEQIDNO:1)的核苷酸序列。圖13B.耙標(biāo)小麥的核苷酸序列Ta.28688.1.Al_at;gb|BJ275807。圖14.從SEQIDNO:1翻譯而來的多肽的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。圖15.在2005年，從兩個地點(diǎn)(N和B)收集的開花后(dpa)30天產(chǎn)的小麥種子樣品中的71個小麥品種中，面粉產(chǎn)率作為種子重量百分率的分布。在這些地點(diǎn)從最初的基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)中根據(jù)面粉產(chǎn)率選擇了10個小麥品種-5個來自分布的低端，5個來自分布的高丄山順。圖16.從生長于Narrabri和Biloela的小麥品種中的來自30dpa樣品的面粉產(chǎn)率的比較。圖17.高產(chǎn)率和低產(chǎn)率小麥品種的平均面粉產(chǎn)率。每個產(chǎn)率類別由5個小麥品種組成，它們來自2005年從30dpa產(chǎn)的小麥種子樣品，從兩個地點(diǎn)(Biloela，Qld.和Narrabri，NSW)收獲的小麥的測定。標(biāo)明了每個產(chǎn)率的平均值的95%置信區(qū)間。圖18.30dpa樣品的每個芯片的表達(dá)的麥粒密度估計。圖19.30dpa樣品的每個芯片的表達(dá)的箱須圖。圖20.30dpa樣品的基因表達(dá)的MA圖。圖21.30dpa樣品的基因表達(dá)的MA圖。圖22.基于30dpa樣品的小麥品種的基因表達(dá)的主要成分圖。圖23.基于30dpa樣品的單一連接算法的聚類樹狀圖(clusterdendogram)。圖24.基于30dpa樣品的平均連接算法的聚類樹狀圖。圖25.基于30dpa樣品的完全連接算法的聚類樹狀圖。圖26.30dpa樣品的低產(chǎn)率相對于高產(chǎn)率品種的ROC曲線。圖27A.TA.11743.1.Al.at(SEQIDNO:3)耙標(biāo)序列的核苷酸序列。圖27B.小麥WHEAT:TA.11743.1.A1_AT_耙標(biāo)序列的核苷酸序列(SEQIDNO:3)。圖28.包含TA.11743.1.Al.at耙標(biāo)序列的EST的核苷酸序列(SEQIDNO:4)。圖29.對應(yīng)于耙標(biāo)Ta.28688.1.Al_at的詳細(xì)基因序列，如從NetAffx網(wǎng)站所獲得。圖30.EST簇與耙標(biāo)Ta.28688.1.Al_at的比對。圖31.EST簇與耙標(biāo)Ta.28688.1.Al_at的比對的共有序列(SEQIDNO:49)。圖32.基于EST與靶標(biāo)Ta.28688.1.Al_at的比對而產(chǎn)生的共有序列的預(yù)測的14dpa基因的開放閱讀框。圖33.預(yù)測的14dpa基因序列的開放閱讀框的推定外顯子。使用水稻基因組序列LocusNCJ)08400來確定外顯子的位置。圖34.針對EST簇與耙標(biāo)Ta.28688的比對而產(chǎn)生的共有序列設(shè)計的引物。在PCR中使用這些引物從小麥擴(kuò)增14dpa基因。圖35.在0.7%的瓊脂糖凝膠上分辨PCR擴(kuò)增片段。經(jīng)PCR擴(kuò)增的推定的14dpa基因片段顯示為1.4kb片段。primerl4dpaFl和primerl4dpaRl用于以小麥cvBobwhite中分離的基因組DNA進(jìn)行的PCR。圖36.篩選白色菌落以鑒定重組菌落，所述重組菌落含有經(jīng)PCR擴(kuò)增的推定的14dpa基因片段顯示為1.4kb片段，其是使用primerl4dpaFl和primerl4dpaRl以小麥cvBobwhite中分離的基因組DNA擴(kuò)增的。圖37.使用重組菌落Cl，C2，C3，C4，C5，C6.C7，C9以PCR擴(kuò)增的推定的14dpa片段。這些片段被純化和測序。圖38.重組菌落Cl，C2，C3，C4，C5，C6.C7和C9中的克隆片段的序列并包含推定的來自小麥的14dpa基因(SEQIDNO:41至48)。圖39.重組克隆Cl，C2，C3，C4，C5，C6，C7和C9中克隆的片段的序列比對。重組菌落包含分離的推定的來自小麥的14dpa基因。這些序列既有外顯子又有內(nèi)含子序列。圖40.EST與靶標(biāo)Ta.28.688的共有序列的比對，和14dpa基因的開放閱讀框序列和來自克隆2的14dpa基因序列。比對顯示克隆2中的分離的PCR片段是14dpa基因。比對還顯示14dpa克隆2序列上的外顯子和開放閱讀框序列的幾乎完美的匹配。圖41.來自所有的重組克隆Cl，C2，C3，C4，C5，C6，C7和C9的14dpa編碼序列的比對。這些序列對應(yīng)于外顯子序列。圖42.來自所有的重組克隆Cl，C2，C3，C4，C5，C6，C7和C9的14dpa翻譯的編碼序列的比對。圖43.的。對應(yīng)于重組克隆2的基因序列的nr-DNA的BLAST搜索。圖44.對應(yīng)于重組克隆2的基因序列的EST的BLAST搜索。圖45.對應(yīng)于重組克隆2的編碼序列的nr-DNA的BLAST搜索。圖46.對應(yīng)于重組克隆2的編碼序列的EST的BLAST搜索。圖47.對應(yīng)于重組克隆2的編碼序列的翻譯序列的蛋白序列的BLAST搜索。圖48.對應(yīng)于靶標(biāo)TA.11743.1.A1_AT的詳細(xì)基因序列，如從NetAffx網(wǎng)站獲得圖49.ESTBQ170720序列的核苷酸序列。圖50.ESTBQ170720和革巴標(biāo)TA.11743.1.A1—AT的比對。圖51.靶標(biāo)序列Ta.11743.1顯示與對應(yīng)于水稻基因組基因座NC_008401的水稻轉(zhuǎn)錄的基因座之間的弱相似性。標(biāo)明了可能的ORF及其結(jié)構(gòu)。圖52.使用相關(guān)的EST和靶標(biāo)Ta.117431.1_AT產(chǎn)生的重疊群(config)的圖示(FIG.52A和B)。圖53.具有基因座IDBQ170720,BF482223禾PCF133508的EST與革巴標(biāo)Ta.117431.1_AT的比對。圖54.具有基因座IDBQ170720,BF482223和CF133508的EST與革巴標(biāo)Ta.117431.1—AT的共有序列。標(biāo)出了引物的位置和它們的序列。這些引物用于擴(kuò)增小麥基因組的上游序列。圖55.巢式基因組步移PCR(GenomeWalkerPCR)產(chǎn)物于0.7%的瓊脂糖凝膠上分辨。小麥基因組DNA用于擴(kuò)增靶標(biāo)Ta.11743.1.Al的DNA上游的區(qū)域。圖56.PCR篩選白色菌落以鑒定含有Dra和Stu片段的重組菌落。圖57.代表靶標(biāo)Ta.11743.1.Al的上游區(qū)域的所有的基因組步移Dra片段的比對。圖58.30dpaDra-片段-1與ESTCF133508,BF482223和BQ170720的重疊群，以及與靶標(biāo)Ta.117431序列的比對。圖59.30dpaDra-片段-2與ESTCF133508,BF482223和BQ170720的重疊群，以及與耙標(biāo)Ta.117431的比對。圖60.重疊群EST-BFBQ上發(fā)現(xiàn)的ORF。圖61.重疊群EST-BFBQ(BF482223和BQ170720)上的兩個開放閱讀框(ORF)的蛋白序列及其比對。ORF-1和ORF-2顯示出完全同源。圖62.ESTCF133508,BF482223和BQ170720的重疊群，顯示出沿著重疊群的開放閱讀框。注意，多數(shù)0RF結(jié)束于817bp。圖63.ESTCF133508，BF482223和BQ170720的重疊群上的兩個開放閱讀框(ORF)滯CF，CF133508;BF，BF482223;BQ，BQ170720上的0RF間蛋的蛋白序列及其比對。圖64.顯示EST歪白序列同源性的比對。圖65.30dpaDra片段DraF2Cl上的ORF。圖66.30dpa基因片段DraF2Cl上的0RFl-DraF2Cl的氨基酸序列(SEQIDNO:190)。圖67.對應(yīng)于0RF-1/BFBQ，0RF-1/CFBFBQ和0RF-l/DraF2Cl的0RF-1的氨基酸序列的比對。圖68.重疊群EST-CFBFBQ和30dpa基因片段DraF2Cl序列的比對。以加框區(qū)域顯示重疊群EST-CFBFBQ中的插入/刪除(indels)。圖69.30dpa基因0RFl-DraF2Cl(DraF2Cl片段)，0RF-1/CFBFBQ(重疊群EST-CFBFBQ，除去圖68中所示的插入/刪除)和0RF-1/BFBQ(重疊群EST-BFBQ)的氨基酸序列的比對。圖70.30dpa-DraF2C3片段的序列，其顯示各種開放閱讀框。開放閱讀框0RFl-DraF2C3，標(biāo)記為0RF-1，與位于30dpaDraF2Cl片段上的0RFl-DraF2Cl在序列上相似。圖71.30dpa-DraF2C4片段的序列，其顯示各種開放閱讀框。開放閱讀框0RFl-DraF2C3，標(biāo)記為0RF-1，與位于30dpaDraF2Cl片段上的0RFl-DraF2Cl在序列上相似。對應(yīng)于DraFl片段的30dpa基因片段的序列變體。對應(yīng)于DraF2片段的30dpa基因片段的序列變體。與對應(yīng)于DraF2Cl片段的30_dpa基因片段的nr-DNA的Blast。與對應(yīng)于DraF2Cl片段的30-dpa基因片段的EST的Blast。圖76.與對應(yīng)于DraF2Cl片段的30-dpa基因片段的nr-蛋白序列的氨基酸Blast。圖77.基因構(gòu)建體pAHC25的質(zhì)粒圖。基因構(gòu)建體pUbi.gfp.nos(pA53)的質(zhì)粒圖。位于重疊群ESTCFBFBQ的0RF-1/ESTCFBFBQ序列。位于30dpa片段DraF2Cl序列的0RF-l/DraF2Cl序列(SEQIDNO:285)。位于30dpa片段DraF2C3序列的0RF-lDraF2C3序列。位于重疊群ESTCFBFBQ，30dpaDraF2Cl和30dpaDraF2C3片段上的0RF-1圖72.圖73.圖74.圖75.圖78.圖79.圖80.圖81.圖82.序列的序列比對。圖83.位于重疊群ESTCFBFBQ(除去圖68和69中所示的插入/刪除)，30dpaDraF2Cl和30dpaDraF2C3片段上的0RF-1序列的蛋白序列比對。圖84.來自DraF2Cl，DraF2C3和DraF2C4的ORF的核苷酸和氨基酸序列。序列表簡要說明SEQIDN0:1TA.28688.1.A1—AT(14dpa)的核苷酸序列。SEQIDNO:2從SEQIDNO:1翻譯而來的轉(zhuǎn)錄延伸因子的氨基酸序列。SEQIDNO:3耙標(biāo)ESTTA.11743.1.Al.at(30dpa)的核苷酸序列。SEQIDNO:4包含TA.11743.1.Al.at的EST的核苷酸序列。11SEQIDNO5Affymetrix革巴序列Ta.28688.1.Al_at。SEQIDNO6ESTWHEAT:TA.28688.2的核苷酸序列。SEQIDNO7ESTBJ24108的核苷酸序列。SEQIDNO8ESTWHEAT:TA.28688.3的核苷酸序列。SEQIDNO9ESTBJ27580的核苷酸序列。SEQIDNO10ESTBJ270815的核苷酸序列。SEQIDNO11ESTBJ297411的核苷酸序列。SEQIDNO12ESTBJ235878的核苷酸序列。SEQIDNO13ESTBJ290803的核苷酸序列。SEQIDNO14ESTAL829370的核苷酸序列。SEQIDNO15Ta.28688.1.Al_at的共有序列的核苷酸序列。SEQIDNO16ORF-1的核苷酸序列。SEQIDNO17水稻外顯子l的核苷酸序列。SEQIDNO18水稻外顯子2的核苷酸序列。SEQIDNO19水稻外顯子3的核苷酸序列。SEQIDNO20水稻外顯子4的核苷酸序列。SEQIDNO21小麥編碼l的核苷酸序列。SEQIDNO22小麥編碼2的核苷酸序列。SEQIDNO23小麥編碼3的核苷酸序列。SEQIDNO24小麥編碼4的核苷酸序列。SEQIDNO25起始密碼子的核苷酸序列。SEQIDNO26Ta.28688.1.Al_at的共有序列的ORF的核苷酸序列。SEQIDNO27來自基因座NC_008400的水稻基因組序列的核苷酸序列SEQIDNO28-40各個Ta.28688.1.Al_at引物序列。SEQIDNO4114dpa基因克隆1的核苷酸序列。SEQIDNO4214dpa基因克隆2的核苷酸序列。SEQIDNO4314dpa基因克隆3的核苷酸序列。SEQIDNO4414dpa基因克隆4的核苷酸序列。SEQIDNO4514dpa基因克隆5的核苷酸序列。SEQIDNO4614dpa基因克隆6的核苷酸序列。SEQIDNO4714dpa基因克隆7的核苷酸序列。SEQIDNO4814dpa基因克隆9的核苷酸序列。SEQIDNO4914dpa基因克隆10RF的氨基酸序列。SEQIDNO5014dpa基因克隆20RF的氨基酸序列。SEQIDNO5114dpa基因克隆30RF的氨基酸序列。SEQIDNO5214dpa基因克隆40RF的氨基酸序列。SEQIDNO5314dpa基因克隆50RF的氨基酸序列。SEQIDNO5414dpa基因克隆60RF的氨基酸序列。SEQIDNO5514dpa基因克隆70RF的氨基酸序列。FLbaf30p05，mRNA序列片段從位置100至214的核苷酸序列(0175]SEQIDNO:560176]SEQIDNO:570177]SEQIDNO:580178]SEQIDNO:590179]SEQIDNO:600180]SEQIDNO:6114dpa基因克隆90RF的氨基酸序列。14dpa基因克隆1片段從位置1至115的核苷酸序列。14dpa基因克隆1片段從位置215至285的核苷酸序列。14dpa基因克隆1片段從位置981至1036的核苷酸序列。14dpa基因克隆1片段從位置864至886的核苷酸序列。大麥(Hordeumvulgaresubsp.vulgare)cDNA克SEQIDNO核苷酸序列。SEQIDNO核苷酸序列。SEQIDNO核苷酸序列。SEQIDNOSEQIDNOSEQIDNO苷酸序列。SEQIDNOSEQIDNOSEQIDNO苷酸序列。SEQIDNO苷酸序列。SEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOpk0150.f4片段從位:SEQIDNO136的核苷酸序列。SEQIDNO65的核苷酸序列SEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOSEQIDNOIDNO:71玉米克隆EL01N0552A10.cmRNA序列片段從位置547至586的核whgc3a045'，mRNA序列片段從位置60至174的核苷酸序列。SEQIDNO:82CJ655632Y.Ogihara未發(fā)表的cDNA庫Wh_GCPCDAM小麥cDNA克隆whgc3a045'，mRNA序列片段從位置268至332的核苷酸序列。SEQwhgc3a045'SEQwhgc3a045'SEQrwhgc3a043'SEQrwhgc3a043'SEQrwhgc3a043'SEQrwhgc3a043'SEQSEQSEQSEQwhsl20e215'SEQwhsl20e215'SEQwhsl20e215'SEQwhsl20e215'SEQSEQSEQSEQ核苷酸序列。SEQ核苷酸序列。SEQSEQSEQwhgc3a045'SEQrwhgc3a043'SEQIDNO:83CJ655632Y.Ogihara未發(fā)表的cDNA庫Wh_GCPCDAM小麥cDNA克隆mRNA序列片段從位置175至243的核苷酸序列。IDNO:84CJ655632Y.Ogihara未發(fā)表的cDNA庫Wh_GCPCDAM小麥cDNA克隆mRNA序列片段從位置245至267的核苷酸序列。IDNO:85CJ547844Y.Ogihara未發(fā)表的cDNA庫Wh_GCPCDAM小麥cDNA克隆，mRNA序列片段從位置644至530的核苷酸序列。IDNO:86CJ547844Y.Ogihara未發(fā)表的cDNA庫Wh_GCPCDAM小麥cDNA克隆，mRNA序列片段從位置436至372的核苷酸序列。IDNO:87CJ547844Y.Ogihara未發(fā)表的cDNA庫Wh_GCPCDAM小麥cDNA克隆，mRNA序列片段從位置529至461的核苷酸序列。IDNO:88CJ547844Y.Ogihara未發(fā)表的cDNA庫Wh_GCPCDAM小麥cDNA克隆，mRNA序列片段從位置459至437的核苷酸序列。IDNO:8914dpa基因克隆1片段從位置215至285的核苷酸序列。IDNO:9014dpa基因克隆1片段從位置981至1045的核苷酸序列。IDNO:9114dpa基因克隆1片段從位置864至886的核苷酸序列。IDNO:92BJ290803Y.Ogihara未發(fā)表的cDNA庫，Wh_SL小麥cDNA克隆，mRNA序列片段從位置79至193的核苷酸序列。IDNO:93BJ290803Y.Ogihara未發(fā)表的cDNA庫，，mRNA序列片段從位置194至264的核苷酸序列。IDNO:94BJ290803Y.Ogihara未發(fā)表的cDNA庫，，mRNA序列片段從位置287至351的核苷酸序列。IDNO:95BJ290803Y.Ogihara未發(fā)表的cDNA庫，，mRNA序列片段從位置264至286的核苷酸序列。IDNO:96編碼14dpa基因克隆2片段從位置1至262的核苷酸序列。IDNO:97編碼14dpa基因克隆2片段從位置1至270的核苷酸序列。IDNO:98編碼14dpa基因克隆2片段從位置1至253的核苷酸序列。IDNO:99大麥cDNA克隆FLbaf30p05，mRNA序列片段從位置102至363的IDNO:100大麥cDNA克隆FLbaf83d21，mRNA序列片段從位置226至495的Wh_SL小麥cDNA克隆Wh_SL小麥cDNA克隆Wh_SL小麥cDNA克隆IDNO:101玉米克隆12168mRNA序列片段從位置110至362的核苷酸序列。IDNO:102編碼14dpa基因克隆2片段從位置1至270的核苷酸序列。IDNO:103CJ655632Y.Ogihara未發(fā)表的cDNA庫Wh_GCPCDAM小麥cDNA克隆mRNA序列片段從位置62至331的核苷酸序列。IDNO:104CJ547844Y.Ogihara未發(fā)表的cDNA庫Wh_GCPCDAM小麥cDNA克隆，mRNA序列片段從位置642至373的核苷酸序列。IDNO:105G356.110E18F010919G356小麥cDNA克隆G356110E18,mRNA序列片段從位置76至345的核苷酸序列。SEQIDNO:106BJ311239Y.Ogihara未發(fā)表的cDNA庫，Wh_yd小麥cDNA克隆14whyd26oQ73'，mRNA序列片段從位置503至234的核苷酸序列。SEQIDNO:107編碼14dpa克隆2片段從位置16至89的蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:108編碼14dpa克隆2片段從位置16至86的蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:109編碼14dpa克隆2片段從位置16至87的蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:110編碼14dpa克隆2片段從位置17至81的蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:111編碼14dpa克隆2片段從位置18至87的蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:112編碼14dpa克隆2片段從位置32至86的蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:113編碼14dpa克隆2片段從位置16至89的蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:114編碼14dpa克隆2片段從位置19至78的蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:115編碼14dpa克隆2片段從位置16至81的蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:116編碼14dpa克隆2片段從位置17至88的蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:117編碼14dpa克隆2片段從位置18至88的蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:1180s07g0631100[粳稻(OryzasativaJ即onica)屬]片段從位置16至89的氨基酸序列。SEQIDNO:119未命名蛋白產(chǎn)物[葡萄(Vitisvinifera)]片段從位置16至86的氨基酸序歹LSEQIDNO:120未知的[毛果楊(Populustrichocarpa)]和未知的[毛果楊x美洲黑楊(Populusdeltoides)]片段從位置16至86的氨基酸序列。SEQIDNO:121gi1115444063|ref|NP_001045811.110s02g0134300[水稻(Oryzasativa)(日本晴(j即onicacultivar-group))]片段從16至87的氨基酸序列。SEQIDNO:122gi118422622|ref|NP_568654.1未知蛋白[擬南芥(Arabidopsisthaliana)]片段從位置16至86的氨基酸序列。SEQIDNO:123gi11167915821gb|ABK26033.11未知[美國西加云杉(Piceasitchensis)]片段從位置17至81的氨基酸序列。SEQIDNO:124gi1168025617|ref|XP_001765330.l|預(yù)領(lǐng)lj蛋白[小立碗蘚(Physcomitrellapatenssubsp.Patens)];gi1162683383|gb|EDQ69793.11預(yù)測蛋白[小立碗蘚]片段從位置17至81的氨基酸序列。SEQIDNO:125gi1168022079|ref|XP_001763568.l|預(yù)測蛋白[小立碗蘚]片段從位置17至81的氨基酸序列。SEQIDNO:126gi|55296704|dbj|BAD69422.11假設(shè)蛋白[粳稻屬]片段從位置21至94的氨基酸序列。SEQIDNO:127gi|55297459|dbj|BAD69310.11假設(shè)蛋白[粳稻屬]片段從位置21至94。SEQIDNO:128gi1125554153|gb|EAY99758.11假設(shè)蛋白OsI_020991[水稻(印度稻(indicacultivar-group)]片段從位置21至94。SEQIDNO:129gi1125596104|gb|EAZ35884.11假設(shè)蛋白OsJ_019367[水稻(日本晴)]片段從位置21至94。SEQIDNO:130gi|9757723|dbj|BAB08248.l|未命名蛋白產(chǎn)物[擬南芥]片段從146至204的氨基酸序列。SEQIDNO:131gi|68487892|ref|XP_712163.l|假設(shè)蛋白Ca019.13944[白色念珠菌(Candidaalbicans)SC5314]片段從位置19至78的氨基酸序列。SEQIDNO:132gi|68488889|ref|XP_711689.1假設(shè)蛋白Ca019.6623[白色念珠菌SC5314]片段從位置19至78。SEQIDNO:133gi|46433010|gb|EAK92467.l|假設(shè)蛋白Ca019.6623[白色念珠菌SC5314]片段從位置19至78。SEQIDNO:134gi|46433534|gb|EAK92970.l|假設(shè)蛋白Ca019.13944[白色念珠菌SC5314]片段從位置19至78。SEQIDNO:135與釀酒酵母(S.cerevisiae)YKL160W[白色念珠菌SC5314]片段從位置19至78相似的GENEID:3646195Ca019.13944|。