專利名稱：：L-賴氨酸的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用大腸桿菌的L-賴氨酸生產(chǎn)方法。L-賴氨酸是一種必需氨基酸，并被用作藥物或者動(dòng)物用飼料添加物等營(yíng)養(yǎng)混合物的組分。
背景技術(shù)：
：L-賴氨酸等L-氨基酸是使用具有生產(chǎn)這些L-氨基酸的能力的棒狀桿菌型細(xì)菌或埃希氏菌屬細(xì)菌等氨基酸生產(chǎn)菌，采用發(fā)酵方法來(lái)工業(yè)生產(chǎn)的。作為這些氨基酸生產(chǎn)菌，為了提高生產(chǎn)力，人們使用了從自然界分離出來(lái)的菌株或該菌株的人工突變株或者通過(guò)基因重組而增強(qiáng)了L-氨基酸生物合成酶活性的重組體等。L-賴氨酸的生產(chǎn)方法包括例如專利文獻(xiàn)14中所述的方法。作為提高L-賴氨酸等氨基酸的生產(chǎn)能力的方法，除了有增加目的氨基酸的固有生物合成途徑的酶的表達(dá)量的方法以外，還開發(fā)了通過(guò)修飾呼吸鏈途徑來(lái)改善能量效率的方法(專利文獻(xiàn)5)、通過(guò)擴(kuò)增煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因來(lái)提高煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸生產(chǎn)能力的方法(專利文獻(xiàn)6)。此外，作為對(duì)各種氨基酸的生物合成的共有途徑進(jìn)行修飾的方法，已知有補(bǔ)給途徑經(jīng)過(guò)修飾的L-氨基酸生產(chǎn)菌，如增加了丙酮酸羧化酶活性的棒狀桿菌型細(xì)菌L-賴氨酸生產(chǎn)菌(專利文獻(xiàn)7)、缺損了丙酮酸激酶的埃希氏菌屬L-賴氨酸生產(chǎn)菌(專利文獻(xiàn)8)、缺損了蘋果酸醌氧化還原酶(malatequinineoxidoreductase)的棒狀桿菌型細(xì)菌L-賴氨酸生產(chǎn)菌(專利文獻(xiàn)9)等。作為L(zhǎng)-賴氨酸的前體，有內(nèi)消旋a，e-二氨基庚二酸(以下也稱"meso-DAP")。meso-DAP不但是L-賴氨酸的前體，而且同時(shí)作為細(xì)胞壁的構(gòu)成成分，也是細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的物質(zhì)。關(guān)于埃希氏菌屬(Escherichia)細(xì)菌的meso-DAP合成，已知meso-DAP是從其前體2，3，4，5-四氫吡啶-2，6-二羧酸(以下也稱"THDP")通過(guò)屬于meso-DAP合成途徑的四種酶的功能來(lái)合成的，這四種酶是2，3，4，5-四氫吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(以下也稱"D即D"，非專利文獻(xiàn)1)、琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶(以下也稱"D即C"，非專利文獻(xiàn)2)、琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀?；?以下也稱"D即E"，非專利文獻(xiàn)3)、以及二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶(以下也稱"D即F"，非專利文獻(xiàn)4)。已經(jīng)清楚在棒狀桿菌型細(xì)菌中另外存在一條以THDP為前體的meso-DAP合成途徑，其使用meso-DAP脫氫酶(以下也稱"二氨基庚二酸脫氫酶"或"DDH")通過(guò)一步反應(yīng)從THDP合成meso-DAP，而且還已知DDH表達(dá)對(duì)于meso-DAP的生產(chǎn)是有用的(專利文獻(xiàn)10)。此外，已經(jīng)公開了如下內(nèi)容在考察埃希氏菌屬細(xì)菌L-賴氨酸生物合成的限速步驟的過(guò)程中，將編碼棒狀桿菌型細(xì)菌DDH的基因?qū)氚ＯＪ暇鷮俚腖-賴氨酸生產(chǎn)菌中，作為增強(qiáng)屬于meso-DAP合成途徑的酶的活性的替代手段，來(lái)進(jìn)行L-賴氨酸生產(chǎn)。然而，人們并未預(yù)想到，當(dāng)在埃希氏菌屬細(xì)菌中表達(dá)DDH時(shí)，降低屬于meso-DAP合成途徑的酶的活性對(duì)L-賴氨酸生產(chǎn)是有效的。專利文獻(xiàn)1特開平10-165180號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2特開平11-192088號(hào)公報(bào)4專利文獻(xiàn)3特開2000-253879號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4特開2001-057896號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5特開2002-17363號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6特許第2817400號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)7特表2002-508921號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)8國(guó)際公開第W003/008600號(hào)小冊(cè)子專利文獻(xiàn)9美國(guó)專利申請(qǐng)公開第0044943號(hào)專利文獻(xiàn)10特開昭61-289887號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)11國(guó)際公開第W02006/093322號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)12美國(guó)專利申請(qǐng)公開第2006/0160191號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)13美國(guó)專利6040160非專利文獻(xiàn)1Richaud，C.etal.，J.Biol.Chem.，259(23):14824-14828,1984非專利文獻(xiàn)2Heimberg，H.etal.，Gene.90(1):69-78，1990非專利文獻(xiàn)3Bouvier，J.etal.，J.Bacteriol.，174(16):5265-71，1992非專利文獻(xiàn)4Wiseman，J.S.etal.，J.Biol.Chem.，259(14):8907-14，198
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供L-賴氨酸生產(chǎn)能力提高的大腸桿菌以及使用該大腸桿菌來(lái)生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。解決問(wèn)題的方法本發(fā)明人等對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行修飾而降低屬于meso-DAP合成途徑的酶的活性，并且導(dǎo)入編碼二氨基庚二酸脫氫酶的基因，能夠提高L-賴氨酸生產(chǎn)能力，從而基于上述認(rèn)識(shí)完成了本發(fā)明。SP，本發(fā)明如下所述。(1)—種具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌，該大腸桿菌經(jīng)過(guò)修飾而降低了內(nèi)消旋a，e-二氨基庚二酸合成途徑的l種或2種以上的酶的活性，并且導(dǎo)入了編碼二氨基庚二酸脫氫酶的基因。(2)前述的大腸桿菌，其中，所述內(nèi)消旋a，e-二氨基庚二酸合成途徑的酶選自2，3，4，5-四氫吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶、琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶、琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀?；敢约岸被岵钕虍悩?gòu)酶。