專利名稱：茶氨酸的酶法生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于茶氨酸的酶法生產(chǎn)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
中國歷史上有很長(zhǎng)的飲茶紀(jì)錄，在世界上的很多地方飲茶的習(xí)慣是從中國傳過去 的。中國名茶在國際上享有很高的聲譽(yù)。茶的最早發(fā)現(xiàn)與利用，是從藥用開始的。茶在英國 人是健康之液，靈魂之飲；在我國被譽(yù)為"國飲"?，F(xiàn)代科學(xué)大量研究證實(shí)，茶葉確實(shí)含有 與人體健康密切相關(guān)的生化成份，茶葉不僅具有提神清心、清熱解暑、消食化痰、去膩減肥、 清心除煩、解毒醒酒、生津止渴、降火明目、止痢除濕等藥理作用，還對(duì)現(xiàn)代疾病，如輻射病、 心腦血管病、癌癥等疾病，有一定的藥理功效?？梢姡枞~藥理功效之多，作用之廣，是其他 飲料無可替代的。 茶葉具有藥理作用的主要成份是茶多酚、咖啡堿、脂多糖等。具體作用有1.有助 于延緩衰老。2、有助于抑制心血管疾病。3、有助于預(yù)防和抗癌。4、有助于預(yù)防和治療輻射 傷害。5、有助于抑制和抵抗病毒菌。6、有助于美容護(hù)膚。7、有助于醒腦提神。8、有助于利 尿解乏。9、有助于降脂助消化。10、有助于護(hù)齒明目。茶具有如此多的功效，所以茶葉提取 物一直是研究者重點(diǎn)研究和關(guān)注的對(duì)象。 茶氨酸(L-Theanine)系統(tǒng)命名為N-乙基-L谷氨酰胺，是1950年酒戶彌二郎博
士在研究玉露茶鮮爽滋味成分的過程中，從新梢中分離鑒定出的不參與組成蛋白質(zhì)的一種
氨基酸，為茶葉的特征氨基酸。它在綠茶中占游離氨基酸的40% 60%，是茶葉中含量最
多的氨基酸，在高級(jí)綠茶、新茶中含量豐富，占干茶含量的1% 2%左右。 雖然我國在茶葉的生產(chǎn)與消費(fèi)上居于世界前列，但對(duì)茶氨酸的研究相對(duì)滯后。日
本在這方面的研究起步較早且貢獻(xiàn)突出。茶氨酸之所以能在食品中得到廣泛應(yīng)用，其原因
主要是由于茶氨酸具有良好的安全性、穩(wěn)定性以及茶氨酸生產(chǎn)技術(shù)的改進(jìn)。目前，茶氨酸的
制備方法主要是通過化學(xué)合成、細(xì)胞組培、微生物發(fā)酵，以及單純地從茶葉或其富集液中提
取茶氨酸的方法。 利用低檔綠茶提取茶葉中的兒茶素，其廢棄物用于生產(chǎn)茶氨酸是當(dāng)前直接提取分 離茶氨酸的主要方法.目前層析技術(shù)富集茶氨酸已經(jīng)完全取代傳統(tǒng)的試劑沉淀法.離子交 換吸附法富集茶氨酸是利用茶氨酸在酸性條件下能與酸性陽離子交換樹脂交換吸附這一 基本特性進(jìn)行分離純化. 目前茶氨酸的化學(xué)合成法主要是谷氨酸_乙胺合成法將谷氨酸在室溫下脫水轉(zhuǎn) 化為環(huán)狀內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，然后控制一定條件，使乙胺與轉(zhuǎn)化成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的谷氨酸結(jié)合形成茶 氨酸。采用化學(xué)合成手段制備茶氨酸具有價(jià)格低、成本低、適合于工業(yè)化的特點(diǎn)。但是化學(xué) 合成制造的都是DL-型消旋體，需要進(jìn)行拆分才能得到L-型產(chǎn)品。 近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，利用微生物發(fā)酵來生產(chǎn)酶，進(jìn)而利用酶的提 取物來進(jìn)行目的物的生產(chǎn)越來越被廣泛地應(yīng)用。與化學(xué)合成法相比，生產(chǎn)茶氨酸的微生物 發(fā)酵法具有完全不同的特色。由于酶促反應(yīng)所具有的高度專一性，能將反應(yīng)底物快速的轉(zhuǎn)化為所需要的產(chǎn)品，并且轉(zhuǎn)化率高，副產(chǎn)物少，對(duì)環(huán)境的污染也小，是一種值得推廣和研究 的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供了一種茶氨酸的酶法生產(chǎn)方法。 本發(fā)明的目的之二是從篩選得到了一種高產(chǎn)氨基?；傅拿咕?，即剌孢小克銀漢
