專利名稱：：從發(fā)酵微生物中提高有機(jī)物產(chǎn)生的方法和組合物的制作方法從發(fā)酵微生物中提高有機(jī)物產(chǎn)生的方法和組合物I.相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考該申請(qǐng)要求在2007年10月12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/979，720的權(quán)益，特此以其整體引入作為參考。II.介紹A.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及使用糖化和發(fā)酵方法和組合物從發(fā)酵微生物中產(chǎn)生有機(jī)物。B.
背景技術(shù)：
：由于不可再生能源方法的限制，復(fù)合多糖如纖維素作為可再生能源的潛力是巨大的。纖維素可轉(zhuǎn)化成糖，如葡萄糖，并被許多微生物，包括細(xì)菌、酵母和其它真菌用作能源用于工業(yè)目的。纖維素材料作為可再生碳源被利用依賴于經(jīng)濟(jì)可行性方法的發(fā)展，所述方法用于將纖維素水解成糖，并將這些糖轉(zhuǎn)化成可用燃料，如乙醇。纖維素可通過稱作纖維素酶的酶降解成產(chǎn)物，如葡萄糖、纖維二糖和其它纖維寡糖。纖維素酶協(xié)同作用將纖維素水解成葡萄糖。外切纖維二糖水解酶(CBH)如CBHI和CBHII通常作用于纖維素末端產(chǎn)生纖維二糖，而內(nèi)切葡聚糖酶(EG)在纖維素隨機(jī)位置上起作用。這些酶一起將纖維素水解成較小的纖維寡糖，如纖維二糖。纖維二糖通過β葡糖苷酶水解成葡萄糖。盡管許多微生物能夠降解纖維素，但僅少數(shù)這些微生物產(chǎn)生大量能夠完全水解微晶纖維素的酶。至今，這些菌株也不能將所得產(chǎn)物有效地轉(zhuǎn)化成工業(yè)規(guī)模有機(jī)物，如乙醇。通常使用多種發(fā)酵微生物如市售酵母菌株進(jìn)行所述第二步來產(chǎn)生乙醇。雖然在生態(tài)學(xué)角度上期望開發(fā)可再生有機(jī)物如纖維素乙醇，但該多級(jí)過程也仍然不能在經(jīng)濟(jì)上與不可再生碳源如油和天然氣競(jìng)爭(zhēng)。因此，仍然強(qiáng)烈需要開發(fā)從發(fā)酵微生物產(chǎn)生有機(jī)物，如從原材料產(chǎn)生乙醇的更有效系統(tǒng)。因而期望提高纖維素材料的酶促水解(糖化)和發(fā)酵的效率和經(jīng)濟(jì)性。II.發(fā)明概述本發(fā)明涉及使用同步糖化和發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)物的方法和組合物。本發(fā)明的一個(gè)方面提供通過同步糖化和發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)物，其包括在缺少補(bǔ)充氮源的情況下組合纖維素底物、全發(fā)酵液和發(fā)酵微生物，并在有助于纖維素水解成葡萄糖和/或木糖并有助于葡萄糖和/或木糖轉(zhuǎn)化成有機(jī)物的條件下孵育所述纖維素底物、全發(fā)酵液和發(fā)酵微生物。本發(fā)明的一個(gè)方面提供通過同步糖化和發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的方法，其包括在缺少補(bǔ)充氮源的情況下組合纖維素底物，全發(fā)酵液，并在有助于纖維素水解成葡萄糖并有助于葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙醇的條件下孵育所述纖維素底物、全發(fā)酵液和產(chǎn)乙醇微生物(ethanologenicmicroorganism)。本發(fā)明也涉及用于從發(fā)酵微生物產(chǎn)生有機(jī)物的反應(yīng)組合物，其包含纖維素底物、全發(fā)酵液和發(fā)酵微生物的混合物，其中所述反應(yīng)組合物基本無補(bǔ)充氮源。本發(fā)明的另一方面提供用于產(chǎn)生乙醇的反應(yīng)組合物，其包含纖維素底物、全發(fā)酵液和產(chǎn)乙醇微生物的混合物，其中所述反應(yīng)組合物基本無補(bǔ)充氮源。III.附圖簡(jiǎn)述技術(shù)人員將理解附圖僅為說明性目的，并不旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。圖1顯示了酸預(yù)處理的甘蔗渣在缺少補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)的情況下同步糖化和發(fā)酵所得的乙醇(ETOH)濃度(g/L)。圖2顯示了必須向澄清的發(fā)酵液補(bǔ)充額外的營(yíng)養(yǎng)，以達(dá)到與酸預(yù)處理的甘蔗渣用全發(fā)酵液同步糖化和發(fā)酵得到的乙醇濃度相當(dāng)?shù)囊掖紳舛?。圖3提供了在有補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)和無補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)的情況下用全發(fā)酵液同步糖化和發(fā)酵的比較。圖4提供了酸預(yù)處理的甘蔗渣使用全發(fā)酵液和補(bǔ)充有β-葡糖苷酶的澄清發(fā)酵液糖化的比較，所述β“葡糖苷酶以有相同量的纖維素水解活力的量補(bǔ)充。IV.發(fā)明詳述應(yīng)理解上述一般性描述和以下詳細(xì)描述僅為示例性和說明性的，并不限制此處所述的組合物和方法。除非此處另有說明，此處所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明隸屬領(lǐng)域一名普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。在該申請(qǐng)中，單數(shù)的使用包括復(fù)數(shù)，除非另有明確說明?！盎蛘摺钡氖褂帽硎尽昂?或”，除非另有說明。同樣，術(shù)語“包含”、“包括”、“含有”和“含”不旨在限制。此處所涉及的所有專利和出版物，包括這些專利和出版物中公開的所有氨基酸和核苷酸序列明確地引入作為參考。此處提供的標(biāo)題不是本發(fā)明多個(gè)方面或?qū)嵤┓桨傅南拗?，其可通過參考說明書整體而得到。因此，此處術(shù)語通過參考說明書整體而得到更詳細(xì)定義。本發(fā)明涉及使用同步糖化和發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)物的方法和組合物。