專利名稱：通過翻譯調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)檢測(cè)和調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的組合物和方法
通過翻譯調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)檢測(cè)和調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的組合物
和方法背景 本技術(shù)涉及翻譯調(diào)控(例如TR)核酸分子，其編碼在應(yīng)激和/或垂死細(xì)胞中被選 擇性翻譯和早期檢測(cè)的mRNA分子。在多個(gè)實(shí)施方案中，本技術(shù)涉及包含此類TR元件的表 達(dá)盒、包含此類表達(dá)盒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，以及使用和治療方法。活生物體中的正常生物活性將構(gòu)成個(gè)體基因組的基因的內(nèi)源表達(dá)與對(duì)外界的反 應(yīng)結(jié)合起來。在高等真核生物中，基因表達(dá)始于細(xì)胞核中的基因組DNA轉(zhuǎn)錄為前mRNA或“初 級(jí)” RNA轉(zhuǎn)錄物。當(dāng)前mRNA仍然處于細(xì)胞核中的時(shí)候，其被修飾以包括5’帽子結(jié)構(gòu)，形成 異核核糖核蛋白(hnRNP)復(fù)合物，獲得3’多聚腺苷酸尾巴，并經(jīng)歷剪接以除去間插DNA序 列(例如內(nèi)含子)。成熟mRNA隨之被輸出至細(xì)胞質(zhì)，在這里蛋白質(zhì)復(fù)合物指導(dǎo)(1)借助5’ 帽子結(jié)構(gòu)與核糖體締合，這稱為帽子依賴性翻譯，或者(2)與促進(jìn)mRNA儲(chǔ)存、加工或降解的 胞質(zhì)RNA結(jié)合蛋白質(zhì)相互作用。繼核糖體驅(qū)動(dòng)的翻譯之后，3’多聚腺苷酸尾巴的相繼縮短 使得mRNA體運(yùn)輸至核糖核酸酶(RNAse)復(fù)合物，所述核糖核酸酶復(fù)合物稱為外來體，降解 衰老的mRNA，并有效終止蛋白質(zhì)合成。如所預(yù)期的那樣，基因表達(dá)是高度調(diào)控的過程，其必須在特定的時(shí)間、以特定的速 率和數(shù)量產(chǎn)生期望的基因產(chǎn)物(一般是多肽)。除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控之外，轉(zhuǎn)錄后過程如mRNA衰 變和翻譯均為基因表達(dá)的關(guān)鍵限制點(diǎn)。由基因突變或?qū)ν獠看碳さ漠惓７磻?yīng)所產(chǎn)生的細(xì)胞 表達(dá)譜的變化能夠造成嚴(yán)重異常，往往導(dǎo)致細(xì)胞死亡，以及表現(xiàn)出疾病表型，這不足為奇。環(huán)境因素[如改變的營(yíng)養(yǎng)水平、細(xì)胞因子、激素和溫度轉(zhuǎn)變]以及環(huán)境應(yīng)激[像低 氧、低血鈣、病毒感染和組織損傷]廣泛或延長(zhǎng)的細(xì)胞刺激導(dǎo)致帽子依賴性翻譯迅速減弱。 此過程是適應(yīng)性的，因其削減對(duì)于即刻應(yīng)激反應(yīng)和恢復(fù)而言并非必需的全局蛋白質(zhì)合成。 然而，這種翻譯減弱并不完全消除核糖體活性，因?yàn)樵S多應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)物和恢復(fù)基因繼續(xù)由 稱為帽子非依賴性翻譯的備選過程來合成(在Guhaniyogi&Brewer，2001，Gene265(l_2) 11-23中綜述)。帽子非依賴性翻譯通過直接將核糖體募集至稱為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的 特異性RNA結(jié)構(gòu)而發(fā)生。繞過對(duì)5’mRNA帽子結(jié)構(gòu)的需求最初被描述為在感染細(xì)胞中與細(xì)胞 帽子依賴性翻譯近乎完全的抑制無關(guān)而翻譯病毒RNA的機(jī)制(Jang等人，1988，J. Virol.， 62 2636-43)。一般而言，IRES序列不能夠通過序列同源性鑒定，而充分表征的IRES元件 已應(yīng)用功能測(cè)定進(jìn)行了驗(yàn)證(Mountford 和 Smith, 1995, TIG, 11 (5) :179_184 ；Baird 等人， 2006, NAR, 12 (10) 1755-85).當(dāng)前的證據(jù)表明IRES RNA的構(gòu)象以及輔助蛋白質(zhì)與特異性 mRNA序列的結(jié)合使得能夠進(jìn)行核糖體結(jié)合。在真核細(xì)胞中，IRES指導(dǎo)的翻譯往往與mRNA的 5’非翻譯區(qū)(5’ UTR)相關(guān)，其含有顯著抑制核糖體依賴性翻譯起始的罕見的長(zhǎng)且熱力學(xué)穩(wěn) 定的RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)，其具有多個(gè)短可讀框(ORF)。然而，許多這些5，UTR IRES元件的IRES 活性的功能驗(yàn)證由于存在自重疊5’基因啟動(dòng)子克隆的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)序列而變得復(fù)雜化。嘗試 在IRES報(bào)告載體中采用這些5’UTR元件由于這種殘留背景轉(zhuǎn)錄活性而變得復(fù)雜化，這種活 性掩蓋了由這些序列所產(chǎn)生的任何翻譯調(diào)控作用。
IRES元件已在許多真核生物mRNA中鑒定(Bonnal S等人，(2003)Nucleic Acids Res. 31 :427-428)，并確保蛋白質(zhì)或其片段在細(xì)胞核失活或急性細(xì)胞應(yīng)激期間在“帽子依賴 性”翻譯起始受抑制時(shí)(即凋亡、饑餓、Y-輻射、低氧、有絲分裂或末端分化時(shí))有效表達(dá)。 美國(guó)公開專利申請(qǐng)No. 2006/0173168公開了通過IRES的內(nèi)部翻譯起始產(chǎn)生的、來自PLP/ DM20基因C-末端的兩種低分子肽，即PIRP-M和PIRP-L?；瘜W(xué)或生物藥物干預(yù)對(duì)于特定個(gè)體總體健康的影響往往是不確定的。雖然藥物 分子可能補(bǔ)救靶癥狀，但是治療可能伴有嚴(yán)重的副作用或不期望的毒性，這在一些情況可 比最初的疾病更為嚴(yán)重。雖然藥物制品的副作用和毒性常常是已知的，并且可能局限于小 亞群的個(gè)體，但是這些效應(yīng)在此小亞群個(gè)體中可能會(huì)如此嚴(yán)重，以至于藥物可能得不到FDA 的許可，這導(dǎo)致巨大的藥物浪費(fèi)。美國(guó)年產(chǎn)大量的化學(xué)品。每年有超過2，000種新化學(xué)品引入到市場(chǎng)上，不 過極少 進(jìn)行過綜合的急性或長(zhǎng)期(chronic)毒性檢驗(yàn)。為了定義新藥物或化學(xué)品的潛在毒性，美 國(guó)食品和藥物管理局(FDA)要求新藥申請(qǐng)(NDA)，以包括在至少兩種動(dòng)物物種中進(jìn)行的大 批毒性、致癌性、誘變性和生殖性/能育性檢驗(yàn)。頻繁侵入性的檢驗(yàn)和尸檢終點(diǎn)已經(jīng)引起了 相當(dāng)大的來自動(dòng)物權(quán)益團(tuán)體和普通公眾關(guān)于動(dòng)物苦難的批判。這種情況強(qiáng)調(diào)了本領(lǐng)域?qū)τ谀軌蛟趶V譜細(xì)胞類型中檢測(cè)急性或長(zhǎng)期接觸化學(xué)品 后的細(xì)胞應(yīng)激和毒性的備選高通量分子和生物篩選技術(shù)的需求。從而需要新方法進(jìn)行有效 和不太昂貴的毒性檢驗(yàn)，以提供動(dòng)物檢驗(yàn)的可靠備選方案。概述本技術(shù)的多方面包括核酸表達(dá)盒，其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可表達(dá)并且以5’至3’方 向包含如下元件至少一種轉(zhuǎn)錄效應(yīng)序列，TR元件，其編碼在應(yīng)激和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA分子，有效連接于TR元件的核苷酸序列，其為第一可讀框(ORF)序列，編碼多肽或其片 段，并與TR元件共翻譯，和多聚腺苷酸化序列，本文稱為TR表達(dá)盒。第一 ORF序列可選自報(bào)告基因、細(xì)胞毒性腫瘤抑制基因、毒素基因、前藥激活基 因和凋亡前(proapoptotic)基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄效應(yīng)序列是啟動(dòng)子。另一方面，TR表達(dá)盒可含有第二 ORF序列，其位于TR序列的5’，并獨(dú)立翻譯。第 二 ORF序列可選自與第一 ORF相同的序列。本技術(shù)另一方面是提供用TR表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞是 胚胎干(ES)細(xì)胞。又在另一方面，本技術(shù)提供了確定物質(zhì)毒性的方法。一種此類方法包括(a)接觸 用TR表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述第一 ORF序列編碼報(bào)告多肽；和(b)檢測(cè)報(bào)告 多肽的存在或測(cè)量其水平，其中與(i)未接觸所述物質(zhì)或(ii)未轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞相比，所 述報(bào)告多肽的存在或其水平的增加指示所述物質(zhì)的毒性。另一種確定物質(zhì)毒性的方法包括 (a)用TR表達(dá)盒轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，其中所述第一 ORF 序列編碼報(bào)告多肽；(b)使(a)中轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與所述物質(zhì)接觸；和(c)檢測(cè)報(bào)告多肽的存在 或測(cè)量其水平，其中與(i)未接觸所述物質(zhì)或(ii)未轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)的對(duì)照細(xì)胞相比，所述報(bào)告多肽的存在或其水平的增加指示所述物質(zhì)的毒性。又在本技術(shù)的另一方面是提供試劑盒，其包括TR表達(dá)盒或用此類表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的 哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以及使用說明書。另一方面，本技術(shù)提供了轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其具有穩(wěn)定整合到其基因組中的TR表 達(dá)盒。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是小鼠。又在另一方面，本技術(shù)提供了殺死靶細(xì)胞的方法，這是通過用TR表達(dá)盒轉(zhuǎn)化所述 細(xì)胞，其中第一 ORF序列選自細(xì)胞毒性腫瘤抑制子、毒素基因、前藥激活基因或凋亡前基 因。附1是示意圖，顯示了用來產(chǎn)生pTR-ORF載體的親本質(zhì)粒。圖IA顯示了 pE YFP_Nl 載體的限制性圖譜。圖IB顯示了 pPLPeyfp表達(dá)載體，用來表達(dá)作為與增強(qiáng)型黃色熒光蛋白 (EYFP)的融合蛋白質(zhì)的蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)的PLP同工型。