與C-Met相關(guān)的生物物質(zhì)的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及可能與VEGF和/或EGFR組合地與c-Met相關(guān)的生物物質(zhì)，并且更特別地涉及多肽、編碼所述多肽的核酸；涉及用于制備所述多肽的方法；涉及表達(dá)或能夠表達(dá)所述多肽的宿主細(xì)胞；涉及包含所述多肽的組合物，特別是藥物組合物，其用于預(yù)防、治療或診斷目的。本發(fā)明還描述并提供了用于評(píng)估患者對(duì)c-Met治療的響應(yīng)性的方法和試劑盒。
【專(zhuān)利說(shuō)明】與C-Met相關(guān)的生物物質(zhì)
發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及與C-Met相關(guān)的生物物質(zhì)，并且更特別地涉及多肽、編碼所述多肽的核酸；涉及用于制備所述多肽的方法；涉及表達(dá)或能夠表達(dá)所述多肽的宿主細(xì)胞；涉及包含所述多肽的組合物，特別是藥物組合物，其用于預(yù)防、治療或診斷目的。本發(fā)明還描述并提供了用于評(píng)估患者對(duì)c-Met治療的響應(yīng)性的方法和試劑盒。
[0002] 發(fā)明背景
[0003]受體酪氨酸激酶(RTKs)是重要細(xì)胞過(guò)程(諸如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、新血管生成和組織修復(fù))的關(guān)鍵調(diào)控劑。除了其在正常生理學(xué)中的重要性之外，某些RTKs的異常表達(dá)已經(jīng)參與多種類(lèi)型的癌癥的形成和進(jìn)展。這些RTKs已經(jīng)成為用于癌癥治療的有希望的藥物靶標(biāo)。
[0004]RTK c-Met是針對(duì)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子((HGF)，也稱(chēng)為分散因子)的細(xì)胞表面受體(Cooper 等，Nature(自然)1984; 311:29-33; Bottaro 等，Science(科學(xué))1991; 251:802 - 4)。HGF是90kD的多結(jié)構(gòu)域糖蛋白，其與纖維蛋白酶原絲氨酸蛋白酶家族的各成員高度相關(guān)。其由間充質(zhì)細(xì)胞分泌為單鏈的無(wú)活性的多肽，并且由多種蛋白酶裂解為其活性的α/β異源二聚體細(xì)胞外形式(Birchmeier等，Nat Rev Mol Cell Biol (自然分子細(xì)胞生物學(xué)綜述)2003;4:915-25)。α鏈NH2-末端部分包含高親和力c_Met受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但是β鏈?zhǔn)桥cc-Met受體相互作用用于受體激活所必需的(Matsumoto&Nakamura Cancer Sci(Matsumoto&Nakamura癌癥科學(xué))2003; 94:321 - 7)。c_Met受體,與其配體相似,是由細(xì)胞外α和β鏈組成的二硫鍵連接的異源二聚體。α鏈異源二聚體化到β鏈的氨基端部分，形成細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中的主要配體結(jié)合位點(diǎn)。c-Met的羧基端尾部包含酪氨酸Υ1349和Υ1356，其在被磷酸化時(shí)作為細(xì)胞內(nèi)銜接蛋白(intracellular adaptor proteins)的?？课稽c(diǎn)，引起下游信號(hào)傳導(dǎo)(Ponzetto等，Mol Cell Biol (分子細(xì)胞生物學(xué))1993; 13:4600 - 8)。c-Met/HGF途徑是侵襲性生長(zhǎng)程序(invasive growth program)的主要驅(qū)動(dòng)者,所述侵襲性生長(zhǎng)程序是一系列的事件，包括細(xì)胞增殖、分散、遷移、存活和組織侵襲。在正常情況下，侵襲性生長(zhǎng)程序?qū)τ谂咛グl(fā)生過(guò)程中的正確的器官形成和成年人內(nèi)穩(wěn)態(tài)是重要的。重要的是，其還參與腫瘤發(fā)生、腫瘤血管形成和轉(zhuǎn)移。
[0005]使用防止配體/受體結(jié)合的HGF-或c-Met-特異性抗體，通過(guò)抑制增殖并且增強(qiáng)細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制和腫瘤消退。三種單克隆抗體的組合在體外和體內(nèi)表現(xiàn)出針對(duì)HGF的高中和活性，并且表現(xiàn)出針對(duì)自分泌HGF-Met-表達(dá)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植物腫瘤的顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制(Cao等，Proc Natl Acad Sci USA (美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))2001; 98:7443 - 8)。使用單克隆抗體的策略允許針對(duì)HGF/c_Met的排他性的特異性，與小分子激酶抑制劑相比相對(duì)長(zhǎng)的半衰期，以及激發(fā)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的宿主免疫應(yīng)答的潛力(Liu等，Expert Opin Investig Drugs (藥物研究的專(zhuān)家觀(guān)點(diǎn))2008; 17:997 - 1011)。
[0006]AMG102 (Amgen, Inc.)是完全的人IgG2單克隆抗體，其選擇性結(jié)合并且中和HGF，由此防止其與c-Met結(jié)合以及隨后的活化(Kakkar等，Pharm Res (藥物研究)2007; 24:1910-8 ;Burgess 等，Cancer Res (癌癥研究)2006; 66:1721 - 9)。[0007]單臂5D5 (0A5D5, MetMAb; Genentech)是來(lái)源于激動(dòng)性單克隆抗體的人源化的、單價(jià)的、拮抗性抗-c-Met抗體(Nguyen等，Cancer Gene Ther (癌癥基因治療)2003;10:840 - 9)。MetMAb以高親和力結(jié)合c_Met，并且保持在具有c-Met的細(xì)胞表面上，防止HGF結(jié)合和隨后的c-Met磷酸化以及下游信號(hào)傳導(dǎo)活動(dòng)和細(xì)胞反應(yīng)。
[0008]不幸的是，使用大的單克隆和/或極大改造的抗體還帶有高的制備成本，并且與其他策略相比，導(dǎo)致不是最理想的腫瘤透過(guò)性。
[0009]根據(jù)目前的生物醫(yī)學(xué)理解，耐藥性由負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵入的復(fù)雜的蛋白網(wǎng)絡(luò)引起。目前，還沒(méi)有關(guān)于生長(zhǎng)因子受體依賴(lài)性信號(hào)傳導(dǎo)途徑的系統(tǒng)性描述。事實(shí)上，c-Met異常性推動(dòng)癌癥發(fā)展的分子途徑是極端復(fù)雜的，并且涉及多種相互連接的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，包括信號(hào)傳導(dǎo)分子(如Ras和PI3K)、受體(如EGFR)和生長(zhǎng)因子(如VEGF)。
[0010]已經(jīng)描述了靶向血清白蛋白來(lái)延長(zhǎng)生物分子(諸如例如免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域)的半衰期，例如，在W02008/028977，W004/041865和W008/122787中，和未公布的2011年6月23日提交的US61/500, 464。
[0011]發(fā)明概沭
[0012]本領(lǐng)域需要更有效的c-Met (或者本文中還稱(chēng)為c-MET)拮抗劑，與小分子藥物相t匕，其具有優(yōu)越的選擇性和特異性，調(diào)節(jié)半衰期的能力，和/或優(yōu)越的腫瘤靶向性，即，比常規(guī)抗體小，并且具有基于白蛋白的腫瘤靶向策略。此外，本領(lǐng)域還需要診斷、預(yù)防和/或治療適用的c-Met拮抗劑，如本文所提供的。
[0013]在研究和治療應(yīng)用中，免疫球蛋白序列，如抗體和來(lái)源于其的抗原結(jié)合片段(例如，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域)用于特異性靶向其各自的抗原。免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域諸如例如VHHs的產(chǎn)生可能包括免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如美洲駝(Llama)，從免疫組織構(gòu)建噬菌體文庫(kù)，選擇結(jié)合噬菌體展示的抗原的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域并針對(duì)需要的特異性篩選所述結(jié)構(gòu)域及其改造的構(gòu)建體(W094/04678)。備選地，通過(guò)直接從首次用于實(shí)驗(yàn)的文庫(kù)或合成的文庫(kù)中選擇結(jié)合噬菌體展示的抗原的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，并且隨后針對(duì)需要的特異性篩選所述結(jié)構(gòu)域及其改造的構(gòu)建體可以產(chǎn)生相似的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，諸如例如，dAbs (Ward 等，Nature (自然)，1989，341:544-6; Holt 等，Trends Biotechnol.(生物技術(shù)趨勢(shì))，2003，21(11):484-490;以及例如，W006/030220, W006/003388和Domantis Ltd.的其他公布的專(zhuān)利申請(qǐng))。
[0014]本發(fā)明涉及特定的多肽，其也稱(chēng)為“本發(fā)明的多肽”或“本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域”或“本發(fā)明的ISVD”，所述多肽包含下述，或者，更優(yōu)選地，基本上由下述組成:
(i)基本上由一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè))免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成的第一結(jié)構(gòu)單元，其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域針對(duì)c-Met,特別是針對(duì)人c-Met ； (ii)任選地基本上由一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè))免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成的第二結(jié)構(gòu)單元，其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域針對(duì)血清白蛋白，特別是針對(duì)人血清白蛋白(并且甚至更優(yōu)選地，其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是Albll或Alb23(如本文定義任選地基本上由一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè))免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域組成的第三和/或第四結(jié)構(gòu)單元，其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域針對(duì)EGFR，特別是針對(duì)人EGFR，和/或針對(duì)VEGF，特別是針對(duì)人VEGF。此外，本發(fā)明還涉及編碼所述多肽的核酸；涉及用于制備所述多肽的方法；涉及表達(dá)或能夠表達(dá)所述多肽的宿主細(xì)胞；涉及包含所述多肽、核酸和/或宿主細(xì)胞的組合物，特別是藥物組合物；并且涉及所述多肽、核酸、宿主細(xì)胞和/或組合物用于預(yù)防、治療或診斷目的的應(yīng)用。本發(fā)明還描述并提供了用于評(píng)估患者對(duì)c-Met治療的響應(yīng)性的方法和試劑盒。本發(fā)明的其他方面、實(shí)施方案、優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用將通過(guò)本文的進(jìn)一步描述而變得清楚。