本發(fā)明也涉及通過同步糖化和發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)物的方法，其包括(a)在缺少補(bǔ)充氮源的情況下組合纖維素底物、全發(fā)酵液和發(fā)酵微生物；和(b)在有助于纖維素水解成葡萄糖和/或木糖并有有助于葡萄糖和/或木糖轉(zhuǎn)化成有機(jī)物的情況下孵育所述纖維素底物、全發(fā)酵液和發(fā)酵微生物。此處還提供從發(fā)酵微生物產(chǎn)生有機(jī)物的反應(yīng)組合物。在一些實(shí)施方案中，用于從發(fā)酵微生物產(chǎn)生有機(jī)物的反應(yīng)組合物主要由纖維素底物、全發(fā)酵液、發(fā)酵微生物和水的混合物組成。在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生有機(jī)物的反應(yīng)組合物包含纖維素底物、全發(fā)酵液和發(fā)酵微生物的混合物，其中所述反應(yīng)組合物基本無補(bǔ)充氮源。如此處所用，術(shù)語“纖維素底物”指含有纖維素和/或半纖維素的任何植物生物量材料。纖維素底物也可以是木質(zhì)素纖維材料，其由彼此交聯(lián)和與木質(zhì)素交聯(lián)的纖維素、半纖維素和葡聚糖組成。這些纖維素底物也可含有其它材料，如果膠、蛋白質(zhì)淀粉和脂類，但優(yōu)選具有作為主要成分的纖維素、半纖維素和β"葡聚糖。纖維素底物合適的非限制性實(shí)例包括，但不限于生物量、草本材料、農(nóng)業(yè)廢物、森林殘?jiān)?、市區(qū)固體廢物、廢紙和紙漿和紙殘?jiān)Ｓ糜诒景l(fā)明的纖維素底物的常見形式包括，但不限于樹、灌木和草、小麥、麥秸、甘蔗渣、玉米、玉米外皮、玉米芯包括來自芯的纖維，來自谷物如玉米碾磨(包括濕磨和干磨)的產(chǎn)品和副產(chǎn)品，以及市區(qū)固體廢物、廢紙和庭院廢物?？蓮摹霸锪俊?如樹、灌木、草、果實(shí)、花、草本農(nóng)作物、硬木和軟木)、“非原生生物量”(如農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品、商業(yè)有機(jī)廢物、建設(shè)和拆毀碎片、市區(qū)固體廢物和庭院廢物)，或“混合生物量”(其為原生和非原生生物量的混合物)獲得所述纖維素底物。在一些實(shí)施方案中，纖維素底物包括木材、木質(zhì)紙漿、造紙污泥、紙漿廢水、碎木板、玉米秸稈、玉米纖維、稻、紙和紙漿加工廢物、木本或草本植物、果漿、蔬菜肉漿、浮石粉、酒糟、草、稻殼、甘蔗渣、棉花、黃麻、大麻、亞麻、竹子、劍麻、馬尼拉麻、稻草、玉米芯、酒糟、樹葉、麥秸、椰子毛、藻類、柳枝稷及其混合物?？稍瓨邮褂美w維素底物或使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理。這些預(yù)處理包括化學(xué)、物理和生物預(yù)處理。例如，物理預(yù)處理技術(shù)可包括，但不限于多種類型的碾磨、壓碎、蒸煮/蒸氣爆破、輻射和水熱解(hydrothermolysis)?；瘜W(xué)預(yù)處理技術(shù)可包括，但不限于稀釋酸、堿、有機(jī)溶劑、氨、二氧化硫、二氧化碳和PH-控制水熱解。生物預(yù)處理技術(shù)可包括，但不限于應(yīng)用木質(zhì)素溶解微生物。在本發(fā)明公開內(nèi)容中，可從用于降解纖維素底物的任何絲狀真菌中制備全發(fā)酵液。術(shù)語“絲狀真菌”指本領(lǐng)域技術(shù)人員識(shí)別的任何和全部絲狀真菌，并包括天然發(fā)生的絲狀真菌、具有天然發(fā)生或經(jīng)誘導(dǎo)的突變的絲狀真菌和已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾的絲狀真菌。一般而言，絲狀真菌是真核微生物并包括真菌亞門(Eumycotina)和Oomycota的所有絲狀體形式。這些真菌的特征在于具有由殼多糖、葡聚糖和其它復(fù)合多糖組成的細(xì)胞壁的植物性菌絲體。在一些實(shí)施方案中，本教導(dǎo)的絲狀真菌在形態(tài)上、生理上和遺傳上與酵母不同。在一些實(shí)施方案中，從支頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、裸孢殼屬(Emericella)、鐮孢屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、鏈孢霉屬(Neurospora)、柱霉屬(Scytalidium)、梭孢殼屬(Thielavia),Tolypocladium或木霉屬(Trichoderma)物種或衍生自其的物種制備全發(fā)酵液。在一些實(shí)施方案中，從棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)>Aspergillusfoetidus、Aspergillusjaponicus、Aspergillusnidulans、黑曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)的發(fā)酵中制備全發(fā)酵液。另一方面，從Fusariumbactridioides、Fusariumcerealis、Fusariumcrookwellense、大刀鍵刀菌(Fusariumculmorum)、禾谷鍵刀菌(Fusariumgraminearum)、Fusariumgraminum、Fusariumheterosporum、Fusariumnegundi、尖抱鍵刀菌(Fusariumoxysporum)、Fusariumreticulatum、粉紅色鍵刀菌(Fusariumroseum)、Fusariumsambucinum、Fusariumsarcochroum、擬分枝孢鐮刀菌(Fusariumsporotrichioides)、硫色鐮刀菌(Fusariumsulphureum)、Fusariumtorulosum、類擬絲抱鍵刀菌(Fusariumtrichothecioides)或Fusariumvenenatum制備全發(fā)酵液。在另一方面，從Humicolainsolens、Humicolalanuginosa>Mucormiehei、Myceliophthorathermophila>|fjcIil包M(Neurosporacrassa)>ScytalidiumthermophilumgJcThielaviaterrestris白勺"Μ.酵中制備全發(fā)酵液。另一方面，從Trichodermaharzianum，康寧木霉(Trichodermakoningii),Trichodermalongibrachiatum,Jl氏木β(Trichodermareesei)M如RL-P37(Sheir-Neiss等，Appl.Microbiol.Biotechnology，20(1984)第46-53頁；MontenecourtB.S.