圖IC顯示了 pDM20eyfp表達(dá) 載體，表達(dá)作為與EYFP的融合蛋白質(zhì)的DM20蛋白脂質(zhì)蛋白同工型。功能性質(zhì)粒元件(限 制性酶位點(diǎn)、復(fù)制起點(diǎn)、可讀框等)按照需要以垂直線、方框和箭頭表示。圖2顯示了單順反子pTR-EYFP表達(dá)載體的圖示實(shí)例。圖2A顯示了 PTRplp_EYFP載 體的圖譜。此載體中的TR-ORF盒由CMV IE轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、源自PLP同工型cDNA序列的TR 元件、EYFP可讀框和SV40多聚腺苷酸化信號(hào)組成。圖2B顯示了 pTRdm_EYFP載體的圖譜。 此TR-ORF盒與圖2A類似，除了 TR元件源自DM20同工型cDNA序列。圖3顯示了雙順反子pORF-TR-ORF載體的示意圖。圖3A顯示了 pfLuc_TRplp-EYFP 載體的圖譜。此載體中的雙順反子盒由CMV IE轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、相對(duì)于TR轉(zhuǎn)錄方向而言處于 “有義”取向的螢火蟲熒光素酶(fLuc)基因、與EYFP ORF功能相連的pip特異性TR元件 和SV40多聚腺苷酸化信號(hào)組成。顯示了相關(guān)的限制性位點(diǎn)和質(zhì)粒功能元件。圖3B顯示了 PfLuc-TRdm-EYFP質(zhì)粒的圖譜。圖3C展示了 ρcuLf-TRplp-EYFP載體的圖譜，其中fLuc ORF 在TR表達(dá)盒中處于“反義”取向。圖3D顯示了具有反義fLuc ORF的PcuLf-TRdm-EYFP質(zhì) 粒的圖譜。圖4展示了 Western印跡分析定量，顯示表達(dá)雙順反子TR盒的細(xì)胞庫(kù)在用毒性劑 量的鈣離子載體A23187或蛋白酶體抑制劑MG132處理之后誘導(dǎo)EYFP翻譯。EYFP蛋白水平 通過光密度測(cè)定法確定，并表示為對(duì)照HEK293細(xì)胞(調(diào)整為100%)中檢測(cè)的蛋白質(zhì)水平 的百分比。帽子非依賴性翻譯獨(dú)立于上游fLuc ORF的取向(顯示為相對(duì)于TR盒處于“有 義”取向的fLuc和“反義”取向的cuLf)。圖5顯示了可用來產(chǎn)生能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的重組病毒的質(zhì)粒穿梭載體的示 意圖。圖5A顯示了可用來產(chǎn)生能夠在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的重組腺伴隨病毒 (rAAV)的pAAV-MCS穿梭載體的圖譜。圖5B顯示了可用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞、以在應(yīng) 激和垂死細(xì)胞中選擇性地翻譯TR-ORF盒的重組桿狀病毒(rBAC)病毒粒體的pBAC_l穿梭 載體的圖譜。圖6展示了 Western印跡分析定量，顯示表達(dá)單順反子TRplp/dm-fLuc盒的細(xì)胞在用 毒性劑量的鈣離子載體A23187處理之后誘導(dǎo)fLuc翻譯。fLuc蛋白水平通過光密度測(cè)定法 確定，并表示為對(duì)照HEK293細(xì)胞(調(diào)整為100% )的百分比。圖6A顯示了與CMV-fLuc和 HEK293細(xì)胞、以及HEK293TRplp-fLuc庫(kù)相比，表達(dá)TRplp-fLuc盒的4個(gè)亞克隆(#3、17、13和16)產(chǎn)生的fLuc蛋白水平。圖6B顯示了與CMV-fLuc、HEK293和HEK293TRdm-fLuc細(xì)胞中 的蛋白水平相關(guān)的表達(dá)TRdm-fLuc盒的5個(gè)亞克隆(#12、43、45、2和8)的fLuc蛋白定量。圖7顯示了熒光HEK293TRplp/dm-EYFP細(xì)胞中用毒性劑量的鈣離子載體 A23187處理 后6小時(shí)和10小時(shí)的TR特異性增加。柱形圖代表熒光細(xì)胞的直接顯微計(jì)數(shù)。細(xì)胞數(shù)表示 為熒光細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照HEK293細(xì)胞(調(diào)整為100% )的百分比。圖8展示了 HEK293TRplp/dm-fLuc細(xì)胞在用毒性劑量的鈣離子載體A23187處理后通 過抗fLuc抗體免疫熒光標(biāo)記染色的TR特異性增加。柱形圖代表染色熒光細(xì)胞的直接顯微 計(jì)數(shù)。細(xì)胞數(shù)表示為熒光細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照HEK293細(xì)胞(調(diào)整為100%)的百分比。圖9顯示了可通過表達(dá)TRplp/dm_EYFP和TRplp/dm-fLuc盒的系列細(xì)胞系接觸毒性劑 量的鈣離子載體A23187后產(chǎn)生的TR依賴性翻譯。柱形圖顯示了可通過微板讀數(shù)器獲得 的隨意(arbitrary)熒光或熒光素酶單位，表示為處理與未處理培養(yǎng)物的比值。比值超過 1. 0指示細(xì)胞呈現(xiàn)TR依賴性翻譯。圖9A顯示了表達(dá)TRplp-EYFP盒的8個(gè)細(xì)胞系與HEK293、 CMV-EYFP和TRplp-EYFP庫(kù)相比的結(jié)果。圖9B顯示了表達(dá)TRplp-fLuc盒的5個(gè)細(xì)胞系、表達(dá) TR^-fLuc盒的3個(gè)細(xì)胞系與CMV-fLuc和HEK293對(duì)照相比的結(jié)果。

圖10顯示了可通過表達(dá)TRplp/dffl-fLUC盒的細(xì)胞系接觸毒性劑量的鈣離子載體 A23187后產(chǎn)生的TR依賴性劑量反應(yīng)。圖10A顯示了可通過微板讀數(shù)器獲得的HEK293、 HEK293CMV-fLuc、HEK TRplp-fLuc (亞克隆 #3)和 HEI^gSTI^-fLuc (亞克隆 #45)細(xì)胞在漸 增濃度毒素中培養(yǎng)后的隨意發(fā)光單位圖。圖10B僅顯示了 HEK293和TRplp/dffl-fLUC的結(jié)果， 以突出峰值處于6 yM的劑量反應(yīng)曲線。圖10C顯示了將隨意熒光素酶讀數(shù)表示為未處理 細(xì)胞中熒光素酶活性百分比的圖。這顯示了可通過CMV-fLuc細(xì)胞產(chǎn)生的帽子依賴性翻譯 向TR-0RF細(xì)胞呈現(xiàn)的帽子非依賴性熒光素酶活性增加變化；然而，劑量反應(yīng)曲線的形狀不 變。圖10D顯示了作為與CMV-fLuc細(xì)胞讀數(shù)比值的隨意熒光素酶讀數(shù)。這種比較突出了 高劑量時(shí)CMV-fLuc活性的急劇下降，并減小了 TR依賴性翻譯在更高毒素劑量時(shí)的明顯下 降。圖11顯示了可通過表達(dá)TRplp/dffl-fLUC盒的細(xì)胞系接觸毒性劑量的鈣離子載體 A23187后產(chǎn)生的TR依賴性時(shí)間反應(yīng)。圖11A顯示了可通過微板讀數(shù)器獲得的HEK293、 HEK293CMV-fLuc、HEK TRplp-fLuc (亞克隆 #3)和 HEI^gSTI^-fLuc (亞克隆 #45)細(xì)胞在用 毒性劑量的鈣離子載體A23187培養(yǎng)后作為漸增時(shí)間函數(shù)的隨意熒光素酶讀數(shù)圖。圖11B 是HEK293和TRplp/dffl-fLUC的結(jié)果圖，顯示了處理后1. 5小時(shí)觀察到熒光素酶活性增加。圖 11C顯示了將隨意熒光素酶讀數(shù)表達(dá)為處理后0小時(shí)的熒光素酶活性百分比的圖。圖11D 顯示了作為與CMV-fLuc細(xì)胞比值的隨意熒光素酶讀數(shù)。圖12是顯示rBAC TR^-EYFP病毒粒體轉(zhuǎn)導(dǎo)HT 1080細(xì)胞、和在應(yīng)激和垂死細(xì)胞中 呈現(xiàn)TR依賴性翻譯能力的柱形圖。用lOpfu/細(xì)胞或25pfu/細(xì)胞的rBAC病毒粒體轉(zhuǎn)導(dǎo)的 細(xì)胞在毒性濃度的鈣離子載體A23187中培養(yǎng)13. 5小時(shí)或23小時(shí)。熒光細(xì)胞顯微計(jì)數(shù)，并 表達(dá)為對(duì)照HEK293細(xì)胞(經(jīng)感染但未用毒素處理)的百分比。圖13是顯示TRplp_TKsr39細(xì)胞庫(kù)響應(yīng)前藥更昔洛韋(ganciclovir)和誘導(dǎo)細(xì)胞 死亡能力的圖。HEK293、HEK CMV-EYFP和HEK293TRplp_TKsr39細(xì)胞在多種濃度的更昔洛韋 中培養(yǎng)3或4天。細(xì)胞生存力通過臺(tái)盼藍(lán)不相容測(cè)定法來確定，且細(xì)胞數(shù)表達(dá)為存活細(xì)胞 百分比。與HEK293和HEK CMV-EYFP培養(yǎng)物在任何前藥濃度或時(shí)間點(diǎn)顯示出無細(xì)胞生存力下降相反，TRplp-TKsr39細(xì)胞處于補(bǔ)充更昔洛韋的培養(yǎng)基中3天后展示出生存力減小。到 第4天，TRplp-TKsr39細(xì)胞顯示出顯著的細(xì)胞死亡和細(xì)胞生存力劑量依賴性的減小。圖14是來自多種脊椎動(dòng)物的髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白C-末端序列的序列比較表， 所述序列來自如下 NCBI Genbank 號(hào)(1)P60201 智人(Homosapiens)、(2) Q5R6E6 猩 猩(Pongo pygmaeus)(猩猩)、(3)XP_001140782 黑猩猩(Pan troglodytes)(黑猩 猩)、(4)XP_001088537 恒河猴(Macacamulatta)(恒河猴)、(5)Q8HXW7 成束猴(Macaca fascicularis)(食蟹獼猴(crab-eating macaque))、(6)NP_999139豬(Sus scrofa)(豬)、 (7)NP_035253小家鼠(Mus musculus)(小鼠)、(8)NP_112252褐家鼠(Rattus norvegicus) (大鼠)、(9)XP 001374483 灰色短尾負(fù)鼠(Monodelphis domestica)(負(fù)鼠)、(10)P47789 穴兔(Oryctolagus cuniculus)(兔)、(11) CAA08909 歐洲牛(Bostaurus)(牛)、(12) 39025 家犬(Can is familiar is)(狗)、(13) CAA43839 原雞(Gallus gallus)(雞)、(14) P47790 斑 胸草雀(Taeniopygia guttata)(珍珠鳥(zebra finch) )、(15) AAW79015 多疣壁虎(Gekko japonicus)(壁虎(geckolizard))、(16)CAA79582 光滑爪蟾(Xenopus laevis)(蛙)禾口 (17)BAA84207 矛尾魚(Latimeria chalumnae)(空棘魚(coelacanth))。在一些物種中存 在的插入突變以雙下劃線顯示。圖15即15A-15C是鼠和人PLP/DM20編碼序列及其TR元件的序列比對(duì)圖。注釋 mDM =鼠 DM20cDNA ;mP =鼠 PLP cDNA ；TRd = TRdm[SEQID NO 1] ；TRp = TRplp [SEQ ID NO: 2] ；hDM=人DM20 ；而hP =人PLP。由于DM20序列刪除了全長(zhǎng)PLP編碼序列中存在的部分 序列，圖15中DM20序列的編號(hào)是不連續(xù)的，而在刪除區(qū)段之后的DM20編號(hào)連續(xù)顯示在比 對(duì)序列下方。在參照?qǐng)D15說明本文的序列時(shí)，在一些情況下利用PLP/DM20核苷酸位置的 雙重編號(hào)，例如殘基560/455 ；這種用法是指可選的PLP和DM20編號(hào)，其中PLP編號(hào)如比對(duì) 序列上方所示，而DM20編號(hào)如比對(duì)序列下方所示。