[0015]如已經(jīng)提及的，在一些具體的而非限制性的方面中(在本文中更詳細(xì)地描述)，本發(fā)明提供:針對(duì)(如本文定義)c-Met并且能夠抑制或阻斷(完全地或部分地，如本文進(jìn)一步所述)配體結(jié)合，且特別是抑制或阻斷(完全地或部分地，如本文進(jìn)一步所述)HGF與c-Met的結(jié)合(如本文進(jìn)一步所述)的氨基酸序列。這些氨基酸序列在本文中還稱(chēng)為“c-Met-阻斷氨基酸序列”或“c-Met-阻斷結(jié)構(gòu)單元”。優(yōu)選地，這些c-Met-阻斷氨基酸序列為ISVD’s (如本文所述)，在這種情形中，其還稱(chēng)為“c-Met-阻斷ISVD’ S”。優(yōu)選地，任意c-Met-阻斷氨基酸序列、c-Met-阻斷結(jié)構(gòu)單元或c-Met-阻斷ISVD’s是這樣的，以使其具有阻斷活性，SP，部分或完全阻斷HGF與c-Met的結(jié)合，這可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)?shù)臏y(cè)定來(lái)確定，諸如，例如，通過(guò)α篩選測(cè)定(Alphascreen assay)或通過(guò)FACS競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定(如本文所述，例如，實(shí)施例2.3.2基于流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的HGF/c-Met競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定)來(lái)確定。優(yōu)選地，阻斷活性通過(guò)實(shí)施例2.3.2所述的FACS競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定來(lái)確定。優(yōu)選地，所述ISVD在A(yíng)549細(xì)胞中具有IC5tl小于600nM，但是優(yōu)選為500nM, 400nM, 300nM, 200nM, IOOnM或者甚至更小的阻斷或競(jìng)爭(zhēng)HGF與c-Met結(jié)合的阻斷活性或競(jìng)爭(zhēng)能力。例如，04E09-樣ISVD在該測(cè)定中具有IC50小于ΙΟΟηΜ，更優(yōu)選地，小于75nM，50nM或者甚至更小，諸如小于20nM或15nM，IOnM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, InM或甚至更優(yōu)選地小于0.75nM或者甚至小于0.5nM的阻斷活性或競(jìng)爭(zhēng)能力。
[0016]例如，33H10-樣ISVD在該測(cè)定中具有IC50小于ΙΟΟηΜ，更優(yōu)選地，小于75nM，50nM或者甚至更小，諸如小于20nM或15nM, IOnM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, InM或者甚至更優(yōu)選地小于0.75nM, 0.5nM, 0.25nM或者甚至小于0.1nM的阻斷活性或競(jìng)爭(zhēng)能力。在一個(gè)具體的而非限制性的方面中，“c-Met-阻斷氨基酸序列”或“c-Met-阻斷結(jié)構(gòu)單元”(中的一些)可以是(并且優(yōu)選也是)這樣的，以使其能夠抑制或阻斷c-Met信號(hào)傳導(dǎo)(例如，參見(jiàn)實(shí)施例2.4-2.6和22)，例如，在用于實(shí)施例2.4的磷酸化測(cè)定，實(shí)施例2.5的增殖測(cè)定和/或?qū)嵤├?.6的趨化性測(cè)定中。優(yōu)選地，任意c-Met-阻斷氨基酸序列，c-Met-阻斷結(jié)構(gòu)單元或c-Met-阻斷ISVD’ s是這樣的，以使其具有阻斷活性，即，部分或完全阻斷或抑制HGF介導(dǎo)的c-Met磷酸化,這可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)?shù)臏y(cè)定來(lái)確定，諸如，例如，通過(guò)任意適當(dāng)?shù)牧姿峄瘻y(cè)定，諸如，例如，如本文所述的HGF-誘導(dǎo)的c-Met磷酸化測(cè)定。優(yōu)選地，通過(guò)實(shí)施例1.6，2.4和22中所述的HGF介導(dǎo)的c-Met磷酸化來(lái)確定對(duì)磷酸化的阻斷活性或抑制能力。優(yōu)選地，所述ISVD在A(yíng)549腫瘤細(xì)胞中具有IC5tl小于600nM,但是優(yōu)選地，500nM，400nM，300nM，200nM, IOOnM或甚至更小的對(duì)配體(例如，HGF)誘導(dǎo)的Tyrl349-磷酸化的c-Met的阻斷活性或抑制能力。例如，04E09-樣ISVD在該測(cè)定中具有IC50小于IOOnM,更優(yōu)選地，小于75nM，50nM或甚至更小，諸如小于40nM或30nM, 25nM, 20nM, 15nM, 14nM, 13nM 或 12nM 或甚至更優(yōu)選地小于 11，10，9，8 或 7nM 的阻斷活性或競(jìng)爭(zhēng)能力。例如，33H10-樣ISVD在該測(cè)定中具有IC50小于IOOnM,更優(yōu)選地，小于75nM, 50nM 或甚至更小，諸如小于 40nM 或 30nM, 25nM, 20nM, 15nM, 14nM, 13nM 或 12nM 或者甚至更優(yōu)選地小于11，10，9，8，7，6，5，4或3nM的阻斷活性或競(jìng)爭(zhēng)能力。
[0017]優(yōu)選地，通過(guò)如實(shí)施例2.5和22中所述的HGF-誘導(dǎo)的增殖測(cè)定來(lái)確定對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)的阻斷活性或抑制能力。優(yōu)選地，所述ISVD具有IC50小于600nM，但是優(yōu)選地，500nM, 400nM, 300nM, 200nM, IOOnM或甚至更小的對(duì)配體(例如，HGF)誘導(dǎo)的BxPC_3細(xì)胞增殖的阻斷活性或抑制能力。例如，04E09-樣ISVD在該測(cè)定中具有IC50小于IOOnM,更優(yōu)選地，小于80nM, 70nM或甚至更小，諸如小于60nM或50nM, 45nM, 40nM, 35nM, 30nM或者甚至更優(yōu)選地小于20nM，諸如15，12，10，8，7，6，5，4，3，或者甚至小于2nM的阻斷活性或競(jìng)爭(zhēng)能力。例如，33H10-樣ISVD在該測(cè)定中具有IC50小于IOOnM,更優(yōu)選地，小于80nM，70nM或甚至更小，諸如小于60nM或50nM, 45nM, 40nM, 35nM, 30nM或者甚至更優(yōu)選地小于20nM,諸如15，12，10，8，7，6，5，4，3，或者甚至小于2nM的的阻斷活性或競(jìng)爭(zhēng)能力。
[0018]優(yōu)選地，通過(guò)實(shí)施例2.6中所述的HGF-依賴(lài)性趨化性測(cè)定來(lái)確定對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)的阻斷活性或抑制能力。優(yōu)選地，所述ISVD具有IC50小于600nM，但是優(yōu)選地，500nM, 400nM, 300nM, 200nM, 150nM或甚至更小的對(duì)配體(例如，HGF)誘導(dǎo)的A549細(xì)胞趨化性的阻斷活性或抑制能力。例如，04E09-樣ISVD在該測(cè)定中具有IC50小于150nM，更優(yōu)選地，小于ΙΟΟηΜ, 90nM, 80nM或甚至更小，諸如小于80nM, 70nM或60nM, 55nM或50nM或甚至更小，諸如小于60nM或50nM, 45nM, 40nM, 35nM, 30nM或者甚至更優(yōu)選地小于20nM,諸如15，12，10，8，7，6，5，4，3，或者甚至小于2nM的阻斷活性或競(jìng)爭(zhēng)能力。[0019]附圖簡(jiǎn)沭
[0020]圖1顯示本發(fā)明的納米抗體抑制HGF-依賴(lài)性c-Met磷酸化。標(biāo)準(zhǔn)化的比率(如實(shí)施例1中標(biāo)題1.6所述)針對(duì)納米抗體或OT5Fab (三角形)的濃度繪圖。標(biāo)記的納米抗體04E09-9GS-Albll(SEQ ID NO: 7)作為封閉的圓形繪圖(封閉的圓形)。所述納米抗體與?5Fab —起評(píng)估，并且在圖中用實(shí)線(xiàn)(SEQ ID NO:7)和虛線(xiàn)(?5Fab)繪制。
[0021]圖2 顯示納米抗體形式04E09-9GS-Albll(SEQ ID NO: 7)和 06C12_9GS_Albll (SEQID NO:9)的激動(dòng)性活性的分析和與OT5mAb和HGF的比較。標(biāo)準(zhǔn)化的比率(如實(shí)施例1中標(biāo)題1.6所述)針對(duì)化合物的濃度繪圖，分析其使c-Met磷酸化的能力。陽(yáng)性對(duì)照HGF用菱形繪制，5D5mAb用封閉的圓形繪制，04E09-9GS-Albll用向上的三角形繪制，并且06C12-9GS-Albll用倒三角性繪制。
[0022]圖3顯示本發(fā)明的納米抗體04E09-9GS-Albll (SEQ ID NO: 7)抑制BxPC3細(xì)胞的HGF-依賴(lài)性的增殖。每個(gè)孔的阻抗值用來(lái)計(jì)算‘標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞指數(shù)’(NCI)，其指示細(xì)胞增殖。在該圖中，在生長(zhǎng)3天后記錄兩種樣品的NCI。所述納米抗體作為封閉的圓形繪制。所述納米抗體與OT5Fab(三角形)一起測(cè)定并且在圖中用虛線(xiàn)繪制。
[0023]圖4顯示c-Met阻斷納米抗體04E09_9GS_Albll抑制A549細(xì)胞的HGF-依賴(lài)性的遷移。測(cè)定讀數(shù)‘相對(duì)熒光單位’指示A549細(xì)胞穿過(guò)膜進(jìn)入到包含HGF的下層區(qū)室中。RFU針對(duì)所選用的納米抗體的濃度繪圖。所述納米抗體用封閉的圓形繪制。所述納米抗體與?5Fab(三角形)一起評(píng)估并且在圖中用實(shí)線(xiàn)(SEQ ID NO:7)和虛線(xiàn)(?5Fab)繪制。
[0024]圖5.在HGF-依賴(lài)性U87MG膠質(zhì)母細(xì)胞瘤異種移植物模型中，A00790035納米抗體治療(10mg/kg;3x/周IP)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。替莫唑胺(Temozolomide)用作陽(yáng)性對(duì)照組中的參比化合物。包括賦形劑組作為陰性對(duì)照組。箭頭表示不同的A00790035給藥。腫瘤體積表示為平均腫瘤體積土SE(mm3)。曲線(xiàn)上部的數(shù)字表示在不同時(shí)間點(diǎn)每組剩余的小鼠數(shù)目。(A00790035 或納米抗體 4E09-9GS-Albll;SEQ ID NO:7)
[0025]圖6.在HGF-依賴(lài)性KP4胰腺異種移植物模型中，A00790035納米抗體治療(IOmg/kg; 3x/周IP)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。吉西他濱(Gemcitabine)用作陽(yáng)性對(duì)照組中的參比化合物。包括賦形劑組作為陰性對(duì)照組。箭頭表示不同的A00790035給藥。腫瘤體積表示為平均腫瘤體積土 SE (mm3)。(A00790035 或納米抗體 4E09-9GS-Albll;SEQ ID N0:7)
[0026]圖7.在用劑量范圍系列的A00790171溫育后對(duì)ANBL-6HGF自分泌人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖的完全抑制。(抗-c-Met納米抗體，A00790171;SEQ ID N0:113;cpm avg,每分鐘計(jì)數(shù)平均數(shù))
[0027]圖8.在用IOnM A00790171溫育后對(duì)INA-6HGF旁分泌人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的HGF-誘導(dǎo)的增殖的完全和特異性的抑制。包括小分子c-Met抑制劑PHA-665752作為陽(yáng)性對(duì)照(40ηΜ) ο (抗-c-Met 納米抗體，A00790171; SEQ ID NO: 113; cpm avg,每分鐘計(jì)數(shù)平均數(shù)；P=顯著性值；N.S.，不顯著)。
[0028]圖9.在用I μ M Α00790171溫育后對(duì)INA-6HGF旁分泌人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的HGF-誘導(dǎo)的遷移的完全和特異性的抑制。包括小分子c-Met抑制劑ΡΗΑ-665752作為陽(yáng)性對(duì)照(ΙΟΟηΜ)。包括促遷移性細(xì)胞因子SDF-1 α作為誘導(dǎo)遷移的陽(yáng)性對(duì)照。(抗-c-Met納米抗體，A00790171;SEQ ID N0:113;NS,不顯著的)。
[0029]圖10.在KP4異種移植物模型中，可溶性c-Met對(duì)納米抗體04E09-9GS-Albll (A00790035, SEQ ID NO: 7)的響應(yīng)。對(duì)于每只動(dòng)物顯示可溶性c-MET水平，對(duì)于兩個(gè)治療組顯示平均值土平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。與賦形劑(PBS，10ml/kg 1.p.)治療的小鼠(5.348ng/ml)相比，在04E09_9GS_Albll納米抗體(NB)治療的小鼠(0.507ng/ml)中，中值可溶性c-MET水平極大減小。
[0030]圖11.在INA-6細(xì)胞中用200ng/ml HGF刺激后，A00790171減少c-Met酪氨酸殘S Tyr1349 (A), Tyrl234/35 (B)和 Tyr1003 (C)的磷酸化。包括 PHA-665752 作為陽(yáng)性對(duì)照(200nM)。細(xì)胞用HGF處理5分鐘，然后將其裂解并加工作為總裂解物進(jìn)行蛋白凝膠電泳。
[0031]圖12.在 INA-6 細(xì)胞中用 150ng/ml HGF 刺激后，A00790171 減少 Akt (A)和 MAPK(B)的磷酸化。細(xì)胞用HGF處理7分鐘，然后將其裂解并加工作為總裂解物進(jìn)行蛋白凝膠電泳。