(3)前述的大腸桿菌，其中，所述2，3，4，5-四氫吡啶_2，6_二羧酸N_琥珀酰轉(zhuǎn)移酶、琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶、琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀酰基酶以及二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶分別由d即D基因、d即C基因、d即E基因以及d即F基因編碼。(4)前述的大腸桿菌，其中，內(nèi)消旋a，e-二氨基庚二酸合成途徑的酶的活性是通過(guò)降低所述基因的表達(dá)量或破壞所述基因而降低的。(5)前述的大腸桿菌，其經(jīng)過(guò)修飾而至少降低了2，3，4，5-四氫吡啶_2，6_二羧酸N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性。(6)前述的大腸桿菌，其中，所述編碼二氨基庚二酸脫氫酶的基因是棒狀桿菌型細(xì)菌的ddh基因。(7)前述的大腸桿菌，其中，所述2，3，4，5_四氫吡啶_2，6_二羧酸N_琥珀酰轉(zhuǎn)移酶是下述(A)或(B)所述的蛋白質(zhì)(A)具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B)具有在SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中包含1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列，且具有2，3，4，5-四氫吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。(8).前述的大腸桿菌，其中，所述琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶是下述(C)或(D)所述的蛋白質(zhì)(C)具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(D)具有在SEQIDNO:4所示的氨基酸序列中包含1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列，且具有琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白質(zhì)。(9).前述的大腸桿菌，其中，所述琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀酰基酶是下述(E)或(F)所述的蛋白質(zhì)(E)具有SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(F)具有在SEQIDNO:6所示的氨基酸序列中包含1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列，且具有琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀?；富钚缘牡鞍踪|(zhì)。(10).前述的大腸桿菌，其中，所述二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶是下述(G)或(H)所述的蛋白質(zhì)(G)具有SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(H)具有在SEQIDNO:8所示的氨基酸序列中包含1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列，且具有二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。(11).前述的大腸桿菌，其中，所述d即D基因是下述(a)或(b)所述的DNA:(a)包含SEQIDNO:1的堿基序列的DNA;或(b)與SEQIDNO:1的堿基序列或能夠由該堿基序列制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有2，3，4，5-四氫吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。(12).前述的大腸桿菌，其中所述d即C基因是下述(c)或(d)所述的DNA:(c)包含SEQIDNO:3的堿基序列的DNA;或(d)與SEQIDNO:3的堿基序列或能夠由該堿基序列制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。(13).前述的大腸桿菌，其中所述d即E基因是下述(e)或(f)所述的DNA:(e)包含SEQIDNO:5的堿基序列的DNA;或(f)與SEQIDNO:5的堿基序列或能夠由該堿基序列制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀?；富钚缘牡鞍踪|(zhì)的DNA。(14).前述的大腸桿菌，其中所述d即F基因是下述(g)或(h)所述的DNA:(g)包含SEQIDNO:7的堿基序列的DNA;或(h)與SEQIDNO:7的堿基序列或能夠由該堿基序列制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。(15).前述的大腸桿菌，其中，所述二氨基庚二酸脫氫酶是下述(I)或(J)所述的蛋白質(zhì)(I)具有SEQIDNO:10、12、14、16或18所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì);(J)具有在SEQIDN0:10、12、14、16或18所示的氨基酸序列中包含l個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列，且具有二氨基庚二酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。(16).前述的大腸桿菌，其中所述ddh基因是下述(i)或(j)所述的DNA:(i)包含SEQIDNO:9、11、13、15或17的堿基序列的DNA;或(j)與SEQIDNO:9、11、13、15或17的堿基序列或能夠由該堿基序列制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有二氨基庚二酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。(17).前述的大腸桿菌，該大腸桿菌還具有解除了由L-賴氨酸導(dǎo)致的反饋抑制的二氫吡啶二羧酸合酶，以及解除了由L-賴氨酸導(dǎo)致的反饋抑制的天冬氨酸激酶，并且該大腸桿菌的二氫吡啶二羧酸還原酶活性得到了增強(qiáng)。(18).—種生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求117中任一項(xiàng)所述的大腸桿菌，并且從該培養(yǎng)基中收集L-賴氨酸。發(fā)明的具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明?！?〉本發(fā)明的大腸桿菌本發(fā)明的大腸桿菌(以下也稱"本發(fā)明的細(xì)菌")是具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力、經(jīng)過(guò)修飾而降低了屬于meso-DAP合成途徑的酶的活性、而且導(dǎo)入了編碼二氨基庚二酸脫氫酶的基因的大腸桿菌。此外，本發(fā)明的優(yōu)選的細(xì)菌，是除了具有上述性質(zhì)外，還具有解除了由L-賴氨酸導(dǎo)致的反饋抑制的二氫吡啶二羧酸合酶以及解除了由L-賴氨酸導(dǎo)致的反饋抑制的天冬氨酸激酶，且二氫吡啶二羧酸還原酶活性得到了增強(qiáng)的細(xì)菌。本發(fā)明的細(xì)菌可以這樣獲得以具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌作為親本株，對(duì)其進(jìn)行修飾而使得其屬于meso-DAP合成途徑的酶的活性降低，進(jìn)而向其中導(dǎo)入編碼二氨基庚二酸脫氫酶的基因。對(duì)于降低屬于meso-DAP合成途徑的酶的活性的修飾，和編碼二氨基庚二酸脫氫酶的基因的導(dǎo)入這兩者的順序而言，沒有特別限制。此外，L-賴氨酸生產(chǎn)的賦予可以在所述修飾和基因?qū)胫g進(jìn)行，還可以在最后進(jìn)行。就為了獲得本發(fā)明的細(xì)菌而使用的大腸桿菌親本株而言，沒有特殊限制，具體地說(shuō)可以利用Neidhardt等的著作(Neidhardt，F(xiàn).C.etal.