顯示的末尾表達(dá)的密碼子是829/724至 831/726 的“ttc”。應(yīng)當(dāng)指出，本文闡述的附圖旨在例舉本技術(shù)中材料和方法的一般特征，以便說明 本文的此類實(shí)施方案。這些附圖可能并不精確反應(yīng)出任何給定實(shí)施方案的特征，而不必然 旨在限定或限制本技術(shù)范圍內(nèi)的具體實(shí)施方案。發(fā)明詳述如下技術(shù)說明就一個(gè)或多個(gè)發(fā)明的主題、制備和用途而言僅僅是舉例性的，而非 旨在限制本申請(qǐng)、或遞交時(shí)可能要求本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)的此類其他申請(qǐng)、或由此授予的專利中 要求保護(hù)的任何具體發(fā)明的范圍、應(yīng)用或用途。如下定義和非限制性指導(dǎo)須參照本文闡釋 的技術(shù)說明予以考慮。本文所用的標(biāo)題(如“引言”和“概述”)和小標(biāo)題(如“表達(dá)盒”)僅僅旨在總體 上組織本技術(shù)公開內(nèi)容范圍內(nèi)的主題，而非旨在限制本技術(shù)的公開內(nèi)容或其任何方面。特 別是，在“引言”中公開的主題可以包括一個(gè)或多個(gè)發(fā)明范圍內(nèi)的技術(shù)方面，并且可以不等 同于現(xiàn)有技術(shù)的敘述。在“概述”中公開的主題并不是本技術(shù)或其任何實(shí)施方案完整范圍 詳盡的或徹底的公開。本文引述的參考文獻(xiàn)并不等同于承認(rèn)那些參考文獻(xiàn)為現(xiàn)有技術(shù)或與本文公開技 術(shù)的專利性有任何相關(guān)性。對(duì)于引言中引述的參考文獻(xiàn)內(nèi)容的討論僅僅旨在提供該參考文 獻(xiàn)作者所作主張的概述，而并不等同于承認(rèn)此類參考文獻(xiàn)內(nèi)容的準(zhǔn)確性。本說明書說明部分所引述的所有參考文獻(xiàn)在此全文并入作為參考。所述說明和具體實(shí)例雖然表示了本技術(shù)的實(shí)施方案，但僅僅是出于舉例說明的目 的，而非旨在限制本技術(shù)的范圍。此外，述及具有指定特征的多個(gè)實(shí)施方案時(shí)并非旨在排除 其他具有附加特征的實(shí)施方案、或其他整合了不同組合的指定特征的實(shí)施方案。提供具體 實(shí)施例是為了舉例說明如何制備、使用和實(shí)施本技術(shù)的材料和方法的目的，故而除非另有 明確說明，并非旨在表示本技術(shù)給定實(shí)施方案已經(jīng)或者尚未進(jìn)行制備或檢驗(yàn)。如本文所用，措辭“優(yōu)選的，，和“優(yōu)選地”是指在某些情況下提供某些益處的本技 術(shù)實(shí)施方案。然而，在相同或其他情況下，其他實(shí)施方案也可以是優(yōu)選的。而且，述及一個(gè) 或多個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案時(shí)并不意味著其他實(shí)施方案無益，也并非旨在將其他實(shí)施方案排除 在本技術(shù)范圍之外。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“包含”、“包括，，和“具有，，及其變形旨在非限制性的，從而述及 羅列款項(xiàng)時(shí)并非排除其他也可用于本技術(shù)材料、組合物和方法的類似款項(xiàng)。如本文所用，當(dāng)術(shù)語(yǔ)“約”應(yīng)用于本技術(shù)組合物或方法的參數(shù)值時(shí)，表示該值的計(jì) 算或測(cè)量允許一些微小的不精確，而不會(huì)對(duì)所述組合物或方法的化學(xué)或物理屬性具有實(shí)質(zhì)影響。當(dāng)介紹本技術(shù)或其優(yōu)選實(shí)施方案的要素時(shí)，單數(shù)形式冠詞(“a”、“an”、“the”W& "said")旨在表示有一個(gè)或多個(gè)要素。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性基因”是指當(dāng)在靶細(xì)胞中表達(dá)時(shí)通過裂解、凋亡、壞死或任何其他 細(xì)胞殺傷機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)“基因”是指包含生產(chǎn)多肽或前體或RNA (例如，tRNA、siRNA、rRNA等)所必需 的編碼序列的核酸(例如，DNA)序列。多肽可由全長(zhǎng)編碼序列或由編碼序列的任何部分編 碼，只要保留全長(zhǎng)或片段的期望活性或功能特性(例如，酶促活性、配體結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等) 即可。該術(shù)語(yǔ)也涵蓋結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)以及在5’及3’端鄰近于編碼區(qū)的序列，從而基因 對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)mRNA的長(zhǎng)度。位于編碼區(qū)5’并在mRNA上存在的序列稱為5’非翻譯序列。位 于編碼區(qū)3’或下游并在mRNA上存在的序列稱為3’非翻譯序列。術(shù)語(yǔ)“基因”涵蓋cDNA以 及基因組形式的基因?；蚪M形式或基因克隆含有編碼區(qū)，其可以被稱為“內(nèi)含子”或“間 插區(qū)域”或“間插序列”的非編碼序列中斷。內(nèi)含子從核或初級(jí)轉(zhuǎn)錄物中移去或“剪接掉”， 因此不存在于信使RNA (mRNA)轉(zhuǎn)錄物中。mRNA在翻譯期間發(fā)揮功能以規(guī)定新生多肽的序列 或氨基酸次序。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”是指包含核酸表達(dá)盒的病毒及非病毒載體。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”用來定義含有有效連接于編碼序列、導(dǎo)致該編碼序列在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄 和翻譯的調(diào)控元件的核苷酸序列?！安溉閯?dòng)物啟動(dòng)子”是指在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮功能、或源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄 啟動(dòng)子，或兩者兼而有之。“哺乳動(dòng)物最小啟動(dòng)子”是指借助于RNA聚合酶結(jié)合正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的“核 心” DNA序列，但是不存在任何有效連接的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)序列時(shí)，其僅呈現(xiàn)象征性的轉(zhuǎn)錄活性。短語(yǔ)“可讀框”或“編碼序列”是指編碼多肽或蛋白質(zhì)的核苷酸序列。在真核生物 中，編碼區(qū)5’側(cè)邊界是編碼起始甲硫氨酸的核苷酸三聯(lián)體“ATG”，而3’側(cè)邊界是規(guī)定終止 密碼子的三個(gè)三聯(lián)體之一(即，TAA、TAG和TGA)。
定義“有效連接”以表示核酸與其他核酸序列以功能關(guān)系進(jìn)行布置。例如，如果啟 動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則其與該序列有效連接；或者如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)的 布置利于翻譯，則其與編碼序列有效連接。一般而言，“有效連接”表示相連的DNA序列是鄰 接的。然而，增強(qiáng)子不用必須鄰接。連接通過方便的限制性位點(diǎn)處的連接而實(shí)現(xiàn)。如果不 存在這樣的位點(diǎn)，則根據(jù)傳統(tǒng)慣例使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭?！爸亟M”是指方法、試劑及實(shí)驗(yàn)操作的結(jié)果，其中核酸或其他生物分子經(jīng)酶促、化學(xué) 或生物切割、合成、組合或以其他方式離體操作以便在細(xì)胞或其他生物系統(tǒng)中產(chǎn)生期望的 產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)“重組DNA”是指由通過分子生物學(xué)技術(shù)連在一起的DNA區(qū)段所組成的DNA分 子。“轉(zhuǎn)染”是用來說明將外來物質(zhì)如外來DNA引入到真核細(xì)胞中的術(shù)語(yǔ)。其與“轉(zhuǎn)化” 和“轉(zhuǎn)導(dǎo)”可互換使用，雖說后一個(gè)術(shù)語(yǔ)在其更窄的范圍上是指通過起載體作用的病毒向細(xì) 胞中引入DNA的過程。因而，經(jīng)過轉(zhuǎn)染的細(xì)胞稱為“轉(zhuǎn)染的”、“轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”細(xì)胞。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！笔侵釜?dú)立復(fù)制的DNA片段。其通常為環(huán)形或雙鏈。“報(bào)告基因”是指任何其表達(dá)能夠通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè) 或測(cè)量的基因。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控元件”或“效應(yīng)元件”是指轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子或終止子，以及 任何翻譯調(diào)控元件、多聚腺苷酸化位點(diǎn)，等等。可以安排調(diào)控及效應(yīng)元件，從而其允許、增強(qiáng) 或利于選擇性地生產(chǎn)受其調(diào)控的成熟編碼序列。術(shù)語(yǔ)“載體”是指可以向其中插入外來DNA片段的DNA分子。一般而言，其含有調(diào) 控序列及目的編碼序列。術(shù)語(yǔ)載體包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、病毒載體和穿梭載體?！按┧蟆陛d體是能夠進(jìn)行原核復(fù)制但不含真核復(fù)制序列的質(zhì)粒載體。此復(fù)制缺陷型 穿梭載體中所含的病毒DNA序列指導(dǎo)真核宿主細(xì)胞中的重組以產(chǎn)生感染性病毒顆粒。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“物質(zhì)”是指具有明確化學(xué)組成的物質(zhì)。在本文其與術(shù)語(yǔ)“化合 物”可互換使用。術(shù)語(yǔ)“病毒載體”是指含有外來遺傳物質(zhì)以遞送到其所感染的細(xì)胞中的病毒?！皬?fù)制缺陷型”病毒載體不能在“野生型”或其他未經(jīng)操作的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制。 為生產(chǎn)顯著量的此類病毒，需要生產(chǎn)細(xì)胞系用輔助病毒共轉(zhuǎn)染或以其他方式修飾以補(bǔ)充或 補(bǔ)償缺失的一種或多種功能?！熬哂袕?fù)制能力的”病毒載體能夠感染細(xì)胞并進(jìn)行DNA復(fù)制、病毒包裝以及從感染 細(xì)胞中釋放。如本文所用的“條件復(fù)制型”病毒載體是經(jīng)設(shè)計(jì)在特定細(xì)胞類型中選擇性表達(dá)的 具有復(fù)制能力的載體，從而避免不期望的廣譜感染。