[0032]圖13.A00790171 (IOOnM)阻斷HGF誘導(dǎo)的INA-6細(xì)胞與纖連蛋白的粘附。在用BCECF-AM (一種熒光染料)預(yù)先溫育后，5X104個(gè)細(xì)胞用或不用細(xì)胞因子HGF (150ng/ml)或SDF-1a (75ng/ml)溫育I小時(shí)。線(xiàn)條表示來(lái)自代表三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的一次實(shí)驗(yàn)的四份樣品的平均數(shù)(+SD)。
[0033]圖14.A00790171 消除 HGF (100ng/ml)對(duì) hMSCs 的 BMP-2-誘導(dǎo)的 ALP-活性和礦化的抑制作用。hMSCs的ALP活性(A)。通過(guò)茜素紅-S (ARS)染色定量(B)或顯現(xiàn)(C)治療21天(5nM A00790171)后的MSCs的礦化。
[0034]發(fā)明描述
[0035]定義
[0036]a)除非另外指明或限定，所用的所有術(shù)語(yǔ)具有它們?cè)诒绢I(lǐng)域內(nèi)的通用意思，其對(duì)于熟練的技術(shù)人員應(yīng)該是清楚的。例如，參考W008/020079第46頁(yè)段落a)中提及的標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)。
[0037]b)除非另外指明，術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域”或"ISVD"用作一般術(shù)語(yǔ)，包括但不限于抗原-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或片段，分別諸如Vffl結(jié)構(gòu)域或Vh或\結(jié)構(gòu)域。術(shù)語(yǔ)抗原結(jié)合分子或抗原結(jié)合蛋白可互換使用，并且還包括術(shù)語(yǔ)納米抗體。所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列(例如，\-序列)，或重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列(例如，Vh-序列)；更具體地，其可以是來(lái)源于常規(guī)四鏈抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列或來(lái)源于重鏈抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。因此，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以是結(jié)構(gòu)域抗體，或適于用作結(jié)構(gòu)域抗體的免疫球蛋白序列，單結(jié)構(gòu)域抗體，或適于用作單結(jié)構(gòu)域抗體的免疫球蛋白序列，"dAbs”，或適于用作dAbs的免疫球蛋白序列，或納米抗體，包括但不限于Vhh序列。本發(fā)明包括不同來(lái)源的免疫球蛋白序列，包括小鼠、大鼠、兔、驢、人和駱駝科動(dòng)物(camelid)免疫球蛋白序列。所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域包括完全人、人源化的、另外序列優(yōu)化或嵌合的免疫球蛋白序列?？梢钥紤]所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)——然而，不限于此——包括四個(gè)構(gòu)架區(qū)或“FR’ s”，其在本領(lǐng)域和本文中分別稱(chēng)為“構(gòu)架區(qū)I”或“FR1” ; “構(gòu)架區(qū)2”或“FR2” ; “構(gòu)架區(qū)3”或“FR3” ;和“構(gòu)架區(qū)4”或“FR4”;所述構(gòu)架區(qū)由三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)或“⑶R’ s”中斷，其在本領(lǐng)域中分別稱(chēng)為“互補(bǔ)決定區(qū)I”或“⑶R1” ； “互補(bǔ)決定區(qū)2”或“⑶R2” ； “互補(bǔ)決定區(qū)3”或“⑶R3”。應(yīng)該注意到術(shù)語(yǔ)納米抗體(Nanobody或Nanobodies)是埃博靈克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)
的注冊(cè)商標(biāo)，并且因此還可以分別稱(chēng)為納米抗體? (Nanobody?或Nanobodies?)。
[0038]c)除非另外指明，術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白序列”，“序列”，“核苷酸序列”和“核酸”如W008/020079第46頁(yè)段落b)中所述。
[0039]d)除非另外指明，所有沒(méi)有具體詳細(xì)描述的方法、步驟、技術(shù)和操作可以以本身已知的方式進(jìn)行 并且已經(jīng)進(jìn)行，這對(duì)于熟練的技術(shù)人員是清楚的。例如，仍舊參考標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)，參考本發(fā)明所提及的公知【背景技術(shù)】以及其中所引用的其他參考文獻(xiàn)；以及例如參考下述綜述:Presta, Adv.Drug Deliv.Rev.(高級(jí)藥物遞送綜述)2006，58 (5-6): 640-56; Levin和 Weiss, Mol.Biosyst.2006, 2 (I):49-57; Irving 等,J.Tmmunol.Methods,(免疫學(xué)方法雜志)2001，248 (1-2)，31-45; Schmitz 等，Placenta, 2000，21 增刊.A, S106-12, Gonzales等，Tumour Biol.(腫瘤生物學(xué))，2005，26 (I)，31-43，其描述了用于蛋白質(zhì)改造的技術(shù)，諸如親和力成熟，和用于提高蛋白如免疫球蛋白的特異性和其他需要的特性的其他技術(shù)。
[0040]e)氨基酸殘基按照標(biāo)準(zhǔn)的三字母或一字母的氨基酸密碼顯示。參考埃博靈克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的題目為 “Immunoglobulin single variable domainsdirected against IL—6R and polypeptides comprising the same for the treatmentof diseases and disorders associated with Il-6mediated signalling(針對(duì) IL-6R 的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和包含其的多肽用于治療與11-6介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的疾病和病癥)”的國(guó)際申請(qǐng)W008/020079第48頁(yè)表A-2。
[0041]f)出于比較兩種或更多種核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之間的“序列同一性”百分?jǐn)?shù)可以如W008/020079 (通過(guò)引用結(jié)合在本文中)第49頁(yè)段落
e)所述進(jìn)行計(jì)算或確定，諸如通過(guò)用[第一核苷酸序列中與第二核苷酸序列中相應(yīng)位置的核苷酸相同的核苷酸數(shù)目]除以[第一核苷酸序列中的核苷酸總數(shù)]并且乘以[100% ]而計(jì)算，其中，與第一核苷酸序列相比，在第二核苷酸序列中核苷酸的每一缺失、插入、取代或添加都視作在單一核苷酸(位置)的差異；或者使用適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)算法或技術(shù)，同樣如W008/020079 (通過(guò)引用結(jié)合在本文中)第49頁(yè)段落e)所述。[0042]g)出于比較兩種或更多種免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或其他氨基酸序列(諸如例如，本發(fā)明的多肽等)的目的，第一氨基酸序列與第二氨基酸序列之間的“序列同一性”百分?jǐn)?shù)(在本文也稱(chēng)為“氨基酸同一性”)可以如W008/020079 (通過(guò)引用結(jié)合在本文中)第49和50頁(yè)段落f)所述進(jìn)行計(jì)算或確定，諸如通過(guò)用[第一氨基酸序列中與第二氨基酸序列中相應(yīng)位置的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基數(shù)目]除以[第一氨基酸序列中的氨基酸殘基總數(shù)]并且乘以[100% ]而計(jì)算，其中，與第一氨基酸序列相比，第二氨基酸序列中氨基酸殘基的每一個(gè)缺失、插入、取代或添加都視作在單一氨基酸殘基(位置)上的差異，即，視作本發(fā)明所定義的“氨基酸差異”;或者使用適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)算法或技術(shù)，同樣如W008/020079(通過(guò)引用結(jié)合在本文中)第49和50頁(yè)段落f)所述。
[0043]此外，在確定兩種免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域之間的序列同一性程度時(shí)，技術(shù)人員可以考慮所謂的“保守”氨基酸取代，如W008/020079第50頁(yè)所述。
[0044]用于本文所述的多肽的任意氨基酸取代也可以是基于Schulz等，Principlesof Protein Structure (蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)原理)，Springer-Verlag, 1978開(kāi)發(fā)的不同物種的同源蛋白之間的氨基酸變異頻率分析，基于Chou和Fasman, Biochemistry (生物化學(xué))13:211, 1974和Adv.Enzymol.(酶學(xué)進(jìn)展)，47:45-149，1978開(kāi)發(fā)的結(jié)構(gòu)形成潛力分析，并且基于 Eisenberg 等,Proc.Natl.Acad Sc1.USA (美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))81:140-144，1984;Kyte&Doolittle; J Molec.Biol.(分子生物學(xué)雜志)157:105-132，1981，和 Goldman 等，Ann.Rev.Biophys.Chem.( 生物物理和化學(xué)年度綜述)15:321-353，1986開(kāi)發(fā)的蛋白質(zhì)疏水性模式的分析，所有這些通過(guò)引用完全結(jié)合在本文中。本文的說(shuō)明書(shū)和上文引用的一般【背景技術(shù)】中給出了關(guān)于納米抗體的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的信息。此外，為了這一目的，例如，Desmyter 等，Nature Structural Biology(自然結(jié)構(gòu)生物學(xué))，卷 3，9，803 (1996) ; Spinelli等，Natural Structural Biology (自然結(jié)構(gòu)生物學(xué))(1996) ; 3，752-757;和 Decanniere等，Structure (結(jié)構(gòu))，卷7，4，361 (1999)給出了來(lái)自美洲馬它的Vhh結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)。關(guān)于在常規(guī)Vh結(jié)構(gòu)域中形成VH/VL界面的一些氨基酸殘基和潛在的駱駝源化取代的進(jìn)一步的信息可見(jiàn)于上文引用的現(xiàn)有技術(shù)。
[0045]h)如果在它們的全長(zhǎng)有100%的序列同一'丨生(如本文所定義),那么認(rèn)為免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和核酸序列“完全相同”。
[0046]i)當(dāng)比較兩個(gè)免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域時(shí)，術(shù)語(yǔ)“氨基酸差異”是指與第二序列相t匕，在第一序列位置上的單個(gè)氨基酸殘基的插入、缺失或取代；應(yīng)該理解兩個(gè)免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以包含I個(gè)、2個(gè)或更多個(gè)這樣的氨基酸差異。
[0047]j)當(dāng)認(rèn)為核苷酸序列或氨基酸序列分別“包括”另一個(gè)核苷酸序列或氨基酸序列，或“基本由”另一個(gè)核苷酸序列或氨基酸序列“組成”時(shí)，這具有在W008/020079第51-52頁(yè)段落i)中給出的意思。
[0048]k)術(shù)語(yǔ)“以基本上分離的形式存在”具有W008/020079第52和53頁(yè)段落j)中關(guān)
于該術(shù)語(yǔ)給出的意思。
[0049]I)術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域”和“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”具有W008/020079第53頁(yè)段落k)中關(guān)于該術(shù)
語(yǔ)給出的意思。