SEQIDNO:136gi|50287065|ref|XP_445962.11未命名蛋白產(chǎn)物[光滑念珠菌(Candidaglabrata)]片段從位置16至87的氨基酸序列。SEQIDNO:137gi|156841713|ref|XP_001644228.1|假設(shè)蛋白Kpol_1051pl9[VanderwaltozymapolysporaDSM70294]片段從位置16至81的氨基酸序列。SEQIDNO:138gi|6322689|ref|NP_012762.11轉(zhuǎn)錄延伸因子的氨基酸序列，其含有保守性的鋅指結(jié)構(gòu)域；參與保持活性轉(zhuǎn)錄區(qū)域的正確的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)；刪除抑制雀麥花葉病毒(BMV)基因表達(dá)；Elflp[釀酒酵母]片段從位置16至91。SEQIDNO:139gi115141650|gb|EDN60012.1延伸因子[釀酒酵母YJM789]片段從位置18至91的氨基酸序列。SEQIDNO:140-154各個Ta.11743.1.Al_at引物的序列。SEQIDNO:155使用EST和Ta.117431/1_AT.at產(chǎn)生的重疊群CF133508的核苷酸序列。SEQIDNO:156ESTCF133508的核苷酸序列。SEQIDNO:157ESTBF482223的核苷酸序列。SEQIDNO:158ESTBQ170720的核苷酸序列。SEQIDNO:15930dpaDraF2Cl的核苷酸序列。SEQIDNO:16030dpaDraF2C4的核苷酸序列。SEQIDNO:16130dpaDraF2C3的核苷酸序列。SEQIDNO:16230dpaDraFlClO的核苷酸序列。SEQIDNO:16330dpaDraFlC2的核苷酸序列。SEQIDNO:16430dpaDraFlCl的核苷酸序列。SEQIDNO:16530dpaDraFlC3的核苷酸序列。SEQIDNO:16630dpaDraFlC4的核苷酸序列。SEQIDNO:16730dpaDraFlC9的核苷酸序列。SEQIDNO:16830dpaDraFlC5的核苷酸序列。SEQIDNO:16930dpaDraFlC7的核苷酸序列。SEQIDNO:170EST-BFBQ的核苷酸序列。SEQIDNO:1710RF-1/EST-BFBQ的核苷酸序列。16SEQIDNO:176ESTCF133508,BF482223和BQ170720的重疊群的ORF-2的核苷酸SEQIDNO:177ESTCF133508,BF482223和BQ170720的重疊群的ORF-3的核苷酸SEQIDNO:178ESTCF133508,BF482223和BQ170720的重疊群的ORF-4的核苷酸SEQIDNO:179ESTCF133508,BF482223和BQ170720的重疊群的ORF-5的核苷酸SEQIDNO:180ESTCF133508,BF482223和BQ170720的重疊群的ORF-6的核苷酸-1/CFBFBQ的氨基酸序列(-5/CFBFBQ的氨基酸序列(SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:序列。SEQIDNO:序列。SEQIDNO:序列。SEQIDNO:序列。SEQIDNO:序列。SEQIDNO:序列。SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:列。SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO列。SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:-2/EST-BFBQ的核苷酸序列。-BFBQORF-1的氨基酸序列。-BFBQORF-2的氨基酸序列。CF133508，BF482223和BQ170720的重;i群的ORF-1的核苷酸t(yī)群共同的ORF的核苷酸序列.:188DraF2Cl的0RF7的核苷酸序列。:189DraF2Cl的0RF8的核苷酸序列。:19030dpa基因片段DraF2Cl上的0RFl-DraF2Cl的氨基酸序列,:19130dpa基因片段DraF2Cl從位置1至1529的核苷酸序列。:1920RF-1EST-CFBFBQmod的氨基酸序列。:19330dpa-DraF2C3片段的核苷酸序列。:1940RF-l/30dpa-DraF2C3片段的核苷酸序列。:1950RF-2/30dpa-DraF2C3片段的核苷酸序列。:1960RF-3/30dpa-DraF2C3片段的核苷酸序列。:1970RF-4/30dpa-DraF2C3片段的核苷酸序列。:1980RF-5/30dpa-DraF2C3片段的核苷酸序列。:1990RF-6/30dpa-DraF2C3片段的核苷酸序列。:2000RF-7/30dpa-DraF2C3片段的核苷酸序列。:2010RF-8/30dpa-DraF2C3片段的核苷酸序列。:2020RF-9/30dpa-DraF2C3片段的核苷酸序列。17SEQIDNO:203與CF133508BF482223BQ170720共同的ORFDraF2C3的核苷酸序SEQIDNO列。SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:體型BDNA修復(fù)蛋白SEQIDNO:209gi1157863729|gb|EU159424.11圓錐小麥單體型BDNA修復(fù)蛋白Rad50基因，完全cds片段從位置12304至12277的核苷酸序列。SEQIDNO:210gi1112361872|gb|DQ871219.1野生二粒小麥克隆BAC409D13和BAC916017，完全序列片段從106894至106990的核苷酸序列。SEQIDNO:211gi1112361872|gb|DQ871219.1野生二粒小麥克隆BAC409D13和BAC916017，完全序列片段從106921至106894的核苷酸序列。SEQIDNO:212gi1112361872|gb|DQ871219.1野生二粒小麥克隆BAC409D13和BAC916017，完全序列片段從106990至106963的核苷酸序列。SEQIDNO:213gi|23476274|gb|AY133251.1|AY133250S2大麥淀粉合成酶II基因，外顯子9和完全cds片段從位置905至1001的核苷酸序列。SEQIDNO:214gi|23476274|gb|AY133251.1|AY133250S2大麥淀粉合成酶II基因，外顯子9和完全cds片段從位置1001至974的核苷酸序列。;群片段從位置769至1327的核苷酸序列。;群片段從位置759至1260的核苷酸序列。t群片段從位置315至581的核苷酸序列。t群片段從位置1至215的核苷酸序列。t群片段從位置1311至1529的核苷酸序列。t群片段從位置611至1179的核苷酸序列。;群片段位置864至1334的核苷酸序列。;群片段從位置446至881的核苷酸序列。;群片段從位置47至214的核苷酸序列。;群片段從位置336至384的核苷酸序列。4IgbIBF482223.11WHE1798_C04_F08ZS小麥開花前穗cDNA庫小麥cDNA克隆WHE1798_C04_F08，mRNA序列片段從位置1至563的核苷酸序列。SEQIDNO:226gi|25204992|gb|CA626696.I|wlln.pk0146.flOwlln小麥cDNA克隆wlln.pk0146.f105'末端，mRNA序列片段從位置1至498的核苷酸序列。SEQIDNO:227gi|70960540|gb|DR733736.1|FGAS079494/JLibrary2Gate3小麥cDNA，mRNA序列片段從位置559至824的核苷酸序列。SEQIDNO:228gi|70960540|gb|DR733736.1|FGAS079494/JLibrary2Gate3小麥cDNA，mRNA序列片段從位置354至560的核苷酸序列。SEQIDNO:229gi|20332543|gb|BQ170720.11WHE1798_C04_F08ZT小麥開花前穗SEQIDNO::215DraF2Cl重SEQIDNO::216DraF2Cl重SEQIDNO::217DraF2Cl重SEQIDNO::218DraF2Cl重SEQIDNO::219DraF2Cl重SEQIDNO::220DraF2Cl重SEQIDNO::221DraF2Cl重SEQIDNO::222DraF2Cl重SEQIDNO::223DraF2Cl重SEQIDNO::224DraF2Cl重SEQIDNO:225gi|115655麥FGAS:麥FGAS:cDNA庫小麥cDNA克隆WHE1798_C04_F08，mRNA序列片段從位置450至235的核苷酸序列。SEQIDNO:230gi|33217688|gb|CF133508.11WHE4358_G06_N12ZT小麥減數(shù)分裂小花cDNA庫小麥cDNA克隆WHE4358_G06_N12，mRNA序列片段從位置93至667的核苷酸序列。SEQIDNO:231gi|93043667|dbj|CJ637246.11CJ637246Y.Ogihara未發(fā)表的cDNA庫Wh_DPA20小麥cDNA克隆whdp8nl15'，mRNA序列片段從位置21至499的核苷酸序列。SEQIDNO:232gi11433201611dbj|CJ809854.11J809854Y.Ogihara未發(fā)表的cDNA庫，whsct小麥cDNA克隆whsct9e045'，mRNA序列片段從位置267至702的核苷酸序列。SEQIDNO:233gi11433201611dbj|CJ809854.11J809854Y.Ogihara未發(fā)表的cDNA庫，whsct小麥cDNA克隆whsct9e045'，mRNA序列片段從位置1至160的核苷酸序列。SEQIDNO:234gi11433201611dbj|CJ809854.11J809854Y.Ogihara未發(fā)表的cDNA庫，whsct小麥cDNA克隆whsct9e045'，mRNA序列片段從位置181至229的核苷酸序列。SEQIDNO:2350RF-1703至1332bp段從位置1至169的氨基酸序列。SEQIDNO:2360RF-1703至1332bp段從位置1至204的氨基酸序列。SEQIDNO:2370RF-1703至1332bp段從位置1至201的氨基酸序列。SEQIDNO:2380RF-1703至1332bp段從位置15至204的氨基酸序列。SEQIDNO:2390RF-1703至1332bp段從位置2至200的氨基酸序列。SEQIDNO:2400RF-1703至1332bp段從位置3至173的氨基酸序列。SEQIDNO:2410RF-1703至1332bp段從位置2至127的氨基酸序列。SEQIDNO:2420RF-1703至1332bp段從位置1至172的氨基酸序列。SEQIDNO:2430RF-1703至1332bp段從位置4至200的氨基酸序列。SEQIDNO:2440RF-1703至1332bp段從位置4至124的氨基酸序列。SEQIDNO:2450RF-1703至1332bp段從位置3至67的氨基酸序列。SEQIDNO:2460RF-1703至1332bp段從位置1至111的氨基酸序列。SEQIDNO:2470RF-1703至1332bp段從位置1至158的氨基酸序列。AgneloDraF2Cl歪AgneloDraF2Cl歪AgneloDraF2Cl歪AgneloDraF2Cl歪AgneloDraF2Cl歪AgneloDraF2Cl歪AgneloDraF2Cl歪AgneloDraF2Cl歪AgneloDraF2Cl歪AgneloDraF2Cl歪AgneloDraF2Cl歪AgneloDraF2Cl歪AgneloDraF2Cl歪區(qū)域1至209)片區(qū)域1至209)片區(qū)域1至209)片區(qū)域1至209)片區(qū)域1至209)片區(qū)域1至209)片區(qū)域1至209)片區(qū)域1至209)片區(qū)域1至209)片區(qū)域1至209)片區(qū)域1至209)片區(qū)域1至209)片區(qū)域1至209)片19t群(區(qū)域1至209)片t群(區(qū)域1至209)片t群(區(qū)域1至209)片t群(區(qū)域1至209)片SEQIDNO:2480RF-1703至1332bpAgneloDraF2Cl重；段從位置1至67的氨基酸序列。SEQIDNO:2490RF-1703至1332bpAgneloDraF2Cl重；段從位置112至163的氨基酸序列。SEQIDNO:2500RF-1703至1332bpAgneloDraF2Cl重；段從位置126至202的氨基酸序列。SEQIDNO:2510RF-1703至1332bpAgneloDraF2Cl重；段從位置13至91的氨基酸序列。SEQIDNO:252gi1115476200|ref|NP_001061696.11Os08g0382800[水稻(日本晴)]從位置222至388的氨基酸序列。SEQIDNO:253gi1125575729|gb|EAZ17013.11假設(shè)蛋白OsJ_031222[水稻(日本晴)]從位置216至418的氨基酸序列。SEQIDNO:254gi1115483508|ref|NP_001065424.110sl0g0566300[水稻(日本晴)]從位置243至445的氨基酸序列。SEQIDNO:255gi1115483534|ref|NP_001065437.1|0sl0g0567900[水稻(日本晴)]從位置151至358的氨基酸序列。SEQIDNO:256gi1110289600|gb|ABG66270.l|含有F_盒(F-box)蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域的蛋白，表達(dá)的[水稻(日本晴)]從位置85至292的氨基酸序列。SEQIDNO:257gi119224986|gb|AAL86462.11AC077693_1推斷轉(zhuǎn)座酶蛋白，5'_部分[水稻(日本晴)]從位置672至879的氨基酸序列。SEQIDNO:258gi118854992|gb|AAL79684.11AC087599—3推斷轉(zhuǎn)座酶[水稻]從190至422的氨基酸序列。SEQIDNO:259gi1125533008gb|EAY79573.11假設(shè)蛋白OsI_033532[水稻(印度稻)]從230至437的氨基酸序列。SEQIDNO:260gi1125532994度稻)]從215至401的氨基酸序列。SEQIDNO:261gi|125586371本晴)]從190至422的氨基酸序列。SEQIDNO:262gi|108708334(日本晴)]從267至499的氨基酸序列SEQIDNO:263gi|125571320本晴)]從171至337的氨基酸序列。SEQIDNO:264gi|125526988度稻)]從237至403的氨基酸序列。SEQIDNO:265gi1115438777晴)]從217至383的氨基酸序列.SEQIDNO:266gi1125555027度稻)]從53至182的氨基酸序列。SEQIDNO:267gi|125596957gbEAY79559.11假設(shè)蛋白OsI_033518[水稻(印EAZ27035.11假設(shè)蛋白OsJ_010518[水稻(日ABF96129.1|含有F-盒結(jié)構(gòu)域的蛋白[水稻EAZ12835.11假設(shè)蛋白OsJ_002660[水稻(日EAY75102.11假設(shè)蛋白OsI_002949[水稻(印ref|NP_001043668.11Os01g0637100[水稻(日本gb|EAZ00633.11假設(shè)蛋白OsI_021865[水稻(印gb|EAZ36737.11假設(shè)蛋白OsJ_020220[水稻(日本晴)]從215至344的氨基酸序列。SEQIDNO:268gi125582083本晴)]從191至365的氨基酸序列。SEQIDNO:269gi125539427度稻)]從191至365的氨基酸序列。SEQIDNO:270gi125605903本晴)]從294至389的氨基酸序列。SEQIDNO:271gi125563939度稻)]從243至483的氨基酸序列。SEQIDNO:272gi125563928度稻)]從189至301的氨基酸序列。SEQIDNO:273gi115479445晴)]從189至301的氨基酸序列。SEQIDNO:274gi125579769本晴)]從202至272的氨基酸序列。SEQIDNO:275gi125543997gb|EAZ23014.11假設(shè)蛋白OsJ_006497[水稻(日gb|EAY85822.11假設(shè)蛋白OsI_007055[水稻(印gb|EAZ44939.11假設(shè)蛋白OsJ_028422[水稻(日gb|EAZ09319.11假設(shè)蛋白OsI_030551[水稻(印gb|EAZ09308.11假設(shè)蛋白OsI_030540[水稻(印ref|NP_001063316.110s09g0448100[水稻(日本gb|EAZ20915.1|假設(shè)蛋白OsJJ)35124[水稻(日gb|EAY90136.11假設(shè)蛋白OsI_011369[水稻(印度稻)]從272至367的氨基酸序列。SEQIDNO:276gi|63147802|gb|AAY34252.llF-盒樣蛋白[大麥]從204至322的氨基酸序列。SEQIDNO:277gi|77556844|gb|ABA99640.1含有F-盒結(jié)構(gòu)域的蛋白[水稻(日本晴)]從202至273的氨基酸序列。SEQIDNO:278gi11478540911emb|CAN83390.11假設(shè)蛋白[葡萄]從129至290的氨基酸序列。SEQIDNO:279gi11255480411gb|EAY93863.11假設(shè)蛋白OsI_015096[水稻(印度稻)]從178至244的氨基酸序列。SEQIDNO:280gi11066176|emb|CAA61663.1病毒體蛋白[犬皰疹病毒1]從61至113的氨基酸序列。SEQIDNO:281gi1190622529|gb|EDV38053.11GF11106[嗜鳳梨果蠅(Drosophilaananassae)]從252至533的氨基酸序列。SEQIDNO:282gi1125590154|gb|EAZ30504.11假設(shè)蛋白OsJ_013987[水稻(日本晴)]從212至292的氨基酸序列。SEQIDNO:283gi|38347475|emb|CAE05295.2|0SJNBa0084N21.13[水稻(日本晴)]從212至292的氨基酸序列。SEQIDNO:2840RF-lDraF2C3的氨基酸序列。SEQIDNO:285DraF2Cl片段的ORF-1的核苷酸序列。SEQIDNO:286DraF2Cl片段的ORF-2的核苷酸序列。SEQIDNO:287DraF2Cl片段的ORF-3的核苷酸序列。SEQIDNO:288DraF2Cl片段的ORF-4的核苷酸序列。SEQIDNO:289DraF2Cl片段的ORF-5的核苷酸序列。SEQIDNO:290DraF2C2，DraF2C3和DraF2C4上的ORF--3的氨基酸序列。SEQIDNO:291DraF2C2，DraF2C3和DraF2C4上的ORF--4的氨基酸序列。SEQIDNO:292DraF2C2，DraF2C3和DraF2C4上的ORF--5的氨基酸序列。SEQIDNO:293DraF2C3上的ORF--6的氨基酸序列'SEQIDNO:294DraF2C3上的ORF--7的氨基酸序列'SEQIDNO:295DraF2C3上的ORF--s的氨基酸序列'SEQIDNO:296DraF2C2，DraF2C3和DraF2C4上的ORF--3的核苷酸序列。SEQIDNO:297DraF2C2，DraF2C3和DraF2C4上的ORF--4的核苷酸序列。SEQIDNO:298DraF2C2，DraF2C3和DraF2C4上的ORF--5的核苷酸序列。SEQIDNO:299DraF2C3上的ORF--e的核苷酸序列'SEQIDNO:300DraF2C3上的ORF--7的核苷酸序列'SEQIDNO:301DraF2C3上的ORF--s的核苷酸序列'SEQIDNO:302重疊群CFBFBQ的核苷酸序列。具體實(shí)施例方式Pina-Dl和Pinb-Dl與改善的制粉能力不相關(guān)或不相聯(lián)。本發(fā)明基于小麥種子發(fā)育過程中低面粉產(chǎn)率和高面粉產(chǎn)率小麥品種之間的基因表達(dá)差異模式的發(fā)現(xiàn)。從這些結(jié)果確定在小麥種子發(fā)育的早期，與高產(chǎn)率小麥品種相比，低產(chǎn)率小麥品種表達(dá)一套分離的基因。本發(fā)明人得出結(jié)論在小麥種子發(fā)育的不同時期，改善的制粉能力與某些核酸序列的表達(dá)分布和模式相關(guān)或相聯(lián)。特別地，與高面粉產(chǎn)率小麥品種相比，低面粉產(chǎn)率小麥品種中的14dpa時的TA.28688.1.A1—AT表達(dá)和30dpa時的TA.11743.1.Al.AT表達(dá)具有顯著不同，這表明控制面粉產(chǎn)率從而控制改善的制粉能力的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。貫穿本說明書，術(shù)語"TA.11743.1.Al.at"，"30dpa基因"和"30dpa序列"將不加區(qū)別地使用，一般是指，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸，其在低制粉品種中在30dpa時顯示增加的表達(dá)。類似地，術(shù)語"TA.28688.1.A1_AT"，"14dpa基因"和"14dpa序列"將不加區(qū)別地使用，一般是指，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸，其在低制粉品種中在14dpa時顯示增加的表達(dá)。通過使用例如基因組步移技術(shù)(genomewalking)和表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫開采的方法，對于每個14dpa序列和30dpa序列鑒定出了一些候選的開放閱讀框和/或蛋白編碼序列?；谛蛄斜葘ρ芯?，本發(fā)明人推測14dpa序列(或者指TA.28688.1.A1_AT)的核苷酸序列編碼轉(zhuǎn)錄延伸因子。廣泛地，轉(zhuǎn)錄延伸因子與RNA聚合酶II相互作用以增加(正轉(zhuǎn)錄延伸因子)或降低(負(fù)轉(zhuǎn)錄延伸因子)轉(zhuǎn)錄延伸速率。雖然不想被任何特別理論束縛，但是TA.28688.1.A1_AT的翻譯產(chǎn)物可能以全局水平或者以基因特異性水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)?？梢韵胂?，具有差的制粉性能的小麥品種中TA.28688.1.A1_AT的高水平表達(dá)上調(diào)或下調(diào)一種或多種其它基因的表達(dá)，這繼而又對面粉產(chǎn)率具有下游的負(fù)效應(yīng)。雖然不想被任何特別理論束縛，但是30dpa序列可能也廣泛參與基因表達(dá)的控制，特別是在轉(zhuǎn)錄延伸的階段。如本發(fā)明人所鑒定的30dpa序列具有幾個開放閱讀框(ORF)和/或蛋白編碼區(qū)域，如圖84所示。優(yōu)選地，30dpa序列0RF是選自SEQIDNO:159至161的核苷酸序列上的ORF的核苷酸序列。在涉及30dpa序列的優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸編碼包含選自以下的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:190，SEQIDNO:290至295和SEQIDNO:284。優(yōu)選地，多肽具有如SEQIDN0:190所示的氨基酸序列。雖然不想被任何特別理論束縛，但是由SEQIDNO:190編碼的多肽是含有細(xì)胞周期蛋白樣的F-盒結(jié)構(gòu)域的蛋白，其在控制基因表達(dá)和特別是轉(zhuǎn)錄延伸、聚泛素化、著絲粒結(jié)合和翻譯抑制中具有潛在作用。在其它的涉及30dpa序列的優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸的ORF和/或蛋白編碼區(qū)域包含選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:188，SEQIDNO:189，SEQIDNO:193至202，SEQIDNO:285至289和SEQIDNO:296至301。