條件復(fù)制可以通過在載體中納入有效 連接于早期病毒基因的組織特異性、腫瘤特異性或細(xì)胞類型特異性或其他選擇性誘導(dǎo)的調(diào) 控控制序列來實(shí)現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)“應(yīng)激”和“毒性”用來指細(xì)胞天然生物化學(xué)及生物物理穩(wěn)態(tài)的混亂。盡管應(yīng) 激一般導(dǎo)致細(xì)胞穩(wěn)態(tài)恢復(fù)，但是毒性反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本技術(shù)中采用的翻譯調(diào)控(TR)序列(也稱為“TR元件”)是IRES元件，其可通過 (a)其核酸序列背景和(b)調(diào)控翻譯的細(xì)胞活性(美國(guó)公開專利申請(qǐng)No. 2006/0173168)而 區(qū)別于5' UTR IRES。這兩個(gè)特征的組合形成了有效連接于此IRES序列的下游編碼序列在應(yīng)激和/或垂死哺乳動(dòng)物細(xì)胞中選擇性翻譯的基礎(chǔ)。因而，本技術(shù)考慮應(yīng)用任何在應(yīng)激 和/或垂死細(xì)胞中選擇性表達(dá)的哺乳動(dòng)物IRES作為TR元件。在一些實(shí)施方案中，本技術(shù)的IRES元件具有定位于哺乳動(dòng)物蛋白脂質(zhì)蛋白(pip) 基因0RF中的帽子非依賴性翻譯活性。在其天然環(huán)境中，pip IRES活性位于含有若干在正 常細(xì)胞中有效阻斷核糖體掃描內(nèi)部AUG密碼子的上游0RF( “uORF”)的多順反子RNA中。 然而，使細(xì)胞接觸毒性劑導(dǎo)致核糖體結(jié)合并從特異性內(nèi)部RNA序列翻譯，從而從pip 0RF的 3’末端翻譯內(nèi)部氨基酸序列。因而，表達(dá)受該TR元件調(diào)控的適當(dāng)編碼序列允許觀察、監(jiān)測(cè) 和調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡，這在眾多應(yīng)用中有用途。本文提供的重組DNA分子允許在應(yīng)激或垂死細(xì) 胞中選擇性地表達(dá)含有編碼一個(gè)或多個(gè)多肽的一個(gè)或多個(gè)核酸序列的RNA轉(zhuǎn)錄物。在一些實(shí)施方案中，本技術(shù)的TR元件源自pip基因的外顯子1-7。雖然不束縛于 特定的理論，基于突變分析數(shù)據(jù)，相信外顯子1至4足以編碼功能性IRES活性。而且，相信 在應(yīng)激/死亡特異性翻譯方面起作用的TR調(diào)控系統(tǒng)定位于外顯子6和/或7中。與US 2006/0173168中公開的在垂死細(xì)胞中表達(dá)的IRES元件相比，本技術(shù)源自 PLP/DM20的TR元件在所有如下特征上均有所不同1)核苷酸1 (SEQ ID No. 1和2中)由A突變?yōu)門，以除去髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白PLP 及DM20cDNA中指導(dǎo)全長(zhǎng)PLP和DM20合成的野生型AUG起始密碼子，以防止發(fā)生這樣的合 成；2)核苷酸4由G突變?yōu)锳，以在PLP及DM20cDNA的第二可能讀框中創(chuàng)建終止密碼 子，以防止其全長(zhǎng)合成；3)核苷酸6、7和8分別由C突變?yōu)門、T突變?yōu)镚、以及T突變?yōu)锳，以在PLP及 DM20cDNA的第三可能讀框中創(chuàng)建終止密碼子，以防止全長(zhǎng)PLP和DM20的合成；4)核苷酸17和18分別由G突變?yōu)锳、以及T突變?yōu)镚，以在PLP及DM20cDNA的主 要(第一)可讀框中創(chuàng)建第一終止密碼子，以防止其全長(zhǎng)合成；5)核苷酸21由T突變?yōu)锳，以在PLP及DM20cDNA的主要(第一)可讀框中創(chuàng)建 第二終止密碼子，以防止其全長(zhǎng)合成；6)核苷酸27由A突變?yōu)門，以從PLP及DM20cDNA的第三可能讀框中去除AUG密 碼子，以防止不存在AUG野生型密碼子時(shí)不符合讀框的翻譯起始；和7)從PLP及DM20cDNA中缺失了終止密碼子，以減小對(duì)下游可讀框翻譯的干擾。因此，本技術(shù)源自PLP/DM20的TR元件并不指導(dǎo)PIRP-M或PIRP-L的帽子依賴性 翻譯。除上述變化之外，還向來自DM 20變體cDNA的TR元件中引入了如下突變1)核苷酸511由A突變?yōu)門，以去除DM20變體中指導(dǎo)PIRP-M蛋白合成的第一個(gè) 符合讀框的內(nèi)部AUG起始密碼子，以防止發(fā)生這樣的合成；和2)核苷酸598由A突變?yōu)門，以去除DM20變體中指導(dǎo)PIRP-L蛋白合成的第二個(gè) 符合讀框的內(nèi)部AUG起始密碼子，以防止發(fā)生這樣的合成。與此類似，向來自PLP變體cDNA的TR元件中引入了如下突變1)核苷酸616由A突變?yōu)門，以去除PLP變體中指導(dǎo)PIRP-M蛋白合成的第一個(gè)符 合讀框的內(nèi)部AUG起始密碼子，以防止發(fā)生這樣的合成；和2)核苷酸703由A突變?yōu)門，以去除PLP變體中指導(dǎo)PIRP-L蛋白合成的第二個(gè)符 合讀框的內(nèi)部AUG起始密碼子，以防止發(fā)生這樣的合成。
本技術(shù)的TR盒在諸如離體或體內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞死亡；體內(nèi)或離體確定化合物的細(xì)胞 毒性；體內(nèi)診斷；體內(nèi)或離體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；體內(nèi)或離體預(yù)防細(xì)胞凋亡；以及將細(xì)胞應(yīng)激和 /或死亡成像與隨后的治療相組合等方法中有許多用途。另外，本技術(shù)詳細(xì)說明了篩選其他 TR盒[即在應(yīng)激和/或垂死細(xì)胞中選擇性表達(dá)的IRES元件]的方法。表汰盒本技術(shù)一方面涉及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可表達(dá)的核酸表達(dá)盒。所述表達(dá)盒以5’至 3’方向含有如下元件至少一種轉(zhuǎn)錄效應(yīng)序列；編碼在應(yīng)激和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯 的mRNA分子的TR元件；有效連接于TR元件的核苷酸序列；和多聚腺苷酸化序列。所述核 苷酸序列為第一可讀框(0RF)序列，編碼多肽或其片段，并與TR元件共翻譯。在多個(gè)實(shí)施方案中，本技術(shù)的TR元件在應(yīng)激和/或垂死細(xì)胞中呈現(xiàn)選擇性翻譯。 術(shù)語(yǔ)在應(yīng)激和/或垂死細(xì)胞中“選擇性地翻譯”或“選擇性翻譯”表示在翻譯活性高峰期、 例如在用誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激和/或死亡的急性毒性劑(acute toxic agent)處理后約9至約18 小時(shí)之內(nèi)，在超過95%的用TR表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的任何細(xì)胞系中觀察到mRNA翻譯活性，并且本發(fā) 明表達(dá)盒第一 0RF的翻譯水平升至在用急性毒性劑處理后相同0RF從缺乏有效連接的TR 元件的相同表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)表達(dá)水平的至少50%。例如，本技術(shù)表達(dá)盒中的TR元件在 應(yīng)激和/或垂死細(xì)胞中在用5 P M濃度的鈣離子載體A23187處理后約9小時(shí)之內(nèi)呈現(xiàn)出選 擇性翻譯，其中在超過95%的用該表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的HEK293細(xì)胞系中觀察到mRNA翻譯，并且該 表達(dá)盒第一 0RF的翻譯水平是處理后相同0RF從缺乏有效連接的TR元件的相同表達(dá)盒轉(zhuǎn) 錄和翻譯時(shí)翻譯水平的至少50%。在一些情況下，本技術(shù)表達(dá)盒中的TR元件在應(yīng)激和/或 垂死細(xì)胞中在用5 P M濃度的鈣離子載體A23187處理后約6至約9小時(shí)之內(nèi)呈現(xiàn)出選擇性 翻譯，其中在約96%、97%、98%、99%、99. 5%或99. 9%的用該表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的HEK293細(xì)胞 系中觀察到mRNA翻譯，并且該表達(dá)盒第一 0RF的翻譯水平是處理后相同0RF從缺乏有效連 接的TR元件的相同表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)翻譯水平的約55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、 85%、90%或 95%。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，TR元件是plpIRES元件，其并不指導(dǎo)PIRP-M或 PIRP-L的翻譯。在其他實(shí)施方案中，TR元件并不源自plpIRES。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，本技術(shù)涉及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可表達(dá)的核酸表達(dá)盒，其 中所述表達(dá)盒以5’至3’方向含有如下元件至少一種轉(zhuǎn)錄效應(yīng)序列；編碼在應(yīng)激和/或 垂死細(xì)胞中翻譯的mRNA分子的TR元件；側(cè)接TR元件、含有本領(lǐng)域常見限制性酶位點(diǎn)的3’ 序列；有效連接于TR元件的核苷酸序列，其為第一可讀框(0RF)序列，編碼多肽或其片段， 并與TR元件共翻譯；和多聚腺苷酸化序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，TR元件選自人或小鼠TR元件。更優(yōu)選TR元件選自鼠序列 TR^ (SEQ ID NO 1)禾口 TRplp(SEQ ID NO :2)。11^核酸序列(SEQ ID N0:1)源自小鼠蛋白脂質(zhì)蛋白基因1的DM20剪接變體 cDNA，但是已經(jīng)在核苷酸位置1、4、6、7、8、17、18、21、27、511和598進(jìn)行了修飾。另外，還去 除了編碼終止密碼子的最后3個(gè)核苷酸。TRplp核酸序列(SEQ ID NO 2)源自小鼠蛋白脂質(zhì)蛋白基因1的PLP剪接變體 cDNA，并且其含有核苷酸位置1、4、6、7、8、17、18、21、27、616和703處的修飾。TRplp因存在 核苷酸349-453而有別于TRdm。去除了編碼終止密碼子的最后3個(gè)核苷酸。