[0050]m)術(shù)語(yǔ)“抗原決定簇”和“表位”，在本文中也可以互換使用，具有W008/020079第53頁(yè)段落I)中關(guān)于該術(shù)語(yǔ)給出的意思。[0051]η)如W008/020079第53頁(yè)段落m)中進(jìn)一步所述，對(duì)于特定的抗原決定簇、表位、抗原或蛋白(或針對(duì)其至少一部分、片段或表位)能夠(特異性)結(jié)合、具有親和力和/或具有特異性的氨基酸序列(諸如抗體、本發(fā)明的多肽或一般是抗原結(jié)合蛋白或多肽或其片段)認(rèn)為是“針對(duì)(against)”或者“針對(duì)(directed against)”所述抗原決定簇、表位、抗原或蛋白。
[0052]ο)術(shù)語(yǔ)“特異性”具有W008/020079第53-56頁(yè)段落η)中關(guān)于該術(shù)語(yǔ)給出的意思；并且如其中提及的，是指特定的抗原-結(jié)合分子或抗原-結(jié)合蛋白(諸如本發(fā)明的多肽)分子可以結(jié)合的許多不同類(lèi)型的抗原或抗原決定簇的數(shù)目。一種抗原-結(jié)合蛋白的特異性可以依據(jù)親和力和/或抗體親抗原性(avidity)而確定，如在W008/020079第53-56頁(yè)中所述(通過(guò)引用結(jié)合在本文中)，其還描述了用于測(cè)量抗原結(jié)合分子(諸如本發(fā)明的多肽)與相關(guān)抗原之間的結(jié)合的一些優(yōu)選的技術(shù)。典型地，抗原-結(jié)合蛋白(諸如本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽)將以10_5-10_12摩爾/升或更小、并且優(yōu)選地10_7-10_12摩爾/升或更小并且更優(yōu)選地10_8-10_12摩爾/升的解離常數(shù)(Kd) (BP,以IO5-1O12升/摩爾或以上、并且優(yōu)選地IO7-1O12升/摩爾或以上、且更優(yōu)選地IO8-1O12升/摩爾的締合常數(shù)(Ka))而結(jié)合它們的抗原。任何大于10_4摩爾/升的Kd值(或任何小于IO4升/摩爾的Ka值)通常認(rèn)為指示非特異性結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明的單價(jià)免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域?qū)⒁孕∮?00nM、優(yōu)選地小于200nM、更優(yōu)選地小于IOnM諸如小于500pM的親和力與理想的抗原結(jié)合?？乖?結(jié)合蛋白與抗原或抗原決定簇的特異性結(jié)合可以以本身已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒ù_定，其包括，例如，斯卡查德分析(Scatchard analysis)和/或競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定，諸如放射性免疫測(cè)定(RIA)、酶免疫測(cè)定(EIA)和夾心式(sandwich)競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定，和本領(lǐng)域本身已知的其不同的變型；以及本文提及的其他技術(shù)。技術(shù)人員應(yīng)該清楚，并且如W008/020079第53-56頁(yè)所述，解離常數(shù)可以是實(shí)際的或表觀(guān)解離常數(shù)。確定解離常數(shù)的方法對(duì)于熟練的技術(shù)人員應(yīng)該是清楚的，并且例如，包括W008/020079第53-56頁(yè)提及的技術(shù)。
[0053]P)本發(fā)明的氨基酸序列、化合物或多肽的半衰期通?？梢匀鏦008/020079第57頁(yè)段落O)所述那樣定義，并且如其中提及的，是指所述氨基酸序列、化合物或多肽的血清濃度在體內(nèi)減少50%所花費(fèi)的時(shí)間，例如，由于所述序列或化合物的降解和/或通過(guò)天然機(jī)制對(duì)所述序列或化合物的清除或螯合(sequestration)。本發(fā)明的氨基酸序列、化合物或多肽的體內(nèi)半衰期可以以本身已知的任何方式確定，諸如通過(guò)藥物動(dòng)力學(xué)分析。適當(dāng)?shù)募夹g(shù)對(duì)于本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員應(yīng)該是清楚的，并且，例如，可以通常如W008/020079第57頁(yè)段落ο)中所述。還如在W008/020079第57頁(yè)段落ο)中所提及的，半衰期可以用參數(shù)如tl/2-a，tl/2_i3和曲線(xiàn)下面積(AUC)表示。例如，參考下述實(shí)驗(yàn)部分，以及標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)，諸如Kenneth, A等:藥物的化學(xué)穩(wěn)定性:藥劑師手冊(cè)(Chemical Stability ofPharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists)和 Peters 等，藥物動(dòng)力學(xué)分子:實(shí)踐方法(Pharmacokinete analysis:A Practical Approach) (1996)。還參考〃藥物動(dòng)力學(xué)(Pharmacokinetics) "，M Gibaldi&D Perron, Marcel Dekker 出版，第 2 修訂版(1982)。術(shù)語(yǔ)“半衰期增加”或“增加的半衰期”也如W008/020079第57頁(yè)段落ο)中所定義，并且特別是指11/2-β的增加，具有或不具有11/2-α和/或AUC或二者的增加。
[0054]q)關(guān)于靶標(biāo)或抗原，術(shù)語(yǔ)在所述靶標(biāo)或抗原上的“相互作用位點(diǎn)”意指在所述靶標(biāo)或抗原上的位點(diǎn)、表位、抗原決定簇、部分、結(jié)構(gòu)域或氨基酸殘基序列，其是所述靶標(biāo)或抗原的用于結(jié)合配體、受體或其他結(jié)合配偶體的位點(diǎn)、催化位點(diǎn)、切割位點(diǎn)、別構(gòu)相互作用的位點(diǎn)、參與多聚體化(如同源多聚體化或異源多聚體化)的位點(diǎn)；或是在所述靶標(biāo)或抗原上的參與所述靶標(biāo)或抗原的生物學(xué)作用或機(jī)制的任何其他位點(diǎn)、表位、抗原決定簇、部分、結(jié)構(gòu)域或氨基酸殘基序列。更一般地，“相互作用位點(diǎn)”可以是在所述靶標(biāo)或抗原上的本發(fā)明的氨基酸序列或多肽可以與之結(jié)合的任何位點(diǎn)、表位、抗原決定簇、部分、結(jié)構(gòu)域或氨基酸殘基序列，以致調(diào)節(jié)(如本文定義)所述靶標(biāo)或抗原(和/或其中涉及所述靶標(biāo)或抗原的任何途徑、相互作用、信號(hào)傳導(dǎo)、生物學(xué)機(jī)制或生物學(xué)作用)。
[0055]r)與第二靶標(biāo)或抗原相比較，當(dāng)與第一抗原以是所述氨基酸序列或多肽與第二靶標(biāo)或多肽結(jié)合的親和力的至少10倍、如至少100倍、且優(yōu)選至少1000倍、且多至10000倍或更多的親和力/抗體親抗原性(如上述，且適當(dāng)表示為Kd值、Ka值、kf速率和/或km速率)結(jié)合時(shí)，認(rèn)為這樣的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽是對(duì)第一靶標(biāo)或抗原“特異性的”。例如，所述第一抗原可以以比所述氨基酸序列或多肽與所述第二靶標(biāo)或多肽結(jié)合的Kd小至少10倍、如小至少100倍、且優(yōu)選小至少1000倍、如小10000倍或者甚至更小的Kd值結(jié)合所述靶標(biāo)或抗原。優(yōu)選地，當(dāng)免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽與第二靶標(biāo)或抗原相比較對(duì)第一靶標(biāo)或抗原是“特異性的”時(shí)，它針對(duì)(如本文定義)所述第一靶標(biāo)或抗原，但是不針對(duì)所述第二靶標(biāo)或抗原。
[0056]s)術(shù)語(yǔ)“交叉阻斷(cross-block)”，“被交叉阻斷的(cross-blocked)”和“交叉阻斷(cross-blocking)”在本文可以互換使用，用來(lái)意指免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽分別干擾天然配體HGF與c-Met的結(jié)合或干擾天然配體EGF與EGFR的結(jié)合、或干擾天然配體 VEGF 與 VEGF 受體(如 VEGFR-1R(Flt-1)，VEGFR-2 (KDR/Flk-Ι)和 / 或 VEGFR-3 (Flt-4))的結(jié)合的能力。本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽能夠干擾另一種化合物諸如天然配體對(duì)其靶標(biāo)(例如，c-Met，VEGF或EGFR)的結(jié)合的程度，且因此其能否被認(rèn)為是本發(fā)明所述的交叉阻斷的，可以使用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定法確定。一種特別適當(dāng)?shù)亩拷徊孀钄鄿y(cè)定法使用基于FACS或基于ELISA的方法或α篩選來(lái)測(cè)量在本發(fā)明的標(biāo)記的(例如，His標(biāo)記的或生物素?；?免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽與另一種結(jié)合劑關(guān)于它們與靶標(biāo)的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)。實(shí)驗(yàn)部分一般地描述了適當(dāng)?shù)挠糜诖_定結(jié)合分子是否交叉阻斷或能夠交叉阻斷本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽的基于FACS、基于ELISA或基于α篩選-置換的測(cè)定。應(yīng)該理解，所述測(cè)定可以與本文所述的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或其他結(jié)合劑中的任一種一起使用。因此，通常，例如，本發(fā)明所述的交叉阻斷的氨基酸序列或其他結(jié)合劑是一種將在上述交叉阻斷測(cè)定法中與靶標(biāo)結(jié)合的，以致在該測(cè)定法中且在存在本發(fā)明的第二氨基酸序列或其他結(jié)合試劑時(shí)，所記錄的本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽的置換是最大理論置換(例如，由需要被交叉阻斷的無(wú)活性的(cold)(例如，未標(biāo)記的)免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽的置換)的60%_100%(例如，在基于ELISA/ α篩選的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中)或80%-100%(例如，在基于FACS的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定中)，所述最大理論置換由以0.01mM以下的量存在的潛在交叉阻斷劑檢測(cè)，所述潛在交叉阻斷劑(交叉阻斷劑可以是另一種常規(guī)的單克隆抗體，諸如IgG,典型的單價(jià)抗體片段(Fab, scFv)和改造的變體(例如，二抗體、三抗體、小抗體(minibodies)、VHHs> dAbs、VHs> VLs))。
[0057]t)如果所述VHHl型免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或VHH型I序列與VHHl共有序列 (SEQ ID NO:99:[0058]QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA)
[0059]具有85%的同一性(使用VHHl共有序列作為查詢(xún)序列，使用具有標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置的blastp算法，即，blosom62評(píng)分矩陣(blosom62scoring matrix))并且任選地在位置50具有半胱氨酸，即C50 (使用Kabat編號(hào)方式)，則認(rèn)為氨基酸序列，諸如例如，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽，是“VHHl型免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域”或“VHH型I序列”。
[0060]u)如果其對(duì)這些不同的抗原或抗原決定簇是特異性的(如本文定義)，則認(rèn)為氨基酸序列，諸如例如，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽，針對(duì)兩種不同的抗原或抗原決定簇(諸如來(lái)自?xún)煞N不同的哺乳動(dòng)物物種的血清白蛋白，諸如人血清白蛋白和食蟹猴血清白蛋白)是“交叉反應(yīng)性的”。