因此，本發(fā)明的廣泛目標(biāo)在于應(yīng)用"面粉產(chǎn)率和制粉性能特別是良好的制粉性能受遺傳控制"這一觀察，從而提供預(yù)測，選擇和工程化谷物或產(chǎn)生谷物的植物的改善的商業(yè)制粉性能的方法。"制粉能力"意思是谷物或產(chǎn)生谷物的植物被研磨成面粉的能力。谷物或產(chǎn)生谷物的植物的制粉能力與谷粒硬度、胚乳與糠的比例、以及糠的分離的簡易性相關(guān)，但不限于此。通常，雖然并不是唯一的，但是制粉過程將更加簡單，如果起始材料表現(xiàn)出較容易將糠與胚乳分離開，因?yàn)樗a(chǎn)生的面粉流動性更強(qiáng)，更容易篩分。貫穿本說明書，制粉能力與"制粉性能"不加區(qū)分地使用。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語"改善的"可能涉及從谷物或產(chǎn)生谷物的植物的群體中選擇，所述谷物或產(chǎn)生谷物的植物由于與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸的相對數(shù)量改變的緣故而在遺傳上傾向于具有優(yōu)良的或增強(qiáng)的制粉性能?；蛘?，"改善的"可能涉及使用常規(guī)植物培育或重組DNA方法學(xué)進(jìn)行遺傳修飾而獲得的優(yōu)良的或增強(qiáng)的制粉性能。面粉可以從眾多農(nóng)作物中，主要是從谷物或其它淀粉類食物來源中研磨產(chǎn)生。非限定性的例子為小麥、玉米(corn)、玉米(maize)和黑麥以及其它產(chǎn)草和種子的農(nóng)作物例如豆類和堅果。優(yōu)選地，農(nóng)作物為谷物。甚至更優(yōu)選地，谷物是小麥。為了本發(fā)明的目的，"分離的"是指從其自然狀態(tài)中移出的材料或否則是經(jīng)過人類操作的材料。分離的材料可以是實(shí)質(zhì)上或本質(zhì)上不含有在其自然狀態(tài)時通常伴隨它的成分，或可以被操作從而與在其自然狀態(tài)時通常伴隨它的成分一起處于人工狀態(tài)。分離的材料可以是天然形式或重組形式。如本文所用的術(shù)語"核酸"是指單鏈或雙鏈的mRNA、RNA、cRNA和DNA，包括cDNA、基因組DNA和DNA-RNA雜交體。本發(fā)明的一個廣泛應(yīng)用是分析和/或預(yù)測谷物或產(chǎn)生谷物的植物是否可能具有改善的制粉性能的基于遺傳學(xué)的方法。更特別地，本發(fā)明的方法易于用于植物培育項(xiàng)目例如在秧苗時期。這樣的方法證明具有加快和改善植物培育效率并最終改善制粉性能的優(yōu)點(diǎn)。在特別的方面，本發(fā)明在于選擇具有改善的制粉能力的特性的谷物或產(chǎn)生谷物的植物的方法，所述方法通過確定與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸的相對數(shù)量而確定谷物或產(chǎn)生谷物的植物是否具有改善的制粉性能的傾向。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，如果谷物或產(chǎn)生谷物的植物與參考樣品相比具有減少的與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸的相對數(shù)量，將為了改善的制粉能力選擇谷物或產(chǎn)生谷物的植物。在另一個特別方面，本發(fā)明在于通過檢測谷物或產(chǎn)生谷物的植物是否具有本發(fā)明的與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸而確定谷物或產(chǎn)生谷物的植物的改善的制粉性能的遺傳傾向的方法。"相對數(shù)量"是指與標(biāo)準(zhǔn)樣品中的相同的分離的核酸的數(shù)量相比，測試樣品中的與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸的相對水平，比例或數(shù)量。在一些情況下，相對于標(biāo)準(zhǔn)樣品例如高面粉產(chǎn)率品種而預(yù)測谷物或產(chǎn)生谷物的植物的改善的制粉能力可以是恰當(dāng)?shù)?。?biāo)準(zhǔn)樣品是低面粉產(chǎn)率品種的話也是恰當(dāng)?shù)?。?yīng)該理解"相對數(shù)量"不是指絕對數(shù)為了本發(fā)明的目的，術(shù)語"傾向于"或"傾向"涉及由于根本的遺傳原因的結(jié)果，谷物或產(chǎn)生谷物的植物將顯示出改善的面粉產(chǎn)率潛力的可能性。優(yōu)選地，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸編碼包含選自以下的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:49，SEQIDNO:190，SEQIDNO:284和SEQIDNO:290至295，或其變體。在一個優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸編碼包含選自以下的氨基酸序列的多肽SEQIDN0:49或SEQIDN0:190，或其片段。在另一個優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸包含選自以下的核苷酸序列:SEQIDNO:15，SEQIDNO:26，SEQIDNO:159至169，SEQIDNO:188至189，SEQIDNO:194至202，SEQIDNO:285至289或SEQIDNO:296至301，或其變體。在其它的優(yōu)選具體實(shí)施方式中，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸包含選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:26或SEQIDNO:285，或其片段。本文描述的遺傳分析方法可以應(yīng)用如本領(lǐng)域熟知的核酸檢測技術(shù)。原則上，可以應(yīng)用任何核酸序列檢測技術(shù)，例如核酸測序、northern和southern雜交、核酸序列擴(kuò)增和核酸陣列。為了檢測谷物或產(chǎn)生谷物的植物是否傾向于具有改善的制粉能力的目的，本發(fā)明考慮這樣的方法的特別具體實(shí)施方式，其可單獨(dú)或聯(lián)合使用。在一個一般具體實(shí)施方式中，核酸序列擴(kuò)增技術(shù)可用于快速檢測指征改善的制粉能力的所述遺傳基因座，特別是在多種樣品待測試的地方。如本文所用的"核素序列擴(kuò)增技術(shù)"包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，如在例如CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGYEds.Ausubel等人(JohnWiley&SonsNYUSA1995-2001)第15章中所描述；鏈置換擴(kuò)增(SDA);滾環(huán)復(fù)制(RCR)，如在例如國際申請WO92/01813和國際申請WO97/19193中所描述；基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，如在例如Sooknanan等人1994，Biotechniques171077所描述；連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，如在例如國際申請W089/09385和上述CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY第15章中所描述；24Q-P復(fù)制酶擴(kuò)增，如在例如Tyagi等人1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA935395中所描述和依賴解旋酶的擴(kuò)增，如在例如國際公開WO2004/02025中所描述。在這一點(diǎn)，應(yīng)該認(rèn)識到DNA的RNA拷貝對應(yīng)于DNA，盡管存在尿嘧啶堿基而不是胸腺嘧啶堿基。在一些具體實(shí)施方式中，核酸片段可以具有約9、12、15、20、30或直至60個連續(xù)核苷酸(例如對于PCR引物來說)或具有100、200、300或更多的連續(xù)核苷酸(例如對于探針來說)。"探針"可以是單鏈或雙鏈的寡核苷酸或多核苷酸，例如在Northern或Southern印跡中為了檢測互補(bǔ)序列進(jìn)行適當(dāng)?shù)臉?biāo)記。"引物"通常是單鏈寡核苷酸，優(yōu)選具有15-50個連續(xù)核苷酸，其能夠退火至互補(bǔ)核酸"模板"并以模板依賴性方式通過DNA聚合酶例如Taq聚合酶、依賴RNA的DNA聚合酶或SequenaseTM的作用而延伸。"多核苷酸"是具有八十(80)個或更多的連續(xù)核苷酸的核酸，而"寡核苷酸"具有八十(80)個以下的連續(xù)核苷酸。術(shù)語"退火"、"雜交(hybridize)"和"雜交(hybridization)"在本文中用于指，本領(lǐng)域通常所理解的意義中，互補(bǔ)或部分互補(bǔ)的核酸之間通過堿基配對而形成二分子復(fù)合體。應(yīng)該理解，這些術(shù)語包含修飾的嘌呤和嘧啶(例如肌苷、甲基肌苷和甲基腺苷)和修飾的嘧啶(例如硫代尿嘧啶和甲基胞嘧啶)之間以及A、G、C、T和U嘌呤和嘧啶之間的堿基配對。影響雜交的因素例如溫度、離子強(qiáng)度、持續(xù)時間和變性劑是本領(lǐng)域熟知的，雖然在CURRENTPROTOCOLSINM0LECULARBIOLOGY(Eds.Ausubel等人JohnWiley&SonsNY，2000)的第二章特別是2.9和2.10部分提供了雜交的有用的即可使用的討論。本發(fā)明還考慮使用應(yīng)用核酸陣列的高通量診斷方法以用于選擇遺傳上傾向于改善的制粉能力的谷物或產(chǎn)生谷物的植物。在一個具體實(shí)施方式中，可以使用包含一種或多種與制粉能力相關(guān)的核酸的庫或陣列來篩選谷物或產(chǎn)生谷物的植物樣品。在另一個具體實(shí)施方式中，使用庫或陣列進(jìn)行篩選，所述庫或陣列包含如上所述的與改善的制粉能力相關(guān)的核酸和其它的與改善的制粉能力相關(guān)的特性例如硬度相關(guān)的核酸的組合，但不限于此。在該具體實(shí)施方式的特別形式中，本發(fā)明提供核酸陣列形式的分子庫，所述陣列包含基質(zhì)，根據(jù)本發(fā)明的特定方面鑒定的與改善的制粉能力相關(guān)的核酸或其片段固定于、結(jié)合于或偶聯(lián)于所述基質(zhì)。每個固定的、結(jié)合的或偶聯(lián)的核酸在陣列上具有"地址"以表示所述核酸的位置和身份。核酸陣列技術(shù)已經(jīng)在本領(lǐng)域熟知，可用于陣列技術(shù)的方法的例子在CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGYEds.Ausubel等人(JohnWiley&SonsNYUSA1995-2001)第22章中提供?？梢酝ㄟ^各種方法產(chǎn)生陣列，例如通過照相平版印刷方法(參見例如，美國專利號5，143,854;5,510,270;和5，527，681)，機(jī)械方法(例如，如在美國專利號5,384,261中描述的定向流方法(directed-flowmethod)，基于針的方法(例如，如在美國專利號5，288，514中描述)和基于珠子的技術(shù)(例如，如在PCTUS/93/04145中描述)。25本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識到本發(fā)明還提供用于檢測生物樣品中指征傾向于改善的制粉能力的本發(fā)明的分離的核酸的試劑盒。試劑盒可以基于使用PCR擴(kuò)增核酸，可以包括用于與已知核酸雜交的引物、試劑例如緩沖液和熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。還可以認(rèn)識到可以使用這種試劑盒檢測DNA也可以檢測mRNA。所用的酶取決于是檢測DNA還是檢測mRNA。檢測mRNA的話可以使用一步偶聯(lián)RT-PCR，其包括依賴RNA的DNA聚合酶和依賴DNA的DNA聚合酶的混合物，以及在相同的反應(yīng)混合物中允許這兩種酶的最大活性的緩沖液?；蛘?，核酸的檢測試劑盒可以基于本領(lǐng)域常用的雜交技術(shù)例如Northern或Southern印跡，使用為檢測感興趣的遺傳區(qū)域而設(shè)計的探針?？梢允褂帽姸啾绢I(lǐng)域常用的標(biāo)記來檢測核酸，例如熒光染料、放射性標(biāo)記例如32p或35s，酶和金屬包括金。關(guān)于上面所述的內(nèi)容，用于遺傳分析的核酸樣品可以從任何細(xì)胞或組織來源分離，包括胚乳組織。例如這樣的組織可以包括但不限于葉子、根、莖和種子。在另一個一般的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可包括測定相對于參考樣品來說與改善的制粉能力相關(guān)的本發(fā)明的核酸的表達(dá)水平。定量核酸的方法是本領(lǐng)域熟知的。測定相對于參考核酸的表達(dá)水平來說與改善的制粉能力相關(guān)的核酸(例如TA.28688.1.A1_AT和/或TA.11743.1.Al.at)水平的相對數(shù)量的方法可使用如上所述的核酸陣列而方便地進(jìn)行。替代的方法包括雜交技術(shù)例如northern雜交，如本領(lǐng)域所熟知的。在此具體實(shí)施方式的另一個特別形式中，使用對應(yīng)于一種或多種本發(fā)明的與制粉能力相關(guān)的核酸的引物的定量或半定量PCR(例如可用于定量該核酸或每個核酸的相對表達(dá)水平從而確定谷物或產(chǎn)生谷物的植物是否傾向于改善的制粉能力)。示例性引物包括選自SEQIDNO:28-40的核苷酸序列，其與包括Ta.28688.1.Al_at的具體實(shí)施方式相關(guān)。在那些包括TA.11743.l.Al.at的一般的具體實(shí)施方式中，示例性的引物包括選自SEQIDNO:140-154的核苷酸序列。PCR擴(kuò)增不是線性的，因此末端點(diǎn)分析并不能總是保證精確確定核酸表達(dá)水平。實(shí)時PCR分析提供了測定基因表達(dá)水平的高通量方法。其使用特異性引物，插入性熒光染料例如SYBRGreenI或溴化乙錠(EtBr)和熒光檢測以測定每個循環(huán)后的產(chǎn)物數(shù)量。雜交探針應(yīng)用淬滅染料或熒光直接產(chǎn)生信號。該方法可用于驗(yàn)證并定量從具有低面粉產(chǎn)率的谷物或產(chǎn)生谷物的植物獲得的細(xì)胞或組織中的核酸表達(dá)相對于從產(chǎn)生高面粉產(chǎn)率的谷物或產(chǎn)生谷物的植物中獲得的細(xì)胞或組織中的核酸表達(dá)的差異。本發(fā)明還考慮到與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸的變體，其在序列間具有基于同源性的關(guān)系。"同源性"是指一個核苷酸序列與參考核苷酸序列的相同的核苷酸的百分比數(shù)目?？赏ㄟ^使用序列對比程序例如BESTFIT(Deveraux等人1984，NucleicAcidsResearch12，387-395)確定同源性，引入本文作為參考。按照這種方式，與本文所列的那些序列具有相似或?qū)嵸|(zhì)上不同長度的序列可以通過向比對中插入空隙而被比較，所述空隙可通過例如使用BESTFIT通過比較算法確定。用于描述兩個或兩個以上核苷酸序列的序列關(guān)系的術(shù)語包括"參考序列"、"對比窗口"、"序列同一性"、"序列同一性百分率"、和"實(shí)質(zhì)上同一"。"參考序列"是長度為至少6但通常為15-18，經(jīng)常為至少25的單體單元，包括核苷酸和氨基酸殘基的長度。因?yàn)閮蓚€多核苷酸可能每個均包括(1)在兩個多核苷酸之間相似的序列(即僅僅完整多核苷酸序列的一部分)，和(2)兩個多核苷酸之間不同的序列，兩個(或兩個以上)多核苷酸之間的序列比較通常是通過在"對比窗口"比較兩個多核苷酸的序列而進(jìn)行，從而鑒定并比較序列相似性的局部區(qū)域。"對比窗口"是指概念性部分，其通常為與參考序列相比的6至12個連續(xù)殘基。對比窗口可包含相對于參考序列(其沒有插入或刪除)約20%或更少的插入或刪除(即空隙)以進(jìn)行兩個序列的最佳比對。比對對比窗口的序列最佳比對可通過計算機(jī)化執(zhí)行算法(575ScienceDriveMadison，WI，USA的GeneticsComputerGroup的WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0中的GAP,BESTFIT，F(xiàn)ASTA和TFASTA，引入本文作為參考)或通過觀察和所選的各種方法中的任一個所產(chǎn)生的最佳比對(即在比對窗口上形成最高百分率的同源性)來進(jìn)行。還可以參考程序的BLAST家族，如由例如Altschul等人1997，Nucl.AcidsRes.25:3389所公開的，引入本文作為參考。序列分析的詳細(xì)討論見于Ausubel等人"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWiley&SonsInc，1994-1998，第15章，19.3單元。本文所用的術(shù)語"序列同一性"是指，在比對窗口上，序列在逐個核苷酸_核苷酸的基礎(chǔ)上相同的程度。因此，"序列同一性百分率"通過在比對窗口比較兩個最佳比對序列，確定兩個序列中存在相同核酸堿基(例如A、T、C、G、1)的位置的數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，以匹配位置的數(shù)目除以比對窗口中位置的總數(shù)目(即窗口大小)，和將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性百分率而計算。為了本發(fā)明的目的，"序列同一性"將被理解為通過DNASIS計算機(jī)程序(window系統(tǒng)下版本2.5;可從HitachiSoftwareengineeringCo.，Ltd.，SouthSanFrancisco,California,USA獲得)計算的"匹配百分率"，其中使用如隨附軟件的參考手冊所用的標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值，引入本文作為參考。在一個具體實(shí)施方式中，核酸變體與本發(fā)明的分離的核酸具有至少50%、55%或60%，優(yōu)選至少65%、66%、67%、68%、69%或70%、71%、72%、73%、74%，更優(yōu)選至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%，甚至更優(yōu)選至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，核酸變體是本發(fā)明的14dpa序列的核苷酸序列的變體。更優(yōu)選地，14dpa序列的變體的核苷酸序列選自SEQIDN0:41，SEQIDN0:42，SEQIDNO:43，SEQIDNO:44，SEQIDNO:45，SEQIDNO:46，SEQIDNO:47或SEQIDN0:48。在另一個優(yōu)選具體實(shí)施方式中，核酸變體是本發(fā)明的30dpa序列的核苷酸序列的變體。更優(yōu)選地，30dpa序列變體的核苷酸序列如SEQIDN0:194所示。在另一個優(yōu)選具體實(shí)施方式中，核酸變體與本發(fā)明的核酸包括片段在至少低嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，優(yōu)選在至少中嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，更優(yōu)選在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。本文所用的"雜交(Hybridise)和雜交(Hybridisation)"是指至少部分互補(bǔ)核苷酸序列的配對以產(chǎn)生DNA-DNA、RNA-RNA或DNA-RNA雜交。雜交序列包括通過堿基配對的互補(bǔ)性核苷酸序列。修飾的嘌呤(例如，肌苷、甲基肌苷和甲基腺苷)和修飾的嘧啶(硫代尿嘧啶和甲基胞嘧啶)也可參與堿基配對。本文所用的"嚴(yán)謹(jǐn)"是指溫度和離子強(qiáng)度條件，以及在雜交過程中一些有機(jī)溶劑和/或去污劑的存在或缺失。嚴(yán)謹(jǐn)程度越高，雜交的核苷酸序列間需要越高的互補(bǔ)水平。"嚴(yán)謹(jǐn)條件"是指這樣的條件在這樣的條件下只有具有高頻率互補(bǔ)堿基的核酸才雜交。本文所稱低度嚴(yán)謹(jǐn)條件包括并且包含(i)對于42C雜交至少約1%v/v至至少約15%v/v的甲酰胺和至少約IM至至少約2M的鹽，對于42。C洗滌至少約1M至至少約2M的鹽；禾口(ii)對于65°C雜交1%的牛血清白蛋白(BSA)，lmMEDTA，0.5MNaHP04(pH7.2)，7%SDS，和對于室溫洗滌(i)2xSSC，0.1%SDS;或(ii)0.5%BSA，lmMEDTA，40mMNaHP04(pH7.2)，5%SDS。中嚴(yán)謹(jǐn)條件包括并且包含(i)對于42t:雜交至少約16%v/v至至少約30%v/v的甲酰胺和至少約0.5M至至少約0.9M的鹽，對于42t:洗滌至少約0.5M至至少約0.9M的鹽；禾口(ii)對于65。C雜交1%的牛血清白蛋白(BSA)，ImMEDTA，O.5MNaHP04(pH7.2)，7%SDS，和對于42。C洗滌(a)2xSSC，0.1%SDS;或(b)0.5%BSA，lmMEDTA，40mMNaHP04(pH7.2)，5%SDS。高嚴(yán)謹(jǐn)條件包括并且包含(i)對于42C雜交至少約31%v/v至至少約50%v/v的甲酰胺和至少約0.01M至至少約0.15M的鹽，對于42t:洗滌至少約0.01M至至少約0.15M的鹽；禾口(ii)對于65。C雜交1%BSA，ImMEDTA，0.5MNaHP04(pH7.2)，7%SDS，和對于超過65。C洗滌約1小時:(a)O.lxSSC，O.1%SDS;或(b)O.5%BSA，lmMEDTA，40mMNaHP04(pH7.2)，1%SDS;禾口(iii)對于68。C或68。C以上洗滌約20分鐘0.2xSSC，O.1%SDS。通常，錯配堿基的數(shù)目每增加1%，雙鏈DNA的Tm下降約1°C。盡管是這樣，但是嚴(yán)謹(jǐn)條件在本領(lǐng)域是熟知的，例如在上述Ausubel等人第2.9和2.10章中所描述，這里引入作為參考。技術(shù)人員還將認(rèn)識到，可以通過操作各種因素來使雜交的特異性最優(yōu)化。最終洗滌的嚴(yán)謹(jǐn)性的最優(yōu)化可以確保高度雜交。通常，通過印跡技術(shù)來鑒定互補(bǔ)核苷酸序列，所述印跡技術(shù)包括以下步驟核苷酸被固定到基質(zhì)(優(yōu)選為合成膜例如硝酸纖維素)上的步驟、雜交步驟和檢測步驟。Southern印跡用于鑒定互補(bǔ)DNA序列；Northern印跡用于鑒定互補(bǔ)RNA序列。Dot印跡和slot印跡可以用于鑒定互補(bǔ)DNA/DNA、DNA/RNA或RNA/RNA多核苷酸序列。這樣的技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的，在上述Ausubel等人第2.9.1頁至2.9.20頁描述，這里引入作為參考。本發(fā)明的核酸變體可通過以下程序制備(i)從合適的宿主例如小麥品種獲得核酸提取物；(ii)產(chǎn)生引物，其可選地為簡并的，其中每個引物包含核苷酸序列的片段，所述核苷酸序列對應(yīng)于與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸，例如SEQIDN0:15、SEQIDNO:26禾卩SEQIDNO:285;禾口(iii)使用所述引物通過核酸擴(kuò)增技術(shù)從所述核酸提取物擴(kuò)增一個或多個擴(kuò)增產(chǎn)物。