，Can.，1-20,1987)、QM9414(ATCCNo.26921)、NRRL15709、ATCC13631、56764、56466、56767或綠色木霉(Trichodermaviride)例如ATCC32098和32086的發(fā)酵中制備全發(fā)酵液。在一些實(shí)施方案中，從包括但不限于以下屬曲霉屬、支頂孢屬、短梗霉屬(Aureobasidium)、白僵菌屬(Beauveria)、頭抱霉屬(Cephalosporium)、Ceriporiopsis、黑毛菌屬(Chaetomium)、擬青霉屬(paecilomyces)、金小孢子屬(Chrysosporium)、麥角菌屬(Claviceps)、Cochiobolus、隱球菌屬(Cryptococcus)、黑蛋巢菌(Cyathus)、Endothia、Endothiamucor、鍵抱屬、Gilocladium、腐質(zhì)霉屬、禾@溫病菌(Magnaporthe)、毀絲霉屬、漆斑菌屬(Myrothecium)、毛霉屬、鏈孢霉屬、白腐真菌(Phanerochaete)、足孢子菌屬(Podospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、Pyricularia、根毛霉菌屬(Rhizomucor)、酒曲菌屬(Rhizopus)、Schizophylum>Stagonospora>足果節(jié)菌屬(Talaromyces)、β屬(Trichoderma)、Thermomyces>Thermoascus>梭包殼屬、Tolypocladium>M'MMM(Trichophyton)和Trametespleurotus的絲狀真菌的發(fā)酵中制備全發(fā)酵液。在一些實(shí)施方案中，從包括但不限于以下構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)、A.awomari、棘孢曲霉(A.aculeatus)、A.kawachi例如NRRL3112、ATCC22342(NRRL3112)、ATCC44733、ATCC14331和菌株UVK143f、米曲霉(A.oryzae)，例如ATCC11490、粗糙脈孢菌(N.crassa)、里氏木霉(Trichodermareesei)，例如NRRL15709、ATCC13631、56764、56765、56466、56767和綠色木霉，例如ATCC32098和32086的絲狀真菌的發(fā)酵中制備全發(fā)酵液。在優(yōu)選實(shí)施方案中，從木霉屬物種的發(fā)酵中制備所述全發(fā)酵液。用于本發(fā)明的尤其優(yōu)選的物種和菌株是里氏木霉RutC30全部纖維素酶，其可從美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(AmericanTypeCultureCollection)作為里氏木霉ATCC56765獲得。如上所述，可從非重組和/或重組絲狀真菌的發(fā)酵中制備全發(fā)酵液。在一些實(shí)施方案中，絲狀真菌是包含與所述絲狀真菌同源或異源的一個(gè)或更多個(gè)基因的重組絲狀真菌。在一些實(shí)施方案中，絲狀真菌是包含與所述絲狀真菌同源或異源的一個(gè)或更多個(gè)基因的重組絲狀真菌，其中所述一個(gè)或更多個(gè)基因編碼可降解纖維素底物的酶。編碼纖維素材料降解酶的基因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所知。編碼降解纖維素底物的酶的基因的合適非限制性實(shí)例包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維素二糖水解酶、葡萄糖水解酶、β“葡糖苷酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、半乳聚糖酶、arabinanases、果膠酸裂合酶、果膠裂合酶、果膠酸裂合酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠乙酰酯酶、果膠甲基酯酶、α-阿拉伯呋喃糖酶、β-半乳糖苷酶、半乳聚糖酶、arabinanases、α-阿拉伯呋喃糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶(rhamnogalacturonases)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、xylogalacturonosidases、xylogalacturonases、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳依賴型過氧化物酶和漆酶。在一些實(shí)施方案中，全發(fā)酵液可補(bǔ)充并非絲狀真菌內(nèi)源表達(dá)的，或以相對(duì)低水平表達(dá)的一種或更多種酶活性，以提高纖維素底物降解為例如可發(fā)酵糖，如葡萄糖或木糖。補(bǔ)充的酶可作為補(bǔ)充物添加到全發(fā)酵液中，并且所述酶可以是分離的全發(fā)酵液的組分，或可以是純化的，或是以最低程度回收和/或純化的。補(bǔ)充酶的合適的非限制性實(shí)例包括纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β“葡糖苷酶、外切_β-1，3(4)-葡聚糖酶、葡萄糖水解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、半乳聚糖酶、arabinanases,果膠酸裂合酶、果膠裂合酶、果膠酸裂合酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠乙酰酯酶、果膠甲基酯酶、β-半乳糖苷酶、半乳聚糖酶、arabinanases、α-阿拉伯呋喃糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、ferrulicacid酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、xylogalacturonosidase、xylogalacturonase、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳依賴型過氧化物酶、具有木質(zhì)素過氧化物酶和錳依賴型過氧化物酶的組合性質(zhì)的雜合過氧化物酶、葡萄糖淀粉酶、淀粉酶、蛋白酶和漆酶。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，全發(fā)酵液包含重組絲狀真菌發(fā)酵的全發(fā)酵液，該重組絲狀真菌過表達(dá)提高纖維素底物降解的酶?