[0061]V)如W008/020079 (通過(guò)引用結(jié)合在本文中)第58和59頁(yè)段落q)進(jìn)一步所述，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基按照Kabat等，(“Sequence of proteins ofimmunological interest (免疫感興趣的蛋白的序列)”，US Public Health Services, NIHBethesda, MD, Publication N0.91)提供的用于Vh結(jié)構(gòu)域的一般編號(hào)方式進(jìn)行編號(hào)，這在 Riechmann 和 Muyldermans, J.1mmunol.Methods (免疫方法雜志)2000 年 6 月 23日；240 (1-2):185-195的論文中用于來(lái)自駱駝科動(dòng)物的Vhh結(jié)構(gòu)域(例如，參見(jiàn)該出版物的圖2)，并且因此，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的FRl包含位置1-30的氨基酸殘基，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的⑶Rl包含位置31-35的氨基酸殘基，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的FR2包含位置36-49的氨基酸殘基，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的⑶R2包含位置50-65的氨基酸殘基，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的FR3包含位置66-94的氨基酸殘基，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的⑶R3包含位置95-102的氨基酸殘基，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的FR4包含位置103-113的氨基酸殘基。
[0062]w)給出附圖、序列表和實(shí)驗(yàn)部分/實(shí)施例只是進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明，并且不應(yīng)該被以任何方式解釋為或者認(rèn)為限制本發(fā)明和/或附上的權(quán)利要求的范圍，除非本文中另外明確指明。
[0063]1.本發(fā)明的多肽及其應(yīng)用
[0064]1.1杭-c-Met結(jié)構(gòu)單元
[0065]本發(fā)明的多肽通?？梢杂糜谡{(diào)節(jié)、特別是抑制和/或防止c-Met、特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)與HGF且特別是人HGF(瑞士蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Swiss Protdatabase):P14210)的結(jié)合，并且因此調(diào)節(jié)、且特別是抑制或防止由c_Met、特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)和/或HGF、特別是人HGF(瑞士蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù):P14210)介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)其中涉及c-Met、特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)和/或HGF、特別是人HGF的生物途徑，和/或調(diào)節(jié)與所述信號(hào)傳導(dǎo)或這些途徑相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制、反應(yīng)和作用。
[0066]因此，本發(fā)明的多肽和組合物可以用于診斷、預(yù)防和治療本發(fā)明的疾病和病癥(本文中也稱(chēng)為“本發(fā)明的疾病和病癥”)，并且包括,但不限于，癌癥(cancer)，例如，癌(carcinomas),神經(jīng)膠質(zhì)瘤(gliomas)，間皮瘤(mesotheliomas)，黑素瘤(melanomas)，淋巴瘤(lymphomas)，白血病(Ieukemias )，腺癌(adenocarcinomas):乳腺癌(breastcancer),卵巢癌(ovarian cancer),宮頸癌(cervical cancer),膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma),多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma)(包括意義未明單克隆Y球蛋白病(monoclonal gammopathy of undetermined significance),無(wú)癥狀的和有癥狀的黑素瘤(asymptomatic and symptomatic myeloma)),前列腺癌(prostate cancer),和伯基特淋巴瘤(Burkitt，s lymphoma),頭頸癌(head and neck cancer),結(jié)腸癌(coloncancer),結(jié)直腸癌(colorectal cancer),非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer),小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer),食道癌(cancer of the esophagus),胃癌(stomach cancer),膜腺癌(pancreatic cancer),月干膽管癌(hepatobiliary cancer),膽囊癌(cancer of the gallbladder),小腸癌(cancer of the small intestine),直腸癌(rectal cancer),腎癌(kidney cancer),膀胱癌(bladder cancer),前列腺癌(prostate cancer),陰莖癌(penile cancer),尿道癌(urethral cancer),睪丸癌(testicular cancer),陰道癌(vaginal cancer),子宮癌(uterine cancer),甲狀腺癌(thyroid cancer),甲狀旁腺癌(parathyroid cancer),腎上腺癌(adrenal cancer),膜腺內(nèi)分泌癌(pancreatic endocrine cancer),類(lèi)癌(carcinoid cancer),骨癌(bonecancer),皮膚癌(skin cancer),視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastomas)，霍奇金淋巴瘤(Hodgkin，s lymphoma),非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma),卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma),多中心卡斯?fàn)柭?multicentric Castleman's disease)或艾滋病相關(guān)的原發(fā)性滲出性淋巴瘤(AIDS-associated primary effusion lymphoma),神經(jīng)外胚瘤(neuroectodermal tumors),橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)(例如，關(guān)于另外的癌癥參見(jiàn) Cancer, Principles and practice (癌癥、原理與實(shí)踐)(DeVita, V.T.等編，1997));以及上述任一種癌癥的任意轉(zhuǎn)移病，以及非癌癥適應(yīng)證，如鼻息肉??；以及本文所述的其他病癥和疾病。具體地，本發(fā)明的多肽和組合物可以用于診斷、預(yù)防和治療涉及c-Met介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、趨化性、細(xì)胞粘著、經(jīng)內(nèi)皮遷移、細(xì)胞增殖和/或存活的疾病，特別是非小細(xì)胞肺癌和多發(fā)性骨髓瘤。本發(fā)明的多肽和組合物還可以用于診斷、預(yù)防和/或治療骨轉(zhuǎn)移癌中的骨骼疾病，包括多發(fā)性骨髓瘤。本發(fā)明的多肽和組合物還可以用于診斷、預(yù)防和/或治療骨轉(zhuǎn)移癌中的溶骨性損傷，包括多發(fā)性骨髓瘤。
[0067]通常，所述“本發(fā)明的疾病和病癥”可以定義為這樣的疾病和病癥，所述疾病和病癥可以通過(guò)給有此需要( 即，患有所述疾病或病癥或具有其至少一種癥狀和/或有危險(xiǎn)引起或發(fā)展所述疾病或病癥)的受試者適當(dāng)?shù)厥┯帽景l(fā)明的多肽或組合物(并且特別是藥物活性量的)和/或已知的針對(duì)c-Met、特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)或者涉及c_Met、特別是人c-Met(SEQ ID NO:1)的生物學(xué)途徑或機(jī)制有活性的活性成分(并且特別是藥物活性量的)而分別得到診斷、預(yù)防和/或治療。
[0068]具體地，本發(fā)明的多肽可以用于診斷、預(yù)防和治療本發(fā)明的疾病和病癥，所述疾病和病癥特征在于由c-Met、特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)或涉及c_Met、特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的途徑(例如，HGF/c-Met軸)介導(dǎo)的過(guò)量的和/或不需要的HGF信號(hào)傳導(dǎo)，特別是人HGF信號(hào)傳導(dǎo)?；诒疚墓_(kāi)的內(nèi)容，技術(shù)人員也應(yīng)該清楚本發(fā)明的所述疾病和病癥的實(shí)例。
[0069]因此，不希望限于此，例如，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽可以用于診斷、預(yù)防和/或治療目前用能夠調(diào)節(jié)c-Met且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的活性成分進(jìn)行診斷、預(yù)防或治療的所有疾病和病癥，諸如疾病和上述現(xiàn)有技術(shù)中提及的那些。還考慮到本發(fā)明的多肽可以用于診斷、預(yù)防和/或治療已經(jīng)提議或在將來(lái)將要提議或研發(fā)的目前正開(kāi)發(fā)使用所述活性成分的治療的所有疾病和病癥。另外，由于其如本文進(jìn)一步所述的有利特性，考慮到本發(fā)明的多肽可以用于診斷、預(yù)防和治療除對(duì)其正使用或?qū)⒁嶙h或研發(fā)這些已知的活性成分的那些疾病和病癥之外的其他疾病和病癥；和/或本發(fā)明的多肽可以提供用于治療本文所述的疾病和病癥的新方法和方案。
[0070]因此，本發(fā)明涉及本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽，其用于治療。
[0071]通過(guò)本文的進(jìn)一步公開(kāi)的內(nèi)容，技術(shù)人員應(yīng)該清楚本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽的其他應(yīng)用和用途。
[0072]通常，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可以用于診斷、預(yù)防和/或治療本發(fā)明的疾病和/或病癥的藥物活性試劑，以及包含其的組合物；提供用于診斷、預(yù)防和/或治療所述疾病和病癥的方法，所述方法包括施用和/或使用所述試劑和組合物。
[0073]特別地，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供所述藥物活性試劑、組合物和/或方法，與目前所用的和/或本領(lǐng)域中已知的試劑、組合物和/或方法相比，所述藥物活性試劑、組合物和/或方法具有某些優(yōu)點(diǎn)。這些優(yōu)勢(shì)從以下進(jìn)一步描述中將變得清楚。
[0074]更特別地，本發(fā)明的目的是提供可以用作藥物活性試劑的治療性蛋白，以及包含其的組合物，其用于診斷、預(yù)防和/或治療本發(fā)明的疾病和/或病癥以及本文提及的其他疾病和病癥；并且提供用于診斷、預(yù)防和/或治療所述疾病和病癥的方法，所述方法包括施用和/或使用所述治療性蛋白和組合物。
[0075]因此，本發(fā)明的一個(gè)特定目的是提供針對(duì)c-Met、特別是針對(duì)來(lái)自溫血?jiǎng)游锏腸-Met、更特別是針對(duì)來(lái)自哺乳動(dòng)物(諸如例如，小鼠)、且尤其是針對(duì)人c-Met (SEQ IDNO:1)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域；并且提供包含至少一種所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或基本上由其組成的蛋白和多肽。
[0076]特別地，本發(fā)明的一個(gè)特定目的是提供所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和所述蛋白和/或多肽，其適于在溫血?jiǎng)游?、特別是哺乳動(dòng)物、更特別是人中的預(yù)防、治療和/或診斷應(yīng)用。
[0077]更特別地，本發(fā)明的一個(gè)特定目的是提供所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和所述蛋白和/或多肽，其可以用于預(yù)防、治療、減輕和/或診斷溫血?jiǎng)游?、特別是哺乳動(dòng)物、更特別是人中的與c-Met相關(guān)和/或由c-Met介導(dǎo)的一種或多種疾病、病癥或病況(諸如本文提及的疾病、病癥和病況)。