如本文所用的"擴(kuò)增產(chǎn)物"是指通過核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)生的核酸產(chǎn)物。本發(fā)明還考慮到如SEQIDNO:49和SEQIDNO:190所示氨基酸序列的蛋白同源物或變體。如本文通常所用的"蛋白同源物"與本發(fā)明的蛋白具有可確定的氨基酸序列關(guān)系，看情況而定。"蛋白同源物"與如上所述的本發(fā)明的蛋白的氨基酸序列具有至少60%，優(yōu)選至少65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%或80%，更優(yōu)選至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。將認(rèn)識到，同源包含所有100%之下的整數(shù)數(shù)值，例如如上所述的百分率數(shù)值和其它的數(shù)值。本發(fā)明進(jìn)一步考慮鑒定與谷物或產(chǎn)生谷物的植物的改善的制粉能力相關(guān)的一種或多種植物遺傳基因座的方法，包括以下步驟確定一種或多種植物遺傳基因座是否與面粉研磨產(chǎn)率相關(guān)或相聯(lián)。"遺傳基因座"是指基因在連鎖圖或染色體上的位置。本文所用的術(shù)語"基因"用于描述基因組內(nèi)的不連續(xù)的核酸位點(diǎn)、單元或區(qū)域，其可以包含一個或多個內(nèi)含子、外顯子、剪接位點(diǎn)，開放閱讀框和5'和/或3'非編碼調(diào)節(jié)序列例如聚腺苷酸化序列。在一般的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明考慮到14dpa序列和/或30dpa序列的核苷酸序列的一種或多種多態(tài)性的鑒定，其中所述變體還可以與改善的制粉能力相聯(lián)或相關(guān)。優(yōu)選地，變體是選自以下的核苷酸序列的變體:SEQIDNO:15，SEQIDNO:26，SEQIDNO:159或SEQIDNO:285。更優(yōu)選地，變體選自SEQIDNO:15或SEQIDNO:159。本文所用的術(shù)語"多態(tài)性"是指發(fā)生于谷物或產(chǎn)生谷物的植物群體中的基因或其編碼蛋白的等位形式上的任何變異。此術(shù)語包括突變、插入、刪除、變體和其它類似的表明多態(tài)性的特異類型的術(shù)語?？梢韵胂裉貏e的多態(tài)性，包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)、剪接變體等可作為傾向于改善的制粉能力的指征而被鑒定，并可用于篩選谷物或產(chǎn)生谷物的植物。這樣的多態(tài)性可存在于基因的任何核苷酸序列，包括但不限于蛋白編碼區(qū)域(例如外顯子區(qū)域)，非編碼的內(nèi)含子序列，基因間序列，分別位于5'和3'-UTR的上游和下游的非調(diào)節(jié)序列，調(diào)節(jié)區(qū)域包括增強(qiáng)子，聚腺苷酸化信號，剪接受體/供體位點(diǎn)和影響mRNA加工、剪接、周轉(zhuǎn)和/或翻譯的核苷酸序列。技術(shù)人員將知曉眾多鑒定核酸多態(tài)性的技術(shù)。通常，雖然非唯一性地，核苷酸序列多態(tài)性可通過核苷酸測序被鑒定，如本領(lǐng)域熟知的。關(guān)于核苷酸測序的詳細(xì)方法學(xué)見于CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGYEds.Ausubel等人JohnWiley&SonsNYUSA(1995-2002)第7章。因此本發(fā)明還考慮到TA.28688.1.A1_AT和/或TA.11743.1.Al.at的天然等位變體的鑒定?？梢韵胂?，與改善的制粉能力相關(guān)的遺傳基因座可通過本領(lǐng)域熟知的許多其它方法中的任何一種被鑒定。只是舉例的方式，可通過構(gòu)建并篩選基因組、表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)或cDNA庫來鑒定遺傳基因座。關(guān)于庫篩選的詳細(xì)的方法學(xué)見于CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGYEds.Ausubel等人JohnWiley&SonsNYUSA(1995-2002)第5章和第6章。基因組方法的一個非限定性例子為基因組步移，其使用本領(lǐng)域熟知的方法。還可應(yīng)用基于基因組范圍的表達(dá)數(shù)據(jù)的方法。潛在的方法學(xué)的非限定性的例子包括基因表達(dá)系列分析(SAGE)、EST庫的篩選和全局基因表達(dá)的基于雜交的測定例如微陣列分析(見CURRENTPR0T0C0LSINMOLECULARBIOLOGYEds.Ausubel等人JohnWiley&SonsNYUSA(1995-2002)第10、22和25章)。其它本領(lǐng)域熟知的基因作圖技術(shù)例如但不限于，連鎖分析可用于獲得與改善的制粉能力相關(guān)的遺傳基因座的染色體位置。將認(rèn)識到，在特別的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明考慮到14dpa序列或30dpa序列或一個或多個可如上所述鑒定的其它的與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的植物遺傳基因座的片段。通常，片段構(gòu)成遺傳基因座的100%以下，或至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、直至90%。在關(guān)于30dpa序列的優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，片段包含選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:57至60，SEQIDNO:72至74，SEQIDNO:95至99，SEQIDNO:215至224，SEQIDNO:102，SEQIDNO:162，SEQIDNO:163，SEQIDNO:164，SEQIDNO:165，SEQIDNO:166，SEQIDNO:167，SEQIDNO:168或SEQIDNO:169。在一個具體實(shí)施方式中，片段可以包括編碼調(diào)節(jié)改善的制粉性能的蛋白的核苷酸序列，所述調(diào)節(jié)是通過例如調(diào)節(jié)基因表達(dá)，例如轉(zhuǎn)錄延伸或者淀粉合成和造粉質(zhì)體分裂，但不限于此。在特別的具體實(shí)施方式中，片段還可以包括"生物活性"片段，其保持給定蛋白的生物活性。在本發(fā)明的上下文中，生物活性廣泛是指調(diào)節(jié)谷物或產(chǎn)生谷物的植物的制粉能力的能力。在一個具體實(shí)施方式中，"片段"包括含有構(gòu)成整個蛋白的100%以下的氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白。優(yōu)選地，片段包含整個蛋白的99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%、70%、60%、50%、40%、30%、20%以下或甚至少至10%、5%or3%。"蛋白"是指氨基酸多聚體。氨基酸可以是天然或非天然的氨基酸，D-或L-氨基酸，如本領(lǐng)域所熟知的那樣。術(shù)語"蛋白"包括和包含"肽"，其通常用于描述具有不超過五十(50)個氨基酸的蛋白，還包括"多肽"，其通常用于描述具有五十(50)個氨基酸以上的蛋白。可以認(rèn)識到本發(fā)明的更廣泛的應(yīng)用是通過操作與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因的表達(dá)而產(chǎn)生具有改善的制粉能力的谷物或產(chǎn)生谷物的植物的方法。優(yōu)選地，操作是選擇性調(diào)控。在涉及14dpa序列的優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因編碼具有如SEQIDN0:49所示的氨基酸序列的多肽。在其它的涉及14dpa序列的優(yōu)選具體實(shí)施方式中，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因包含選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:15或SEQIDNO:26或其變體。在涉及30dpa序列的優(yōu)選具體實(shí)施方式中，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因編碼具有如SEQIDN0:190所示的氨基酸序列的多肽或其變體。在涉及30dpa序列的優(yōu)選具體實(shí)施方式中，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因包含選自以下的核苷酸序列:SEQIDNO:159至161，SEQIDNO:188至189，SEQIDNO:193至202，SEQIDNO:285至289或SEQIDNO:296至301。優(yōu)選地，基因是SEQIDNO:285。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，本發(fā)明包括通過常規(guī)植物培育技術(shù)或者重組DNA方法學(xué)進(jìn)行遺傳修飾而產(chǎn)生具有改善的制粉能力的谷物或產(chǎn)生谷物的植物。因此，在一個方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生谷物或產(chǎn)生谷物的植物的方法，其包括以下步驟選擇性調(diào)節(jié)與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因從而與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因的相對數(shù)量比所述基因沒有被調(diào)節(jié)的產(chǎn)生谷物的植物中的低。術(shù)語"遺傳修飾"廣泛是指將異源核酸引入植物。異源核酸可以通過以染色體整合進(jìn)入宿主基因組或通過游離性復(fù)制而生存于生物中。優(yōu)選地，遺傳修飾導(dǎo)致與非修飾的植物相比，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因的表達(dá)水平實(shí)質(zhì)性降低或者零表達(dá)。"常規(guī)植物培育"是指通過將兩個供體植物(其中的一個攜帶感興趣的性質(zhì))雜交，然后通過篩選和田野選擇而產(chǎn)生新的植物品種。此過程不依賴于插入重組DNA以表達(dá)想要的性質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，常規(guī)植物培育方法通常包括鑒定一個或多個親代植物，其包含至少一個遺傳成分，該遺傳成分通過調(diào)節(jié)與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因而增加面粉產(chǎn)率。僅以舉例的方式，常規(guī)植物培育方法可以包括以下步驟(a)鑒定第一親代植物和第二親代植物，其中第一和第二植物包含至少一個與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因，其中第一和第二植物能夠異花傳粉。對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的遺傳篩選方法可用于鑒定合適的親代；(b)對第一親代植物授以來自第二親代植物的花粉，或者，對第二親代植物授以來自第一親代植物的花粉；(c)在一定條件下培養(yǎng)經(jīng)授粉的植物以產(chǎn)生子代植物；(d)使用本領(lǐng)域熟知的方法選擇那些質(zhì)量特性為純合的子代植物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，一旦獲得了對改善的制粉能力的增強(qiáng)元件為雜合或純合的植物，那些雜合或純合的植物可用于培育程序以將產(chǎn)生高面粉產(chǎn)率的能力轉(zhuǎn)移給產(chǎn)生低面粉產(chǎn)率的植物品種。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，常規(guī)植物培育可包括研究與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因的遺傳可變性并將觀察到的多樣性與基因表達(dá)測定關(guān)聯(lián)起來。那些低表達(dá)的等位基因?qū)⑼ㄟ^使用區(qū)分基因的低表達(dá)等位基因和高表達(dá)等位基因的基于核酸的標(biāo)記而被選擇以用于培育程序。例如來自面包小麥的A、B和D基因組的每一個的可能的三個基因座的發(fā)育種子中基因表達(dá)的作用的知識也可以對此方法是有價值的。通過本發(fā)明的方法鑒定或產(chǎn)生的植物可用于生產(chǎn)任何該生物適合的食物產(chǎn)品。例如，谷物農(nóng)作物可用于產(chǎn)生大米、面粉或谷物以用于生產(chǎn)食物產(chǎn)品，例如，面包、啤酒或其它發(fā)酵和非發(fā)酵的飲料。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因的選擇性調(diào)節(jié)可能需要下調(diào)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地認(rèn)識到，植物中的一個或多個與改善的制粉能力相關(guān)的基因表達(dá)的下調(diào)可通過沉默來進(jìn)行。沉默可通過引入靶向打亂或降解特異核苷酸序列的合成性重組分子或轉(zhuǎn)基因而實(shí)現(xiàn)。因此，根據(jù)一個具體實(shí)施方式，可通過構(gòu)建敲除基因而實(shí)現(xiàn)沉默。通常，雖然并不唯一，可通過將外源序列同源重組進(jìn)入感興趣基因中從而打亂該基因而產(chǎn)生基因敲除。31根據(jù)另外的具體實(shí)施方式，本發(fā)明的基因可在轉(zhuǎn)錄后的水平上被沉默。僅以舉例的方式，本發(fā)明良好適應(yīng)于通過將一個或多個位點(diǎn)特異性突變引入核酸的功能喪失方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，該方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠工程化對蛋白功能有效應(yīng)的精確的突變。因此，可使用各種重組技術(shù)對突變進(jìn)行人工工程化。合適的技術(shù)的非限定性例子包括寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn)的)突變、PCR突變和盒式突變。或者，無需之前知道功能，可使用隨機(jī)突變而產(chǎn)生功能喪失的突變(例如轉(zhuǎn)座子突變)而引入突變。根據(jù)另外一個具體實(shí)施方式，沉默可包括產(chǎn)生抑制性RNA分子(以下稱為"RNAi")。RNAi，特別是siRNA(但不限于此)包括同族mRNA的序列特異性切割。因此本發(fā)明考慮到產(chǎn)生用于RNAi的遺傳試劑，其中遺傳試劑包括一個或多個能夠指導(dǎo)RNA分子合成的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自(i)可轉(zhuǎn)錄為RNA分子的核苷酸序列，所述RNA分子包含的RNA序列與本發(fā)明的核苷酸序列優(yōu)選如SEQIDN0:26或SEQIDNO:285所示的序列實(shí)質(zhì)同源或匹配的核苷酸序列所編碼的RNA序列實(shí)質(zhì)同源；(ii)(i)中的核苷酸序列的反向互補(bǔ)；(iii)(i)和(ii)中的核苷酸序列的組合;(iv)多個拷貝的(i)、(ii)或(iii)中的核苷酸序列，可選地由間隔序列分開;(v)(i)和(ii)中的核苷酸序列的組合，其中(ii)中的核苷酸序列代表(i)中的核苷酸序列的倒轉(zhuǎn)重復(fù)，由間隔序列分開；或(vi)如(v)中所描述的組合，其中間隔序列包括從所述組合剪接的內(nèi)含子序列。如果核苷酸序列包含由非內(nèi)含子間隔序列分開的倒轉(zhuǎn)重復(fù)，在轉(zhuǎn)錄時，非內(nèi)含子間隔序列的存在由于倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列彼此的結(jié)合而促進(jìn)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成。非內(nèi)含子間隔序列的存在引起所形成的轉(zhuǎn)錄的RNA序列(本文也稱為"轉(zhuǎn)錄本")基本上保持在一段內(nèi)，本文可稱為"發(fā)夾"?；蛘?，如果核苷酸序列包含倒轉(zhuǎn)重復(fù)，其中間隔序列包含內(nèi)含子序列，在轉(zhuǎn)錄時，內(nèi)含子序列的任一側(cè)的內(nèi)含子/外顯子剪接接頭序列促進(jìn)不然就形成環(huán)結(jié)構(gòu)的序列。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本包含雙鏈RNA(dsRNA)分子，可選地在一端或兩端具有外伸的3'序列。這樣的dsRNA轉(zhuǎn)錄本在本文中被稱為"完美發(fā)夾"。RNA分子可包含單一發(fā)夾或多個發(fā)夾，包括發(fā)生于雙鏈DNA序列的區(qū)域的單鏈DNA的"凸出部分"?？梢灶A(yù)見通過降低谷物或產(chǎn)生谷物的植物例如具有低面粉研磨分值的小麥品種中的與本發(fā)明的改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因的表達(dá)可以將這些品種轉(zhuǎn)化為高面粉產(chǎn)率品種。RNA沉默可用作降低具有低研磨品種中的與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因表達(dá)的方法。例如，可以使用包含與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的核酸的RNAi載體轉(zhuǎn)化具有低研磨分值的小麥品種，從而產(chǎn)生幾個獨(dú)立的遺傳修飾的小麥植物?？梢院Y選獨(dú)立的遺傳修飾的植物以鑒定那些具有降低的轉(zhuǎn)錄的植物，然后確定制粉性能。本發(fā)明還考慮到通過突變產(chǎn)生新的等位基因，其是低表達(dá)或非表達(dá)的，或者表達(dá)后不產(chǎn)生功能性蛋白。也可以在培育程序中使用特異性DNA標(biāo)記選擇這些新的等位基因。該方法可導(dǎo)致表達(dá)水平或功能性蛋白的水平低于培育試驗(yàn)中所包括的小麥品種中所發(fā)現(xiàn)的水平。這將潛在地增加這些基因?qū)γ娣郛a(chǎn)率的正影響(除了現(xiàn)有的培育系中發(fā)現(xiàn)的以外的影響)?？梢韵胂?，可以使用為TILLING所開發(fā)的方法(McCallum等人Nat.Biotechnol.(2000)1^,455-457;Till等人MethodsMol.Biol.(2003)236:205-220;Till等人GenomeRes.(2003)1^:524-530)從具有誘導(dǎo)突變的種質(zhì)中鑒定與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因的低表達(dá)或非功能性版本。該方法將可能包括在為TILLING產(chǎn)生的一池突變體中將每個基因座分別靶向于三個基因組上。明智的雜交和選擇產(chǎn)生的品系可以產(chǎn)生具有功能性基因產(chǎn)物的低表達(dá)的植物并因此產(chǎn)生超過野生型等位基因可能的改善面粉產(chǎn)率的潛力。在任何情況下，產(chǎn)生具有低表達(dá)或非功能性基因產(chǎn)物的潛力可以增加選擇合適的等位基因并產(chǎn)生高面粉產(chǎn)率品種的可能性。在涉及產(chǎn)生遺傳修飾的植物的替代的優(yōu)選具體實(shí)施方式中，還可以預(yù)見方法進(jìn)一步包括以下步驟在所需的具有高制粉分值的小麥品種中增加本發(fā)明的與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因的表達(dá)從而將這些品種轉(zhuǎn)化為低制粉品種。具有高制粉分值的小麥品種將被選擇并以設(shè)計為過表達(dá)與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因的基因構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而產(chǎn)生幾個獨(dú)立的遺傳修飾的植物?？梢院Y選獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因植物以鑒定那些具有增加轉(zhuǎn)錄的植物，然后確定其制粉性能。通過前面所述可以認(rèn)識到，以上討論的分離的核酸非常易于插入遺傳構(gòu)建體以產(chǎn)生遺傳修飾的植物，其中遺傳構(gòu)建體包含一個或多個與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地認(rèn)識到，遺傳構(gòu)建體是包含許多核苷酸序列元件中的任一個的核酸，其功能取決于構(gòu)建體所需要的用途。用途有，用于一般性操作和繁殖重組DNA的載體，到更復(fù)雜的應(yīng)用，如異源核酸的原核或真核表達(dá)和遺傳修飾的植物的產(chǎn)生。通常，雖然并不唯一，遺傳構(gòu)建體被設(shè)計為提供一種以上的應(yīng)用。僅以舉例的方式，最終設(shè)計用途為在真核系統(tǒng)中表達(dá)重組蛋白的遺傳構(gòu)建體可能在用于表達(dá)的序列以外和之上具有整合的核苷酸序列以用于這樣的功能，如在原核細(xì)胞中克隆和繁殖。當(dāng)設(shè)計和制備這樣的遺傳構(gòu)建體時，一個重要考慮是預(yù)期應(yīng)用的所需核苷酸序列。鑒于以上所述，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯然的是，遺傳構(gòu)建體是可適用于許多目的中的任一個的萬能工具。在一個優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，遺傳構(gòu)建體可適合于植物轉(zhuǎn)化。在另一個優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，遺傳構(gòu)建體適合于小麥中的顆粒轟擊。更優(yōu)選地，遺傳構(gòu)建體包含載體pAHC25的核苷酸序列。在考慮共轟擊的替代的具體實(shí)施方式中，可以應(yīng)用多數(shù)遺傳構(gòu)建體的混合物。在一個優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，一個遺傳構(gòu)建體例如PAHC25可包含選擇性遺傳標(biāo)記，而另一個基于質(zhì)粒例如但不限于pGEM3zf的遺傳構(gòu)建體可包含一個或多個與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸。"載體"是指核酸，優(yōu)選為DNA分子，其源自例如質(zhì)粒，噬菌體，或植物病毒，其中可以插入或克隆入核酸序列。載體優(yōu)選包含一個或多個獨(dú)特的限制性位點(diǎn)并能夠在確定的宿主細(xì)胞包括靶細(xì)胞或組織或祖細(xì)胞或其組織中自主復(fù)制，或者可與確定的宿主的基因組整合從而使克隆的序列復(fù)制。