，EscherichiacoliandSalmonellaTyphimurium，AmericanSocietyforMicrobiology,WashingtonD.C.，1029table1)中列舉的微生物。具體而言，可以列舉出原型野生株K12株來(lái)源的大腸桿菌W3110(ATCC27325)、大腸桿菌MG1655(ATCC47076)等。這些菌株可以從例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland20852，UnitedStatesofAmerica)通過(guò)分售獲得。即，各菌株被給予了對(duì)應(yīng)的登錄號(hào)，可以利用該登錄號(hào)通過(guò)分售獲得。對(duì)應(yīng)于各菌株的登錄號(hào)見美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄?！?-1>L_賴氨酸生產(chǎn)能力的賦予以及具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌7作為大腸桿菌中的L-賴氨酸生產(chǎn)菌的例子，可以列舉出對(duì)L-賴氨酸類似物具有抗性的突變株。L-賴氨酸類似物可抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，但在培養(yǎng)基中有L-賴氨酸共同存在時(shí)，這種抑制會(huì)被完全或部分地解除。作為L(zhǎng)-賴氨酸類似物的例子，可以列舉出氧代賴氨酸(oxalysine)、賴氨酸氧肟酸(lysinehydroxamate)、S_(2_氨基乙基)_L_半胱氨酸(AEC)、Y-甲基賴氨酸、a-氯己內(nèi)酰胺等，但不限于此。對(duì)這些賴氨酸類似物具有抗性的突變株可以通過(guò)對(duì)大腸桿菌實(shí)施常規(guī)人工突變處理來(lái)獲得。作為可用于L-賴氨酸生產(chǎn)的細(xì)菌菌株的具體例子，可以列舉出大腸桿菌(E.coli)AJl1442(FERMBP-1543,NRRLB-12185;參照美國(guó)專利4，346，170)以及大腸桿菌VL611。在這些微生物中，L_賴氨酸對(duì)天冬氨酸激酶造成的反饋抑制已被解除。WC196株可以用作大腸桿菌中的L-賴氨酸生產(chǎn)菌。該菌株是通過(guò)對(duì)大腸桿菌K-12來(lái)源的W3110株賦予AEC抗性而選育獲得的。該菌株被命名為大腸桿菌AJ13069，于1994年12月6日保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，〒305-8566日本國(guó)茨城縣筑波市東l丁目l番地l中央第6)，保藏號(hào)FERMP-14690，并于1995年9月29日轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國(guó)際保藏，保藏號(hào)FERMBP-5252(美國(guó)專利5，827，698)。作為用于衍生L-賴氨酸生產(chǎn)菌的親本株的例子，還可以列舉出1種或1種以上的編碼L-賴氨酸生物合成系統(tǒng)酶的基因的表達(dá)增加的菌株。作為這樣的基因的例子，可以列舉出編碼二氫吡啶二羧酸合酶(d即A)、天冬氨酸激酶(lysC)、二氫吡啶二羧酸還原酶(d即B)、二氨基庚二酸脫羧酶(lysA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)以及天冬氨酸酶(aspA)(EP1253195A)的基因，但不限于此。此外，親本株中與能量效率相關(guān)的基因(cyo)(EP1170376A)、編碼煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶的基因(pntAB)(美國(guó)專利5，830，716)、ybjE基因(W02005/073390)、編碼谷氨酸脫氫酶的基因(gdhA)(Gene23:199-209(1983))或這些基因的組合表達(dá)水平增加也是可以的。括號(hào)內(nèi)是所述基因的簡(jiǎn)稱。大腸桿菌的lysC基因的堿基序列如SEQIDNO:21所示，編碼的天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQIDNO:22所示。大腸桿菌的dapA基因的堿基序列如SEQIDNO:23所示，編碼的二氫吡啶二羧酸合酶的氨基酸序列如SEQIDN0:24所示。大腸桿菌的d即B基因的堿基序列如SEQIDN0:25所示，編碼的二氫吡啶二羧酸還原酶的氨基酸序列如SEQIDNO:26所示。已知大腸桿菌來(lái)源的野生型二氫吡啶二羧酸合酶受到L-賴氨酸的反饋抑制，而大腸桿菌來(lái)源的野生型天冬氨酸激酶受到L-賴氨酸的阻遏和反饋抑制。因此，在使用d即A基因和lysC基因時(shí)，這些基因優(yōu)選是編碼不受由L-賴氨酸導(dǎo)致的反饋抑制的突變型酶的突變型基因。作為編碼不受由L-賴氨酸導(dǎo)致的反饋抑制的突變型二氫吡啶二羧酸合酶的DNA，可以列舉編碼具有SEQIDN0:24的第118位的組氨酸殘基被酪氨酸殘基取代而得的序列的蛋白質(zhì)的DNA。此外，作為編碼不受由L-賴氨酸導(dǎo)致的反饋抑制的突變型天冬氨酸激酶的DNA，可以列舉對(duì)具有SEQIDNO:22的第352位的蘇氨酸殘基被異亮氨酸殘基取代、第323位的甘氨酸殘基被天冬酰胺殘基取代、第318位的甲硫氨酸被異亮氨酸取代而成的序列的AKIII編碼的DNA(關(guān)于這些突變體，參照美國(guó)專利5661012以及6040160)。突變型DNA可以通過(guò)基于PCR等的定點(diǎn)突變法來(lái)獲得。已知的RSF1010來(lái)源的廣宿主域質(zhì)粒RSFD80、pCABl、pCABD2(美國(guó)專利6040160)是包含編碼具有如上文所述的突變的大腸桿菌突變型二氫吡啶二羧酸合酶的突變型d即A以及編碼突變型天冬氨酸激酶的突變型lysC的質(zhì)粒。經(jīng)RSFD80轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109株(美國(guó)專利6040160)被命名為AJ12396，該菌株于1993年10月28日被保藏于通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，〒305-8566日本國(guó)茨城縣筑波市東l丁目l番地l中央第6)，保藏號(hào)FERMP-13936,并于1994年11月1日轉(zhuǎn)為基于布達(dá)佩斯條約的國(guó)際保藏，保藏號(hào)FERMBP_4859。RSFD80可以從AJ12396株采用公知方法獲得。pCABl是在所述RSFD80中進(jìn)一步插入大腸桿菌的d即B基因而制備的。此外，pCABD2是通過(guò)在該pCABl中進(jìn)一步插入乳發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)2256株(ATCC13869)的ddh基因而制備的(美國(guó)專利6040160)。作為L(zhǎng)-賴氨酸生產(chǎn)菌或用于衍生L-賴氨酸生產(chǎn)菌的親本株的例子，可以列舉出催化從L-賴氨酸的生物合成途徑中改道而生成L-賴氨酸以外的化合物的反應(yīng)的酶的活性降低或缺損的菌株。作為催化從L-賴氨酸的生物合成途徑中改道而生成L-賴氨酸以外的化合物的反應(yīng)的酶的例子，可以列舉出高絲氨酸脫氫酶、賴氨酸脫羧酶(美國(guó)專利5，827，698)、以及蘋果酸酶(W02005/010175)。這里，為了降低或缺損賴氨酸脫羧酶活性，優(yōu)選降低編碼賴氨酸脫羧酶的cadA基因和ldcC基因這兩者的表達(dá)(國(guó)際公布第W02006/038695號(hào)小冊(cè)子)。為了提高甘油同化性，本發(fā)明中使用的細(xì)菌的glpR基因(EP1715056)的表達(dá)可以被弱化，或者其glpA、glpB、glpC、glpD、glpE、glpF、glpG、glpK、glpQ、glpT、glpX、tpiA、gldA、dhaK、dhaL、dhaM、dhaR、fsa以及talC基因等甘油代謝基因(EP1715055A)的表達(dá)可以被強(qiáng)化?！?-2>本發(fā)明的大腸桿菌的構(gòu)建接下來(lái)，對(duì)降低屬于meso-DAP合成途徑的酶的活性的修飾以及編碼二氨基庚二酸脫氫酶的基因的導(dǎo)入進(jìn)行說(shuō)明。