；蛘?，所述全發(fā)酵液可包含非重組絲狀真菌和重組絲狀真菌發(fā)酵的全發(fā)酵液的混合物，該重組絲狀真菌過表達(dá)提高纖維素底物降解的酶。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，全發(fā)酵液包含過表達(dá)葡糖苷酶的絲狀真菌發(fā)酵的全發(fā)酵液?；蛘撸糜诒景l(fā)明方法和反應(yīng)組合物的所述全發(fā)酵液可包含非重組絲狀真菌發(fā)酵的全發(fā)酵液和過表達(dá)β“葡糖苷酶的重組絲狀真菌發(fā)酵的全發(fā)酵液的混合物。術(shù)語“β-葡糖苷酶”此處定義為分類為EC3.2.1.21的β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，和/或在某些GH家族，包括但不限于GH家族1、3、7、9或48中的那些，其催化纖維二糖水解釋放β-D-葡萄糖。過表達(dá)的β-葡糖苷酶可來自相同或不同物種，而不是來自宿主絲狀真菌。值得注意的是，過表達(dá)的葡糖苷酶不需要是真菌葡糖苷酶。在一些實(shí)施方案中，可通過表達(dá)編碼β-葡糖苷酶的基因產(chǎn)生β-葡糖苷酶。例如，所述β-葡糖苷酶可通過革蘭氏陽性菌(如桿菌(Bacillus)和放線菌(Actinomycetes))或真核宿主(例如木霉屬、曲霉屬、酵母菌屬和畢赤酵母)分泌到細(xì)胞外間隙。應(yīng)理解在一些實(shí)施方案中，所述β-葡糖苷酶可在重組微生物中相對(duì)于天然水平進(jìn)行過表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，如果宿主細(xì)胞用于表達(dá)所述葡糖苷酶，可對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以降低對(duì)該細(xì)胞而言為內(nèi)源的一個(gè)或更多蛋白質(zhì)的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可含有一個(gè)或更多天然基因，尤其是編碼已經(jīng)缺失或失活的分泌蛋白質(zhì)的基因。例如，一個(gè)或更多蛋白酶編碼基因(例如天冬氨酰蛋白酶編碼基因；參閱Berka等，Gene199086153-162和USP6,509,171)或纖維素酶編碼基因可缺失或失活。在一個(gè)實(shí)施方案中，木霉屬物種的宿主細(xì)胞可以是里氏木霉宿主細(xì)胞，在cbhl、cbh2和egll和egl2基因中含有失活缺失，如WO05/001036中所述。編碼β-葡糖苷酶的核酸可存在于木霉屬物種的宿主細(xì)胞的細(xì)胞核基因組中或可存在于例如在木霉宿主細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒中?？墒褂玫摩?葡糖苷酶的優(yōu)選實(shí)例包括來自棘孢曲霉(Kawaguchi等，1996，Gene173:287_288)、Aspergilluskawachi(Iwashita等，1999,App1.Environ.Microbiol.655546-5553)、米曲霉(W02002/095014)Xellulomonasbiazotea(Wong等，1998，Gene20779-86)、Saccharomycopsisfibuligera(Machida等，1988,App1.Environ.Microbiol.543147-3155)、裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)(Wood等，2002，Nature415871-880)的β-葡糖苷酶，和里氏木霉的β-葡糖苷酶1(美國(guó)專利號(hào)6，022，725)、里氏木霉的葡糖苷酶3(美國(guó)專利號(hào)6，982，159)、里氏木霉的β_葡糖苷酶4(美國(guó)專利號(hào)7，045，332)、里氏木霉的β-葡糖苷酶5(美國(guó)專利號(hào)7，005，289)，里氏木霉的β-葡糖苷酶6(美國(guó)專利20060258554)、里氏木霉的β-葡糖苷酶7(美國(guó)專利20040102619)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，全發(fā)酵液具有至少400pNPGU/gβ-葡糖苷酶活性，其中一個(gè)pNPG單位的活性表示在50°C和ρΗ4.8下10分鐘內(nèi)從對(duì)-硝基苯基-B-D-批喃葡萄糖苷釋放1μmol硝基苯酚。可使用本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定β_葡糖苷酶的活性和全部纖維素酶制劑的活性。在該上下文中，可使用以下條件?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法，如Chen，H.；Hayn,M.；Esterbauer,H."PurificationandcharacterizationoftwoextracellularβglucosidasesfromTrichodermareesei”，BiochimicaetBiophysicaActa，1992，1121，54-60描述的測(cè)定方法來測(cè)定β-葡糖苷酶的活性。一個(gè)pNPG表示在50°C(122°F)和pH4.8下10分鐘內(nèi)從對(duì)-硝基苯基-B-D-吡喃葡萄糖苷釋放1μmol硝基酚?？墒褂敏燃谆w維素(CMC)作為底物測(cè)定全部纖維素酶制劑的纖維素酶活性。全部纖維素酶活性的測(cè)定從CMC活性方面進(jìn)行測(cè)定。該方法測(cè)定了在CMC上起作用的酶混合物產(chǎn)生的還原末端的產(chǎn)生，其中1單位是釋放Imol產(chǎn)物/分鐘的酶的量(Ghose，Τ.K.，MeasurementofCellulseActivities,Pure&App1.Chem.59，第257-268頁，1987)。在一些實(shí)施方案中，全發(fā)酵液具有至少2500CMCU/g的內(nèi)切葡聚糖酶活性，其中一個(gè)CMC單位的活性在50°C和pH4.8下1分鐘內(nèi)釋放1μmol還原糖。雖然總體纖維素活性對(duì)本發(fā)明是重要的，總體纖維素活性與β“葡糖苷酶活性的比例也是重要的，因?yàn)樗靓?葡糖苷酶水解否則負(fù)面影響其它纖維素酶活性的終產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，全培養(yǎng)液包含從約0.5到25pNPG/CMC單位范圍內(nèi)的酶活性比例。