因此，載體可以是自主復(fù)制載體，即載體作為染色體外的實(shí)體而存在，其復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，例如線性或閉合環(huán)質(zhì)粒，染色體外元件，微型染色體，或人工染色體。載體可包含任何確保自我復(fù)制的方式。或者，載體可以是這樣的，當(dāng)被引入宿主細(xì)胞時，被整合入基因組并與其所整合進(jìn)入的染色體一起復(fù)制。載體系統(tǒng)可包含單一載體或質(zhì)粒，兩個或兩個以上載體或質(zhì)粒，其共同含有需要引入宿主細(xì)胞的基因組的總DNA，或轉(zhuǎn)座子。載體的選擇通常取決于載體與該載體將被引入的宿主細(xì)胞的兼容性。載體還可以包括選擇標(biāo)記例如可以用于選擇合適的轉(zhuǎn)化子的抗生素抗性基因。這樣的抗性基因的例子對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。其它的序列本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還可包括增強(qiáng)子，不論是翻譯或轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子，只要需要的話。這些增強(qiáng)子區(qū)域?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的，其可包括ATG起始密碼子和臨近序列。起始密碼子必須與涉及異源或內(nèi)源DNA序列的編碼序列的閱讀框同相，以確保整個序列的翻譯。翻譯控制信號和起始密碼子可以是眾多來源的，天然的或合成的均可?？梢詮霓D(zhuǎn)錄起始區(qū)域的來源提供翻譯起始區(qū)域，或從異源或內(nèi)源DNA序列提供。序列還可以源自用于驅(qū)動轉(zhuǎn)錄所選的啟動子的來源，可以被特異性修飾從而增加mRNA的翻譯。轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的例子包括但不限于，來自CaMV35S啟動子和章魚堿(octopine)合成酶基因的元件，如Last等人所描述(美國專利號5，290，924，引入本文作為參考)。推測當(dāng)在植物轉(zhuǎn)化情況中應(yīng)用時，使用增強(qiáng)子元件例如ocs元件特別是多拷貝的元件將增加來自臨近啟動子的轉(zhuǎn)錄水平。由于在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和編碼序列起始之間插入的DNA序列，即非翻譯引導(dǎo)序列可影響基因表達(dá)，所以還可以應(yīng)用特別的引導(dǎo)序列。優(yōu)選的引導(dǎo)序列包括那些包含選作指導(dǎo)異源或內(nèi)源DNA序列的最佳表達(dá)的序列。例如，這樣的引導(dǎo)序列包括優(yōu)選的共有序列，其可增加或保持mRNA的穩(wěn)定性并防止翻譯的不正確的起始，如例如Joshi所描述(1987，Nucl.AcidRes.，15:6643)，引入本文作為參考。但是，其它的引導(dǎo)序列，例如RTBV的引導(dǎo)序列，具有預(yù)期降低mRNA穩(wěn)定性和/或降低mRNA翻譯的高度的二級結(jié)構(gòu)。因此，(i)不具有高度的二級結(jié)構(gòu)；(ii)具有不抑制mRNA穩(wěn)定性和/或降低翻譯的高度的二級結(jié)構(gòu)；或(iii)源自在植物中高表達(dá)的基因的引導(dǎo)序列是最優(yōu)選的。如果需要的話，還可包括調(diào)節(jié)元件，如由例如Vasil等人(1989，PlantPhysiol.，91:5175)所描述的蔗糖合成酶內(nèi)含子，如由例如Callis等人(1987，GenesDevelop.，II)所描述的Adh內(nèi)含子I，或如由例如Gallie等人(1989，ThePlantCell，l:301)所描述的TMV"元件。實(shí)施本發(fā)明時可用的其它這樣的調(diào)節(jié)元件對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。另外，耙序列可用于將異源或內(nèi)源核苷酸序列的蛋白產(chǎn)物靶向植物細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)腔室或細(xì)胞外環(huán)境。例如，編碼轉(zhuǎn)運(yùn)或信號肽序列的DNA序列可以可操作地與編碼所需蛋白的序列連接，從而當(dāng)翻譯時，轉(zhuǎn)運(yùn)或信號肽可以將蛋白分別運(yùn)輸至特定的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外目的地，然后可以在翻譯后除去。轉(zhuǎn)運(yùn)或信號肽通過促進(jìn)蛋白穿過細(xì)胞內(nèi)膜，例如液泡、小泡、質(zhì)體和線粒體膜的運(yùn)輸而起作用，而信號肽指導(dǎo)蛋白穿過細(xì)胞外膜。例如轉(zhuǎn)運(yùn)或信號肽可以指導(dǎo)所需蛋白至特定的細(xì)胞器例如質(zhì)體(例如葉綠體)，而不是至胞漿。例如，可以參考Heijne等人(1989，Eur.J.Biochem.，180:535)和Keegstra等人(1989，Ann.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.，40:471)，引入本文作為參考。本發(fā)明的分離的核酸還可以被引入載體，例如質(zhì)粒。質(zhì)粒載體包括另外的DNA序列，這些DNA序列提供在原核和真核細(xì)胞中表達(dá)盒的選擇、擴(kuò)增和轉(zhuǎn)化的方便，例如源自pUC的載體，源自pSK的載體，源自pGEM的載體，源自pSP的載體，或源自pBS的載體。另外34的DNA序列包括復(fù)制起始子以提供載體的自主復(fù)制，選擇性標(biāo)記基因，優(yōu)選編碼抗生素或除草劑抗性基因，獨(dú)特的多克隆位點(diǎn)以提供用于插入DNA序列或DNA構(gòu)建體中編碼基因的多重位點(diǎn)，以及增強(qiáng)原核和真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的序列。載體優(yōu)選含有允許載體穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞基因組或允許載體在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于細(xì)胞的基因組而自主復(fù)制的元件。當(dāng)被引入宿主細(xì)胞時，載體可以整合入宿主細(xì)胞基因組。為了整合，載體可依賴于異源或內(nèi)源DNA序列或其它任何載體元件以通過同源重組而將載體穩(wěn)定整合入基因組?；蛘?，載體可含有另外的核酸序列以指導(dǎo)其通過同源重組而整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組。另外的核酸序列使載體能夠在染色體上的精確位點(diǎn)整合進(jìn)入宿主基因組。為了增加在精確位點(diǎn)整合的可能性，整合元件應(yīng)該優(yōu)選包含足夠數(shù)目的與對應(yīng)的靶序列高度同源的核酸，例如100至1，500堿基對，優(yōu)選400至1，500堿基對，最優(yōu)選800至1，500堿基對，從而增強(qiáng)同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細(xì)胞的基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼核酸序列。為了自主復(fù)制，載體還可包含復(fù)制起始子以使載體能夠在相關(guān)宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制。細(xì)菌的復(fù)制起始子的例子為質(zhì)粒pBR322，pUC19，pACYC177和pACYC184的復(fù)制起始子，其允許在大腸桿菌(E.coli)中復(fù)制，和pUB110，pE194，pTA1060和pAM.beta.1的復(fù)制起始子，其允許在芽孢桿菌(Bacillus)中復(fù)制。復(fù)制起始子可以具有突變以使其在芽孢桿菌細(xì)胞中具有溫度敏感性功能(參見，例如Ehrlich，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1433)。標(biāo)記某因?yàn)榱舜龠M(jìn)轉(zhuǎn)化子的鑒定，遺傳構(gòu)建體優(yōu)選包含可選擇或可篩選的標(biāo)記基因，作為可表達(dá)的異源或內(nèi)源核苷酸序列，或除此之外還包含可表達(dá)的異源或內(nèi)源核苷酸序列。標(biāo)記的實(shí)際選擇并不重要，只要其與所選植物細(xì)胞組合是功能性的(即選擇性的)。標(biāo)記基因和感興趣的異源或內(nèi)源核苷酸序列不需要連在一起，因?yàn)樵谥参镛D(zhuǎn)化中，未連接的基因的共轉(zhuǎn)化也是有效的方法，如美國專利號4，399，216所描述。術(shù)語可選擇或可篩選的標(biāo)記基因包括編碼"可分泌標(biāo)記"的基因，其分泌可作為鑒定或選擇所轉(zhuǎn)化細(xì)胞而被檢測。例子包括編碼可分泌抗原的標(biāo)記，其可通過抗體相互作用被鑒定，或可分泌酶，其可通過它們的催化活性被檢測。可分泌蛋白包括但不限于插入或捕獲在細(xì)胞壁上的蛋白(例如包括引導(dǎo)序列蛋白，如在伸展蛋白或煙草PR-S的表達(dá)單元中發(fā)現(xiàn)的蛋白)；小的可通過例如ELISA檢測的擴(kuò)散性蛋白；以及可在細(xì)胞外溶液中檢測的小的活性酶(例如a-淀粉酶，|3-內(nèi)酰胺酶，草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶)。選擇性標(biāo)記細(xì)菌的選擇性標(biāo)記的例子有來自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的dal基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，例如氨比西林、卡那霉素、紅霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。用于植物轉(zhuǎn)化的選擇的示例性的選擇性標(biāo)記包括但不限于編碼潮霉素B抗性的hyg基因；賦予對卡那霉素、巴龍霉素、G418等抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)基因，例如，由Potrykus等人(1985，Mol.Gen.Genet.199:183)所描述；來自大鼠肝臟的賦予對源自谷胱甘肽的除草劑抗性的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因，例如，在EP-A256223中描述的；谷氨酰胺合成酶基因，其過表達(dá)時賦予對谷氨酰胺合成酶抑制劑例如草胺膦的抗性，例如，在W087/05327中描述；來自綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Str印tomyces35viridochromogenes)的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，其賦予對選擇性試劑草胺膦的抗性，如例如EP-A275957中描述；編碼5-烯醇莽草酸(enolshikimate)-3-磷酸合成酶(EPSPS)的基因，其賦予對N-膦酰甲基甘氨酸的耐受性，如例如Hinchee等人(1988，Biotech.，6:915)所描述；賦予對雙丙氨膦抗性的bar基因，例如，在W091/02071中描述；腈水解酶基因例如來自臭鼻克雷伯菌(Klebsiellaozaenae)的bxn，其賦予對溴苯腈的抗性(Stalker等人1988，Science,242:419);賦予對氨甲蝶呤抗性的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(Thillet等人1988，J.Biol.Chem.，263:12500);突變的乙酰乳酸合成酶基因(ALS)，其賦予對咪唑啉酮、磺酰脲或其它ALS抑制性化學(xué)物質(zhì)的抗性(EP-A-154204)。突變的鄰氨基苯甲酸鹽合成酶基因，其賦予對5-甲基色氨酸的抗性；或茅草枯脫鹵酶基因，其賦予對除草劑的抗性。篩詵標(biāo)記優(yōu)選的篩選標(biāo)記包括但不限于編碼13-葡萄糖苷酸酶(GUS)酶的基因，該酶的各種發(fā)色底物是已知的；編碼P-半乳糖苷酶的基因，該酶的各種發(fā)色底物是已知的；發(fā)光蛋白質(zhì)(aequorin)基因(Prasher等人1985，Biochem.Biophys.Res.Comm.，126:1259)，其可用于鈣敏感的生物發(fā)光檢測；綠色熒光蛋白基因(Niedz等人1995PlantCellR印orts，14:403);熒光素酶基因(Ow等人1986，Science,234:856)，其允許生物發(fā)光檢測；P-內(nèi)酰胺酶基因(Sutcliffe，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:3737)，其編碼的酶的各種發(fā)色底物是已知的(例如PADAC，發(fā)色的頭孢菌素)；R-基因座基因，其編碼調(diào)節(jié)植物組織中產(chǎn)生花青素色素(紅色)的產(chǎn)物(Dellaporta等人1988，inChromosomeStructureandFunction,pp.263-282);a淀粉酶基因(Ikuta等人1990，Biotech.，8:241);酪氨酸酶基因(Katz等人1983，J.Gen.Microbiol.，129:2703)，其編碼能夠?qū)⒗野彼嵫趸癁槎喟秃投喟王拿?，多巴和多巴醌再縮合形成易于檢測的化合物黑色素；或xylE基因(Zukowsky等人1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:1101)，其編碼轉(zhuǎn)化發(fā)色的兒茶酚的兒茶酚加雙氧酶。植物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生遺傳修飾的植物的最初步驟是將DNA引入植物宿主細(xì)胞中。許多技術(shù)可用于將DNA引入植物宿主細(xì)胞中。有很多本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的植物轉(zhuǎn)化技術(shù)，新技術(shù)也正涌現(xiàn)。轉(zhuǎn)化技術(shù)的特別選擇將由其轉(zhuǎn)化一些植物品種的效率以及以選擇的特定方法學(xué)實(shí)施本發(fā)明的人員的經(jīng)驗(yàn)和喜好所決定。對本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，特定選擇轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以將遺傳構(gòu)建體引入植物細(xì)胞對本發(fā)明不重要，或不限制本發(fā)明，只要其達(dá)到可接受的核酸轉(zhuǎn)移水平。用于植物改善的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的實(shí)際實(shí)施的指導(dǎo)見于Birch(1997，An皿.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.48:297-326)，其引入本文作為參考。在一個具體實(shí)施方式中，通過微注射轟擊進(jìn)行轉(zhuǎn)化，例如在Franks&Birch，1991，Aust.J.Plant.Physiol.，18:471;Gambley等人1994，supra;和Bower等人1996，MolecularBreeding,2:239所描述，其引入本文作為參考。在另一個具體實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化是農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的單子葉植物的轉(zhuǎn)化的例子見于美國專利號6，037，522，Hiei等人1994，Plantjo證al6271和Ishida等人1996，NatureBiotechnol.14745，關(guān)于各種谷物，Arencibia等人1998，TransgenicRes.7213。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將知曉，眾多其它的轉(zhuǎn)化方法可用于本發(fā)明的方法，例如脂質(zhì)體介導(dǎo)的(Ahokas等人1987，Heriditas106129)，激光介導(dǎo)的(Guo等人1995，PhysiologiaPlanta進(jìn)9319)，碳化硅或鴇質(zhì)須簧(美國專利號5，302，523;Ka印pler等人1992，Theor.Appl.Genet.84560)，病毒介導(dǎo)的(Brisson等人1987，Nature310511)，聚乙二醇介導(dǎo)的(Paszkowski等人1984，EMB0J.32717)方法，以及通過微注射(Neuhaus等人1987，Theor.Appl.Genet.7530)和原生質(zhì)體的電穿孔(Fromm等人1986，Nature319791)的轉(zhuǎn)化?；蛘?，可以應(yīng)用不同技術(shù)的組合以增強(qiáng)轉(zhuǎn)化過程的效率，例如以農(nóng)桿菌包被的微顆粒轟擊(EP-A-486234)或微注射轟擊以誘導(dǎo)傷口然后以農(nóng)桿菌共培養(yǎng)(EP-A-486233)。棺物再牛用于將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生為分化的植物的方法對本發(fā)明不是重要的，可以應(yīng)用對于目標(biāo)植物來說任何合適的方法。正常地，在轉(zhuǎn)化過程之后將植物細(xì)胞再生以獲得完整的植物。本文所用的術(shù)語"再生"是指從植物細(xì)胞、一組植物細(xì)胞、植物部分(包括種子)或植物片段(例如從原生質(zhì)體、愈傷組織或組織部分)生長出完整的分化的植物。從原生質(zhì)體的再生在植物的品種與品種之間有所不同，但通常首先制備原生質(zhì)體的懸浮液。在一些品種中，然后可以從原生質(zhì)體懸浮液誘導(dǎo)形成胚胎至成熟期并作為正常的胚胎發(fā)芽。培養(yǎng)基通常含有生長和再生必須的各種氨基酸和激素。所用的激素的例子包括茁長素和細(xì)胞分裂素。有時優(yōu)選向培養(yǎng)基中加入谷氨酸和脯氨酸，尤其是為這樣的品種例如玉米和紫花苜蓿。有效的再生將取決于培養(yǎng)基、基因型和培養(yǎng)歷史。如果這些變量被控制，再生是可重現(xiàn)的。再生也可發(fā)生于植物愈傷組織、外植體、器官或部分。從愈傷組織上除掉發(fā)育的芽，并將這些芽移植到誘導(dǎo)根的合適的選擇性培養(yǎng)基中。在根出現(xiàn)以后盡快將生根的小植物移植到土壤。如果需要的話，小植物可以被移植直至達(dá)到成熟。例如，已經(jīng)通過只選擇年老緊密的和小結(jié)的胚胎發(fā)生愈傷組織以建立胚胎發(fā)生愈傷組織懸浮液培養(yǎng)物而從胚胎發(fā)生懸浮液培養(yǎng)物再生出了小麥植物(Vasil，1990，Bio/Technol.8:429-434)。對這些農(nóng)作物的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的組合使本發(fā)明可應(yīng)用于單子葉植物。在生長繁殖的農(nóng)作物中，通過進(jìn)行剪切或通過組織培養(yǎng)技術(shù)而繁殖成熟的轉(zhuǎn)基因植物以產(chǎn)生多個相同的植物。選擇了所需要的轉(zhuǎn)基因，獲得了新的品種并為商業(yè)目的進(jìn)行了生長繁殖。在繁殖種子的農(nóng)作物中，成熟的轉(zhuǎn)基因植物可以自交以產(chǎn)生純合近親繁殖植物。近親繁殖植物產(chǎn)生含有新引入的異源基因的種子。這些種子可長成將產(chǎn)生選擇的表型例如增加的胚乳硬度的植物。從再生植物獲得的部分，例如谷物、花、種子、葉子、枝、果實(shí)等包含在本發(fā)明內(nèi)，只要這些部分包含如上所述的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。再生植物的子代和變體，和突變體也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要這些部分包含所引入的核酸序列。將認(rèn)識到，文獻(xiàn)中描述的各種用于再生特異性植物類型和更多的技術(shù)仍在繼續(xù)涌現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考文獻(xiàn)的細(xì)節(jié)并選擇合適的技術(shù)，而無需復(fù)出過量實(shí)驗(yàn)。魃為了證實(shí)再生植物中異源核酸的存在，可以進(jìn)行各種檢驗(yàn)。這樣的檢驗(yàn)包括例如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的"分子生物學(xué)"檢驗(yàn)，例如Southern和Northern印跡和PCR;可以通過western印跡、高效液相色譜或ELISA(例如nptll)分析異源DNA表達(dá)的蛋白，如本領(lǐng)域所熟知的。適用于轉(zhuǎn)基因植物鑒定的各種方法的例子見于PLANTM0LECULARBI0L0GY:ALaboratoryManualEd.M.S.Clark(Springer-Verlag，Heidelberg,1997)第9章禾口第11章，這些章節(jié)引入本文作為參考。為了使本發(fā)明容易理解并付諸實(shí)際實(shí)施，提供了以下非限定性實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)施例1測定兩個地點(diǎn)小麥品種的面粉產(chǎn)率以進(jìn)行使用開花14天后所產(chǎn)種子的樣品的DNA微陣列的基因表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)的比較試驗(yàn)中種植的200個品種的小麥中的154個品種提供足夠的種子材料使得能夠進(jìn)行小規(guī)模制粉試驗(yàn)，這提供了Narrabri地點(diǎn)和Biloela的97個品種的面粉產(chǎn)率的數(shù)據(jù)。挑選了71個被分類為"硬小麥"的品種進(jìn)行潛在的包括于微陣列基因表達(dá)分析研究的分析。從兩個地點(diǎn)提供了55個品種的面粉產(chǎn)率數(shù)據(jù)。面粉產(chǎn)率測定的分布顯示于圖1。兩個地點(diǎn)的小麥品種的面粉產(chǎn)率是相似的，地點(diǎn)間相關(guān)系數(shù)為r=0.59。在圖2中顯示了比較兩個地點(diǎn)的產(chǎn)率的散點(diǎn)圖。發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)間面粉產(chǎn)率的差異(表l)是統(tǒng)計學(xué)顯著的，如基因型(品種)間的面粉產(chǎn)率差異那樣重要(表2)。但是沒有發(fā)現(xiàn)這兩個因素之間有顯著性相關(guān)(表2)。從最高產(chǎn)率小麥品種和最低產(chǎn)率小麥品種中，從開花后14天所產(chǎn)種子樣品中提取RNA進(jìn)行基因表達(dá)分析。選擇了IO個小麥品種，其具有足夠質(zhì)量和數(shù)量的RNA，來自面粉產(chǎn)率分布的極端。在兩個實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)的來自這些品種的產(chǎn)率顯示于表3。