大腸桿菌所具有的meso-DAP合成途徑是指從(S)_2，3，4，5_四氫吡啶_2，6_二羧酸((S)-2，3，4，5-四氫吡啶二羧酸)生成meso-DAP(內(nèi)消旋-2，6-二氨基庚二酸、內(nèi)消旋-a，e-二氨基庚二酸、或內(nèi)消旋-二氨基庚二酸)的途徑，其由以下的4步反應(yīng)催化。這些反應(yīng)是可逆反應(yīng)。在大腸桿菌中，meso-DAP合成途徑也稱為DapDCEF途徑。1)D即D(2，3，4，5-四氫吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶)(EC2.3.1.117)琥珀酰-CoA+(S)-2，3，4，5-四氫吡啶_2，6_二羧酸+H20—CoA+N_琥珀酰-L-2-氨基_6_酮庚二酸(N-succinyl-L-2-咖ino-6-oxoh印tanedioate)D即D由d即D基因編碼。大腸桿菌的d即D基因的序列如SEQIDNO:1所示，D即D的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。D即D的酶活性可以參考S.A，Simms等的方法(J.Biol.Chem.，1984，Mar10;259(5):2734-2741)來(lái)測(cè)定。2)D即C(琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶)(也稱SDAP氨基轉(zhuǎn)移酶)(EC2.6.1.17)N-琥珀酰-LL-2，6_二氨基庚二酸+2-酮戊二酸一N_琥珀酰_L_2-氨基_6_酮庚二酸+L_谷氨酸D即C由dapC基因編碼。大腸桿菌的dapC基因的序列如SEQIDNO:3所示，氨基9酸序列如SEQIDNO:4所示。D即C的酶活性可以采用Thilo，M.等的方法(J.Bacteriol.，2000，Jul;182(13):3626-3631)來(lái)測(cè)定。3)D即E(琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀酰基酶)(也稱SDAP脫琥珀?；?(EC3.5.1.18)N-琥珀酰-LL-2,6-二氨基庚二酸+H20—琥珀酸+LL_2，6_二氨基庚二酸D即E由dapE基因編碼。大腸桿菌的dapE基因的序列如SEQIDNO:5所示，氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。D即E的酶活性可以采用Lin，Y.K.等的方法(J.Biol.Chem.，1988，F(xiàn)eb5;263(4):1622-1627)來(lái)測(cè)定。4)D即F(二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶(EC5.1.1.7)LL-2，6-二氨基庚二酸一內(nèi)消旋_2，6-二氨基庚二酸(meso-2，6-di咖inopimalate)D即F由dapF基因編碼。大腸桿菌的dapF基因的序列如SEQIDNO:7所示，氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。D即F的酶活性可以參考Wiseman,J.S.等的方法(J.Biol.Chem.，1984，Jul25;259(14):8907-8914)來(lái)測(cè)定。此外，在本發(fā)明中，DDH(二氨基庚二酸脫氫酶)(EC1.4.1.16)是可逆地從內(nèi)消旋-2，6-二氨基庚二酸生成(S)-2，3，4，5-四氫吡啶-2，6-二羧酸的酶，其催化以下的反應(yīng)。內(nèi)消旋-2，6-二氨基庚二酸+1120+脆0+—(S)_2，3，4，5-四氫吡啶-2，6-二羧酸+NH3+NADPH+H+DDH的酶活性可以參考Misono，H.等的方法(J.Biol.Chem.，255,10599-10605，1980)來(lái)測(cè)定。編碼DDH的ddh基因在埃希氏菌屬細(xì)菌中是不存在的，可以使用谷氨酸棒桿菌(SEQIDN0:9)、乳發(fā)酵短桿菌(SEQIDNO:11)、Corynebacteriumefficiens(SEQIDNO:13)等棒狀桿菌型細(xì)菌的ddh基因。谷氨酸棒桿菌ATCC13032的ddh基因(NCgl2528)登錄于GenbankNP_601818.2GI:23308957，Corynebacteriumefficiens的ddh基因(CE2498)登錄于NP_739108.1GI:25029054。此夕卜，除了棒狀桿菌型細(xì)菌以外，還可以禾U用Herminiimonasarsenicoxydans的ddh基因(SEQIDNO:15)、多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)的ddh基因(SEQIDNO:17)。Herminiimonasarsenicoxydans的ddh基因登錄于GenbankYP_001100730.1GI:134095655，多形擬桿菌的ddh基因登錄于NP—810892.1GI:29347389。上述各基因以及所述的L-賴氨酸生物合成系統(tǒng)酶基因不僅限于具有上述基因信息的基因或者具有公知序列的基因，也可以是這些基因的同源物、人工修飾體等具有保守突變的基因，只要無(wú)損于所編碼的蛋白質(zhì)的功能即可。也就是說(shuō)，可以是編碼具有在公知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中包含1個(gè)或者數(shù)個(gè)位置上的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入或添加等而成的序列的蛋白質(zhì)的基因。這里，"l個(gè)或者數(shù)個(gè)"因氨基酸殘基在蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)中的位置或氨基酸殘基的種類而異，具體地說(shuō)優(yōu)選為120個(gè)、更優(yōu)選110個(gè)、更優(yōu)選15個(gè)。保守突變的代表是保守取代。所謂保守取代，當(dāng)取代位點(diǎn)是芳香族氨基酸時(shí)為Phe、Trp和Tyr之間，當(dāng)取代位點(diǎn)是疏水氨基酸時(shí)為L(zhǎng)eu、Ile和Val之間，是極性氨基酸時(shí)為Gln和Asn之間，是堿性氨基酸時(shí)為L(zhǎng)ys、Arg和His之間，當(dāng)是酸性氨基酸時(shí)為Asp和Glu之間，是具有羥基的氨基酸時(shí)為Ser和Thr之間的相互取代的突變。視為保守取代的取代具體包括例如用Ser或Thr取代Ala;用Gln、His或Lys取代Arg;用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn;用Asn、Glu或Gin取代Asp;用Ser或Ala取代Cys;用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gin;用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu;用Pro取代Gly;用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His;用Leu、Met、Val或Phe取代Ile;用Ile、Met、Val或Phe取代Leu;用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys;用Ile、Leu、Val或Phe取代Met;用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe;用Thr或Ala取代Ser;用Ser或Ala取代Thr;用Phe或Tyr取代Trp;用His、Phe或Trp取代Tyr;和用Met、Ile或Leu取代Val。此外，這樣的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等還包括因基于提供所述基因的微生物的個(gè)體差異、種間差異等情形而天然發(fā)生的突變(mutant或variant)而產(chǎn)生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。這樣的基因可以通過(guò)對(duì)公知基因的堿基序列進(jìn)行修飾，例如采用定點(diǎn)突變法使得所編碼的蛋白質(zhì)的特定部位的氨基酸殘基包含取代、缺失、插入或添加來(lái)獲得。