[0078]本發(fā)明還有一個(gè)特定的目的是提供所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和所述蛋白和/或多肽，其可以用于制備藥物組合物或獸醫(yī)用組合物，所述組合物用于預(yù)防和/或治療溫血?jiǎng)游铩⑻貏e是哺乳動(dòng)物、更特別是人中的一種或多種與c-Met相關(guān)的和/或由c-Met介導(dǎo)的疾病、病癥或病況(諸如本文提及的疾病、病癥和病況)。
[0079]通常，在本發(fā)明中，這些目的通過(guò)使用本文所述的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域、蛋白、多肽和組合物而實(shí)現(xiàn)。
[0080]通常，本發(fā)明提供針對(duì)(如本文定義)和/或能夠特異性結(jié)合(如本文定義)c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域；以及包含至少一種此類(lèi)氨基酸序列的化合物和構(gòu)建體，特別是 蛋白和多肽。
[0081]更特別地，本發(fā)明提供能夠以如本文定義的親和力(適當(dāng)?shù)販y(cè)量的和/或表示為Kd-值(實(shí)際的或表觀(guān)的)、Ka-值(實(shí)際的或表觀(guān)的)、kon-速率和/或Iitjff-速率，或備選地作為IC5tl值，如本文進(jìn)一步所述)結(jié)合C-Met、且特別是人C-Met (SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽；以及包含至少一種此類(lèi)氨基酸序列的化合物和構(gòu)建體，特別是蛋白和多妝。
[0082]特別地，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽是這樣的，以致:
[0083]-其在α篩選測(cè)定(例如，如在實(shí)驗(yàn)部分所述(參見(jiàn)實(shí)施例2.3.1))中以1.2ηΜ以下、更優(yōu)選地500ρΜ以下、甚至更優(yōu)選地200ρΜ以下、最優(yōu)選地150ρΜ以下的IC50結(jié)合人c-Met (SEQ ID NO:1)，并且其中所述多肽僅包含一個(gè)人c-Met結(jié)合免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域單位，并且其中完全的置換意指約60%-80%且更多、優(yōu)選95%以上的平均HGF置換(例如，當(dāng)按照實(shí)施例2.3.1中的配體置換測(cè)定測(cè)量時(shí))；
[0084]和/或是這樣的，以致:
[0085]-其在測(cè)定(例如，如在實(shí)驗(yàn)部分(實(shí)施例2.3)中所述)中以2.5nM以下的平均IC50值、更優(yōu)選地2nM以下的平均IC50值、甚至更優(yōu)選地1.5nM以下的平均IC50值將人HGF完全從人c-Met (SEQ ID NO:1)置換下來(lái)，并且其中所述多肽僅包含一個(gè)人c-Met結(jié)合免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域單位，并且其中完全的置換意指約60%-80%且更多、優(yōu)選95%以上的平均HGF置換(例如，當(dāng)按照實(shí)施例2.3.2中的配體置換測(cè)定測(cè)量時(shí))；
[0086]通過(guò)本文的進(jìn)一步描述和實(shí)施例，本發(fā)明的針對(duì)c-Met、且特別是針對(duì)人c-Met (SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或多肽的結(jié)合、置換、遷移或其他體內(nèi)和/或體外功效的一些優(yōu)選的技術(shù)價(jià)值將變得清楚。 [0087]對(duì)于與c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的結(jié)合，本發(fā)明的氨基酸序列通常將在其氨基酸序列內(nèi)包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基或一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基片段(即，每個(gè)“片段”包含兩個(gè)以上彼此相鄰或彼此緊密接近的氨基酸殘基，即，在氨基酸序列的一級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)中),通過(guò)其本發(fā)明的氨基酸序列能夠結(jié)合c-Met、且特別是人c-Met (SEQID NO:1)，因此，所述氨基酸殘基或氨基酸殘基的片段形成用于結(jié)合c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的“位點(diǎn)”(本文中還稱(chēng)為“抗原結(jié)合位點(diǎn)”)。
[0088]本發(fā)明提供的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域優(yōu)選是以基本上分離的形式(如本文定義)存在，或形成本發(fā)明的蛋白或多肽的一部分(如本文定義)，其可以包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或基本上由其組成，并且其可以任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)其他免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域(所有任選地通過(guò)一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)?shù)慕宇^連接)。例如，并且不限于，本發(fā)明的優(yōu)選方面分別提供基本上由下述組成的多肽:通過(guò)肽接頭(如本文定義)連接的一個(gè)針對(duì)人c-Met的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和針對(duì)人血清白蛋白的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，以提供本發(fā)明的雙特異性多肽，和/或也通過(guò)肽接頭(如本文定義)連接的針對(duì)人EGFR的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，以提供本發(fā)明的另外的雙特異性或三特異性的多肽，均如本文所述。所述蛋白或多肽也可以是基本上分離的形式(如本文定義)。
[0089]因此，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽優(yōu)選基本上由不通過(guò)二硫鍵與任意其他氨基酸序列或鏈連接的單個(gè)氨基酸鏈組成(但是其可以或不可以包含一個(gè)或多個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。例如，已知本發(fā)明的試劑——如本文所述——有時(shí)可能包含在⑶R3與⑶Rl或FR2之間的二硫鍵)。然而，應(yīng)該注意的到，本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以彼此連接和/或與其他免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域連接(例如，通過(guò)二硫鍵)，以提供也可以用于本發(fā)明的肽構(gòu)建體(例如，F(xiàn)ab’片段，F(xiàn)(ab’)2片段，ScFv構(gòu)建體，“二抗體”和其他多特異性構(gòu)建體)。例如，參考Holliger和Hudson, Nat Biotechnol.(自然生物技術(shù))2005;23:1126-36(通過(guò)引用結(jié)合)的綜述。
[0090]通常，當(dāng)意欲將本發(fā)明的氨基酸序列(或包含其的化合物、構(gòu)建體或多肽)用于施用給受試者時(shí)(例如，用于本文所述的治療和/或診斷目的)，優(yōu)選在所述受試者中天然不存在的氨基酸序列；或者，當(dāng)其確實(shí)在所述受試者中天然存在時(shí)，其是基本上分離的形式(如本文定義)。
[0091]技術(shù)人員還應(yīng)該清楚，對(duì)于制藥用途，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域(以及包含其的化合物、構(gòu)建體和多肽)優(yōu)選是針對(duì)人c-Met，特別是針對(duì)人c-Met (SEQ ID NO:1);而對(duì)于獸醫(yī)用目的，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽優(yōu)選是針對(duì)來(lái)自待治療的物種的c-Met，或者至少與來(lái)自待治療的物種的c-Met交叉反應(yīng)。
[0092]此外，本發(fā)明的氨基酸序列可以任選地，并且除了至少一個(gè)用于針對(duì)c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)之外，包含一個(gè)或多個(gè)用于針對(duì)其他抗原、蛋白或靶標(biāo)結(jié)合的其他結(jié)合位點(diǎn)。
[0093]取決于所涉及的具體的疾病或病癥，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽以及包含其的組合物的功效可以使用任何適當(dāng)?shù)捏w外測(cè)定、基于細(xì)胞的測(cè)定、體內(nèi)測(cè)定和/或本身已知的動(dòng)物模型或它們的任意組合來(lái)檢測(cè)。適當(dāng)?shù)臏y(cè)定和動(dòng)物模型應(yīng)該是技術(shù)人員所清楚的，并且，例如，包括配體置換測(cè)定(Burgess等，Cancer Res (癌癥研究)200666:1721-9)，二聚體化測(cè)定(W02009/007427A2, Goetsch, 2009)，信號(hào)傳導(dǎo)測(cè)定(Burgess等，Mol Cancer Ther (分子癌癥治療法)9:400-9),增殖/存活測(cè)定(Pacchiana等，J Biol Chem (生物化學(xué)雜志)2010年9月，M110.134031)，細(xì)胞粘著測(cè)定(Holt 等,Haematologica (血液病學(xué))200590:479-88)和遷移測(cè)定(Kong-Beltran等，Cancer Cell (癌細(xì)胞)6:75_84),內(nèi)皮細(xì)胞出芽測(cè)定(Wang等，J Immunol.(免疫學(xué)雜志)2009; 183:3204-11)，成骨細(xì)胞分化測(cè)定，ALP測(cè)定(Standal等，Blood2007四月一日；109(7):3024-30)，和體內(nèi)異種移植物模型(Jin等，Cancer Res.(癌癥研究)200868:4360-8)，以及在下述實(shí)驗(yàn)部分和在本文引用的現(xiàn)有技術(shù)中所用的測(cè)定和動(dòng)物模型。
[0094]此外，按照本發(fā)明，針對(duì)來(lái)自第一溫血?jiǎng)游镂锓N的C-Met的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽可以或不可以表現(xiàn)出與來(lái)自一種或多個(gè)其他溫血?jiǎng)游镂锓N的c-Met的交叉反應(yīng)性。例如，針對(duì)人c-Met、且特別是針對(duì)人c-Met (SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽可以或不可以表現(xiàn)出與來(lái)自一種或多種其他靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物物種(諸如，不限于，來(lái)自稱(chēng)猴屬(Macaca)的猴子(諸如,且特別是食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus)))的c_Met的交叉反應(yīng)性，和/或與來(lái)自通常用在疾病動(dòng)物模型(例如，小鼠、大鼠、兔、豬或狗)中、且特別是用在與c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)相關(guān)的疾病和病癥的動(dòng)物模型中的一種或多種動(dòng)物物種(諸如，本文提及的物種和動(dòng)物模型)的c-Met的交叉反應(yīng)性。在這一方面，技術(shù)人員應(yīng)該清楚，從藥物開(kāi)發(fā)觀(guān)點(diǎn)來(lái)看，所述交叉反應(yīng)性，當(dāng)存在時(shí)，可能具有優(yōu)點(diǎn)，原因在于這允許在所述疾病模型中檢測(cè)針對(duì)人c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽。
[0095]更一般地，由于允許所述氨基酸序列或多肽跨多個(gè)物種使用，所以，本發(fā)明與來(lái)自多種哺乳動(dòng)物物種的c-Met交叉反應(yīng)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽通常有利地用在獸醫(yī)應(yīng)用中。因此，本發(fā)明的范圍還包括針對(duì)來(lái)自一個(gè)動(dòng)物物種的c-Met的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽(諸如針對(duì)人c-Met (SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽)可以用于治療另一個(gè)動(dòng)物物種，只要所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和/或多肽的應(yīng)用在待治療的物種中提供需要的作用。