兩類小麥(高-H，低-L)的平均面粉產(chǎn)率的95%置信區(qū)間表明兩個類別在其面粉產(chǎn)率性質(zhì)中是廣泛分離的，因此可能對于此特性在遺傳學(xué)上是非常不同的(圖3A)。從14dpa(圖3B)和30dpa(圖3C)產(chǎn)的小麥種子中提取并純化了RNA，并以Bioanalyser檢查了產(chǎn)率和質(zhì)量。實(shí)施例2低產(chǎn)率和高產(chǎn)率小麥品種的開花后14天樣品的表達(dá)差異的統(tǒng)計學(xué)分析簡介本發(fā)明人使用Affymetrix小麥芯片研究了小麥種子中的基因表達(dá)。本報告提供了這些研究的統(tǒng)計學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)計為進(jìn)行具有低面粉產(chǎn)率和高面粉產(chǎn)率的小麥品種之間基因表達(dá)的比較?？梢垣@得10個品種的Affymetrix表達(dá)數(shù)據(jù)，5個為低面粉產(chǎn)率，5個為高面粉產(chǎn)率。對數(shù)據(jù)的質(zhì)量評價表明來自每個芯片的數(shù)據(jù)均適合于分析。進(jìn)行了一系列分析以研究低產(chǎn)率和高產(chǎn)率品種之間的表達(dá)的總體差異，以及個體基因之間的差異。結(jié)果顯示在很大數(shù)量的基因內(nèi)存在小差異，而不是很小數(shù)量的基因內(nèi)存在大差異。鑒定了一套可能適合于進(jìn)一步分析的分離的基因。數(shù)據(jù)篩選高質(zhì)量的數(shù)據(jù)對于從基因表達(dá)研究中獲得有意義的結(jié)果是至關(guān)重要的。RNA的質(zhì)量和芯片及其處理的質(zhì)量均影響最終的數(shù)據(jù)?？梢酝ㄟ^RNAIntegrityNumber(RIN)[5]評價RNA的質(zhì)量。RIN是由Agilentbioanalyzersystem(其設(shè)計為檢測RNA的降解)產(chǎn)38生的得分。得分介于l(代表嚴(yán)重降解)至10(代表沒有降解)。RIN均比5.5大，使其適合于分析，但不理想?？梢詸z測所處理的表達(dá)值的分布的質(zhì)量。使用RMA算法[3]處理芯片后，使用表達(dá)的核密度評估(見圖4)和箱須圖(見圖5)顯示分布。雖然RMA迫使探針?biāo)奖磉_(dá)的評估在每個芯片上具有相同分布，但是對于基因水平表達(dá)評估不是這樣。然而，基因水平表達(dá)評估的分布對每個芯片來說是非常相似的。沒有芯片具有非典型性分布。還使用了MA圖檢測表達(dá)值(見圖6和7)。給定芯片的MA圖是對每個基因的所有芯片上中位數(shù)與芯片表達(dá)和所有芯片上中位數(shù)之間差異的比較。理想地，MA圖的點(diǎn)在水平線附近從0點(diǎn)開始平均分散。雖然對于芯片4和8有一些非線性的證據(jù)，但是總體上MA圖表明數(shù)據(jù)適合于分析。數(shù)據(jù)分析第一個分析設(shè)計為檢測數(shù)據(jù)中的任何結(jié)構(gòu)。將品種繪圖于它們的前兩個主要部分的空間，進(jìn)行聚類分析(clusteranalysis)。聚類算法的選擇容易對聚類分析的結(jié)果產(chǎn)生偏差。為了避免偏差，將聚類進(jìn)行三次，每次使用不同的聚類算法。構(gòu)建基于單一連接算法的聚類樹狀圖、平均連接算法的聚類樹狀圖和完全連接算法的聚類樹狀圖。使用受試者工作特征(R0C)曲線總結(jié)以基因表達(dá)數(shù)據(jù)區(qū)分低面粉產(chǎn)率和高面粉產(chǎn)率的能力。這些曲線顯示了正確鑒定高產(chǎn)率樣品為高產(chǎn)率和正確鑒定低產(chǎn)率樣品為低產(chǎn)率之間的關(guān)系。我們將使用術(shù)語敏感性和選擇性來描述這種關(guān)系。通常，這樣術(shù)語適用于陽性樣品和陰性樣品，即對于某疾病來說，樣品要么是陽性，要么是陰性。為了本報告的目的，我們將把高產(chǎn)率品種作為"陽性"，將低產(chǎn)率樣品作為"陰性"。因此，敏感性是通過基因表達(dá)數(shù)據(jù)將高產(chǎn)率品種正確鑒定為高產(chǎn)率的百分率；選擇性是通過基因表達(dá)數(shù)據(jù)將低產(chǎn)率品種正確鑒定為低產(chǎn)率的百分率。R0C曲線在生物統(tǒng)計文獻(xiàn)中受到廣泛重視。大多數(shù)評估R0C曲線的技術(shù)有問題，其中診斷是基于單一測量(例如抗體滴定度)。技術(shù)是基于待鑒別的兩組內(nèi)測量的分布的評估，和平滑變化的決定闕值。—旦計算出判別函數(shù)值，即可獲得所有的統(tǒng)計學(xué)工具?；谧兓年I值和固定的判別函數(shù)值的決定過程可由對先驗(yàn)概率的影響的討論(見上)所驅(qū)動。我們考慮隨機(jī)變量X，其代表判別函數(shù)值的數(shù)值，和闕值c，使得觀測到的低于c的X值被分類為陰性，而觀測到的大于c的X被分類為陽性?，F(xiàn)在我們定義敏感性和選擇性作為如下的c的函數(shù)敏感性(c)-一i^力f"W，.選擇性(c)-廣其中fl(X)是對于正常個體的X的概率密度函數(shù)，f2(X)是對于受影響個體的X的概率密度函數(shù)。然后R0C的評估剩下評估陰性和陽性個體(fl(X)和f2(X)，分別地)的判別函數(shù)值的分布的問題。為此過程使用兩種方法—種方法基于X的經(jīng)驗(yàn)分布函數(shù)，其產(chǎn)生原始R0C曲線。這種方法具有以下缺點(diǎn)其是階躍函數(shù)，每當(dāng)c的數(shù)值越過數(shù)據(jù)中實(shí)際呈現(xiàn)的數(shù)值的時候就變化。39—種方法使用每個組的值的分布的核密度評估，具有Lloyd方法所選擇的帶寬。核密度方法產(chǎn)生ROC的平滑評估，但不依賴于常態(tài)的假定。使用交叉驗(yàn)證獲得該分析中使用的判別函數(shù)值的數(shù)值。即，不是使用以所有的數(shù)據(jù)從判別分析獲得的判別函數(shù)值，而是通過丟棄該觀測，擬合判別函數(shù)，然后計算被丟棄的觀測的判別函數(shù)值，獲得每個觀測的分值。該過程可能是更保守性的，產(chǎn)生更"誠實(shí)"的ROC的評估。還研究了品種的個體基因之間的差異，以及高產(chǎn)率品種和低產(chǎn)率品種之間的總體差異的分析。構(gòu)建了線性模型以比較低產(chǎn)率和高產(chǎn)率小麥品種之間的基因表達(dá)。將經(jīng)驗(yàn)Bayes程序[4]應(yīng)用于該模型，計算每個基因的差異表達(dá)的p值。使用兩個程序?yàn)槎鄠€比較調(diào)整P值。使用Holm方法[2]提供I型誤差率判斷族(FamilyWiseType1ErrorRate)的強(qiáng)烈控制。此外，使用Benjamini和Hochberg的方法[6]控制假發(fā)現(xiàn)率(FalseDiscoveryRate,FDR)。兩個程序均為保守性的，但是Holm程序比FDR程序更加保守。控制FWER的優(yōu)點(diǎn)是任何被鑒定為差異表達(dá)的基因均極有可能是這樣，但是缺點(diǎn)是容易忽略差異性表達(dá)的基因。還鑒定了分離的基因，對于這樣的基因來說，一個產(chǎn)率類型的所有數(shù)值均高于另一個產(chǎn)率類型的所有數(shù)值。對分離的基因的數(shù)目進(jìn)行計數(shù)，在組的隨機(jī)排列(低/高產(chǎn)率)的標(biāo)記下計算該數(shù)目的分布。如果觀察到的分離的基因的數(shù)目處于排列分布的極端，則數(shù)據(jù)提供分離的基因的統(tǒng)計學(xué)顯著數(shù)目的證據(jù)。題圖8顯示了繪于前兩個主要部分的空間的品種。在第一個主要部分中低產(chǎn)率和高產(chǎn)率品種均沒有分離。但是，在第二個主要部分有一些分離。在圖9、10和11中分別顯示了基于單一連接算法、平均連接算法和完全連接算法的聚類樹狀圖。這些樹狀圖中沒有一個顯示出品種因產(chǎn)率的任何成簇。在圖12中包括基于一個、兩個、三個、四個、五個和六個主要部分的R0C曲線。當(dāng)包括至少三個主要部分時，獲得了最佳的敏感性和選擇性和曲線下的最大面積。這表明低產(chǎn)率和高產(chǎn)率品種的差異由大數(shù)量的基因中的小變化構(gòu)成而不是由小數(shù)量的基因中的大變化構(gòu)成?？偟膩碚f，基于3個或6個主要部分，最佳敏感性和選擇性均為0.8。還使用了支持向量機(jī)方法對小麥品種進(jìn)行了分類，但是這種分析的結(jié)果不如R0C曲線給出的結(jié)果。從使用線性模型的數(shù)據(jù)的分析中，基于Holm和FDR校正檢測到一個統(tǒng)計學(xué)上顯著的基因-Ta.28688.1.Al_at。^Ji^^按照如下所述進(jìn)行了14dpa基因的分析和鑒定。使用目前接受的AffymetrixGeneChip陣列的程序分析來自陣列的數(shù)據(jù)(RMA-robustmulti-arrayaverage(Irizarry等人2003))。將探針?biāo)綌?shù)據(jù)進(jìn)行背景校正，在陣列之間標(biāo)準(zhǔn)化，從探針數(shù)據(jù)總結(jié)總基因水平數(shù)據(jù)(表達(dá)值)。檢測探針數(shù)據(jù)在實(shí)驗(yàn)中的，AffymetrixGeneCWp⑧陣列間的相等分布(箱須圖、核密度評估)和來自每個芯片的數(shù)據(jù)與所有的芯片中位數(shù)(MA圖)比較以檢測樣品間任何雜交行為的異常。然后在從每個表達(dá)的基因經(jīng)log2轉(zhuǎn)化的數(shù)值上進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)(t-檢驗(yàn))，將p值通過乘以所測的基因數(shù)目進(jìn)行調(diào)整(Holm校正)。我們確定發(fā)現(xiàn)1，014個基因在低面粉產(chǎn)率和高面粉產(chǎn)率組之間分離地表達(dá)(在基因表達(dá)中沒有重疊，圖12A)。一個基因，我們稱為"14dpa基因"，似乎在高制粉產(chǎn)率品種中下調(diào)。以校正P值為0.04所鑒定的基因?qū)?yīng)于affy探針(表7)，其被設(shè)計為在靶標(biāo)Ta.28688.1.Al_at上(圖13B)。對于基因Ta.28688來說，在高制粉產(chǎn)率品種中與低制粉產(chǎn)率品種間從Affymetrix陣列獲得的"表達(dá)值"有12.8倍的差異。皿低產(chǎn)率和高產(chǎn)率小麥品種的基因表達(dá)的差異由大量基因中的小差異構(gòu)成而不是由小量基因中的大差異構(gòu)成。在保守性調(diào)整p值后，只有一個基因Ta.28688.1.Al_at，在低產(chǎn)率和高產(chǎn)率品種間可以檢測到統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異。實(shí)施例3測定兩個地點(diǎn)小麥品種的面粉產(chǎn)率以進(jìn)行使用開花30天后所產(chǎn)種子的樣品的DNA微陣列的基因表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)的比較試驗(yàn)中種植的200個品種的小麥中，154個品種提供足夠的種子材料使得能夠進(jìn)行小規(guī)模制粉試驗(yàn)，這提供了Narrabri地點(diǎn)和Biloela的97個品種的面粉產(chǎn)率的數(shù)據(jù)。挑選了71個被分類為"硬小麥"的品種進(jìn)行潛在包括于微陣列基因表達(dá)分析研究的分析。從兩個地點(diǎn)提供了55個品種的面粉產(chǎn)率數(shù)據(jù)。面粉產(chǎn)率測定的分布顯示于圖15。兩個地點(diǎn)的小麥品種的面粉產(chǎn)率是相似的，地點(diǎn)間相關(guān)系數(shù)為r=0.59。在圖16中顯示了比較兩個地點(diǎn)的產(chǎn)率的散點(diǎn)圖。發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)間面粉產(chǎn)率的差異(表4)是統(tǒng)計學(xué)顯著的，如基因型(品種)間的面粉產(chǎn)率差異那樣重要(表5)。但是沒有發(fā)現(xiàn)這兩個因素之間有顯著性相關(guān)(圖5)。從最高產(chǎn)率小麥品種和最低產(chǎn)率小麥品種中，從開花后30天所產(chǎn)種子樣品中提取RNA進(jìn)行基因表達(dá)分析。選擇了IO個小麥品種，其具有足夠質(zhì)量和數(shù)量的RNA，來自面粉產(chǎn)率分布的極端。在兩個實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)的來自這些品種的產(chǎn)率顯示于表6。兩類小麥(高-H，低-U的平均面粉產(chǎn)率的95%置信區(qū)間表明兩個類別在其面粉產(chǎn)率性質(zhì)中是廣泛分離的，因此可能對于此特性在遺傳學(xué)上是非常不同的(圖17)。實(shí)施例4低產(chǎn)率和高產(chǎn)率小麥品種的開花后30天的表達(dá)差異的統(tǒng)計學(xué)分析簡介本發(fā)明人使用Affymetrix小麥芯片研究了小麥種子中的基因表達(dá)。本報告提供了這些研究的統(tǒng)計學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)計為進(jìn)行具有低面粉產(chǎn)率和高面粉產(chǎn)率的小麥品種之間基因表達(dá)的比較?？梢垣@得10個品種的Affymetrix表達(dá)數(shù)據(jù)，5個為低面粉產(chǎn)率，5個為高面粉產(chǎn)率。該實(shí)驗(yàn)延續(xù)較早的實(shí)驗(yàn)，較早的實(shí)驗(yàn)使用來自不同時間點(diǎn)的小麥種子。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果大體上與較早實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是相似的。對數(shù)據(jù)的質(zhì)量評價表明來自每個芯片的數(shù)據(jù)均適合于分析。進(jìn)行了一系列分析以研究低產(chǎn)率和高產(chǎn)率品種之間的表達(dá)的總體差異，以及個體基因之間的差異。有證據(jù)表明在大量基因中存在小差異。本研究的結(jié)果也與較早研究的結(jié)果結(jié)合。當(dāng)研究相結(jié)合時，幾乎沒有證據(jù)表明在低產(chǎn)率和高產(chǎn)率品種之間存在差異性表達(dá)。數(shù)據(jù)篩選高質(zhì)量的數(shù)據(jù)對于從基因表達(dá)研究中獲得有意義的結(jié)果是至關(guān)重要的。RNA的質(zhì)量和芯片及其處理的質(zhì)量均影響最終的數(shù)據(jù)。可以通過RNAIntegrityNumber(RIN)[5]評價RNA的質(zhì)量。RIN是由Agilentbioanalyzersystem(其設(shè)計為檢測RNA的降解)產(chǎn)生的分值。分值介于l(代表嚴(yán)重降解)至10(代表沒有降解)。對于此實(shí)驗(yàn)，RIN介于7.4至8.4之間，其為平均至平均以上的結(jié)果。還可以檢測所處理的表達(dá)值的分布的質(zhì)量。使用RMA算法[3]處理芯片后，使用表達(dá)的核密度評估(見圖18)和箱須圖(見圖19)顯示分布。雖然RMA迫使探針?biāo)奖磉_(dá)評估在每個芯片上具有相同分布，但是對于基因水平表達(dá)評估不是這樣。然而，基因水平表達(dá)評估的分布對每個芯片來說是非常相似的。沒有芯片具有非典型性分布。還使用了MA圖檢測表達(dá)值(見圖20和21)。給定芯片的MA圖是對所有芯片上中位數(shù)的每個基因與芯片表達(dá)和所有芯片上中位數(shù)之間差異的比較。理想地，MA圖的每個點(diǎn)在水平線附近從O點(diǎn)開始平均分散。雖然對于芯片4和5有一些非線性的證據(jù)，但是總體上講MA圖表明數(shù)據(jù)適合于分析。數(shù)據(jù)分析^￡第一個分析設(shè)計為檢測數(shù)據(jù)中的任何結(jié)構(gòu)。將品種繪圖于它們的前兩個主要部分的空間，進(jìn)行聚類分析(clusteranalysis)。聚類算法的選擇容易對聚類分析的結(jié)果產(chǎn)生偏差。為了避免偏差，將聚類計算三次，每次使用不同的算法。構(gòu)建基于單一連接算法的聚類樹狀圖、平均連接算法的聚類樹狀圖和完全連接算法的聚類樹狀圖。通過受試者工作特征(ROC)曲線總結(jié)以基因表達(dá)數(shù)據(jù)區(qū)分低面粉產(chǎn)率和高面粉產(chǎn)率品種的能力。這些曲線顯示了正確鑒定高產(chǎn)率樣品為高產(chǎn)率和正確鑒定低產(chǎn)率樣品為低產(chǎn)率之間的關(guān)系。我們將使用術(shù)語敏感性和選擇性來描述這種關(guān)系。通常，這樣術(shù)語適用于陽性樣品和陰性樣品，即對于某疾病來說，樣品要么是陽性，要么是陰性。為了本報告的目的，我們將把高產(chǎn)率品種作為"陽性"，將低產(chǎn)率品種作為"陰性"。因此，敏感性是通過基因表達(dá)數(shù)據(jù)將高產(chǎn)率品種正確鑒定為高產(chǎn)率的百分率；選擇性是通過基因表達(dá)數(shù)據(jù)將低產(chǎn)率品種正確鑒定為低產(chǎn)率的百分率。ROC曲線在生物統(tǒng)計文獻(xiàn)中受到廣泛重視。大多數(shù)評估R0C曲線的技術(shù)有問題，其中診斷是基于單一測量(例如抗體滴度)。技術(shù)是基于待區(qū)分的兩組之內(nèi)測量的分布的評估，和平滑變化的決定闕值。—旦計算出判別函數(shù)值，即可獲得所有的統(tǒng)計學(xué)工具。基于變化的闕值和固定的判別函數(shù)值的決定過程可由對先驗(yàn)概率的效應(yīng)的討論(見上)所驅(qū)動。我們考慮隨機(jī)變量X，其代表判別函數(shù)值的數(shù)值，和闕值c，使得觀測到的低于c的X值被分類為陰性，而觀測到的大于c的X被分類為陽性?，F(xiàn)在我們定義敏感性和選擇性作為如下的c的函數(shù)敏感性(<:)=i—f/2(A')dX3選擇性(c)-/其中fl(X)是對于正常個體的X的概率密度函數(shù)，f2(X)是對于受影響個體的X的概率密度函數(shù)。然后ROC的評估剩下評估陰性和陽性個體(fl(X)和f2(X)，分別地)的判別函數(shù)值的分布的問題。為此過程使用兩種方法—種方法基于X的經(jīng)驗(yàn)分布函數(shù)，其產(chǎn)生原始ROC曲線。這種方法具有以下缺點(diǎn)42其是階躍函數(shù)，每當(dāng)c的數(shù)值越過數(shù)據(jù)中實(shí)際呈現(xiàn)的數(shù)值的時候就變化。—種方法使用每個組的值的分布的核密度評估，具有Lloyd方法所選擇的帶寬。核密度方法產(chǎn)生ROC的平滑評估，但不依賴于常態(tài)的假定。使用交叉驗(yàn)證獲得該分析中使用的判別函數(shù)值的數(shù)值。即，不是使用以所有的數(shù)據(jù)的判別分析獲得的判別函數(shù)值，而是通過丟棄該觀測，擬合判別函數(shù)，然后計算被丟棄的觀測的判別函數(shù)值，獲得每個觀測的數(shù)值。該過程可能是更保守的，產(chǎn)生更"誠實(shí)"的ROC的評估。還研究了品種的個體基因之間的差異，以及高產(chǎn)率品種和低產(chǎn)率品種之間的總體差異的分析。構(gòu)建了線性模型以比較低產(chǎn)率和高產(chǎn)率小麥品種之間的基因表達(dá)。將經(jīng)驗(yàn)Bayes程序[4]應(yīng)用于該模型，計算每個基因的差異表達(dá)的p值。使用兩個程序?yàn)槎鄠€比較調(diào)整P值。使用Holm方法[2]提供I型誤差率判斷族(FamilyWiseType1ErrorRate)的強(qiáng)烈控制。此外，使用Benjamini和Hochberg的方法[6]控制假發(fā)現(xiàn)率(FalseDiscoveryRate,FDR)。兩個程序均為保守性的，但是Holm程序比FDR程序更加保守?？刂艶WER的優(yōu)點(diǎn)是任何被鑒定為差異表達(dá)的基因均高度可能是這樣，但是其缺點(diǎn)是容易忽略差異性表達(dá)的基因。構(gòu)建了第二個線性模型，其包括來自第一個實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。按照最初的線性模型，使用FDR和Holm程序調(diào)整p值。還鑒定了分離的基因，對于這樣的基因來說，一個產(chǎn)率類型的所有數(shù)值均高于另一個產(chǎn)率類型的所有數(shù)值。將通過第一和第二實(shí)驗(yàn)鑒定的分離的基因的組相比較，進(jìn)行Fisher檢驗(yàn)以測試獨(dú)立性。題圖22顯示了繪于前兩個主要部分的空間的品種。在第一個或第二個主要部分中低產(chǎn)率和高產(chǎn)率品種之間沒有分離。注意到在第一個主要部分上品種4和品種5彼此有顯著不同。這可以表明這兩個品種與其它的品種之間的差異表達(dá)或可能是質(zhì)量問題(按照這些品種的MA圖的非線性)。在圖23、24和25中分別顯示了基于單一連接算法、平均連接算法和完全連接算法的聚類樹狀圖。這些樹狀圖中沒有一個顯示出品種因產(chǎn)率的任何成簇。按照主要部分的圖，存在品種4和5與其它品種之間差異的證據(jù)。在圖26中包括基于一個、兩個、三個、四個、五個和六個主要部分的R0C曲線。這些R0C曲線中沒有一個指示在低產(chǎn)率和高產(chǎn)率小麥品種之間存在實(shí)質(zhì)性差異?；?個主要部分的最佳敏感性和選擇性均為0.8。還使用了支持向量機(jī)方法對小麥品種進(jìn)行了分類，但是這種分析的結(jié)果不如R0C曲線給出的結(jié)果。從使用線性模型的數(shù)據(jù)的分析中，基于Holm和FDR校正檢測到一個統(tǒng)計學(xué)上顯著的基因-Ta.11743.1.Al_at。總的來說使用從高制粉和低制粉品種開花后(dpa)30天所產(chǎn)種子樣品中提取的RNA樣品得到的探針詢問AffymetrixGeneChip⑧小麥基因組陣列，鑒定了表達(dá)圖譜中顯示顯著性差異的候選基因?；趯?0個小麥品種面粉產(chǎn)率的測定，基于其面粉產(chǎn)率的測定選擇了10個小麥品種；5個為高面粉產(chǎn)率，5個為低面粉產(chǎn)率。收獲30dpa時植物所產(chǎn)的小麥種子，提取RNA并純化，使用Bioanalyser檢測產(chǎn)率和質(zhì)量。然后標(biāo)記RNA并與AffymetrixGeneChip⑧小43麥基因組陣列雜交，分析數(shù)據(jù)以鑒定高制粉組和低制粉組小麥品種之間顯示出轉(zhuǎn)錄水平的顯著性差異的依排列順序的基因。按照如下進(jìn)行30dpa基因的分析和鑒定。使用目前接受的AffymetrixGeneChip陣列的程序分析來自陣列的數(shù)據(jù)(薩-robustmulti-arrayaverage(Irizarry等人2003))。將探針?biāo)綌?shù)據(jù)進(jìn)行背景校正，在陣列之間標(biāo)準(zhǔn)化，從探針數(shù)據(jù)總結(jié)總基因水平數(shù)據(jù)(表達(dá)值)。檢測探針數(shù)據(jù)在實(shí)驗(yàn)中的AffymetrixGeneChip⑧陣列中的相等分布(箱須圖、核密度評估)和來自每個芯片的數(shù)據(jù)與所有的芯片中位數(shù)(MA圖)比較以檢測樣品間任何雜交行為的異常。然后在從每個表達(dá)的基因經(jīng)log2轉(zhuǎn)化的數(shù)值上進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)(t-檢驗(yàn))，將p值通過乘以所測的基因數(shù)目進(jìn)行調(diào)整(Holm校正)。我們確定發(fā)現(xiàn)1，038個基因在低面粉產(chǎn)率和高面粉產(chǎn)率組之間分離地表達(dá)(在基因表達(dá)中沒有重疊，圖12B)。一個基因，我們稱為"30dpa基因"，似乎在高制粉產(chǎn)率品種中下調(diào)。