而且，具有如上所述的保守突變的基因可以是編碼這樣的蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)相對(duì)于編碼的氨基酸序列整體具有80%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95%以上、特別優(yōu)選97%以上的同源性，且具有與野生型蛋白質(zhì)等同的功能。而且，在本說(shuō)明書中，"同源性"(homology)"有時(shí)指"同一性"(identity)。此外，可以將基因的序列中的各密碼子分別替換成易于在基因所導(dǎo)入的宿主中使用的密碼子。具有保守突變的基因可以通過(guò)突變劑處理等用于常規(guī)突變處理的方法來(lái)獲得。此外，基因還可以是這樣的DNA:其在嚴(yán)格條件下與能夠從公知的基因序列制備的探針、例如上文所述基因序列或其互補(bǔ)序列雜交，且編碼具有與公知的基因產(chǎn)物等同的功能的蛋白質(zhì)。這里，"嚴(yán)格條件"是指形成所謂特異性雜交體而不形成非特異性雜交體的條件。舉一實(shí)例，有這樣的條件在該條件下，具有高同源性的DNA之間，例如具有80X以上，優(yōu)選90%以上，更優(yōu)選95%以上，特別優(yōu)選具有97%以上同源性的DNA之間相互雜交，而同源性較之為低的DNA之間則不發(fā)生雜交；或者是這樣的條件在與常規(guī)Southern雜交的洗滌條件即60°C，1XSSC、0.1%SDS，優(yōu)選0.1XSSC、0.1%SDS，更優(yōu)選68°C，0.1XSSC、0.1%SDS相當(dāng)?shù)柠}濃度和溫度下，洗滌一次，更優(yōu)選兩次至三次的條件。作為探針，也可以使用基因的互補(bǔ)序列的一部分。這樣的探針可以使用基于公知基因序列制作的寡核苷酸作為引物，以包含這些堿基序列的DNA片段為模板進(jìn)行PCR來(lái)制作。例如，當(dāng)使用300bp左右長(zhǎng)度的DNA片段作為探針時(shí)，雜交的洗滌條件可以是例如5(TC、2XSSC、0.1%SDS。"經(jīng)過(guò)修飾而降低了meso-DAP合成途徑的酶活性"是指經(jīng)過(guò)了修飾而使得屬于meso-DAP合成途徑(以下也稱"DapDCEF途徑")的酶、具體地是DapD、DapC、DapE以及DapF這4種酶中的至少一種的活性完全消失，或者與大腸桿菌的非修飾株例如野生株相比活性降低。被降低活性的酶可以是D即D、D即C、D即E以及D即F中的任何酶，并且可以是1種或2種以上。優(yōu)選D即DCEF途徑的上游側(cè)的酶的活性，特別優(yōu)選的是進(jìn)行修飾而至少降低DapD的活性。所謂降低了D即DCEF途徑的酶活性，優(yōu)選是指，例如，D即DCEF途徑的各種酶活性與非修飾株例如野生株相比，每個(gè)菌體降低至50%以下、優(yōu)選30%以下，更優(yōu)選10%以下。此處，作為對(duì)照的大腸桿菌包括例如作為野生株的原型野生株K12株來(lái)源的大腸桿菌W3110(ATCC27325)、大腸桿菌MG1655(ATCC47076)等。關(guān)于使得D即DCEF途徑的酶活性降低的修飾，具體地說(shuō)可以這樣來(lái)實(shí)現(xiàn)缺損染色體上的編碼DapDCEF途徑的酶的基因，具體地是dapD、dapC、dapE或dapF基因的編碼區(qū)域的一部分或全部，或者對(duì)啟動(dòng)子、ShineDargarno(SD)序列等表達(dá)調(diào)節(jié)序列進(jìn)行修飾等。此外，通過(guò)對(duì)表達(dá)調(diào)節(jié)序列以外的非翻譯區(qū)域進(jìn)行修飾也能夠降低基因的表達(dá)量。而且，還可以缺失整個(gè)基因，包括染色體上的基因上下游序列。此外，還可以通過(guò)采用基因重組在染色體上的編碼酶的區(qū)域中導(dǎo)入氨基酸取代(錯(cuò)義突變)、或者導(dǎo)入終止密碼子(無(wú)義突變)、或者導(dǎo)入一二個(gè)堿基的添加或缺失的移框突變來(lái)實(shí)現(xiàn)(JournalofBiologicalChemistry272:8611-8617(1997)ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,USA955511-5515(1998)，JournalofBiologicalChemistry266,20833-20839(1991))。在本發(fā)明中，優(yōu)選利用同源重組，通過(guò)缺損染色體上的基因的表達(dá)調(diào)節(jié)序列例如啟動(dòng)子區(qū)域、或編碼區(qū)域、或非編碼區(qū)域的一部分或全部，或者通過(guò)在這些區(qū)域中插入其它序列，來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)的酶活性。然而，還可以通過(guò)照射X射線或紫外線，或通過(guò)使用N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍等突變劑進(jìn)行的常規(guī)突變處理來(lái)進(jìn)行修飾，只要該修飾使得DapDCEF途徑的酶活性降低即可。表達(dá)調(diào)節(jié)序列的修飾優(yōu)選為1個(gè)堿基以上、更優(yōu)選2個(gè)堿基以上、特別優(yōu)選3個(gè)堿基以上。此外，當(dāng)缺失編碼區(qū)域時(shí)，發(fā)生缺失的區(qū)域可以是N末端區(qū)域、內(nèi)部區(qū)域、C末端區(qū)域中的任何區(qū)域，也可以是編碼區(qū)域整體，只要產(chǎn)生的酶蛋白質(zhì)的功能降低或缺失即可。通常，缺失的區(qū)域越長(zhǎng)，越能夠切實(shí)地使基因失活。此外，優(yōu)選的是，要缺失的區(qū)域的上游和下游的閱讀框不一致。當(dāng)在編碼區(qū)域中插入其它序列的場(chǎng)合，基因的任何區(qū)域都可以插入，且插入的序列越長(zhǎng)，越能夠切實(shí)地使編碼酶的基因失活。優(yōu)選的是插入部位的上下游序列的閱讀框不一致。作為所述其它序列，沒有特殊限制，只要其能夠降低或缺損酶蛋白質(zhì)的功能即可，包括例如攜帶抗生素抗性基因或?qū)-賴氨酸生產(chǎn)有用的基因的轉(zhuǎn)座子等。為了對(duì)染色體上的基因進(jìn)行諸如所述的修飾，例如可以這樣來(lái)實(shí)現(xiàn)制作經(jīng)過(guò)修飾而缺失了基因的部分序列、不產(chǎn)生正常發(fā)揮功能的酶蛋白質(zhì)的缺失型基因，用包含該基因的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌，使缺失型基因與染色體上的基因之間發(fā)生同源重組，從而將染色體上的基因替換成缺失型基因。缺失型基因所編碼的酶蛋白質(zhì)即使產(chǎn)生也具有與野生型酶蛋白質(zhì)不同的立體結(jié)構(gòu)，其功能降低或消失?；诶萌缟纤龅耐粗亟M的基因取代的基因破壞已經(jīng)確立，包括下述方法稱為"Red驅(qū)動(dòng)整合(Red-drivenintegration)"的方法(Datsenko，K.A，andWa騰r，B.LProc.Natl.Acad.Sci.USA.97:6640-6645(2000))、Red驅(qū)動(dòng)整合法與A噬菌體來(lái)源的切出系統(tǒng)(Cho，E.H.，Gumport，R.I.，Gardner,J.F.J.Bacteriol.184:5200-5203(2002))相結(jié)合的方法(參照W02005/010175號(hào))等使用線性DNA的方法，或者使用含有溫度敏感復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒、可接合轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒的方法，利用在宿主內(nèi)不具有復(fù)制起點(diǎn)的自殺載體的方法，等等(美國(guó)專利6303383、或特開平05-007491號(hào))?；蜣D(zhuǎn)錄量的降低可以通過(guò)將從該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的量與野生株或非修飾株進(jìn)行比較來(lái)確認(rèn)。評(píng)價(jià)mRNA量的方法包括例如Northern雜交、RT-PCR等(Molecularcloning(ColdspringHarborLaboratoryPress,ColdspringHarbor(USA)，2001))?