除TR元件外，本技術(shù)的表達(dá)盒還包含調(diào)控基因表達(dá)的上游轉(zhuǎn)錄效應(yīng)序列。在一個(gè) 實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄效應(yīng)序列是哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子。另外，轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子還可包括其他啟動(dòng)子序列 和/或轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，例如增強(qiáng)子和沉默子或其組合。這些轉(zhuǎn)錄效應(yīng)序列可包括已知與調(diào)控 任何有效連接編碼序列轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞組分結(jié)合的部分。例如，增強(qiáng)子或沉默子序列可包括結(jié) 合已知細(xì)胞組分如轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì)的序列。轉(zhuǎn)錄效應(yīng)序列可選自任何適宜的核酸，例如基 因組DNA、質(zhì)粒DNA、病毒DNA、mRNA或cDNA，或任何適宜的生物(例如，病毒、細(xì)菌、酵母、真 菌、植物、昆蟲或哺乳動(dòng)物)?；谒玫霓D(zhuǎn)錄和/或翻譯系統(tǒng)選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄效應(yīng)序列 落在本領(lǐng)域技術(shù)范疇之內(nèi)?？蓪⑷魏蝹€(gè)體調(diào)控序列以野生型排列(如同天然基因組次序存 在)或人工排列安排在轉(zhuǎn)錄效應(yīng)元件之中。例如，修飾的增強(qiáng)子或啟動(dòng)子序列可以包括調(diào) 控序列的重復(fù)單位，從而通過這些變化修飾載體的轉(zhuǎn)錄活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子選自組成型、誘導(dǎo)型、組織特異性、腫瘤特異性和反應(yīng) 基因啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子可選自例如勞斯肉瘤病毒(RSV)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)啟動(dòng)子、巨 細(xì)胞病毒即時(shí)早期基因(CMV)啟動(dòng)子、猿猴病毒40早期(SV40E)啟動(dòng)子、胞質(zhì)肌動(dòng)蛋 白啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子和磷酸甘油激酶(PGK)啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組 成型啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，組成型啟動(dòng)子是SV40E啟動(dòng)子。選擇響應(yīng)特定的生理或合成信號(hào)調(diào)控的啟動(dòng)子能夠允許基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄。 例如，在轉(zhuǎn)基因的表達(dá)對(duì)于生產(chǎn)載體的細(xì)胞有毒性的情況下，可能期望防止或減小轉(zhuǎn)基因 的轉(zhuǎn)錄。作為舉例，凋亡前轉(zhuǎn)基因可對(duì)于生產(chǎn)之的細(xì)胞有毒性。因而，若干誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系 統(tǒng)可用來生產(chǎn)含有編碼毒性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因的載體。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括金屬調(diào)控的人金屬硫蛋白(hMT-IIA)啟動(dòng)子、 鋅誘導(dǎo)型人鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白l(hZnT-l)啟動(dòng)子、地塞米松(Dex)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、小鼠乳瘤病毒
(MMTV)啟動(dòng)子、蛻皮素反應(yīng)昆蟲啟動(dòng)子、四環(huán)素反應(yīng)Tet-Oi^^TefOff 系統(tǒng)、冊(cè)486
誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和雷帕霉素反應(yīng)啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是金屬硫蛋白 hMT-IIA啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是鋅誘導(dǎo)型hZnT-1啟動(dòng)子。提供了在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中控制誘導(dǎo)基因表達(dá)的方法和組合物。例如，通過升 高重金屬離子及糖皮質(zhì)激素的濃度來誘導(dǎo)包含人金屬硫蛋白(hMT-IIA)及鋅誘導(dǎo)型人鋅 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白l(hZnT-l)轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)的DNA序列。這些誘導(dǎo)型啟動(dòng)子由鄰近于本底水平轉(zhuǎn)錄 調(diào)控子的多個(gè)金屬調(diào)控元件(例如，MRE)組成。在其他情形下，可能期望利用響應(yīng)激素或抗生素的啟動(dòng)子來激活轉(zhuǎn)錄。蛻皮素系 統(tǒng)(Invitrogen，Carlsbad, Calif.)由緊密調(diào)控的表達(dá)機(jī)制構(gòu)成，其防止本底水平的轉(zhuǎn)基 因表達(dá)，但是允許超過200倍的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)。該系統(tǒng)基于果蠅(Drosophila)的雜二聚體蛻皮 素受體，并且當(dāng)蛻皮素或其類似物(例如幕黎留酮A)與受體結(jié)合時(shí)，該受體激活啟動(dòng)子以 開啟下游轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。在此系統(tǒng)中，雜二聚體受體的兩個(gè)單體皆由一個(gè)載體組成型地表 達(dá)，而驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的蛻皮素反應(yīng)啟動(dòng)子位于第二質(zhì)粒上。因而，將含有受調(diào)控轉(zhuǎn)基因及 受體單體的兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至報(bào)告細(xì)胞允許甚至是毒性轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)型表達(dá)。Tet-Off 或Tet-On 系統(tǒng)(Clontech，Palo Alto, Calif.)最初由 Gossen 和 Bujard(Gossen和Bujard，1992 ；Gossen等人，1995)開發(fā)，利用四環(huán)素或四環(huán)素衍生物如多 西環(huán)素來調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)。在Tet-Gn 系統(tǒng)中，通過四環(huán)素或多西環(huán)素誘導(dǎo)基因表達(dá)，而在Tet-Off系統(tǒng)中，抗生素暴露則消除基因表達(dá)。這些系統(tǒng)基于源自大腸桿菌(E.coli) 四環(huán)素抗性操縱子的兩個(gè)調(diào)控元件，即四環(huán)素操縱子DNA序列和四環(huán)素阻遏蛋白。Tet調(diào) 控質(zhì)粒含有帶四環(huán)素反應(yīng)操縱子元件的最小啟動(dòng)子。第二質(zhì)粒含有四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄激活 蛋白，其為融合蛋白，由VP16轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和Tet-Off系統(tǒng)的野生型四環(huán)素阻遏蛋白組 成。在Tet-On 系統(tǒng)中，四環(huán)素阻遏蛋白已被改變，從而因存在四環(huán)素或多西環(huán)素而激活 轉(zhuǎn)錄。組織特異性啟動(dòng)子可選自例如轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF)、酪氨酸酶(TYR)、白蛋白(ALB)、肌 肉肌酸激酶(CKM)、髓鞘堿性蛋白(MBP)、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)元特異性 烯醇化酶(NSE)和突觸蛋白I(SYN1)啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，組織特異性啟動(dòng)子是突 觸蛋白I(SYm)啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組織特異性啟動(dòng)子是ALB啟動(dòng)子。腫瘤特異性啟動(dòng)子包括但不限于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、VEGF受體(即KDR、 E-選擇蛋白或內(nèi)皮糖蛋白(endoglin))、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、erbB2 (V-erb_b2 成紅血細(xì)胞白血病病毒癌基因同源物2)、骨鈣蛋白(骨羧基谷氨酸蛋白，BGLAP)、 SLP1 (分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制因子或抗白細(xì)胞蛋白酶1)、低氧反應(yīng)元件(HRE)、L-絲束蛋 白(plastin)(淋巴細(xì)胞胞質(zhì)蛋白1)和已糖激酶II(HK2)的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中， 腫瘤特異性啟動(dòng)子是甲胎蛋白(AFP)啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤特異性啟動(dòng)子是 SLP1啟動(dòng)子。反應(yīng)基因啟動(dòng)子優(yōu)先或獨(dú)特地在某些細(xì)胞狀態(tài)下和/或響應(yīng)外部化學(xué)或環(huán)境刺 激(即熱擊或冷擊)而刺激轉(zhuǎn)錄，其可選自例如早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因1 (EGR1/ZIF268)、組織型 血纖維蛋白溶酶原活化因子(t-PA)、多藥耐性蛋白l(mdr-l)、HSPA5/Grp78/BIP(70kDa熱 擊蛋白5) ,c-fos(v-fos FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物)、c-jun(V-jun肉瘤病毒17癌基 因同源物)的啟動(dòng)子，或選自細(xì)胞周期調(diào)控基因，例如但不限于E2F-1 (E2F轉(zhuǎn)錄因子1)、細(xì) 胞周期蛋白Al(CCNAl)和CDC25C(細(xì)胞分裂周期25C)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)基因啟 動(dòng)子是HSPA5的啟動(dòng)子。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)基因啟動(dòng)子是EGR1啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，分離特定的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)元件，然后有效連接于最小啟動(dòng)子，以產(chǎn) 生其轉(zhuǎn)錄活性依賴于單一或有限類型細(xì)胞反應(yīng)(例如，熱擊反應(yīng)或金屬調(diào)控元件)的表達(dá)