發(fā)現(xiàn)30dpa基因在校正的0.05水平具有顯著的差異表達(dá)水平。Holm校正方法調(diào)整是由于以下事實(shí)測定了大量基因的表達(dá)水平的差異。以校正的P值為0.04所鑒定的基因?qū)?yīng)于affy探針(表8)，其被設(shè)計為在耙標(biāo)Ta.11743.1.Al_at上(圖29B)。對于30dpa基因來說，基因表達(dá)值的倍數(shù)差異為在低產(chǎn)率品種中比高產(chǎn)率品種中高3.1倍。結(jié)論1.低產(chǎn)率和高產(chǎn)率小麥品種間的基因表達(dá)的差異由大量基因中的小差異構(gòu)成而不是由小量基因中的大差異構(gòu)成。2.在保守性調(diào)整p值后，只有一個基因在低產(chǎn)率和高產(chǎn)率品種中可以檢測到統(tǒng)計學(xué)上的顯著的差異。實(shí)施例514dpa基因的鑒定從NetAffx網(wǎng)站htt?！╳ww.affymetrix.com/analysis/netaffx/index.affx獲得對應(yīng)于存在于AffymetrixGeneChip小麥基因組陣列中的靶標(biāo)"Ta.28688.1.Al_at"的候選基因的序列(圖29)。"Ta.28688.1.Al—at"還顯示與來自水稻的轉(zhuǎn)錄基因座NP_001060360.1(其對應(yīng)于水稻基因組上的基因座NC_008400)的相似性，以及與來自擬南芥的轉(zhuǎn)錄基因座AT5G46030假設(shè)蛋白(其對應(yīng)于擬南芥基因組上的基因座NC_003076)具有相似性。但是，耙標(biāo)"Ta.28688.1.Al—at"顯示與來自酵母的有注解的轉(zhuǎn)錄基因座(轉(zhuǎn)錄基因座NPJ)12762.1)的相似性，所述酵母轉(zhuǎn)錄基因座對應(yīng)于基因座NCJ)01143且被認(rèn)為是含有保守性鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄延伸因子并參與活性轉(zhuǎn)錄區(qū)域中正確染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的保持。耙標(biāo)"Ta.28688.1.Al_at"是來自小麥的EST。耙標(biāo)"Ta.28688.1.Al—at"與來自小麥的其它不完全EST成簇，在圖30中顯示了所有這些EST的比對。使用EST比對產(chǎn)生了共有序列(圖31)，使用該共有序列預(yù)測開放閱讀框，如圖32所示。將圖8所示的開放閱讀框與對應(yīng)于NC_008400的水稻基因組DNA序列比對以預(yù)測可能的內(nèi)含子外顯子界線，發(fā)現(xiàn)含有4個外顯子(圖33)。如圖31所示的共有序列用于設(shè)計PCR引物(primerl4dpaFl和primerl4dpaRl)以擴(kuò)增小麥中的14dpa基因(圖34)。使用引物primerl4dpaFl和primerl4dpaRl聯(lián)合來自品種Bobwhite的小麥基因組DNA通過PCR成功擴(kuò)增了14dpa基因序列(圖35)。將PCR片段純化并連接進(jìn)入pGEM3zf(Promega，USA)TA載體，然后克隆進(jìn)入JM109細(xì)胞(Promega，USA)。使用M13F+primerl4dpaFl(GelA)和M13F+primerl4dpaFl(GelB)通過PCR選擇并篩選了12個白色菌落(C1至C12)，以鑒定重組菌落(圖36)，在12個菌落中，被鑒定為重組子的6個菌落Cl、C2、C3、C4、C5、C6、C7和C9進(jìn)行PCR(M13F和M13R)以擴(kuò)增14dpa基因，將擴(kuò)增的產(chǎn)物(圖37)進(jìn)行測序。實(shí)施例6分離的小麥14dpa基因序列對應(yīng)于克隆C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7和C9的序列顯示于圖38。這些基因序列的比對顯示出高度同源性，雖然觀察到一些差異(圖39)。這些序列是基因序列，因此具有內(nèi)含子和外顯子序列。為了鑒定內(nèi)含子序列，將對應(yīng)于C2的序列與EST至靶標(biāo)"Ta.28688.1.Al_at"的共有序列(圖31)和14dpa基因的預(yù)測編碼序列(圖32)進(jìn)行比對，產(chǎn)生的比對顯示于圖40?；趫D40的數(shù)據(jù)，記錄了所有克隆(Cl、C2、C3、C4、C5、C6、C7和C9)的內(nèi)含子-外顯子界線，刪除了外顯子序列以產(chǎn)生相應(yīng)的編碼序列。當(dāng)比對所有克隆(C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7和C9)的編碼序列時顯示出具有一些差異的高度同源性(圖41)。翻譯并比對編碼序列以顯示完美匹配(圖42)，這表明對應(yīng)的編碼序列中的核苷酸差異(圖41)全部位于搖擺位置(wobble-position)，蛋白序列處于高度進(jìn)化壓力下以保持其序列。實(shí)施例7小麥14dpa基因序列和其它植物編碼序列的比較將對應(yīng)于克隆2的14dpa基因的分離的小麥基因組序列在NCBI入口進(jìn)行非冗余DNA禾口EST的BLAST分析:http:〃blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。在圖43中顯示了具有前4個hit比對的nr-DNABLAST分析的結(jié)果。在圖44中顯示了具有前4個hit比對的ESTBLAST分析的結(jié)果。類似地，將對應(yīng)于分離的小麥基因組序列克隆2的14dpa基因(克隆2)的編碼序列(僅外顯子)在NCBI入口進(jìn)行非冗余DNA(nr-DNA)和EST的BLAST分析http:〃blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。在圖45中顯示了具有前4個hit比對的nr-DNABLAST分析的結(jié)果。在圖46中顯示了具有前4個hit比對的ESTBLAST分析的結(jié)果。類似地，將克隆2的14dpa編碼序列的翻譯的氨基酸序列進(jìn)行非冗余蛋白序列的BLASTp分析。在圖47中顯示了具有前4個hit比對的nr-protein序列的結(jié)果。實(shí)施例830dpa基因的鑒定從NetAffx網(wǎng)站(htt。〃www.affymetrix.com/analysis/netaffx/index.affx)獲得對應(yīng)于存在于AffymetrixGeneChip⑧小麥基因組陣列上的靶標(biāo)"Ta.11743.1.Al_at"的候選基因的序列(圖48)。靶標(biāo)"Ta.11743.1.Al—at"未顯示與任何nr-DNA的相似性，但是與基因座BQ170720的一個EST完美匹配(圖49)，這并不令人驚訝，因?yàn)樵揈ST含有耙標(biāo)"Ta.11743.1.Al_at"(圖50)。但是，靶標(biāo)"Ta.11743.1.Al_at"顯示與水稻基因組上的轉(zhuǎn)錄的基因座NP_001061696.1的弱相似性。耙標(biāo)"Ta.11743.1.Al—at"與轉(zhuǎn)錄的基因座NP_001061696.1的弱相似性(27bp中有13個)對應(yīng)于水稻基因組上的基因座NCJ)08401。該區(qū)域顯示出三個開放閱讀框；一個在有意義鏈，兩個在互補(bǔ)鏈。對應(yīng)于有意義鏈的開放閱讀框橫越lbp至1163bp和2125bp至2296bp，這表明存在一個內(nèi)含子(圖51)。該開放閱讀框被標(biāo)記為含有"細(xì)胞周期蛋白樣的F-盒結(jié)構(gòu)域"的蛋白，其中F-盒結(jié)構(gòu)域是約50個氨基酸長，通常發(fā)現(xiàn)存在于眾多蛋白的N末端半部分。通常發(fā)現(xiàn)的與F-盒結(jié)構(gòu)域相關(guān)的兩個基序是富亮氨酸重復(fù)和WD重復(fù)。F-盒結(jié)構(gòu)域有調(diào)節(jié)眾多環(huán)境中蛋白-蛋白相互作用的作用，例如在多聚泛素化、轉(zhuǎn)錄延伸、著絲粒結(jié)合和翻譯抑制中。ESTBQ170720(其含有耙標(biāo)"Ta.11743.l.Al_at")的5'端顯示出與另一個小麥EST(基因座ID為BF482223)的3'末端在17bp上的完美匹配。ESTBF482223繼而顯示出與另一個小麥EST(基因座ID為CF133508)的強(qiáng)烈相似性(圖52A和B)。"Ta.11743.1.Al_at"，BQ170720,BF482223和CF133508間的比對是重疊群EST-CFBFBQ，如圖53顯示的共有序列。圖53中顯示的共有序列用于設(shè)計PCR引物(primerday30GMRl和primerday30GMR2)以從小麥擴(kuò)增30dpa基因片段(圖54)。這些引物設(shè)計為分離對應(yīng)于基因序列的剩余部分白勺±坊1，歹廿。UniversalGenomeWalkerkit(Clonetech，USA)iftfi"i坊f，歹[J白勺》胃。分離小麥基因組DNA并以EcoRV，DraI，PvuII和StuI限制性分別進(jìn)行消化以產(chǎn)生平末端片段。然后將試劑盒供應(yīng)商提供的接頭連接至這些平的DNA片段的兩端以獲得對應(yīng)的基因組步移(GenomeWalker)庫，即EcoRV-庫、DraI庫、PvuII-庫和StuI-庫。使用引物Primer30GWRl(CGTTCTTCCCTTGAAACAAAACCTCGAGAGAG)和API(TAATACGACTCACTATAGGGC)按照生產(chǎn)商推薦進(jìn)行第一PCR。將第一PCR稀釋至55倍，取出其中的2iU，使用引物Primer30GWR2(CAGGCCAGAACAGCGCAAGATGCTTAGAGAGG)和AP2(ACTATAGGGCACGCGTGGT)按照生產(chǎn)商的推薦進(jìn)行第二PCR(巢式PCR)。以DraI和StuI庫擴(kuò)增兩個PCR片段的每個，標(biāo)記為DraFl和DraF2片段以及StuFl和StuF2片段。DraFl和DraF2片段的大小分別為約0.7Kb和2.6Kb，StuFl和StuF2片段的大小分別為約0.8Kb和2.6Kb(圖55)。將Dra和Stu片段連接入pGEMT-easy(—個TA克隆載體(Promega，USA))，并克隆入JM109細(xì)胞(Promega，USA)。通過PCR使用引物Primer30GWR2(CAGGCCAGAACAGCGCAAGATGCTTAGAGAGG)和M13reverse(CACACCGGAAACAGCTATGACC)篩選出幾個白色菌落以鑒定重組菌落。選擇每個對應(yīng)于DraFl和StuFl的8個菌落，以及每個對應(yīng)于DraF2和StuF2的4個菌落以制備質(zhì)粒和測序。發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于DraFl(Cl至C8)和DraF2(Cl、C3、C4)的克隆的序列彼此顯示高度同源性(圖57)。所有的30dpaDraFl片段顯示出與重疊群EST-CFBFBQ(CF133508，BF482223和BQ170720)和靶標(biāo)Ta.11743.1序列的高度同源性(圖58)。相似地，所有的30dpaDraF2片段顯示出與重疊群EST-CFBFBQ(CF133508，BF482223和BQ170720)和耙標(biāo)Ta.11743.1序列的高度同源性(圖59)。下一個步驟是確定DraF2片段上的開放閱讀框(ORF)。為了確定這個，我們首先確定重疊群EST-BFBQ(BF482223和BQ170720)和重疊群EST-CFBFBQ(CF133508，BF482223和BQ170720)上的ORF。在重疊群EST-BFBQ上發(fā)現(xiàn)兩個ORF:0RF-1/BFBQ和0RF-2/BFBQ(圖60)。0RF-1/BFBQ比0RF-2/BFBQ長，但是在重疊處彼此顯示出完全的同源性，因?yàn)樗鼈儽舜说淖x碼框一致并顯示出良好同源性(圖61)。重疊群EST-CFBFBQ在有意義方向共顯示6個ORF:0RF-1/CFBFBQ，0RF-2/CFBFBQ，0RF-3/CFBFBQ，0RF-4/CFBFBQ，0RF-5/CFBFBQ和0RF-6/CFBFBQ(圖62)。發(fā)現(xiàn)0RF-1/CFBFBQ與0RF-2/CFBFBQ，0RF-3/CFBFBQ，0RF-4/CFBFBQ和0RF-6/CFBFBQ的讀碼框一致并比它們長。0RF-1/CFBFBQ和0RF-5/CFBFBQ的氨基酸序列和比對顯示于圖63，兩個0RF顯示出部分同源，因?yàn)樗鼈儽舜说淖x碼框不一致。重疊群EST-BFBQ和重疊群EST-CFBFBQ上的ORF的比對表明0RF-1/CFBFBQ，0RF-1/BFBQ和0RF-2/46BFBQ顯示出高度同源性，0RF-1/CFBFBQ是較長的蛋白序列，與其它兩個EST的讀碼框一致(圖64)。下一個步驟是確定三個DraF2片段上的ORF，將這些彼此比較并與重疊群EST-CFBFBQ上的ORF比較。DraF2Cl片段顯示出一些ORF(圖65)，其中0RF-l/DraF2Cl是最長的，其與重疊群EST-BFBQ上的ORF(0RF-1/BFBQ和0RF-2/BFBQ)以及重疊群EST-CFBFBQ上的0RF(0RF-5.CFBFBQ)在讀碼框上一致。0RFl-DraF2Cl的氨基酸序列顯示于圖66，其與來自重疊群EST-BFBQ的ORF-1/BFBQ和來自重疊群EST-CFBFBQ的ORF-1/CFBFBQ之間的同源性水平顯示于圖67。如圖67所示，0RFl-DraF2Cl和0RF-1/CFBFBQ之間的同源性對于整個全長來說是顯著性的，除了序列的第一部分之外。我們感覺基因的第一部分的同源性的缺乏是由于在重疊群EST-CFBFBQ存在兩個插入/刪除(indel)(在圖68中顯示為加框區(qū)域)，其可能是ESTCF133508中的測序錯誤，不存在于DraF2Cl克隆中，因?yàn)槲覀儥z查了我們的序列的測序錯誤。一旦從EST-CFBFBQ中除去這兩個插入/刪除，序列上和長度上與0RFl/DraF2Cl匹配的ORF位于重疊群EST-CFBFBQ(圖69)。該結(jié)果證明位于30dpa基因片段DraF2Cl上的0RFl/DraF2Cl最可能是真實(shí)的ORF。0RFl/DraF2Cl也位于30dpaDraF2C3片段上(圖70)。但是，在30dpaDraF2C4片段上存在0RFl/DraF2Cl但是是截短的形式，這是由于基因的突變(在T被A取代的位置)，從而導(dǎo)致產(chǎn)生終止密碼子(見陰影區(qū)域)(圖71)。實(shí)施例9分離的小麥30dpa基因序列分離30dpa基因序列為兩個片段DraFl和DraF2片段。DraFl片段的變體的序列DraF2-Cl，DraF2-C2，DraF2-C3，DraF2-C4，DraF2-C5，DraF2-C7和DraF2-C10顯示于圖72。30dpa-DraF2片段的變體的序列DraF2Cl，DraF2C3和DraF2C4顯示于圖73。實(shí)施例10小麥30dpa基因序列和其它植物編碼序列間的比較將對應(yīng)于DraF2Cl的30dpa基因的分離的小麥基因組序列在NCBI入口進(jìn)行非冗余DNA(nr-DNA)和EST的BLAST分析http:〃blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。在圖74中顯示了具有前幾個hit比對的nr-DNABLAST分析的結(jié)果。在圖75中顯示了具有前4個hit比對的ESTBLAST分析的結(jié)果，。類似地，將位于DraF2Cl片段的0RF_l/DraF2Cl的翻譯的氨基酸序列在NCBI入口進(jìn)行非冗余DNA(nr-DNA)和EST的BLAST分析:http:〃blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。在圖76中顯示了具有前幾個hit比對的nr-DNABLAST分析的結(jié)果。實(shí)施例11通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化構(gòu)建遺傳修飾的小麥構(gòu)建體構(gòu)建體pEvec202Nnos將用于制備所有的用于小麥轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大壽和水稻的轉(zhuǎn)化將通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的胚胎發(fā)生的愈傷組織的轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小麥。在無菌條件下從小麥種子中分離胚胎。經(jīng)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)在MGL培養(yǎng)基中生長過夜。為了接種，將使用Eppendorf移液管將農(nóng)桿菌培養(yǎng)物滴在不成熟胚胎的剪切端。在24t:于黑暗處孵育培養(yǎng)板約2天后，將胚胎轉(zhuǎn)移至含有補(bǔ)充了潮霉素和特美汀的BCI-匿培養(yǎng)基的培養(yǎng)板。在黑暗中孵育約6周后(每兩周轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中)，產(chǎn)生的胚胎發(fā)生的愈傷組織將被轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充了潮霉素的FHG培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)移至土壤前，將再生的芽轉(zhuǎn)移至BCI培養(yǎng)基以生根。使用裝有觀察熒光的附件的復(fù)式顯微鏡進(jìn)行GFP發(fā)出的綠色熒光的檢測。為了確定轉(zhuǎn)基因的存在，使用純化的基因組DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的PCR篩選。通過PCR篩選所有的潮霉素抗性植物中的gfp-nos序列(例如根據(jù)Furtado，A.和Henry，R.J.(2006)，PlantBiotechnologyJournal2:421—434)?；旧县S艮據(jù)建立的程序(Maniatis等人1982)進(jìn)行southern-blot雜交。以HindIII消化來自非轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化植物的基因組DNA，在瓊脂糖凝膠上分辨之前檢驗(yàn)消化情況，然后轉(zhuǎn)移至尼龍膜上(Nylon-hybond，Roche，Germany)。使用對應(yīng)于gfp基因的Dig標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，然后使用Dig檢測系統(tǒng)(Roche，Germany)進(jìn)行信號的生成。實(shí)施例12通過顆粒轟擊構(gòu)建遺傳修飾的小麥肝碰絲白術(shù)封本在一個方法中，將使用質(zhì)粒pAGN用作克隆載體以產(chǎn)生啟動子構(gòu)建體，所述質(zhì)粒pAGN為基于pGEM3Zf+的載體(PromegaCorporation,MI，USA)且含有綠色熒光蛋白的合成變體(gfpS65T)(Patterson等人1997)和nos終止子序列。promoter,gfp.nos構(gòu)建體將被制備作為啟動子與gfpS65T(以下稱為gfp基因)的轉(zhuǎn)錄融合體。質(zhì)粒pAGN也將用作克隆載體以產(chǎn)生基因構(gòu)建體pUbi.gfp.nos，pCaMV35S.gfp.nos，其含有玉米泛素，花椰菜花葉病毒35SRNA啟動子，與gfp基因和nos終止子序列相連。質(zhì)粒pDP687將用作對照以檢測成功的顆粒轟擊和細(xì)胞的存活性，其含有控制兩個基因的組成性表達(dá)的花椰菜花葉病毒35SRNA啟動子(CaMV35S)，所述兩個基因每個編碼調(diào)節(jié)紅色花青素色素合成的轉(zhuǎn)錄因子。按照如Furtado，A.禾口Henry，R.J.(2006)，PlantBiotechnologyJournal2:421-434的描述進(jìn)行組織制備、顆粒轟擊和孵育條件。在另一個方法中，基因構(gòu)建體將被制備用于通過顆粒轟擊未成熟小麥胚胎而進(jìn)行的小麥遺傳轉(zhuǎn)化?；驑?gòu)建體將被制備以含有感興趣的基因和構(gòu)建體上的可選擇性標(biāo)記基因(策略1)，或者感興趣的基因和可選擇性標(biāo)記基因位于單獨(dú)的基因構(gòu)建體上(策略2)。策略1載體pAHC25(Christensen和Quail)含有兩個基因盒一個含有玉米泛素啟動子控制下的GUS(UidA)基因，另一個含有另一個泛素啟動子控制下的bar基因(圖77)。GUS基因?qū)⒈磺谐?0dpa基因或14dpa基因?qū)⒍ㄏ蚩寺∫垣@得質(zhì)粒pUbi30dpagene/14dpagene.nos-Ubi.bar.nos。通過測序檢查重組構(gòu)建體的序列正確性。使用商售試劑盒(Promega，USA)制備構(gòu)建體的Maxi-pr印，質(zhì)粒將以約1yg/iU的最終構(gòu)建體制備以用于通過顆粒轟擊進(jìn)行小麥的遺傳轉(zhuǎn)化。策略2在這個策略中將使用兩個載體，目的是以兩個基因構(gòu)建體的等量混合物進(jìn)行共同轟擊。a)含有可選擇性標(biāo)記基因的基因構(gòu)建體構(gòu)建體pAHC25(圖77)用于產(chǎn)生pUbi.bar.nos，如下所述。以限制性酶HindIII消化質(zhì)粒PAHC25以產(chǎn)生兩個片段，其中一個含有與質(zhì)粒的剩余部分相連的基因盒Ubi.bar.nos。含有bar基因的片段將重連以獲得基因構(gòu)建體pUbi.bar.nos。b)含有感興趣基因的基因構(gòu)建體質(zhì)粒pGEM3zf(Promega，USA)將用作基礎(chǔ)載體以產(chǎn)生載體pUbi.gfp.nos。質(zhì)粒pUbi.gfp.nos(圖78)含有來自玉米的泛素啟動子，綠色熒光蛋白基因和nos終止子序列。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)以30dpa-基因或14dpa基因替換gfp基因以產(chǎn)生載體pUbi.30dpagene/14dpagene.nos。實(shí)施例13小麥(TriticumaestivumL)的生物彈射擊轉(zhuǎn)化如實(shí)施例12所示的基因構(gòu)建體將用于通過未成熟的合子胚胎的顆粒轟擊進(jìn)行小麥的遺傳轉(zhuǎn)化。以下示意性概述轉(zhuǎn)化程序?？梢园凑找韵滤静襟E概括的進(jìn)行轉(zhuǎn)化程序。培養(yǎng)供體植物材料小麥植物(TriticumaestivumL.)將生長于暖房以獲得未成熟胚胎。BobwhiteMPB26(126'Bobwhite"accession)的種子用于產(chǎn)生具有以下培養(yǎng)規(guī)程的小麥植物播種將5粒種子播種于罐子(上直徑為27cm，體積為8.1L)，罐中含有盆栽植料(pottingmix)即l:1:l等份的泥煤苔、珍珠巖和蛭石(含有白云石以調(diào)節(jié)pH)、micromax痕量元素和奧綠肥(0smocote)精確體積的營養(yǎng)物。播種至6周于24t:，70X以下的濕度和12小時的日長培養(yǎng)秧苗和植物(這些條件可以不嚴(yán)格控制)。6周至收獲于24t:，70X以下的濕度和14小時的日長培養(yǎng)植物以剌激開花。這個規(guī)程確保在2周內(nèi)開花。收獲外植體組織方法1.鑒定14至18DPA時具有發(fā)育中的小麥穎果的供體小麥植物。2.從頭部和任何與其相連的植物材料如穎苞、花藥等上將發(fā)育中的穎果取下。3.使用次氯酸鈉(有0.8%的氯)將未成熟的穎果滅菌20分鐘。4.將表面無菌的未成熟的穎果轉(zhuǎn)移至無菌的皮氏培養(yǎng)板(10cmX1.4cmht)。從小麥穎果分離未成熟胚胎方法1.