；蛩幋a的蛋白質(zhì)的量降低可以通過(guò)使用抗體進(jìn)行western印跡來(lái)確認(rèn)(Molecularcloning(ColdspringHarborLaboratoryPress,ColdspringHarbor(USA)，2001))。為了在大腸桿菌中導(dǎo)入編碼DDH的基因(ddh)，例如，可以利用質(zhì)粒、噬菌體等載體用ddh基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌。這樣的載體包括例如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、p麗119、p麗118、p麗219、p麗218等。DDH基因可以使用該基因固有的啟動(dòng)子，也可以使用在大腸桿菌中高效發(fā)揮功能的啟動(dòng)子，只要DDH基因能在大腸桿菌中表達(dá)即可。這樣的啟動(dòng)子包括例如lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、A噬菌體的PR啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子、tet啟動(dòng)子等。此夕卜，ddh基因也可以通過(guò)利用轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)座子(Berg，D.E.andBerg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))、Mu噬菌體(特開平2-109985)或同源性重組(ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLab.(1972))的方法整合到大腸桿菌的染色體上。而且，還可以使整合到染色體上的ddh基因發(fā)生轉(zhuǎn)移，來(lái)提高拷貝數(shù)。ddh基因?qū)氲拇_認(rèn)可以通過(guò)例如Southern雜交來(lái)進(jìn)行。此外，導(dǎo)入ddh基因的大腸桿菌具有DDH活性，可以通過(guò)例如采用味園春雄，發(fā)酵與工業(yè)(発酵i工業(yè))45，964(1987)中記載的方法測(cè)定DDH活性來(lái)確認(rèn)。此外，也可以使用抗體通過(guò)的western印跡檢測(cè)DDH?！?〉L-賴氨酸的生產(chǎn)方法本發(fā)明的L-賴氨酸生產(chǎn)方法用培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌，在該培養(yǎng)基中或菌體內(nèi)生成并蓄積L-賴氨酸，并從該培養(yǎng)基或菌體收集L-賴氨酸。作為所使用的培養(yǎng)基，可以使用在利用微生物的L-賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中傳統(tǒng)上使用的培養(yǎng)基。即，可以使用含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)離子以及視需要而定的其它有機(jī)成分的常規(guī)培養(yǎng)基。這里，作為碳源，可以使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物等糖類，甘油、山梨醇等醇類，富馬酸、檸檬酸、琥珀酸等有機(jī)酸類。作為氮源，可以使用硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等無(wú)機(jī)銨鹽，大豆水解物等有機(jī)氮、氨氣、氨氣水等。作為有機(jī)微量營(yíng)養(yǎng)源，理想的是摻入適量的維生素B1、L-高絲氨酸等要求的物質(zhì)或酵母提取物等。除此之外，還可以視需要少量添加磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。而且，本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基可以是天然培養(yǎng)基，也可以是合成培養(yǎng)基，只要是包含碳源、氮源、無(wú)機(jī)離子以及視需要而定的其它有機(jī)微量成分的培養(yǎng)基即可。特別地，在本發(fā)明中優(yōu)選使用甘油作為碳源。甘油可以是作為試劑的甘油，但理想的是使用工業(yè)生產(chǎn)的含雜質(zhì)的甘油。例如，理想的是使用通過(guò)用于生物柴油燃料生產(chǎn)的酯化反應(yīng)來(lái)工業(yè)生產(chǎn)的甘油(MuY，etal，BiotechnolLett.，28,1755-91759(2006)，HaasMJ，etal;BioresourTechnol.97，4，671-8678(2006))。本發(fā)明的培養(yǎng)基中所含的甘油可以作為單獨(dú)的碳源，也可以使用除甘油之外還添加了其它碳源的混合培養(yǎng)基。作為其它碳源，優(yōu)選葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、廢糖蜜、淀粉水解物以及生物質(zhì)水解而得到的糖液等糖類，乙醇等醇類，富馬酸、檸檬酸、琥珀酸等有機(jī)酸類。當(dāng)使用混合培養(yǎng)基時(shí)，優(yōu)選甘油相對(duì)于培養(yǎng)基中的總碳源的比率為50%以上、60%以上、理想的是70%以上、更理想的是80%以上、特別理想的是90%以上。培養(yǎng)可以在好氧條件下實(shí)施17天，培養(yǎng)溫度可以是24°C37"，培養(yǎng)中的pH可以是59。而且，pH調(diào)整可以使用無(wú)機(jī)或者有機(jī)的酸性或者堿性物質(zhì)，還可以使用氨氣等。從發(fā)酵液中回收L-賴氨酸可以通過(guò)組合使用常規(guī)的離子交換樹脂法、沉淀法及其它公知方法來(lái)實(shí)施。而且，當(dāng)L-賴氨酸在菌體內(nèi)蓄積時(shí)，可以例如利用超聲波等破碎菌體，再離心分離除去菌體而得到上清，然后用離子交換樹脂法等回收L-賴氨酸。而且，還可以通過(guò)采用下述方法進(jìn)行發(fā)酵，并回收賴氨酸的方法來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)，所述方法中控制培養(yǎng)中的pH為6.59.0、培養(yǎng)結(jié)束時(shí)培養(yǎng)基的pH為7.29.0，并且控制發(fā)酵中發(fā)酵罐內(nèi)壓力為正，或者，向培養(yǎng)基中供給二氧化碳或含有二氧化碳的混合氣體，使得存在培養(yǎng)基中的碳酸氫根離子和/或碳酸根離子為至少2g/L以上的培養(yǎng)期，并且以所述碳酸氫根離子和/或碳酸根離子作為以堿性氨基酸為主的陽(yáng)離子的反荷離子(參照特開2002-065287號(hào)，美國(guó)專利申請(qǐng)公開2002025564)。實(shí)施例以下，通過(guò)實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明?！矊?shí)施例1〕d即D被破壞的L-賴氨酸生產(chǎn)菌的構(gòu)建〈l-l〉d即D基因破壞株的構(gòu)建首先，使用大腸桿菌野生型株MG1655株進(jìn)行d即D破壞株的構(gòu)建。以p麗118(AattL-Knf-AattR)(參照國(guó)際公布第W02006093322號(hào)公報(bào))質(zhì)粒為模板，以SEQIDNO:19以及20所示的、在引物3'末端具有對(duì)應(yīng)于A噬菌體附著位點(diǎn)的序列attL和attR的兩端的序列、在引物5'末端具有對(duì)應(yīng)于作為目的基因的d即D基因的一部分的序列的合成寡核苷酸為引物進(jìn)行PCR，采用美國(guó)專利申請(qǐng)公開第2006/0160191號(hào)公報(bào)以及W02005/010175所述的A-red法構(gòu)建了MG1655Ad即D::att-Km株。A-red法中Km抗性重組體的獲得是通過(guò)于37t:在含Km(卡那霉素)(50mg/L)的L-瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)，并選擇Km抗性重組體來(lái)進(jìn)行的?！?