在一些實(shí)施方案中，酶活性比例從約1到20pNPG/CMC單位，或從約1.5到15pNPG/CMC單位，或從約2到10pNPG/CMC單位，或從約2.5到8pNPG/CMC單位，從約3到7pNPG/CMC單位，或從約3.5到6.5pNPG/CMC單位，或從約4到6pNPG/CMC單位，或從約4.5到5.5pNPG/CMC單位，或從約5到6pNPG/CMC。尤其合適的是例如約5.5pNPG/CMC單位的比例。適當(dāng)劑量水平和操作條件對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，尤其是在依據(jù)此處提供的詳細(xì)公開內(nèi)容的情況下。全發(fā)酵液的最佳劑量水平將根據(jù)所用的纖維素底物和預(yù)處理技術(shù)發(fā)生很大變化。操作條件如PH、溫度和反應(yīng)時(shí)間也會(huì)影響乙醇生產(chǎn)的速率。優(yōu)選地，反應(yīng)組合物含有每克纖維素0.006到6mL的全發(fā)酵液，更優(yōu)選每克纖維素0.015到1.5mL的全發(fā)酵液，并最優(yōu)選每克纖維素0.03到0.6mL的全發(fā)酵液。或者，可基于系統(tǒng)中生物量底物的總量確定全發(fā)酵液的量。在該情況下，所述反應(yīng)組合物優(yōu)選含有每克生物量底物0.003到3mL的全發(fā)酵液，更優(yōu)選地每克生物量底物0.075到0.75mL的全發(fā)酵液，并更優(yōu)選每克生物量底物0.015到0.3mL的全發(fā)酵液。在另一實(shí)施方案中，可以約0.3%到300.0%wt.的生物量底物固體，更優(yōu)選約0.75%到75%wt.的生物量底物固體，并最優(yōu)選約1.5%到30%wt.的生物量底物固體的有效量添加所述全發(fā)酵液?；蛘?，可基于向系統(tǒng)提供的源自全發(fā)酵液的細(xì)胞質(zhì)量的總量測(cè)定全發(fā)酵液的量。在該情況下，所述反應(yīng)組合物優(yōu)選含有每克生物量底物0.0001到0.Igm來源自全發(fā)酵液的細(xì)胞質(zhì)量，更優(yōu)選每克生物量底物0.00025到0.025gm來源自全發(fā)酵液的細(xì)胞質(zhì)量，并更優(yōu)選每克生物量底物0.0005到0.Olgm來源自全發(fā)酵液的細(xì)胞質(zhì)量。如此處所述，全發(fā)酵液可來自本領(lǐng)域中導(dǎo)致表達(dá)能夠水解纖維素底物的酶的任何絲狀真菌的培養(yǎng)物。發(fā)酵可包括在合適培養(yǎng)基中并在允許纖維素酶表達(dá)的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵、如實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵。通常，所述全發(fā)酵液包括纖維素分解酶，包括但不限于(i)內(nèi)切葡聚糖酶(EG)或1，4-d-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.4)，(ii)外切葡聚糖酶，包括1，4-_d-葡聚糖葡聚糖水解酶(也稱為纖維糊精酶)(EC3.2.1.74)和l，4-d-葡聚糖纖維二糖水解酶(外切纖維二糖水解酶，CBH)(EC3.2.1.91)，和(iii)β-葡糖苷酶(BG)或β-葡糖苷葡糖水解酶(EC3.2.1.21)。一般地，絲狀真菌在適合產(chǎn)生能夠水解纖維素底物的酶的細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在包含碳源和氮源以及無機(jī)鹽的適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行所述培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基、溫度范圍和適合于生長(zhǎng)和纖維素酶產(chǎn)生的其它條件為本領(lǐng)域所知。優(yōu)選地，以這樣的方式進(jìn)行絲狀真菌的發(fā)酵可控制含碳底物作為限制性因子，由此提供含碳底物順利向細(xì)胞轉(zhuǎn)化并避免所述細(xì)胞污染大量未轉(zhuǎn)化底物。后者對(duì)水溶性底物不成問題，因?yàn)槿魏螝埩艉圹E會(huì)容易地被洗掉。然而，在非水溶性底物的情況下，其是一個(gè)問題，并需要額外的產(chǎn)物處理步驟，如合適的洗滌步驟?？赏ㄟ^培養(yǎng)絲狀真菌至靜止生長(zhǎng)時(shí)期并在限制性碳條件下維持所述絲狀真菌足以表達(dá)一種或更多纖維素酶或葡糖苷酶的時(shí)間來制備全發(fā)酵液。一旦酶如纖維素酶由絲狀真菌分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中，則全發(fā)酵液可使用。本發(fā)明的全發(fā)酵液包含絲狀真菌。在一些實(shí)施方案中，所述全發(fā)酵液包含來自發(fā)酵結(jié)束時(shí)的發(fā)酵材料的未分餾成分。通常，所述全發(fā)酵液包含耗盡的培養(yǎng)基和絲狀真菌生長(zhǎng)至飽和、在碳限制性條件孵育以允許蛋白質(zhì)合成(尤其是表達(dá)纖維素酶和/或葡糖苷酶)后存在的細(xì)胞碎片。在一些實(shí)施方案中，所述全發(fā)酵液包含耗盡的細(xì)胞培養(yǎng)基、胞外酶和絲狀真菌。在一些實(shí)施方案中，可以使用本領(lǐng)域已知的方法溶解、透化或殺死全發(fā)酵液中存在的絲狀真菌，以產(chǎn)生細(xì)胞被殺死的全發(fā)酵液。在一些實(shí)施方案中，全發(fā)酵液是細(xì)胞被殺死的全發(fā)酵液，其中所述全發(fā)酵液含有被溶解或殺死的絲狀真菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，通過化學(xué)和/或PH處理溶解絲狀真菌來殺死細(xì)胞，以產(chǎn)生絲狀真菌發(fā)酵的細(xì)胞被殺死的全培養(yǎng)液。在一些實(shí)施方案中，通過化學(xué)和/或PH處理溶解絲狀真菌來殺死細(xì)胞，并包括將細(xì)胞被殺死的發(fā)酵混合物的PH調(diào)整至約4到6之間，以產(chǎn)生絲狀真菌發(fā)酵物的細(xì)胞被殺死的全培養(yǎng)液?？上蛉l(fā)酵液或細(xì)胞被殺死的全發(fā)酵液中任選加入額外的防腐劑和或制菌劑，包括但不限于山梨醇、氯化鈉、山梨酸鉀和本領(lǐng)域已知的其它。盡管本發(fā)明不受理論約束，相信未澄清的全發(fā)酵液為產(chǎn)乙醇的微生物提供殘留營(yíng)養(yǎng)。這可導(dǎo)致更快的乙醇發(fā)酵并提高乙醇產(chǎn)量。