從無菌的皮氏培養(yǎng)板中取出一小部分的滅菌的未成熟胚胎。2.使用體視顯微鏡，切除胚胎軸，而未成熟胚胎在穎果中。3.將16至25個胚胎以胚鱗(scutellum)—側(cè)朝上(遠(yuǎn)離培養(yǎng)基)置于分別為4X4或5X5陣列的皮氏培養(yǎng)板(含有固體滲透培養(yǎng)基(E3-麥芽糖培養(yǎng)基))的中心。4.將層流(laminarflow)中含有胚胎的培養(yǎng)板孵育2個小時，然后在1個小時內(nèi)進(jìn)行轟擊。使用PDS-1000槍前的準(zhǔn)備步驟簡述，以下詳述1.選擇/調(diào)整破裂圓盤保留蓋(rupturediskretainingc即)與微攜帶子送出組(microcarrierlaunchassembly)之間的間隙距離的轟擊參數(shù)。將停止屏支座(sto卯ingscreensu卯ort)置于微攜帶子送出組的固定式巢(fixednest)內(nèi)的正確位置。確保停止屏與外植體材料之間的距離是6cm。2.檢查氦供應(yīng)(超過需要的破裂圓盤保留蓋爆炸壓力200PSI)。如果使用900PSI的破裂圓盤保留蓋，則工作氦氣壓應(yīng)調(diào)整至IIOOPSI。3.將以下擦凈/滅菌設(shè)備破裂圓盤保留蓋，微攜帶子送出組；消耗物巨攜帶子/巨攜帶子支架4.無菌微攜帶子(金顆粒，直徑為0.6m)。5.在實(shí)驗(yàn)?zāi)翘鞂⒕哂蠨NA的微攜帶子包被并裝載至無菌的巨攜帶子/巨攜帶子支架。*碰白勺頓將獲得直徑不同的微米級別的金顆粒。雖然使用了600至1200微米的顆粒尺寸，但是以下程序使用0.6iim的金顆粒(Finer和McMullen，1990;Finer等人1992)。方法1.在1.5ml的印pendorf管中將40mg金(直徑為0.6ym)重懸于1ml95%的乙醇。2.在室溫進(jìn)行20分鐘孵育。3.在桌面離心機(jī)中將混合物于12，OOOrpm離心1至2分鐘。4.丟棄上清液，在500ill的無菌蒸餾水中洗滌3次。5.最終，將鴇或金顆粒懸于1ml的無菌蒸餾水中以獲得無菌gold-pr印。6.將50ill的均勻分散的無菌gold-pr印轉(zhuǎn)移至印pendorf管中，將這些儲存于4t:備用，可存儲4周。金-質(zhì)?；旌衔锏闹苽浞椒?.從印pendorf管中取出50y1(2mg)的無菌Gold-pr印(40mg/ml)，確保顆粒均勻分散為精細(xì)的分散物。2.然后加入5ia質(zhì)粒DNA(li!g/iU)。如果要使用1個以上質(zhì)粒(用于共同轟擊)，則取出5ill每個質(zhì)粒(1yg/Pi)。3.在加入CaCl2溶液前，確保通過手指混合均勻分散金_DNA溶液。4.立即加入25ii1CaCl2(2.5M)，以手指混合以使Ca-DNA-包被的金顆粒均勻分散。5.然后加入101亞精胺(0.1M)，再次以手指混合。6.將管在冰上孵育5分鐘，然后丟棄50ii1上清液。7.然后加入lmllOOX的乙醇，置于冰上1分鐘。8.于12，OOORPM離心2分鐘，棄上清。9.加入lmll00X的乙醇，以手指混合，然后于12，OOOrpm離心2分鐘，除去盡可能多的上清。加入110ii1100%的乙醇，以手指混合以重懸顆粒。將混合物置于冰上，可在1或2個小時內(nèi)用于轟擊。該制備物在llOiU內(nèi)包含2mg的金。每個轟擊使用10iU(182iig金顆粒)以上的Ca-金-DNA懸浮液。組織培養(yǎng)和詵擇以獲得轉(zhuǎn)某因棺物方法該程序基于使用bar基因作為選擇性標(biāo)記基因并使用除草劑草胺膦(PPT)。1.在轟擊后18至24小時，將經(jīng)轟擊的未成熟胚胎轉(zhuǎn)移至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(E3call-Ind)。將培養(yǎng)板密封并于25。C黑暗中培養(yǎng)14天。2.每3天監(jiān)視培養(yǎng)板以檢查污染情況和未污染材料的恢復(fù)。3.如果以GUS構(gòu)建體(Ubi.gus.nos)轟擊的話，取轟擊_控制_培養(yǎng)板進(jìn)行GUS組織化學(xué)檢驗(yàn)(GUS染色)；如果以GFP構(gòu)建體(Ubi.gfp.nos)轟擊的話，則進(jìn)行GFP表達(dá)檢驗(yàn)。4.將增殖的愈傷組織從實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至含有5mg/1PPT+250mg/1頭孢噻肟(Cefotaxim)的選擇性培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板密封并于25。C光照(16h)和黑暗(8h)循環(huán)中孵育直至體細(xì)胞胚胎顯示出綠色跡象。5.在直射光下將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至25t:光照(16h)和黑暗(8h)循環(huán)以增強(qiáng)體細(xì)胞胚胎萌至芽和根。每io天將組織轉(zhuǎn)移至新鮮的培養(yǎng)基。6.將PPT抗性的芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(RMed，含有5mg/lPPT和250mg/l頭孢噻肟)。確保以盡可能少的愈傷組織取芽。這樣的話每個培養(yǎng)板將有一個芽。以Parafilm密封培養(yǎng)板并于25t:光照(16h)和黑暗(8h)循環(huán)中孵育直至可以看到良好生根。每10天將培養(yǎng)物進(jìn)行亞培養(yǎng)。7.將那些具有良好生根的芽轉(zhuǎn)移至組織培養(yǎng)器皿，其含有生根培養(yǎng)基(RMed，含有5mg/lPPT和250mg/l頭孢噻月虧)。于25。C光照(16h)和黑暗(8h)循環(huán)中孵育以進(jìn)一步生根。8.將有良好生根的植物轉(zhuǎn)移至含有盆栽植料的小罐中，并轉(zhuǎn)移至暖房，定期澆水從而增加存活。貫穿本說明書，目標(biāo)是描述本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式而不將本發(fā)明限制到任何一個具體實(shí)施方式或特征的特異性集合。因此本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，對于本公開，在示例的特別的具體實(shí)施方式中可以進(jìn)行各種修飾和改變而不背離本發(fā)明的范圍。所有本文提到的計算機(jī)程序、算法、專利和科學(xué)文獻(xiàn)并入本文作為參考。參考文獻(xiàn)W.S.Cleveland.Robustlocallyweightedregressionandsmoothingscatterplots.J.Amer.Statist.Assoc,74:829-836，1979.S.Holm.Asimplesequentiallyrejectivemultipletestprocedure.ScandinavianjournalofStatistics,6:65_70，1979.R.Irizarry，B.Hobbs，F(xiàn).Collin，Y.Beazer-Barclay，K.Antonellis，U.Scherf，andT.Speed.Exploration,normalization,andsummariesofhighdensityoligonucleotidearrayprobeleveldata.Biostatistics，4:249264,2003.I.lxi皿stedtandT.Speed.Replicatedmicroarraydata.StatisticsSinica，pages31-46，2002.0.Mueller,S.Lightfoot，andA.Schroeder.RNAintegritynumber(RIN)-standardizationofRNAqualitycontrol.TechnicalReport5989-1165EN,AgilentTechnologies,May2004.Y.BenjaminiandY.Hochberg.Controllingthefalsediscoveryrate:apracticalandpowerfulapproach至multipletesting.JournaloftheRoyalStatisticalSocietySeries表1:對于14dpa樣品生長于兩個地點(diǎn)-Biloela(B)和Narrabri(N)的小麥品種的平均面粉產(chǎn)率<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>表2:地點(diǎn)、基因型(品種)和其相互作用對14dpa樣品小麥面粉產(chǎn)率的效應(yīng)的顯著性的測試。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>表3:基于在兩個地點(diǎn)的80個品種的14dpa樣品的產(chǎn)率測定而選作低或高產(chǎn)率品種的10個小麥品種的面粉產(chǎn)率。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>表8設(shè)計為耙向Ta.11743的AffyMatrix探針探針名稱核苷酸序列>Ta.11743.1.Al——at承探針1CTTGTTTCTATAGCAGAGGTGTCTA>Ta.11743.1.Al——at承探針2GTCTAAGTAAGTGTCTATGCTCAAC>Ta.11743.1.Al——at承探針3TTGGCTTATTTTTTACGCACCTCTC>Ta.11743.1.Al——at承探針4TTTACGCACCTCTCTAAGCATCTTG>Ta.11743.1.Al——at承探針5ATCTTGCGCTGTTCTGGCCTGATGT>Ta.11743.1.Al——at承探針6GGCCTGATGTGTTTGCTTGTCTGTC>Ta.11743.1.Al——at承探針7TTGCTTGTCTGTCTACTCATGCCTA>Ta.11743.1.Al——at承探針8GTCTACTCATGCCTACCTATTTAAT>Ta.11743.1.Al——at承探針9AATGGATCATTGAACCTCTCTCGAG>Ta.11743.1.Al——at承探針10CTCTCTCGAGGTTTTGTTTCAAGGG>Ta.11743.1.Al——at承探針11GTATTGACACTTAAACGATGCTTTG權(quán)利要求一種選擇具有改善的制粉能力的谷物或產(chǎn)生谷物的植物的方法，所述方法包括以下步驟確定谷物或產(chǎn)生谷物的植物中存在的與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸的相對數(shù)量，從而確定谷物或產(chǎn)生谷物的植物是否具有改善的制粉能力的傾向。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸編碼包含選自以下氨基酸序列的多肽SEQIDN0:49或SEQIDN0:190，或其片段。3.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸包含選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:26或SEQIDNO:285，或其片段。4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中片段包含選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:162，SEQIDNO:163，SEQIDNO:164，SEQIDNO:165，SEQIDNO:166，SEQIDNO:167，SEQIDNO:168或SEQIDNO:169。5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸是與選自SEQIDN0:26或SEQIDNO:285的核苷酸序列具有至少70%的序列同一性的變體。6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中變體包含選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:41，SEQIDNO:42，SEQIDNO:43，SEQIDNO:44，SEQIDNO:45，SEQIDNO:46，SEQIDNO:47，SEQIDNO:48或SEQIDNO:194。7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中谷物或產(chǎn)生谷物的植物具有包含至少胚乳和糠層的谷粒。8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中谷物或產(chǎn)生谷物的植物是小麥。9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中，當(dāng)與參考樣品相比時，谷物或產(chǎn)生谷物的植物具有減少的相對數(shù)量的與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸。10.—種確定谷物或產(chǎn)生谷物的植物是否在遺傳上傾向于改善的制粉能力的方法，所述方法包括以下步驟檢測與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸，從而確定谷物或產(chǎn)生谷物的植物是否在遺傳上傾向于改善的制粉能力。11.根據(jù)權(quán)利要求io所述方法，其中與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸包含選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:26或SEQIDNO:285，或其片段。12.根據(jù)權(quán)利要求10至11任一項(xiàng)所述的方法，其中片段包含選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:162，SEQIDNO:163，SEQIDNO:164，SEQIDNO:165，SEQIDNO:166，SEQIDNO:167，SEQIDNO:168或SEQIDNO:169。13.根據(jù)權(quán)利要求10至12任一項(xiàng)所述的方法，其中與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸是與選自SEQIDN0:26或SEQIDNO:285的核苷酸序列具有至少70%的序列同一性的變體。14.根據(jù)權(quán)利要求10至13任一項(xiàng)所述的方法，其中變體包含選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:41，SEQIDNO:42，SEQIDNO:43，SEQIDNO:44，SEQIDNO:45，SEQIDNO:46，SEQIDNO:47，SEQIDNO:48或SEQIDNO:194。15.根據(jù)權(quán)利要求10至14任一項(xiàng)所述的方法，其中谷物或產(chǎn)生谷物的植物具有包含至少胚乳和糠層的谷粒。16.根據(jù)權(quán)利要求10至15任一項(xiàng)所述的方法，其中谷物或產(chǎn)生谷物的植物是小麥。17.—種研磨面粉的方法，所述方法包括以下步驟根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的方法選擇可研磨的谷物或可研磨的產(chǎn)生谷物的植物以便于后續(xù)將所述谷物研磨產(chǎn)生面粉。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中可研磨的谷物或可研磨的產(chǎn)生谷物的植物具有包含至少胚乳和糠層的谷粒。19.根據(jù)權(quán)利要求17至18任一項(xiàng)所述的方法，其中可研磨的谷物或可研磨的產(chǎn)生谷物的植物是小麥。20.—種鑒定與谷物或產(chǎn)生谷物的植物的改善的制粉能力相關(guān)的一個或多個植物遺傳基因座的方法，所述方法包括以下步驟確定一個或多個植物遺傳基因座是否與面粉研磨產(chǎn)率相關(guān)或相聯(lián)。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中一個或多個植物遺傳基因座是選自SEQIDNO:15或SEQIDNO:159的核苷酸序列的多態(tài)性。22.—種生產(chǎn)具有改善的制粉能力的產(chǎn)生谷物的植物的方法，所述方法包括以下步驟選擇性調(diào)節(jié)與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因，從而與所述基因沒有被選擇性調(diào)節(jié)的產(chǎn)生谷物的植物相比，與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的所述基因的相對數(shù)量較低或較高。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中選擇性調(diào)節(jié)是與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因的下調(diào)。24.根據(jù)權(quán)利要求22至23任一項(xiàng)所述的方法，其中基因編碼包含選自以下的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:49或SEQIDNO:190，或其片段。25.根據(jù)權(quán)利要求22至24任一項(xiàng)所述的方法，其中基因包含選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:26或SEQIDNO:285。26.根據(jù)權(quán)利要求22至25任一項(xiàng)所述的方法，其中基因包含核苷酸序列，該核苷酸序列是與SEQIDNO:26或SEQIDNO:285具有至少70%的序列同一性的變體。27.根據(jù)權(quán)利要求22至26任一項(xiàng)所述的方法，其中基因包含核苷酸序列，該核苷酸序列是選自以下的變體:SEQIDNO:41，SEQIDNO:42，SEQIDNO:43，SEQIDNO:44，SEQIDNO:45，SEQIDNO:46，SEQIDNO:47，SEQIDNO:48或SEQIDNO:194。28.根據(jù)權(quán)利要求22至27任一項(xiàng)所述的方法，谷物或產(chǎn)生谷物的植物具有包含至少胚乳和糠層的谷粒。29.根據(jù)權(quán)利要求22至28任一項(xiàng)所述的方法，其中谷物或產(chǎn)生谷物的植物是小麥。30.根據(jù)權(quán)利要求22至29任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的具有改善的制粉能力的產(chǎn)生谷物的植物。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的產(chǎn)生谷物的植物，其為小麥。32.—種研磨面粉的方法，所述方法包括以下步驟從根據(jù)權(quán)利要求22至29任一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)的產(chǎn)生谷物的植物獲得谷物以用于后續(xù)研磨產(chǎn)生面粉。33.—種用于改善谷物制粉能力的遺傳構(gòu)建體，其包括與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的遺傳構(gòu)建體，其中與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸編碼選自以下的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:49或SEQIDNO:190，或其片段。35.根據(jù)權(quán)利要求33至34任一項(xiàng)所述的遺傳構(gòu)建體，其中與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸包含選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:26或SEQIDNO:285，或其片段。36.根據(jù)權(quán)利要求33至35任一項(xiàng)所述的遺傳構(gòu)建體，其中片段包含選自以下的核苷酸序列SEQIDN0:162，SEQIDN0:163，SEQIDN0:164，SEQIDN0:165，SEQIDNO:166，SEQIDNO:167，SEQIDNO:168或SEQIDNO:169。37.根據(jù)權(quán)利要求33至36任一項(xiàng)所述的遺傳構(gòu)建體，其中與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸是與選自SEQIDNO:26或SEQIDNO:285的核苷酸序列具有至少70%的序列同一性的變體。38.根據(jù)權(quán)利要求33至37任一項(xiàng)所述的遺傳構(gòu)建體，其中變體包含選自以下的核苷酸序歹lj:SEQIDNO:41，SEQIDNO:42，SEQIDNO:43，SEQIDNO:44，SEQIDNO:45，SEQIDNO:46，SEQIDNO:47，SEQIDNO:48或SEQIDNO:194。39.—種具有改善的制粉能力的產(chǎn)生谷物的植物，其中與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因被選擇性調(diào)節(jié)從而與那些基因沒有被調(diào)節(jié)的植物相比，具有與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因的較低相對數(shù)量。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的產(chǎn)生谷物的植物，其中與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因編碼選自以下的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:49或SEQIDN0:190，或其片段。41.根據(jù)權(quán)利要求39至40任一項(xiàng)所述的產(chǎn)生谷物的植物，其中與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因包含選自以下的核苷酸序列SEQIDNO:26或SEQIDNO:285，或其片段。42.根據(jù)權(quán)利要求39至41任一項(xiàng)所述的產(chǎn)生谷物的植物，其中與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的基因包含核苷酸序列，該核苷酸序列是與SEQIDN0:26或SEQIDN0:285具有至少70%的序列同一性的變體。43.根據(jù)權(quán)利要求39至43任一項(xiàng)所述的產(chǎn)生谷物的植物，其中變體包含選自以下的核苷酸序列:SEQIDNO:41，SEQIDNO:42，SEQIDNO:43，SEQIDNO:44，SEQIDNO:45，SEQIDNO:46，SEQIDNO:47，SEQIDNO:48或SEQIDNO:194。全文摘要在此提供一種選擇具有改善的制粉能力的谷物或產(chǎn)生谷物的植物的方法，所述方法通過確定與改善的制粉能力相關(guān)或相聯(lián)的分離的核酸的相對數(shù)量以確定谷物或產(chǎn)生谷物的植物是否具有改善的制粉能力。通常，谷物或產(chǎn)生谷物的植物是小麥。還提供了遺傳構(gòu)建體、診斷改善的制粉能力的方法和生產(chǎn)具有改善的制粉能力的谷物或產(chǎn)生谷物的植物的方法。文檔編號C12N15/29GK101765365SQ200880024908公開日2010年6月30日申請日期2008年7月17日優(yōu)先權(quán)日2007年7月17日發(fā)明者P·C·本多克,R·J·亨利申請人:谷物食品Crc有限公司