-2>用Ad即D::att-kan轉(zhuǎn)化L-賴氨酸生產(chǎn)菌WC196LC/pCABD2株從〈1-1>中所得的MG1655AdapD::att-Km株按常規(guī)方法獲得Pl溶胞產(chǎn)物，以采用美國(guó)專利申請(qǐng)公開第2006/0160191號(hào)公報(bào)所述的方法構(gòu)建的L-賴氨酸生產(chǎn)菌WC196AcadAAldcC/pCABD2株作為宿主，采用Pl轉(zhuǎn)化法構(gòu)建了WC196AcadAAIdcCAdapD::att_Km/pCABD2株。WC196AcadAAldc株是采用將Red驅(qū)動(dòng)整合法(Datsenko，K.A.andWa騰r，B.L，2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97:6640-6645)與入噬菌體來(lái)源的切出系統(tǒng)(Cho，E.H.，Gumport，R.I.，Gardner,J.F.J.Bacteriol.184:5200-5203(2002))相結(jié)合的方法(參照W02005/010175號(hào))破壞了大腸桿菌WC196的賴氨酸脫羧酶基因cadA和ldc而得到的菌株。在該菌株中導(dǎo)入pCABD2而得的菌株為14WC196AcadAAldcC/pCABD2。目標(biāo)轉(zhuǎn)化株可以通過(guò)于37。C在含Km(卡那霉素)(50mg/L)和Sm(鏈霉素)(20mg/L)的L-瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)，并選擇Km抗性且Sm抗性的重組體來(lái)獲得。此外，將這些菌株于37t:在含20mg/L鏈霉素的L培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)至終0D600"0.6，然后加入與培養(yǎng)液等量的40%甘油溶液并攪拌，再以適當(dāng)?shù)牧窟M(jìn)行分裝，于-8(TC保存。這稱作甘油保存液。〔實(shí)施例2〕d即D被破壞的L-賴氨酸生產(chǎn)菌的L-賴氨酸生產(chǎn)能力評(píng)價(jià)融解實(shí)施例1中所得菌株的甘油保存液，取100iiL均勻涂布在含20mg/L鏈霉素的L平板上，于37t:培養(yǎng)24小時(shí)。將所得平板上的約l/8量的菌體懸浮在0.5mL的生理鹽水中，用分光光度計(jì)U-2000(日立)測(cè)定波長(zhǎng)600nm的濁度。將所得包含菌體的懸濁液接種在500mL坂口燒瓶中的含20mg/L鏈霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，組成如下述)20mL中，其中接種的液量使得波長(zhǎng)600nm的濁度為0.15，用往復(fù)式振蕩培養(yǎng)裝置在攪拌速度114rpm、溫度37。C的條件下培養(yǎng)約24小時(shí)。培養(yǎng)后，使用BiotecAnalyzerAS210(SAKURA精機(jī))測(cè)定培養(yǎng)基中蓄積的L-賴氨酸的量，以及殘存的葡萄糖。此外，使用BiotecAnalyzerBF-5(王子計(jì)測(cè)機(jī)器)測(cè)定培養(yǎng)基中蓄積的甘油?！舶l(fā)酵培養(yǎng)基組成，g/L〕葡萄糖或甘油40(NH4)2S0424K2HP0411.0MgS047H201.0FeS047H200.01MnS045H200.01酵母提取物2.0用K0H調(diào)整至pH7.O，于115"高壓滅菌10分鐘(但葡萄糖或甘油以及MgS04*7H20另行滅菌)后，加入符合藥典的CaC0330g/L(18(TC，干熱滅菌2小時(shí))。添加20mg/L的鏈霉素。結(jié)果如表1所示(0D表示26倍稀釋后于吸光度660nm測(cè)定而得的菌體量，Lys(g/L)表示燒瓶中蓄積的L-賴氨酸蓄積量，葡萄糖(g/L)、甘油(g/L)表示培養(yǎng)基中殘存的葡萄糖、甘油的量，收率(％)表示從基質(zhì)收獲的L-賴氨酸的收率)。由表l可知，與d即D基因未缺損的WC196AcadAAldcC/pCABD2株相比，WC196AcadAAldcCAd即D::att-Km/pCABD2株蓄積了更多量的L-賴氨酸。表lMS葡萄糖培養(yǎng)基菌株名0.D.(x26)Lys(g/L)葡萄糖(g/L)收率(％)WC196AcadAAldcC/pCABD2株0.3618.2818.6738.82WC196AcadAAldcCAdapD::att-Km/pCABD2株0.3778.7518.1340.0115MS甘油培養(yǎng)基<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>序列表的說(shuō)明〕SEQIDNO:1:大腸桿菌d即D的堿基序列SEQIDNO:2:大腸桿菌DapD的氨基酸序列SEQIDNO:3:大腸桿菌dapC的堿基序列SEQIDNO:4:大腸桿菌DapC的氨基酸序列SEQIDNO:5:大腸桿菌dapE的堿基序列SEQIDNO:6:大腸桿菌DapE的氨基酸序列SEQIDNO:7:大腸桿菌dapF的堿基序列SEQIDNO:8:大腸桿菌DapF的氨基酸序列SEQIDNO:9:谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)的ddh基因的堿基序列SEQIDNO:10:谷氨酸棒桿菌的DDH的氨基酸序列SEQIDNO:11:乳發(fā)酵短桿菌(B.lactofermentum)的ddh基因的堿基序列SEQIDNO:12:乳發(fā)酵短桿菌的DDH的氨基酸序列SEQIDNO:13:C.efficiens的ddh基因的堿基序列SEQIDNO:14:C.efficiens的DDH的氨基酸序列SEQIDNO:15:H.arsenicoxydans的ddh基因的堿基序列SEQIDNO:16:H.arsenicoxydans的DDH的氨基酸序列SEQIDNO:17:多形擬桿菌(B.thetaiotaomicron)的ddh基因的堿基序列SEQIDNO:18:多形擬桿菌的DDH的氨基酸序列SEQIDNO:19:d即D基因缺失用引物SEQIDNO:20:d即D基因缺失用引物SEQIDNO:21:大腸桿菌lysC的堿基序列SEQIDNO:22:大腸桿菌LysC的氨基酸序列SEQIDNO:23:大腸桿菌dapA的堿基序列SEQIDNO:24:大腸桿菌DapA的氨基酸序列SEQIDNO:25:大腸桿菌dapB的堿基序列SEQIDNO:26:大腸桿菌DapB的氨基酸序列工業(yè)實(shí)用件根據(jù)本發(fā)明，在依照使用大腸桿菌的發(fā)酵方法進(jìn)行L-賴氨酸的生產(chǎn)中，能夠提高L-賴氨酸的生產(chǎn)量和/或發(fā)酵收率。此外，本發(fā)明能夠用于大腸桿菌的L-賴氨酸生產(chǎn)菌的權(quán)利要求一種具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌，其特征在于該大腸桿菌經(jīng)過(guò)修飾而降低了內(nèi)消旋α，ε-二氨基庚二酸合成途徑的1種或2種以上的酶的活性，并且導(dǎo)入了編碼二氨基庚二酸脫氫酶的基因。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的大腸桿菌，其中，所述內(nèi)消旋a，e-二氨基庚二酸合成途徑的酶選自2，3，4，5-四氫吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶、琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶、琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀?；敢约岸被岵钕虍悩?gòu)酶。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大腸桿菌，其中，所述2，3，4，5-四氫吡啶-2，6-二羧酸N_琥珀酰轉(zhuǎn)移酶、琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶、琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀?；敢约岸被岵钕虍悩?gòu)酶分別由d即D基因、d即C基因、d即E基因以及d即F基因編碼。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大腸桿菌，其中，所述內(nèi)消旋a，e-二氨基庚二酸合成途徑的酶的活性是通過(guò)降低所述基因的表達(dá)量或破壞所述基因而降低的。