品.o表達(dá)盒可包括物種特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。此類DNA調(diào)控序列可基于將要向其中插 入表達(dá)盒的細(xì)胞類型來選擇，并且可分離自原核或真核細(xì)胞，包括但不限于細(xì)菌、酵母、植 物、昆蟲、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或分離自病毒。在這樣的實(shí)例中，將選擇哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子以在哺乳 動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)所選的核酸。本技術(shù)的TR表達(dá)盒能夠在應(yīng)激和垂死細(xì)胞中進(jìn)行選擇性基因表達(dá)，允許異源0RF 插入在TR序列3’的和多聚腺苷酸化信號(hào)的5’。異源基因可為目的基因的全長(zhǎng)基因組序列 (例如包括內(nèi)含子)、合成核酸或cDNA拷貝，其編碼目的蛋白質(zhì)或多肽，其中多肽包括生物 學(xué)活性的(“生物活性”)蛋白質(zhì)片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，出于本技術(shù)的目的使用cDNA 序列，這是因?yàn)橥ㄟ^去除mRNA剪接位點(diǎn)而提供的基因組復(fù)雜度減小。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，第一 0RF序列選自報(bào)告基因、細(xì)胞毒性腫瘤抑制基因、 毒素基因、前藥激活基因和凋亡前基因。在多個(gè)實(shí)施方案中，第一 0RF序列是報(bào)告基因。如其名稱所暗示的那樣，報(bào)告基因并不對(duì)其中引入之的細(xì)胞賦予任何選擇優(yōu)勢(shì)。相反，報(bào)告基因編碼的產(chǎn)物賦予細(xì)胞可檢 測(cè)的生物化學(xué)或視覺可見(例如熒光)表型。報(bào)告多肽還可包括融合或雜合多肽，其中另 一多肽融合于多肽或其片段的N-末端或C-末端。融合多肽通過對(duì)編碼一種多肽的核酸 序列(或其部分)與編碼另一種多肽的核酸序列(或其部分)進(jìn)行符合讀框的克隆而產(chǎn) 生。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域已知，并且包括連接編碼多肽的編碼序列，從而使之符合 讀框，且融合多肽的翻譯處于TR盒的控制之下。例如，對(duì)pip 0RF與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (EGFP) 0RF進(jìn)行符合讀框的克隆產(chǎn)生了融合蛋白，用來監(jiān)測(cè)該融合蛋白在培養(yǎng)細(xì)胞中的表 達(dá)、亞細(xì)胞定位和生物學(xué)效應(yīng)(Ghandour S等人Glia (2002) 40 (3) 300-11 ；Boucher S等人 J Neurosci(2002)22(5) 1772—83)?！惓Ｓ玫膱?bào)告基因編碼酶或其他生物化學(xué)標(biāo)記，當(dāng)其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá) 時(shí)，造成細(xì)胞或細(xì)胞環(huán)境中可見的變化。此類變化可直接觀察，可包括添加轉(zhuǎn)變成可檢測(cè) 產(chǎn)物的適當(dāng)?shù)孜铮蛱砑雍徒Y(jié)合代謝示蹤物。這些報(bào)告基因的實(shí)例有編碼半乳糖甘酶
-gal)的細(xì)菌lacZ基因、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)、螢火蟲熒光素酶(鞘翅目甲蟲)、 花蟲(Renilla)熒光素酶(海腎)、單純皰疹1胸苷激酶(HSV1-TK)以及突變的單純皰疹1 胸苷激酶(HSVl-sr39tk)基因。在0-gal的情況下，表達(dá)細(xì)胞與鹵素衍生的半乳糖一起孵 育，產(chǎn)生能夠通過組織化學(xué)或熒光測(cè)定法檢測(cè)和定量的有色或熒光產(chǎn)物。在CAT的情況下， 細(xì)胞裂解物與放射性標(biāo)記的氯霉素或其他乙?；w分子如乙酰輔酶A —起孵育，并通過 色譜法測(cè)定乙酰化的氯霉素產(chǎn)物。其他有用的報(bào)告基因編碼自然發(fā)熒光的蛋白質(zhì)，包括綠 色熒光蛋白(GFP)、增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(EYFP)或單體紅色熒光蛋白(mRFPl)。如可從上文看到的那樣，例示性的報(bào)告基因可選自GFP、EYFP、mRFPl、^-Gal 和CAT，但是可使用任何本領(lǐng)域已知的其他報(bào)告基因。參見例如http World Wide ffebolympusconfocal. com/appli cat ions/fpcolorpalette. html 網(wǎng)址。在優(yōu)選的實(shí)施方案 中，報(bào)告基因是螢火蟲熒光素酶。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，報(bào)告基因是花蟲熒光素酶。第一 0RF序列也可編碼細(xì)胞毒性腫瘤抑制基因，該基因編碼能夠抑制腫瘤表型和 /或誘導(dǎo)凋亡的多肽。用于實(shí)施本技術(shù)的腫瘤抑制基因的實(shí)例包括P53、腺瘤性結(jié)腸息肉 (APC)、乳腺癌-1 (BRCA-1)、BRCA-2、腎胚細(xì)胞瘤(WT-1)、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因(Rb)、神經(jīng)纖 維瘤病-1 (NF-1)、NF-2和vonHippel-LindaiKVHL)基因。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性 腫瘤抑制基因是P53基因。在另一實(shí)施方案中，第一 0RF序列編碼“毒素基因”，其與細(xì)胞受體蛋白質(zhì)結(jié)合，并 且在攝入后通過阻斷核糖體組裝或功能而干擾蛋白質(zhì)合成。毒素基因的實(shí)例包括蛋白質(zhì)如 假單胞菌外毒素(例如，外毒素A或“ETA”)、蓖麻毒蛋白毒素、白喉毒素等等。在優(yōu)選的實(shí) 施方案中，毒素基因是白喉毒素基因。在另一實(shí)施方案中，第一 0RF序列是前藥激活基因(例如，藥物敏感性或自殺基 因)，其編碼將缺乏治療效應(yīng)的前藥轉(zhuǎn)化成藥物的蛋白質(zhì)，所述藥物使表達(dá)所述基因的細(xì)胞 在接觸所述前藥后易于死亡。前藥基因的實(shí)例包括單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)、細(xì)胞 色素P450、人脫氧胞苷激酶和細(xì)菌酶胞嘧啶脫氨酶和鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(gpt)基因。 表達(dá)這些基因的細(xì)胞變成對(duì)前藥更昔洛韋(HSV-tk)、環(huán)磷酰胺(細(xì)胞色素P450)、阿糖胞苷 (脫氧胞苷激酶)、5_氟胞嘧啶(細(xì)菌cytosonine脫氨酶)或硫代黃嘌呤(gpt)敏感。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，前藥激活基因是HSV-tk基因，其還能夠提供重要的治療優(yōu)勢(shì)。在TK催化抗病毒鳥苷類似物更昔洛韋期間，釋放凋亡分子，通過稱為“旁觀者”殺傷的過程殺死周 圍的細(xì)胞。雖然有限數(shù)目的靶細(xì)胞可以最初表達(dá)HSV-tk基因，但這種局部的殺細(xì)胞效應(yīng)提 供了對(duì)于鄰近非表達(dá)的不期望旁觀者細(xì)胞的治療效應(yīng)。在第一 0RF序列是凋亡前基因的實(shí)施方案中，這樣的序列導(dǎo)致表達(dá)細(xì)胞的程序性 細(xì)胞死亡或凋亡。凋亡前基因的實(shí)例包括P53、p53的凋亡刺激蛋白質(zhì)(例如ASPP1、ASPP2 和ASPP3)、Bcl-2同源物Bax和Bcl2-L_10 (Diva)、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)、Fas、起始胱天蛋白 酶例如胱天蛋白酶_8和胱天蛋白酶_9，或效應(yīng)胱天蛋白酶例如胱天蛋白酶-3。在優(yōu)選的 實(shí)施方案中，凋亡前基因是胱天蛋白酶_3基因。在另一實(shí)施方案中，第一 0RF序列編碼包含F(xiàn)ab或單鏈Fv(SCFv)分子的重組細(xì) 胞內(nèi)抗體(“胞內(nèi)抗體”)，但是不編碼有效的分泌序列，因此被限制在其結(jié)合的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室 中，中和或修飾靶抗原的活性。這種相互作用可以導(dǎo)致直接抑制靶抗原功能、恢復(fù)突變?nèi)毕?活性、干擾抗原的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸或限制病理突變蛋白質(zhì)的折疊。為發(fā)揮其功能，重組胞內(nèi)抗體 被定向于抗原所在的亞細(xì)胞區(qū)室。這可通過摻入通常融合在N-或C-末端的信號(hào)序列而實(shí) 現(xiàn)。例如，KDEL肽序列允許重組抗體滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，因此能夠用來阻斷細(xì)胞表面靶向蛋 白質(zhì)的加工。其他信號(hào)序列可摻入在胞內(nèi)抗體0RF中，以產(chǎn)生細(xì)胞核定位、ER或高爾基體 路徑、核仁定位、以及轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)體或脂質(zhì)體區(qū)室中。產(chǎn)生單鏈抗體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。作為舉例，有關(guān)此類方法，請(qǐng)技術(shù)人 員參閱美國(guó)專利No. 5，359，046。單鏈抗體("scFv〃或〃 SCA")由通過設(shè)計(jì)的肽接在一 起的抗體可變輕鏈氨基酸序列(VL)和可變重鏈序列(VH)的組成，所述肽將VL序列的羧基 末端連接于VH序列的氨基酸末端，由此在單個(gè)分子上重構(gòu)抗原結(jié)合位點(diǎn)。SCA具有單克隆 抗體的結(jié)合特異性和親和力，并且其天然形式為單克隆抗體大小的約1/5至1/6。除了這些 益處之外，全人胞內(nèi)抗體還能夠直接由人文庫(kù)(例如人單重(single-fold)、單鏈可變片段 (scFv)文庫(kù))分離，而無需昂貴耗時(shí)的“人源化”過程。幾乎任何類型的生物分子皆能夠作為胞內(nèi)抗體靶抗原，例如中間代謝物、糖、脂質(zhì) 和激素以及大分子如復(fù)合糖、磷脂、核酸和蛋白質(zhì)。優(yōu)選的靶分子是內(nèi)源蛋白質(zhì)。已經(jīng)開 發(fā)了參與癌癥、傳染病、移植、神經(jīng)變性疾病(neurodegenerative disease)以及其他與蛋 白質(zhì)過表達(dá)或誘變相關(guān)的疾病的許多靶蛋白質(zhì)的胞內(nèi)抗體。胞內(nèi)抗體靶蛋白質(zhì)的具體實(shí)例 包括erbB-2 (雄激素受體)、IL_2受體、表皮生長(zhǎng)因子受體、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2、葉酸 受體、HIV gpl20蛋白、CCR5、CXCR4、a V整聯(lián)蛋白、金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9、NF-k B的 RelA亞基、朊病毒樣蛋白質(zhì)PrP、himtingtin蛋白和淀粉樣前體蛋白。在一個(gè)實(shí)施方 案中，胞內(nèi)抗體針對(duì)NF-kB的RelA亞基。