除糖化纖維素之外，去除需要為產(chǎn)乙醇微生物提供營(yíng)養(yǎng)液或減少補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)量的能力當(dāng)然將導(dǎo)致用于乙醇發(fā)酵過程的原材料的成本降低。此處所述的方法和組合物缺少或基本沒有用于發(fā)酵微生物的補(bǔ)充氮源和/或營(yíng)養(yǎng)源。在一些實(shí)施方案中，所述方法和組合物缺少或基本沒有酵母提取物、蛋白胨和/或尿素。本領(lǐng)域一名普通技術(shù)人員應(yīng)理解本發(fā)明的方法和組合物可缺失或基本沒有補(bǔ)充氮源，然而，痕量的氮源和/或營(yíng)養(yǎng)源可作為雜質(zhì)存在或以基本不增加全發(fā)酵液營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的量向發(fā)酵微生物添加。此處所述的方法和組合物可減少用于發(fā)酵微生物的補(bǔ)充氮源的量和/或類型。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可減少用于發(fā)酵微生物的酵母提取物、蛋白胨和/或尿素的量。本領(lǐng)域一名普通技術(shù)人員應(yīng)理解可使用本發(fā)明的方法和組合物來減少用于發(fā)酵微生物的補(bǔ)充氮源的量和/或類型。全發(fā)酵液對(duì)產(chǎn)乙醇微生物具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值這個(gè)發(fā)現(xiàn)與通常預(yù)期相反，因?yàn)榘l(fā)酵培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值預(yù)計(jì)在絲狀真菌的發(fā)酵過程中衰竭或耗盡。一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)未過濾的纖維素酶培養(yǎng)液與過濾的培養(yǎng)液相比顯示提高的乙醇產(chǎn)量。然而，據(jù)推測(cè)提高的乙醇產(chǎn)量是由于附著在絲狀真菌細(xì)胞壁上的額外葡糖苷酶，其在過濾過程中被去除。Schell，等"WholeBrothCellulaseProductionforUseinSimultaneousSaccharificationandFermentationofCellulasetoEthanol,”App1.Biochem.Biotech.24/25287-298(1990)。出乎意料的是，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)全發(fā)酵液可替換補(bǔ)充氮源(通常是蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物或尿素形式)，其作為產(chǎn)乙醇微生物，如酵母的營(yíng)養(yǎng)源而在通常操作中需要。單獨(dú)用葡糖苷酶補(bǔ)充澄清的發(fā)酵液不能達(dá)到全發(fā)酵液的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(見圖1和下文實(shí)施例)。因此本發(fā)明的一個(gè)方面提供其中纖維素底物、全發(fā)酵液和產(chǎn)乙醇微生物組合并在缺少補(bǔ)充氮源下孵育的方法。在其它實(shí)施方案中，所述纖維素底物、全培養(yǎng)液和產(chǎn)乙醇微生物組合并在缺少任何補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)源下孵育。本發(fā)明的一個(gè)方面提供通過同步糖化和發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的方法，所述方法包括(a)在缺少補(bǔ)充氮源的情況下組合纖維素底物，全發(fā)酵液；和(b)在有助于纖維素水解成葡萄糖并有助于葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙醇的條件下孵育所述纖維素底物、全發(fā)酵液和產(chǎn)乙醇微生物。本發(fā)明的一個(gè)方面提供通過同步糖化和發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的方法，所述方法包括(a)在缺少補(bǔ)充氮源的情況下組合纖維素底物，全發(fā)酵液和產(chǎn)乙醇微生物；和(b)在有助于纖維素水解成葡萄糖和/或木糖并有助于葡萄糖和/或木糖轉(zhuǎn)化成乙醇的條件下孵育所述纖維素底物、全發(fā)酵液和產(chǎn)乙醇微生物。如此處所用，發(fā)酵微生物表示適合在用于產(chǎn)生有機(jī)物的期望發(fā)酵過程中使用的任何微生物。合適的非限制性發(fā)酵微生物能夠?qū)⑻牵缙咸烟?、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖或寡糖發(fā)酵或轉(zhuǎn)化成期望的發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵微生物的合適的非限制性實(shí)例包括真菌生物，如酵母，和細(xì)菌。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)酵微生物是產(chǎn)乙醇微生物。術(shù)語“產(chǎn)乙醇的”旨在包括微生物從碳水化合物產(chǎn)生作為初級(jí)發(fā)酵產(chǎn)物的乙醇的微生物的能力。然而，本領(lǐng)域熟知此處所用的產(chǎn)乙醇生物也可用于產(chǎn)生其它有機(jī)物。所述術(shù)語旨在包括天然發(fā)生的產(chǎn)乙醇生物、具有天然發(fā)生或經(jīng)誘導(dǎo)的突變的產(chǎn)乙醇生物，和已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾的產(chǎn)乙醇生物。雖然纖維素材料水解成葡萄糖和其它小糖是重要步驟，但同步糖化和發(fā)酵(SSF)依賴于產(chǎn)乙醇微生物的活培養(yǎng)物以將這些糖轉(zhuǎn)化成乙醇。在一些實(shí)施方案中，所述產(chǎn)乙醇微生物是酵母細(xì)胞，如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、葡萄汁酵母(S.uvarum)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromycesfagilis)、假熱帶念珠菌(candidapseudotropicalis)和嗜鞣管囊酵母(Pachysolentarmophilus)，其可將葡萄糖有效發(fā)酵成乙醇。