霉菌。該細(xì)菌所產(chǎn)的氨基?；缚蓮V泛的用于去乙?；磻?yīng)之中。 本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下 1.剌孢小克銀漢霉菌菌株的篩選培養(yǎng) 將采自于土壤中的樣品自然風(fēng)干后，用研缽碾碎，按照梯度稀釋法和涂布平板法 進(jìn)行分離操作。涂布好的平板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后，用紫外分析儀進(jìn)行觀察， 分析鑒定出剌孢小克銀漢菌。 挑取該菌落接至新鮮固體平板，將平板上的菌株用無菌水洗脫，接至培養(yǎng)液中振 搖培養(yǎng)。取稀釋至10ml的上述種子液分為2ml裝入小試管，在黑暗條件下進(jìn)行紫外線照射 處理，2『C _301:倒置培養(yǎng)l-3天至有單菌落出現(xiàn)。挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落反復(fù)進(jìn)行搖瓶發(fā) 酵復(fù)篩。經(jīng)過發(fā)酵復(fù)篩，我們將得到的產(chǎn)酶量高的菌株轉(zhuǎn)接到試管斜面培養(yǎng)基，于2『C恒溫 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28h-36h至試管斜面長(zhǎng)滿菌絲。然后再將其制成孢子懸浮液搖床培養(yǎng)，收集 得到的菌絲球。 2.dl-茶氨酸的乙?；?在堿性溶液中加入dl-茶氨酸，攪拌溶解，滴加乙酐，同時(shí)加堿控制溶液的ra為弱 堿性，反應(yīng)時(shí)用冰浴控制溫度，用茚三酮顯色反應(yīng)控制反應(yīng)終點(diǎn)。然后調(diào)節(jié)ra為強(qiáng)酸性，減
壓、脫鹽，再加入丙酮析出N-乙酰-dl-茶氨酸。 3.酶法拆分dl-茶氨酸及拆分產(chǎn)物的分離純化 配制N-乙酰-dl-茶氨酸溶液，調(diào)節(jié)ra值為中性，加入濕菌體放置恒溫振蕩器中 進(jìn)行轉(zhuǎn)化。過濾，調(diào)節(jié)PH，脫色。將JK008的陽離子交換樹脂柱處理成堿性然后用蒸餾水洗
柱為中性，料液上柱，收集l-茶氨酸的流出液，調(diào)節(jié)ra為酸性，濃縮結(jié)晶，得到l-茶氨酸。
未轉(zhuǎn)化的N-乙酰-dl-茶氨酸用蒸餾水洗脫下來，經(jīng)處理后繼續(xù)進(jìn)行拆分。 本發(fā)明以化工合成的原料dl-茶氨酸為原料，經(jīng)過乙?；?，利用從土壤中篩選
到的剌孢小克銀漢霉菌經(jīng)過紫外線誘變得到的高產(chǎn)氨基酰化酶菌株立體專一性地去乙酰
化，從而拆分dl-氨酸制備l-茶氨酸。與其它方法相比，該方法具有生產(chǎn)成本低、反應(yīng)條件
溫和、光學(xué)純度較高、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，極易于操作，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前
旦 足。
權(quán)利要求
茶氨酸的酶法生產(chǎn)，其特征在于包括以下步驟(1)刺孢小克銀漢霉菌菌株的篩選培養(yǎng)將采自于土壤中的樣品自然風(fēng)干后，用研缽碾碎，按照梯度稀釋法和涂布平板法進(jìn)行分離操作。涂布好的平板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后，用紫外分析儀進(jìn)行觀察，分析鑒定出刺孢小克銀漢菌。挑取該菌落接至新鮮固體平板，將平板上的菌株用無菌水洗脫，接至培養(yǎng)液中振搖培養(yǎng)。取稀釋至10ml的上述種子液分為2ml裝入小試管，在黑暗條件下進(jìn)行紫外線照射處理，28℃-30℃倒置培養(yǎng)1-3天至有單菌落出現(xiàn)。挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落反復(fù)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩。經(jīng)過發(fā)酵復(fù)篩，我們將得到的產(chǎn)酶量高的菌株轉(zhuǎn)接到試管斜面培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28h-36h至試管斜面長(zhǎng)滿菌絲。然后再將其制成孢子懸浮液搖床培養(yǎng)，收集得到的菌絲球。(2)DL-茶氨酸的乙酰化在堿性溶液中加入DL-茶氨酸，攪拌溶解，滴加乙酐，同時(shí)加堿控制溶液的PH為弱堿性，反應(yīng)時(shí)用冰浴控制溫度，用茚三酮顯色反應(yīng)控制反應(yīng)終點(diǎn)。然后調(diào)節(jié)PH為強(qiáng)酸性，減壓、脫鹽，再加入丙酮析出N-乙酰-DL-茶氨酸。(3)酶法拆分DL-茶氨酸及拆分產(chǎn)物的分離純化配制N-乙酰-DL-茶氨酸溶液，調(diào)節(jié)PH值為中性，加入濕菌體放置恒溫振蕩器中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。過濾，調(diào)節(jié)PH，脫色。將JK008的陽離子交換樹脂柱處理成堿性然后用蒸餾水洗柱為中性，料液上柱，收集L-茶氨酸的流出液，調(diào)節(jié)PH為酸性，濃縮結(jié)晶，得到L-茶氨酸。未轉(zhuǎn)化的N-乙酰-DL-茶氨酸用蒸餾水洗脫下來，經(jīng)處理后繼續(xù)進(jìn)行拆分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求(1)中所說的分析鑒定出剌孢小克銀漢菌，其剌孢小克銀漢菌特征在 于菌落初呈白色，后灰白色。大量的分生孢子形成時(shí)，表面呈粉末狀。最適宜的生長(zhǎng)溫度 為28-30度。菌絲的分枝繁茂，直徑約12微米。分生的孢子梗聚傘狀或擬雙分叉分枝，頂 端形成一個(gè)泡囊，接近球形。泡囊表面生著小梗，小梗上形成分生孢子，上面密密生長(zhǎng)約4 微米的小剌，無色。
3. 根據(jù)權(quán)利要求(1)中所說的接至培養(yǎng)液中振搖培養(yǎng)，其特征在于按5%的接種量接 至培養(yǎng)液中28°C -30°。振搖(120r/min)培養(yǎng)24h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求(1)中所說的在黑暗條件下進(jìn)行紫外線照射處理，其特征在于用15W 的紫外燈，距離固定在30厘米左右，照射時(shí)間為1分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求(3)中所說加入濕菌體放置恒溫振蕩器中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其特征在于轉(zhuǎn)化 溫度為5(TC，振蕩頻率為130r/min，轉(zhuǎn)化時(shí)間為30h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種茶氨酸的酶法生產(chǎn)方法。以化工合成的原料DL-茶氨酸為原料，經(jīng)過乙酰化后，利用從土壤中篩選到的刺孢小克銀漢霉菌經(jīng)過紫外線誘變得到的高產(chǎn)氨基酰化酶菌株立體專一性地去乙?；?，從而拆分DL-氨酸制備L-茶氨酸。與其它方法相比，該方法具有生產(chǎn)成本低、反應(yīng)條件溫和、光學(xué)純度較高、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，極易于操作，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P41/00GK101760499SQ20081012171
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日
發(fā)明者吳菁, 陳群 申請(qǐng)人:湖州來色生物基因工程有限公司;吳菁