5.根據(jù)權(quán)利要求24中任一項(xiàng)所述的大腸桿菌，其經(jīng)過(guò)修飾而至少降低了2，3，4，5_四氫吡啶_2，6-二羧酸N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性。6.根據(jù)權(quán)利要求15中任一項(xiàng)所述的大腸桿菌，其中，所述編碼二氨基庚二酸脫氫酶的基因是棒狀桿菌型細(xì)菌的ddh基因。7.根據(jù)權(quán)利要求26中任一項(xiàng)所述的大腸桿菌，其中，所述2，3，4，5-四氫吡啶_2，6-二羧酸N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶是下述(A)或(B)所述的蛋白質(zhì)(A)具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B)具有在SEQIDN0:2所示的氨基酸序列中包含l個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列，且具有2，3，4，5-四氫吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。8.根據(jù)權(quán)利要求27中任一項(xiàng)所述的大腸桿菌，其中，所述琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶是下述(C)或(D)所述的蛋白質(zhì)(C)具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(D)具有在SEQIDN0:4所示的氨基酸序列中包含l個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列，且具有琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白質(zhì)。9.根據(jù)權(quán)利要求28中任一項(xiàng)所述的大腸桿菌，其中，所述琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀?；甘窍率?E)或(F)所述的蛋白質(zhì)(E)具有SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(F)具有在SEQIDN0:6所示的氨基酸序列中包含l個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列，且具有琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀?；富钚缘牡鞍踪|(zhì)。10.根據(jù)權(quán)利要求29中任一項(xiàng)所述的大腸桿菌，其中，所述二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶是下述(G)或(H)所述的蛋白質(zhì)(G)具有SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(H)具有在SEQIDN0:8所示的氨基酸序列中包含l個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列，且具有二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。11.根據(jù)權(quán)利要求310中任一項(xiàng)所述的大腸桿菌，其中，所述d即D基因是下述(a)或(b)所述的DNA:(a)包含SEQIDNO:1的堿基序列的DNA;或(b)與SEQIDN0:1的堿基序列或能夠由該堿基序列制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有2，3，4，5-四氫吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。12.根據(jù)權(quán)利要求311中任一項(xiàng)所述的大腸桿菌，其中，所述d即C基因是下述(c)或(d)所述的DNA:(c)包含SEQIDNO:3的堿基序列的DNA;或(d)與SEQIDNO:3的堿基序列或能夠由該堿基序列制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。13.根據(jù)權(quán)利要求312中任一項(xiàng)所述的大腸桿菌，其中，所述d即E基因是下述(e)或(f)所述的DNA:(e)包含SEQIDNO:5的堿基序列的DNA;或(f)與SEQIDN0:5的堿基序列或能夠由該堿基序列制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀?；富钚缘牡鞍踪|(zhì)的DNA。14.根據(jù)權(quán)利要求313中任一項(xiàng)所述的大腸桿菌，其中，所述d即F基因是下述(g)或(h)所述的DNA:(g)包含SEQIDNO:7的堿基序列的DNA;或(h)與SEQIDN0:7的堿基序列或能夠由該堿基序列制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。15.根據(jù)權(quán)利要求114中任一項(xiàng)所述的大腸桿菌，其中，所述二氨基庚二酸脫氫酶是下述(I)或(J)所述的蛋白質(zhì)(I)具有SEQIDNO:10、12、14、16或18所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì);(J)具有在SEQIDNO:10、12、14、16或18所示的氨基酸序列中包含1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列，且具有二氨基庚二酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)。16.根據(jù)權(quán)利要求613中任一項(xiàng)所述的大腸桿菌，其中，所述ddh基因是下述(i)或(j)所述的DNA:(i)包含SEQIDNO:9、11、13、15或17的堿基序列的DNA;或(j)與SEQIDN0:9、ll、13、15或17的堿基序列或能夠由該堿基序列制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有二氨基庚二酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。17.根據(jù)權(quán)利要求116中任一項(xiàng)所述的大腸桿菌，該大腸桿菌還具有解除了由L-賴氨酸導(dǎo)致的反饋抑制的二氫吡啶二羧酸合酶以及解除了由L-賴氨酸導(dǎo)致的反饋抑制的天冬氨酸激酶，并且該大腸桿菌的二氫吡啶二羧酸還原酶活性得到了增強(qiáng)。18.—種生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求117中任一項(xiàng)所述的大腸桿菌，并且從該培養(yǎng)基中收集L-賴氨酸。全文摘要通過(guò)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)下述具有L-賴氨酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌，并從該培養(yǎng)基收集L-賴氨酸，來(lái)生產(chǎn)L-賴氨酸，所述大腸桿菌經(jīng)過(guò)修飾而降低了內(nèi)消旋α，ε-二氨基庚二酸合成途徑的1種或2種以上的酶，例如2，3，4，5-四氫吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶、琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶、琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀?；富蚨被岵钕虍悩?gòu)酶的活性，并且其中導(dǎo)入了編碼二氨基庚二酸脫氫酶的基因。文檔編號(hào)C12P13/00GK101765659SQ20088010022公開日2010年6月30日申請(qǐng)日期2008年7月22日優(yōu)先權(quán)日2007年7月23日發(fā)明者土井秀高,植田拓嗣申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社