優(yōu)選的菌株包括，但不限于釀酒酵母D5A(ATCC200062)、釀酒酵母Y567(ATCC24858)、ACA174(ATCC60868),MY9KATCC201301)、MY138(ATCC201302)、C5(ATCC201298)、ET7(ATCC201299)、LA6(ATCC201300)、0SB21(ATCC201303)、F23(S.globosusATCC90920)、ACA174(ATCC60868)、A54(ATCC90921)、NRCC202036(ATCC46534)、ATCC24858、ATCC24858、G3706(ATCC42594)、NRRL、Y-265(ATCC60593)、Sa28(ATCC26603)和ATCC24845-ATCC24860。適合用于本發(fā)明的其它非釀酒酵母菌株包括畢赤酵母(Pichiapastoris)(tozonyID4922),S.pastorianusSA23(卡爾酵母(S.carlsbergensis)ATCC26602),S.pastorianus(卡爾酵母ATCC2345)、Candidaacidothermophilum(東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)，ATCC20381)。在一些實(shí)施方案中，所述產(chǎn)乙醇微生物是重組酵母菌株。合適的重組酵母可含有編碼木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和/或木酮糖激酶的基因(參閱例如USPN5，789，210)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，產(chǎn)乙醇微生物是細(xì)菌細(xì)胞，優(yōu)選革蘭氏陰性、兼性厭氧菌，并且來自腸桿菌科。在另一相關(guān)實(shí)施方案中，所述產(chǎn)乙醇微生物是埃希氏菌屬(Escherichia)或克雷伯氏菌屬(Klebsiella),優(yōu)選是E.coliB、E.coliDH5、E.coliK04(ATCC55123)、E.coliKOll(ATCC55124)、E.coliK012(ATCC55125)、Ε.coliLYOU產(chǎn)酸克雷伯氏菌(K.oXytoCa)M5Al或產(chǎn)酸克雷伯氏菌P2(ATCC55307)菌株。在一些實(shí)施方案中，所述產(chǎn)乙醇微生物是發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)種，或來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)(ATCC31821)。在一些實(shí)施方案中，重組發(fā)酵單胞菌屬菌株例如可含有編碼木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、醛糖移轉(zhuǎn)酶和酮糖移轉(zhuǎn)酶的基因。通常向水解產(chǎn)物中添加發(fā)酵微生物并且允許發(fā)酵進(jìn)行12-96小時(shí)，如30-80小時(shí)。溫度通常在26-40°C之間，尤其約32°C，并且pH為3-6。發(fā)酵后，通過本領(lǐng)域已知的任何方法回收目的有機(jī)物。這些方法包括，但不限于蒸餾、提取、色譜、電泳方法、差異溶解。例如，在乙醇發(fā)酵中，通過蒸餾常規(guī)方法分離并純化所述醇。根據(jù)本發(fā)明方法獲得的乙醇可用作燃料乙醇、飲用乙醇或工業(yè)乙醇?？赏ㄟ^以下實(shí)施例進(jìn)一步理解本教導(dǎo)的方面，所述實(shí)施例不應(yīng)解釋為限制本教導(dǎo)的范圍。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可對(duì)材料和方法進(jìn)行許多修飾，而不背離本教導(dǎo)。VI.實(shí)施例A.實(shí)施例1制備全發(fā)酵液制備葡萄糖/槐糖溶解60%(w/w)的葡萄糖溶液并在121°C滅菌30分鐘。將溫度降至65°C并加入10g/L總蛋白質(zhì)(先前由里氏木霉產(chǎn)生的全纖維素酶)。緩慢攪動(dòng)混合物并在65°C下保持3天。該60%的葡萄糖溶液中的槐糖含量測(cè)定為12g/L。將1.5ml里氏木霉RLP-37冷凍芽孢懸浮液接種至0.8L培養(yǎng)基中作為種子瓶。48小時(shí)后將該瓶分為兩個(gè)0.4L的部分并轉(zhuǎn)移至兩個(gè)不同的HLBiolafitte發(fā)酵罐中的2X7L發(fā)酵培養(yǎng)基中。生長(zhǎng)培養(yǎng)基具有以下成份培養(yǎng)某成份ΓαKH2PO44~(NH4)2S04635MgSO4-7H202CaCl2-2H20θΓδ3葡萄糖/槐糖350~固態(tài)玉米浸膏(Roquette)625<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在25°C、750RPM和每分鐘8標(biāo)準(zhǔn)立升(SLM)氣流下運(yùn)行發(fā)酵罐。在約20小時(shí)時(shí)分批加入的葡萄糖已耗盡，此時(shí)細(xì)胞停止生長(zhǎng)并開始碳限制性飼喂。按0.25g/分鐘加入40%的葡萄糖/槐糖。在分批期之后立即誘導(dǎo)了與纖維素酶產(chǎn)生直接相關(guān)的總蛋白質(zhì)(基于我們對(duì)總胞外蛋白質(zhì)與纖維素酶活性的比較)。通過化學(xué)處理和pH處理的組合經(jīng)裂解殺死細(xì)胞。裂解后如需要，可將細(xì)胞殺死的全發(fā)酵液調(diào)至更中性的PH值，例如，約在pH4和pH6之間。B.實(shí)施例2制備澄清的發(fā)酵液絲狀真菌如上文實(shí)施例1中描述生長(zhǎng)。不進(jìn)行裂解細(xì)胞，而是將全發(fā)酵液的內(nèi)含物過濾以去除細(xì)胞和大的細(xì)胞碎片來制備澄清的發(fā)酵液。由于目的纖維素酶和葡糖苷酶由木霉屬細(xì)胞分泌，在澄清的發(fā)酵液中仍保留纖維素水解活力。隨后通過用IOkDa截留膜的超濾來濃縮澄清發(fā)酵液中所含的酶。C.實(shí)施例3同步糖化和發(fā)酵在標(biāo)準(zhǔn)酵母發(fā)酵條件(例如Thermosaccyeast,pH5.0，38°C)下250ml燒瓶中一式兩份地進(jìn)行同步糖化和發(fā)酵(SSF)。在一般實(shí)驗(yàn)中，使用20mM的檸檬酸鈉緩沖液(pH5.0)將酸預(yù)處理的甘蔗渣調(diào)節(jié)至7%的纖維素載量。