在第一 0RF編碼分泌抗體融合蛋白的實(shí)施方案中，此類蛋白能夠在靶細(xì)胞中誘 導(dǎo)凋亡或增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。實(shí)例包括產(chǎn)生治療反應(yīng)的任何抗體融合蛋白，例如人白介 素-2-截短的白喉毒素、抗CD22dsFv-截短的假單胞菌外毒素、抗CD25scFv-截短的假單胞 菌外毒素和抗B4-阻斷的蓖麻毒蛋白(抗CD19)免疫毒素蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 抗體融合蛋白是抗B4-阻斷的蓖麻毒蛋白免疫毒素蛋白。序列變體在某些情況下，有效連接于TR序列的序列元件可能破壞TR表達(dá)盒所展示的選擇 性翻譯活性，或者呈現(xiàn)亞佳翻譯活性。為減輕連接的0RF對(duì)TR活性的任何影響，本技術(shù)提供了所公開核苷酸序列的密碼子使用變體，其采用不改變ORF產(chǎn)物多肽序列(從而不影響生 物活性)的可選密碼子。這些變體基于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，藉此若干氨基酸由不止一種密 碼子三聯(lián)體編碼。實(shí)例可以是密碼子CGT、CGG、CGC和CGA，他們均編碼氨基酸精氨酸(R)。 因而，蛋白質(zhì)可由變體核酸序列編碼，其在精確序列上有所不同，但仍然編碼具有完全相同 氨基酸序列的多肽?；诿艽a子利用/偏好，可選擇密碼子以優(yōu)化ORF的翻譯效率，而不影 響TR表達(dá)盒的調(diào)控翻譯。定點(diǎn)誘變是一種通過在多個(gè)期望位置之一改變核苷酸序列而產(chǎn)生序列變體的尤 其有用的方法。定點(diǎn)(或位點(diǎn)特異性)誘變應(yīng)用包含具有期望突變的DNA序列的寡核苷酸 序列，以及 足夠數(shù)目的鄰近核苷酸，以提供具有足夠大小和復(fù)雜度的序列，以在建議突變兩 側(cè)均形成穩(wěn)定的雙鏈體。一般，優(yōu)選長(zhǎng)度約20至25個(gè)核苷酸的合成引物，其中序列建議突 變兩側(cè)的約5至10個(gè)殘基均被改變。用于定點(diǎn)誘變的典型載體包括所公開的載體以及任 何商業(yè)或?qū)W術(shù)上可得的質(zhì)粒載體。一般而言，通過使適當(dāng)?shù)腄NA寡核苷酸序列與靶DNA退 火，并通過本領(lǐng)域已知的PCR方法擴(kuò)增靶序列而引入核苷酸取代。本技術(shù)考慮在編碼序列 中應(yīng)用所有可能的密碼子，以產(chǎn)生用于根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的期望的ORF序列。定向進(jìn)化技術(shù)可用來制備具有改進(jìn)的TR功能的序列變體。在定向進(jìn)化技術(shù)中，可 從含TR的多核苷酸起始，進(jìn)行至少一輪核酸突變或核酸剪接或同源重組。可按定向或隨機(jī) 的方式進(jìn)行突變、剪接和同源重組。例如，可如上文所述設(shè)計(jì)一種或多種寡核苷酸進(jìn)行TR 元件的定點(diǎn)誘變，或者可用一種或多種隨機(jī)生成的寡核苷酸與含TR的初始多核苷酸模板 進(jìn)行接觸?？蛇x地或另外地，可在誤差容許條件和/或易錯(cuò)聚合酶下進(jìn)行初始模板的PCR 擴(kuò)增，以允許引入突變，這是一種稱為“松散(sloppy) ” PCR的技術(shù)。與此類似，一組含TR元件的同源多核苷酸可按定向或隨機(jī)的方式進(jìn)行剪接或重 組。例如，可利用一種或多種限制性核酸內(nèi)切酶隨機(jī)地或以預(yù)定的方式來消化同源多核苷 酸模板，然后可將所得的片段連接在一起?？蛇x地或另外地，可匯集該組含TR元件的多核 苷酸，并在有利于他們之間同源重組的條件下進(jìn)行體外或細(xì)胞中(in cyto)處理?？刹捎?突變與剪接或重組技術(shù)的組合。任何這些方法皆可進(jìn)行一輪或一輪以上。在一輪或多輪突變、剪接和/或重組之后，隨之檢驗(yàn)所得的多核苷酸以篩選其TR 活性。一般，這可通過將報(bào)告分子編碼序列置于一種或多種已產(chǎn)生的TR變體的有效控制之 下而進(jìn)行。然后在置于能夠發(fā)生TR翻譯的條件例如應(yīng)激條件下的細(xì)胞中表達(dá)所得的構(gòu)建 體。該檢驗(yàn)?zāi)軌蛴脕頇z測(cè)TR元件功能方面期望的改進(jìn)。例如，TR元件翻譯對(duì)應(yīng)激條件的 特異性、TR元件激活對(duì)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的敏感性(例如，細(xì)胞應(yīng)激和/或死亡前的生物化學(xué) 變化)、或經(jīng)TR元件激活后翻譯起始的效率(即量度(magnitude))方面的任一改進(jìn)均可成 為測(cè)定的焦點(diǎn)?；跍y(cè)定結(jié)果，可選擇一種或多種改進(jìn)的TR元件進(jìn)行應(yīng)用或進(jìn)一步的開發(fā)；在一 些實(shí)施方案中，所選擇的改進(jìn)的TR元件核酸可用作為起始多核苷酸或用作為起始多核苷 酸組，進(jìn)行另一輪、或一連串輪的定向進(jìn)化。在本文的多個(gè)實(shí)施方案中，TR元件可包含這樣的PLP/DM20多核苷酸或通過突變 之來制備，所述PLP/DM20多核苷酸包含圖15鼠或人PLP/DM20 DNA序列堿基約27至約 615/510或與之對(duì)應(yīng)的堿基；且這還可包含堿基約616/511至約702/597、堿基約703/598 至約772/666、和/或堿基約773/667至約810/705或與之對(duì)應(yīng)的堿基。例如，TR元件可包含這樣的PLP/DM20多核苷酸或通過突變之來制備，所述PLP/DM20多核苷酸包含參照?qǐng)D15編號(hào)的堿基約27至約810/705或與之對(duì)應(yīng)的堿基，其中刪除或未刪除堿基約616/511至約 702/597。在PLP/DM20編碼序列及其或由之構(gòu)建的TR元件中，可在對(duì)應(yīng)于如下參照?qǐng)D15所 述的PLP/DM20位置中的一個(gè)或多個(gè)位置上進(jìn)行突變而對(duì)TR元件功能沒有不利影響，即位 置:01、02、03、04 至 21 (包括缺失全部或部分此區(qū)段)、25、26、314、332、560/455、614/509、 622/518至696/591 (包括缺失全部或部分此區(qū)段，這去除了外顯子5)、616/511、703/598、 806/701、811/706、817/712、818/713和827/722。在多個(gè)實(shí)施方案中，除前述之外的其他核 堿基(nucleobase)可保留在PLP/DM20編碼序列中。例如，在多個(gè)實(shí)施方案中，此PLP/DM20編碼序列的核堿基序列可在對(duì)應(yīng)于PLP核 苷酸位置 41-48、50-56、75-81、150-156、200-205、227-244、251-257 和 563-570 的核苷酸 位置上包含多聚嘧啶基序。在一些實(shí)施方案中，這樣的序列還可在一個(gè)或多個(gè)PLP位置 270-274、299-303、490-494、578-582、597-601上包含多聚嘧啶基序；而在一些實(shí)施方案 中，還在一個(gè)或多個(gè) PLP 位置 626-632、642-648、669-674、707-712、755-761、767-771 和 800-804上包含。與此類似，在多個(gè)實(shí)施方案中，此PLP/DM20編碼序列的核堿基序列可在對(duì)應(yīng)于 PLP 核苷酸位置130-133、142-145、190-193、220-223、305-308 的核苷酸位置上包含 GNRA 基序；而在一些實(shí)施方案中，還在635-638上包含；而在其他實(shí)施方案中，還在一個(gè)或多個(gè) 位置329-332、343-346和572-575上包含；而在一些實(shí)施方案中，又還在一個(gè)或多個(gè)位置 650-653 和 683-686 上包含。然而，如所提及的那樣，可采取如下位置的突變而沒有不利影響，且在一些情況 下具有增強(qiáng)的效應(yīng)01、04、06、07、08、17、18、21、27。在一些實(shí)施方案中，這些突變可為 01t、04a、06t、07g、08a、17a、18g、21a和27t中一個(gè)或多個(gè)。可進(jìn)行突變而對(duì)功能沒有不 利影響的其他位置包括一個(gè)或多個(gè)PLP位置25、26、314、332、560/455、616/511、703/598、 806/701、811/706、817/712、818/713和827/722上的突變。在一些實(shí)施方案中，這些可以 是 25g、26c、314g、332g、560/455c、616/511t、703/598t、806/701g、811/706t、817/712a、 818/713a和827/722g中的一個(gè)或多個(gè)。另外，可在PLP位置614/509上進(jìn)行插入，例如插 入多達(dá)或約5個(gè)核苷酸，而對(duì)功能沒有不利影響。另外，報(bào)告或其他靶基因編碼序列與位置 831/726的融合，例如與之符合讀框的融合，對(duì)TR元件功能并不呈現(xiàn)出任何不利影響。在多個(gè)實(shí)施方案中，可用于本文的PLP或DM20序列可為脊椎動(dòng)物序列；在一些 實(shí)施方案中，這可為人、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物、馬科動(dòng)物(equine)、?？苿?dòng)物(bovine)、 羊(ovine)、豬科動(dòng)物(porcine)、犬科動(dòng)物(canine)、貓科動(dòng)物(feline)、兔科動(dòng)物 (Iapine)、有袋動(dòng)物、鳥類、魚類、兩棲動(dòng)物或爬行動(dòng)物序列。在多個(gè)實(shí)施方案中，脊椎動(dòng)物 序列可為野生型或變體天然序列；在一些實(shí)施方案中，脊椎動(dòng)物序列可為野生型序列。如本文所用，就PLP/DM20序列而言，“脊椎動(dòng)物共有序列”是指DNA序列1 atgggyykgy wdgakkgytg yrynmgmtgy mtbrtwgggg ymccmttygc ytchbtsrtb61 gccacwgkvy tvtgyttyky tggrgtsgcv ctvttctgyg gmtgyggrca ygargchytv121 asygghacmg armagytvat ygagacmtay ttytccaara aytaccaaga mtaygartay181 ctcatyvayg tsatymaygc yttycagtay gtcatctatg gaaywgccwy yttcttctty
241 cthtwyggrr ycctvctkyt ggcygarggm ttctacacca cmrsygchrt cargcavatc301 ythggsgast wcmrrmccmc mryywkmrrs rrkggsctga kykcwacrgt racwggrggm361 cmkaarggga grrghdcsmg rggmmvvcak cvagyycayw cywtrsagck srtstgtcrb 421 tgyttgggaa artggctmgg acayccygay aagtttgtsg gyrtyacyta tryyhtsacy481 rtyktvtggm tmctrrystt ygcctgctcd gcygtdccyg tvtacatyta yttyaayacc541 tggrycacyt gycagtctat ygcckyccch rssaagacyw cwrccagyrt mrgyasbcts601 tgykcdgayg symgvatgta yggtgtycts ccmtggaayg cbttycchgg saargtktgy661 ggswccarcc tkctbkccat ctgcaaracm rsygagttcc aratgacntt ycayctbttt721 atygckgcvt tygtgggkgc wgcngchacw ctdgtbkcmc tgctcacytw yatgrthgsy781 gcmwcwtwca actwygcygt sctbmrastb aykggccgrr gcwcmaagtt ytga及其DNA互補(bǔ)物、對(duì)應(yīng)于任何前述的RNA序列、具有對(duì)應(yīng)于任何這些的核堿基序列 的核酸類似物、以及由其編碼的氨基酸序列。如本文所用，就PLP/DM20氨基酸和核苷酸序列而言，“脊椎動(dòng)物特異性序列”是 指圖14所列物種的PLP或DM20序列，即智人(Homo sapiens)、猩猩(Pongo pygmaeus) (猩猩)、黑猩猩(Pan troglodytes)(黑猩猩)、恒河猴(Macaca mulatta)(恒河猴)、