[0096]本發(fā)明在其最廣泛的意義上不特別局限于或限制為本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽所針對(duì)的c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的特定的抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域、亞基或構(gòu)象(confirmation)。例如,所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽可以或不可以針對(duì)HGF/c-Met相互作用位點(diǎn)、c_Met的細(xì)胞內(nèi)在化位點(diǎn)、c_Met的脫落位點(diǎn)(shedding site)和/或c-Met/c-Met同源二聚體化位點(diǎn)，并且如本文進(jìn)一步所定義。
[0097]此外，具有針對(duì)c-Met和RON、且特別是人c_Met (SEQ ID NO:1)和人RON ((Ming-Hai Wang 等，Acta Pharmacologica Sinica (2010) 31:1181 - 1188)的雙重特異性的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0098]如本文進(jìn)一步所述，本發(fā)明的多肽可以包含(盡管不優(yōu)選)兩個(gè)以上本發(fā)明的針對(duì)c-Met且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域。通常，與本發(fā)明的單個(gè)氨基酸序列相比，所述多肽將以增加的抗體親抗原性結(jié)合c-Met、且特別是人c-Met (SEQ IDNO:1)。例如，所述多肽可以包含兩個(gè)本發(fā)明的針對(duì)c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的相同的抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域、亞基或構(gòu)象(當(dāng)適用時(shí))(其可以或不可以是相互作用位點(diǎn))的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域；或包含至少一個(gè)本發(fā)明的針對(duì)c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的第一抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域、亞基或構(gòu)象(當(dāng)適用時(shí))(其可以或不可以是相互作用位點(diǎn))的“第一”氨基酸序列；和至少一個(gè)本發(fā)明的針對(duì)與第一不同的第二抗原決定簇、表位、部分、結(jié)構(gòu)域、亞基或構(gòu)象(當(dāng)適用時(shí))(并且其可以或不可以是相互作用位點(diǎn))的“第二”氨基酸序列。優(yōu)選地，在所述本發(fā)明的“二互補(bǔ)位”多肽中，至少一個(gè)本發(fā)明的氨基酸序列是針對(duì)相互作用位點(diǎn)(如本文定義)，盡管本發(fā)明在其最廣泛意義上不限于此。例如，本發(fā)明的多肽可以被格式化(formatted)，例如，以二互補(bǔ)位方式格式化，以組合如實(shí)驗(yàn)部分所表征的針對(duì)不同表位的單價(jià)結(jié)構(gòu)單元。
[0099]此外，當(dāng)靶標(biāo)是結(jié)合對(duì)(例如，受體-配體結(jié)合對(duì))的一部分時(shí),所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽可以是這樣的，以致其與關(guān)聯(lián)結(jié)合配偶體(例如，HGF)競(jìng)爭(zhēng)與c-Met的結(jié)合，和/或是這樣的，以致其(完全或部分地)中和所述結(jié)合配偶體與所述靶標(biāo)的結(jié)合。
[0100]還預(yù)測(cè)到本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽通常將與C-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的所有天然存在的或合成的類(lèi)似物、變體、突變體、等位基因、部分和片段結(jié)合；或至少與c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的包含與本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽結(jié)合c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的抗原決定簇或表位基本上相同的一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇或表位的那些類(lèi)似物、變體、突變體、等位基因、部分和片段結(jié)合。
[0101]同樣，在這樣的情形中，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽可以以與本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域與(野生型)C-Met結(jié)合的親和力和特異性相同的或不同的(即，高于或低于其)的親和力和/或特異性結(jié)合所述類(lèi)似物、變體、突變體、等位基因、部分和片段。[0102]由于c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)以單體形式和一個(gè)或多個(gè)多聚體形式存在，例如，以同源二聚體形式存在，因此，下述也在本發(fā)明的范圍內(nèi):本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽i)僅結(jié)合單體形式的c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID N0:l),ii)僅結(jié)合多聚體/ 二聚體(同源和/或異源二聚體)形式的c-Met、且特別是人c-Met (SEQ IDN0:1)，或iii)結(jié)合單體和多聚體形式二者。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，本發(fā)明的多肽防止形成同源二聚體化的人c-Met復(fù)合物。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的方面中，本發(fā)明的多肽不誘導(dǎo)(甚至在較高的濃度,如IOnM以下，50nM以下，IOOnM以下或500nM以下)同源二聚體化人c-Met復(fù)合物的形成。同樣地，在這樣的情形中，本發(fā)明的多肽可以以與本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合多聚體形式的親和力和特異性相同或不同(即，高于或低于其)的親和力和/或特異性結(jié)合單體形式。[0103]此外，當(dāng)c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)能夠與其他蛋白或多肽締合形成蛋白復(fù)合物時(shí)(例如，與HGF締合，而且還與其他受體如EGFR，HER3，叢蛋白，整聯(lián)蛋白，CD44，RON締合)，下述在本發(fā)明的范圍內(nèi):本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽結(jié)合處于其非締合狀態(tài)的c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)(并且例如，防止配體結(jié)合和/或防止信號(hào)傳導(dǎo))，結(jié)合處于其締合狀態(tài)的c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1),或者結(jié)合二者(優(yōu)選結(jié)合非締合狀態(tài))。在所有這些情形中，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽可以以與本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽結(jié)合處于其非締合狀態(tài)的c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的親和力和/或特異性相同或不同的(即，高于或低于其)親和力和/或特異性結(jié)合所述締合的蛋白復(fù)合物。
[0104]此外，技術(shù)人員應(yīng)該清楚，包含兩個(gè)以上針對(duì)c-Met、且特別是人c_Met(SEQ IDNO:1)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的蛋白或多肽，例如，本發(fā)明的“二互補(bǔ)位”多肽，可以以比相對(duì)應(yīng)的單體氨基酸序列更高的抗體親抗原性結(jié)合c-Met、且特別是人c-Met (SEQ IDNO:1)。例如，不限于，包含兩個(gè)以上針對(duì)c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的不同表位的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的蛋白或多肽可以(并且通常)以比不同單體中的每一個(gè)更高的抗體親抗原性結(jié)合，并且包含兩個(gè)以上針對(duì)c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的蛋白或多肽可以(并且通常)還以更高的抗體親抗原性結(jié)合c-Met的多聚體(例如，同源二聚體)，且特別是結(jié)合人c-Met (SEQ ID NO:1)的多聚體(例如，同源二聚體)。
[0105]通常，本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽至少結(jié)合與生物學(xué)和/或治療觀(guān)點(diǎn)最相關(guān)的形式的那些形式的c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)(包括單聚體、多聚體、締合的和不同的構(gòu)象形式)，這將是技術(shù)人員所清楚的。
[0106]使用本發(fā)明的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域和多肽的部分、片段、類(lèi)似物、突變體、變體、等位基因和/或衍生物，和/或使用包含一個(gè)或多個(gè)所述部分、片段、類(lèi)似物、突變體、變體、等位基因和/或衍生物或基本上由其組成的蛋白或多肽也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要這些適合用于本文所考慮的應(yīng)用。所述部分、片段、類(lèi)似物、突變體、變體、等位基因和/或衍生物通常包含用于結(jié)合c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的功能性抗原-結(jié)合位點(diǎn)(的至少一部分)；并且更優(yōu)選地能夠特異性結(jié)合c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1),并且甚至更優(yōu)選地能夠以如本文定義的EC50值、平均K1、IC5tl值(涉及結(jié)合、遷移、置換和/或增殖阻斷和/或其他效果測(cè)量，如本文進(jìn)一步所述(例如，在實(shí)驗(yàn)部分))結(jié)合c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)，并且所述部分、片段、類(lèi)似物、突變體、變體、等位基因和/或衍生物可以更有效、更穩(wěn)定、更可溶，并且可以具有相同的表位。通過(guò)本文的進(jìn)一步描述，所述部分、片段、類(lèi)似物、突變體、變體、等位基因、衍生物、蛋白和/或多肽的一些非限制性的實(shí)例將變得清楚。本發(fā)明的另外的片段或多肽也可以通過(guò)適當(dāng)組合(即，通過(guò)連接或遺傳融合)一種或多種如本文所述的(較小的)部分或片段而提供。
[0107]關(guān)于免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的一般描述，參考下文的進(jìn)一步描述，以及參考本文引用的現(xiàn)有技術(shù)。然而，在這一方面，應(yīng)該注意到本說(shuō)明書(shū)和現(xiàn)有技術(shù)主要描述所謂的“Vh3種類(lèi)”的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域(即，與人種系Vh3序列(如DP-47, DP-51或DP-29)具有高度的序列同源性的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域)，這形成本發(fā)明的優(yōu)選方面。然而，應(yīng)該注意到，本發(fā)明在其最廣泛意義上通常涵蓋任意類(lèi)型的針對(duì)c-Met、且特別是人c-Met (SEQID NO:1)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，并且例如還涵蓋屬于所謂的“VH4種類(lèi)”的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域(即，與人種系Vh4種類(lèi)序列(如DP-78)具有高度的序列同源性的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域)，如例如在W007/118670中所述。