加入酵母營(yíng)養(yǎng)物來獲得1.Og/L的酵母提取物、1.0g/L的蛋白胨和1.0g/L尿素的終濃度。全發(fā)酵液或澄清的發(fā)酵液(至0.4CMCU/g酸預(yù)處理的甘蔗渣的濃度)與酵母同步加入來開始發(fā)酵。當(dāng)補(bǔ)充時(shí)，澄清的發(fā)酵液中葡糖苷酶具有0.063pNPG/g酸處理甘蔗渣的比活性。全發(fā)酵液具有相似的β葡糖苷酶活性。以150rpm搖動(dòng)燒瓶。以不同時(shí)間間隔提取樣品并通過HPLC方法分析乙醇、甘油、乙酸、乳酸和殘留糖。圖1顯示當(dāng)不存在酵母營(yíng)養(yǎng)物時(shí)，使用全發(fā)酵液的SSF比使用澄清發(fā)酵液(具有或不具有β-葡糖苷酶)的SSF提供高得多的濃度的乙醇。例如，96小時(shí)時(shí)，使用全發(fā)酵液的乙醇濃度為30.7g/L，與之相比使用補(bǔ)充有β-葡糖苷酶的澄清發(fā)酵液的乙醇濃度為22.2g/L。圖2比較了使用了全發(fā)酵液的SSF性能與使用澄清發(fā)酵液的SSF的性能。在所有情況中，以相同水平加入酵母營(yíng)養(yǎng)物?？梢娙l(fā)酵液導(dǎo)致增加的發(fā)酵率和稍微更高的乙醇產(chǎn)率。圖3顯示了使用具有酵母營(yíng)養(yǎng)物和不具有酵母營(yíng)養(yǎng)物的全發(fā)酵液的SSF性能比較?？梢妰烧叩腟SF性能是相當(dāng)?shù)摹?6小時(shí)時(shí)，具有酵母營(yíng)養(yǎng)物的乙醇濃度為31.3g/L，而不具有酵母營(yíng)養(yǎng)物的乙醇濃度為30.7g/L。該結(jié)果揭示酵母能夠使用來自全發(fā)酵液的氮源用于乙醇發(fā)酵。D.實(shí)施例4糖化在250ml燒瓶中一式兩份進(jìn)行酸預(yù)處理甘蔗渣的糖化。在一般實(shí)驗(yàn)中，使用20mM的檸檬酸鈉緩沖液(PH5.0)將酸預(yù)處理的甘蔗渣調(diào)節(jié)至7%的纖維素載量。加入全發(fā)酵液纖維素酶或補(bǔ)充有葡糖苷酶的澄清發(fā)酵液來開始酶促水解。使用相同量的纖維素裂解活力，即分別為0.4CMCU/g酸預(yù)處理的甘蔗渣和0.063pNPG/g酸預(yù)處理的甘蔗渣。以150rpm搖動(dòng)燒瓶。以不同時(shí)間間隔提取樣品并通過HPLC方法分析葡萄糖、纖維二糖和木糖。圖4顯示如酸處理甘蔗渣的可比較糖化證明，全發(fā)酵液和補(bǔ)充有β-葡糖苷酶的澄清發(fā)酵液的纖維素裂解能力是基本一致的。因此，由全發(fā)酵液提高的乙醇產(chǎn)量并不是如Schell等"WholeBrothCellulaseProductionforUseinSimultaneousSaccharificationandFermentationofCellulasetoEthanol，，Appl.Biochem.Biotech.24/25:287_298(1990)所提出的是由于β葡糖苷酶的原因。權(quán)利要求通過同步糖化和發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)物的方法，其包括(a)在缺少補(bǔ)充氮源的情況下組合纖維素底物、全發(fā)酵液和發(fā)酵微生物；和(b)在有助于纖維素水解成葡萄糖和/或木糖并有助于葡萄糖和/或木糖轉(zhuǎn)化成有機(jī)物的情況下孵育所述纖維素底物、全發(fā)酵液和發(fā)酵微生物。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述纖維素底物包含選自木材、木質(zhì)紙漿、造紙污泥、紙漿廢水、碎木板、玉米秸稈、玉米纖維、玉米芯、稻、紙和紙漿加工廢物、木本或草本植物、果漿、蔬菜肉漿、浮石粉、酒糟、草、稻殼、甘蔗渣、棉花、黃麻、大麻、亞麻、竹子、劍麻、馬尼拉麻、稻草、玉米芯、樹葉、麥秸、椰子毛、藻類、柳枝稷及其混合物的一種或更多種纖維素來源。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述纖維素底物經(jīng)過機(jī)械或化學(xué)預(yù)處理。4.權(quán)利要求1的方法，其中從絲狀真菌的發(fā)酵物中制備所述全發(fā)酵液。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述發(fā)酵微生物是酵母或細(xì)菌細(xì)胞。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述發(fā)酵微生物是產(chǎn)乙醇微生物。7.權(quán)利要求1的方法，其中所述有機(jī)物是醇。8.權(quán)利要求1的方法，其中所述有機(jī)物是乙醇。9.用于產(chǎn)生有機(jī)物的反應(yīng)組合物，其包含纖維素底物、全發(fā)酵液和發(fā)酵微生物的混合物，其中所述反應(yīng)組合物基本無補(bǔ)充氮源。10.權(quán)利要求9的反應(yīng)組合物，其中所述纖維素底物包含選自木材、木質(zhì)紙漿、造紙污泥、紙漿廢水、碎木板、玉米秸稈、玉米纖維、玉米芯、稻、紙和紙漿加工廢物、木本或草本植物、果漿、蔬菜肉漿、浮石粉、酒糟、草、稻殼、甘蔗渣、棉花、黃麻、大麻、亞麻、竹子、劍麻、馬尼拉麻、稻草、玉米芯、樹葉、麥秸、椰子毛、藻類、柳枝稷及其混合物的一種或更多種纖維素來源。11.權(quán)利要求9的反應(yīng)組合物，其中所述纖維素底物經(jīng)過機(jī)械或化學(xué)預(yù)處理。12.權(quán)利要求9的反應(yīng)組合物，其中所述全發(fā)酵液是絲狀真菌全發(fā)酵液。13.權(quán)利要求9的反應(yīng)組合物，其中所述發(fā)酵微生物是酵母或細(xì)菌細(xì)胞。14.權(quán)利要求9的反應(yīng)組合物，其中所述發(fā)酵微生物是產(chǎn)乙醇微生物。全文摘要本發(fā)明涉及使用同步糖化和發(fā)酵從發(fā)酵微生物產(chǎn)生有機(jī)物的方法和組合物。本發(fā)明的一個(gè)方面通過在有助于纖維素水解成葡萄糖并有助于葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙醇的條件下組合纖維素底物和全發(fā)酵液以及產(chǎn)乙醇微生物來同步糖化和發(fā)酵以產(chǎn)生乙醇。文檔編號(hào)C12P7/10GK101821397SQ200880111135公開日2010年9月1日申請(qǐng)日期2008年10月9日優(yōu)先權(quán)日2007年10月12日發(fā)明者C·米奇森,L·斯蒂爾,李勉申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司