[0108]通常，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域(特別是Vhh序列和序列優(yōu)化的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域)可以特別地特征在于在一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架序列(同樣如本文進(jìn)一步所述)中存在一個(gè)或多個(gè)“標(biāo)志殘基”(如本文所述)。
[0109]因此，通常，免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域可以定義為具有下述(通用)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列:
[0110]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0111]其中FR1-FR4分別是指構(gòu)架區(qū)1_4，并且其中⑶Rl-⑶R3分別是指互補(bǔ)性決定區(qū)1_3 ο
[0112]在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的多肽，所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域是具有下述(通用)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列:
[0113]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
[0114]其中FR1-FR4分別是指構(gòu)架區(qū)1_4，并且其中⑶Rl-⑶R3分別是指互補(bǔ)性決定區(qū)
1-3，并且其中:
[0115]i)在按照 Kabat 編號(hào)的位置 11，37，44，45，47，83，84，103，104 和 108 的至少一個(gè)
氨基酸殘基選自下表A-1中提及的標(biāo)志殘基；并且其中:
[0116]ii)所述氨基酸序列與W02009/138519中所示的(參見(jiàn)W02009/138519的SEQ IDN0:sl-125)至少一種免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域具有至少80%、更優(yōu)選地90%、甚至更優(yōu)選地95%的氨基酸同一性，其中為了確定氨基酸同一性程度的目的，忽略形成CDR序列的氨基酸殘基(在所述序列中表不為X);并且其中:
[0117]iii)所述⑶R序列通常如本文進(jìn)一步所定義(如表(B-2)中提供的組合的⑶R1、⑶R2和⑶R3，注意⑶R定義按照Kabat編號(hào)系統(tǒng)考慮)。
[0118]表A-1: VHHs中的標(biāo)志殘基
[0119]
【權(quán)利要求】
1.能夠?qū)GF從人C-Met(SEQ ID NO:1)上置換下來(lái)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，其IC50小于ΙΟηΜ，并且最大HGF置換水平為60%_80%或以上。
2.權(quán)利要求1的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域包含具有式I的氨基酸序列:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I)； 其中FR1-FR4是指構(gòu)架區(qū)1-4，并且是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)；并且其中⑶Rl選自由以下組成的組:
a)SEQID NO:51 和 160， b)與SEQID NO:51和160具有至少80%的氨基酸同一性的多肽， c)與SEQID NO:51和160具有3、2或I個(gè)氨基酸差異的多肽，并且其中⑶R2選自由以下組成的組:
d)SEQID NO:67 和 170， e)與SEQID NO:67和170具有至少80%的氨基酸同一性的多肽， f)與SEQID NO:67和170具有3、2或I個(gè)氨基酸差異的多肽，并且其中⑶R3選自由以下組成的組:
g)SEQID NO:83 和 180， h)與SEQID NO:83和180的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)具有至少80%的氨基酸同一性的多肽， i)與SEQID NO:83和180具有3、2或I個(gè)氨基酸差異的多肽。
3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述構(gòu)架區(qū)(FRs)與SEQID NO: 102的FRs具有大于80%的序列同一性。
4.權(quán)利要求1的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，其中所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域包含具有式I的氨基酸序列:
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(I)； 其中FR1-FR4是指構(gòu)架區(qū)1-4，并且是免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)；其中CDRl是 SEQ ID NO: 51 或 160，其中 CDR2 是 SEQ ID NO:67 或 170 ;并且其中 CDR3 是 SEQ ID NO:83或 180。
5.包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的多肽。
6.權(quán)利要求5的多肽，其中所述多肽選自由以下組成的組:氨基酸序列與SEQIDNO:23-29, 102或187具有大于80%的序列同一性的多肽。
7.權(quán)利要求5或6任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽選自由以下組成的組:氨基酸序列與SEQ ID NO:26或187具有大于80%的序列同一性的多肽。
8.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的多肽，其另外包含與人血清白蛋白結(jié)合的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域，諸如例如 Albll (SEQ ID NO: 5)或 Alb23 (SEQ ID NO: 101)。
9.權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽選自由以下組成的組:氨基酸序列與SEQ ID NO:7-12, 103-111，113，188 或 142-150 具有大于 80% 的序列同一性的多肽。
10.權(quán)利要求5-9中任一 項(xiàng)的多肽，其中所述多肽選自由以下組成的組:氨基酸序列與SEQ ID NO:7, 106，113，188，143，146或147具有大于80%的序列同一性的多肽。
11.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的多肽，其中在α篩選測(cè)定中的IC50為1.2ηΜ以下。
12.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的多肽，其中在α篩選測(cè)定中的IC50為500ρΜ以下。
13.核酸序列，所述核酸序列編碼:i)權(quán)利要求1-4，11或12中任一項(xiàng)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域；或ii)權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的多肽。
14.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含:i)權(quán)利要求1-4，11或12中任一項(xiàng)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域；或ii)權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的多肽；以及任選地藥用賦形劑。
15.權(quán)利要求1-4，11或12中任一項(xiàng)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域；或^)權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的多肽，其用于癌癥。
16.用于制備權(quán)利要求1-4，11或12中任一項(xiàng)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或ii)權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的多肽的方法，所述方法至少包含下述步驟: a)在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞或宿主生物體中或在另一種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)中表達(dá)權(quán)利要求13的核酸或核苷酸序列； 任選地接著進(jìn)行: b)分離和/或純化所述免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域或所述多肽。
17.用于篩選針對(duì)c-Met、且特別是人c-Met(SEQ ID NO:1)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包括至少下述步驟: a)提供VHHl型免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的組、集合或文庫(kù)；和 b)從所述VHHl型免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域的組、集合或文庫(kù)中篩選能夠結(jié)合c-Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)和/或具有針對(duì)c_Met、且特別是人c_Met (SEQ ID NO:1)的親和力的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域；和 c)分離能夠結(jié)合c-Met、且特別是人c-Met(SEQ ID NO:1)和/或具有針對(duì)c_Met、且特別是人c-Met (SEQ ID NO:1)的親和力的氨基酸序列。
18.用于評(píng)估患有c-Met相關(guān)的疾病或病癥的患者對(duì)治療的響應(yīng)性的體外方法，所述方法包括下述步驟: a)提供在治療前來(lái)自所述患者的第一樣品，并且測(cè)量所述第一樣品中的可溶性c-Met的量， b)提供在開(kāi)始治療后來(lái)自所述患者的第二樣品，并且測(cè)量所述第二樣品中可溶性c-Met的量， c)將在所述第一樣品中存在的可溶性c-Met的量與在所述第二樣品中存在的可溶性c-Met的量進(jìn)行比較； 其中，與在所述第一樣品中的可溶性c-Met的量相比，在所述第二樣品中發(fā)現(xiàn)的可溶性c-Met的量的減少表示所述患者對(duì)所述治療有響應(yīng)。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述樣品是血液樣品，血清樣品，血漿樣品，糞便樣品，尿樣，支氣管肺泡灌洗液，腦脊液或組織樣品。
20.權(quán)利要求18的方法，其中可溶性c-Met的量使用免疫測(cè)定、化學(xué)發(fā)光測(cè)定或電化學(xué)發(fā)光測(cè)定來(lái)測(cè)量。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述治療包括施用:i)權(quán)利要求1-4，11或12中任一項(xiàng)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域；ii)權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的多肽；或iii)權(quán)利要求14的藥物組合物。
22.—種治療至少一種與c-Met相關(guān)的疾病或病癥的方法，所述方法包括給有此需要的受試者施用權(quán)利要求14的藥物組合物。
23.用于評(píng)估患有c-Met相關(guān)的疾病或病癥的患者對(duì)治療的響應(yīng)性的試劑盒，所述試劑盒包含用于按照權(quán)利要求18的方法測(cè)量患者中可溶性c-Met的量的一種或多種試劑。
24.權(quán)利要求23的試劑盒，所述試劑盒還包含:i)權(quán)利要求1-4，11或12中任一項(xiàng)的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域；或ii)權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)的多肽；或iii)權(quán)利要求14的藥物組 合物。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK103889451SQ201280047858
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年10月1日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月30日
【發(fā)明者】格拉爾德·貝斯特, 蓋伊·赫爾曼斯, 索倫·斯特芬森, 亞歷山大·希羅基, 塞德里克·約瑟夫·內(nèi)奧特里·韋爾韋肯, 延納克·德納耶爾 申請(qǐng)人:埃博靈克斯股份有限公司