矣(Macaca. fascicularis) ((crab-eating macaque)) > (Sus scrofa)
(豬)、小家鼠(Mus musculus)(小鼠)、褐家鼠(Rattus norvegicus)(大鼠)、灰色短尾 負(fù)鼠(Monodelphis domestica)(負(fù)鼠)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)(兔)、歐洲牛 (Bos taurus)(牛)、家犬(Canisfamiliaris)(狗)、原雞(Gallus galIus)(雞)、斑胸草 雀(Taeniopygia guttata)(珍珠鳥(zebra finch))、多疣壁虎(Gekko japonicus)(壁虎 (gecko lizard))、光滑爪蟾(Xenopus laevis)(娃)禾口矛尾魚(Latimeria chalumnae) (空棘魚(coelacanth))。在一些實(shí)施方案中，脊椎動(dòng)物特異性序列可包含或編碼具有 如下Genbank號(hào)的任一氨基酸序列P60201 (人)、Q5R6E6(猩猩)、XP_001140782 (黑猩 猩)、XP_001088537 (恒河猴)、Q8HXW7 (食蟹獼猴)、NP_999139 (豬)、NP_035253 (小鼠)、 NP_112252 (大鼠)、ΧΡ_001374483 (負(fù)鼠)、P47789 (兔)、CAA08909 (牛)、39025 (狗)、 CAA43839 (雞)、P47790 (珍珠鳥)、AAW79Ol5 (壁虎)、CAA79582 (蛙)或 BAA^2O7 (空棘 魚)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過在 http World Wide Webncbi.nlm.nih.gov/sites/ entrez網(wǎng)址的Nucleotide菜單中搜索NCBI Genbank可容易地獲得編碼這些的DNA 序列。例如，有用的DNA序列包括如下Genbank登錄號(hào)所列的那些AJ006976 (人)、 CR860432(猩猩)、XM_001140782 (黑猩猩)、ΧΜ_001088537 (恒河猴)、AB083324(食蟹獼 猴)、NM_213974 (豬)、NM_011123 (小鼠)、NM_030990 (大鼠)、ΧΜ_001374446 (負(fù)鼠)、 NM_001082328 (兔)、AJ009913 (牛)、X55317 (狗)、X6I66I (雞)、NM_001076703 (殘基 113-946，珍珠鳥)、AY880400 (壁虎)、Z19522 (蛙)禾口 AB025938 (空棘魚)。在多個(gè)實(shí)施方案中，可用于本文的PLP或DM20序列可為哺乳動(dòng)物序列；在一些實(shí) 施方案中，這可為人、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物、馬科動(dòng)物(equine)、?？苿?dòng)物(bovine)、羊 (ovine)、豬科動(dòng)物(porcine)、犬科動(dòng)物(canine)、貓科動(dòng)物(feline)、兔科動(dòng)物(Iapine) 或有袋動(dòng)物序列。如本文所用，就PLP/DM20序列而言，“哺乳動(dòng)物共有序列”是指DNA序列
1 atgggcytgt tagagtgytg ygcnagatgy ctsgtagggg ccccctttgc ttccytggtg61 gccactggat trtgtttctt tggrgtggca ctsttctgtg gmtgtggaca tgaagchytm121 actggyacag aaaagytaat tgagacmtat ttctccaaaa aytaccaaga ctaygagtat181 ctcatyaatg tgatycatgc yttccagtat gtcatctatg gaactgcctc tttcttcttc241 ctttatgggg ccctcctgct ggcygagggc ttctacacca ccggygcwgt caggcagatc301 tttggcgact acaagaccac catctgcggs aagggcctga gygcaacggt aacagggggc361 cagaagggga ggggttccag aggccaacat caagctcatt ctttggagcg ggtgtgtcat 421 tgtttgggaa aatggctagg acatcccgac aagtttgtgg gcatcaccta tgccytgacy481 gttgtrtggc tcctrgtgtt tgcctgctck gctgtrcctg tgtacattta yttcaayacc541 tggaccacyt gycagtctat tgcckycccy agcaagacyt ctgccagyat aggcastctc601 tgygctgatg ccagaatgta tggtgttctc ccatggaatg ctttyccwgg caargtktgt661 ggctccaacc ttctgtccat ctgcaaaaca gctgagttcc aaatgacstt ccayctgttt721 attgctgcvt tygtgggkgc tgcrgcyaca ctrgtktccc tgctcacctt catgattgct781 gccacttaca acttygccgt cctkaaactc atgggccgag gcaccaagtt ctga及其DNA互補(bǔ)物、對(duì)應(yīng)于任何前述的RNA序列、具有任何這些的核堿基序列的核酸 類似物、以及由其編碼的氨基酸序列。如本文所用，就PLP/DM20氨基酸和核苷酸序列而言，“哺乳動(dòng)物特異性序列” 是指圖14所列哺乳動(dòng)物物種的PLP或DM20序列，即智人(Homosapiens)、猩猩(Pongo pygmaeus)(猩猩)、黑猩猩(Pan troglodytes)(黑猩猩)、恒河猴(Macaca mulatta)(恒 可 f矣)、 猴(Macaca fascicularis) ( * — f矣(crab-eating macaque))、(Sus scrofa)(豬)、小家鼠(Mus musculus)(小鼠)、褐家鼠(Rattus norvegicus)(大鼠)、灰色 短尾負(fù)鼠(Monodelphis domestica)(負(fù)鼠)、穴兔(Oryctolagus cuniculus)(兔)、歐洲牛 (Bos taurus)(牛)或家犬(Canisfamiliaris)(狗)。在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物特異性 序列可包含或編碼具有如下Genbank號(hào)的任一氨基酸序列P60201 (人)、Q5R6E6 (猩猩)、 XP_001140782 (黑猩猩)、XP_001088537 (恒河猴)、Q8HXW7 (食蟹獼猴)、NP_999139 (豬)、 NP_035253(小鼠)、NP_112252(大鼠)、XP_001374483(負(fù)鼠)、P47789(兔)、CAA08909(牛) 或39025 (狗)。包含此類TR多核苷酸的TR元件如同包含那些TR元件的表達(dá)盒一樣可用 于本文。在多個(gè)實(shí)施方案中，TR元件可具有與圖15PLP序列或圖15DM20序列分別至少 62%同一性的PLP或DM20核苷酸序列。與之的序列同一性可為至少或約65%、70%、75%、 80%、85%、90%或95%。在一些實(shí)施方案中，序列可與之97%、98%、99%或更高同一性。 此類不完全相同的序列將保留PLP或DM20TR元件的有效特征，即所定義的多嘧啶片、GNRA 基序及其19S rRNA結(jié)合位點(diǎn)。在多個(gè)實(shí)施方案中，此TR元件可用來鑒定誘導(dǎo)、增強(qiáng)或抑制細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，例如 對(duì)熱應(yīng)激、冷應(yīng)激、氧化應(yīng)激、緊張應(yīng)激、中毒或其組合的反應(yīng)的活性劑(agent)。細(xì)胞應(yīng)激 反應(yīng)可包括凋亡和/或壞死。在一些實(shí)施方案中，鑒定此類活性劑的方法可包括鑒定活性 劑誘導(dǎo)、增強(qiáng)、抑制或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的程度；這可例如通過鑒定與由在TR元件控制下 表達(dá)的報(bào)告分子所檢測(cè)的信號(hào)量級(jí)成比例的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)程度來實(shí)現(xiàn)。在多個(gè)實(shí)施方案中，此TR元件可用于預(yù)防性、治療性或姑息性治療需要細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)防護(hù)的受試人的方法。在這樣的實(shí)施方案中，所述TR元件為構(gòu)建體的一部分，其中TR 元件與包含編碼提供細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)防護(hù)的表達(dá)產(chǎn)物的編碼序列的多核苷酸有效相連，且所 述治療包括給藥包含此類構(gòu)建體的組合物。由此提供的防護(hù)可為例如隔離或降解毒性劑 (toxifying agent)、穩(wěn)定細(xì)胞中的生物分子、催化形成防護(hù)劑、或促使由不同編碼序列表 達(dá)防護(hù)劑的活性。雙順反子TR表汰念如上面章節(jié)所述的表達(dá)盒稱為單順反子盒，因?yàn)閮H存在單個(gè)作為TR轉(zhuǎn)錄物的ORF序列。除單順反子盒之外，本技術(shù)還考慮應(yīng)用雙順反子TR表達(dá)盒，其包括兩個(gè)ORF序列。從而，在本技術(shù)的一個(gè)實(shí)施方案中，雙順反子TR表達(dá)盒包括位于TR序列5’的第 二 ORF序列，除了上文所述的單順反子TR表達(dá)盒的相同元件之外，其中第二 ORF序列與TR 元件并不有效連接。因而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)容易地意識(shí)到，雖然第二 ORF序列與TR序 列和第一 ORF在單個(gè)mRNA物質(zhì)中一起轉(zhuǎn)錄，但是其獨(dú)立于TR元件和第一 ORF序列借助于 帽子依賴性機(jī)制翻譯。當(dāng)人們希望觀察任何活性劑或分子對(duì)帽子依賴性或帽子非依賴性翻 譯的不同影響時(shí)，第二 ORF序列具有實(shí)用性。例如，毒性劑將誘導(dǎo)帽子依賴性向帽子非依賴 性翻譯轉(zhuǎn)變。在第二 ORF序列是報(bào)告基因的情況下，報(bào)告基因活性喪失提供了對(duì)帽子依賴 性向帽子非依賴性翻譯轉(zhuǎn)變的時(shí)間和定量衡量。因此，許多實(shí)施方案包括雙順反子表達(dá)盒， 其中第一 ORF序列是報(bào)告基因、細(xì)胞毒性腫瘤抑制子、毒素基因、前藥激活基因、抗體、衍生 抗體或凋亡前基因，而第二 ORF序列是報(bào)告基因。可選地，雙順反子TR表達(dá)盒可包括為報(bào) 告基因的第一 ORF序列，和選自細(xì)胞毒性腫瘤抑制子、毒素基因、前藥激活基因、單鏈抗體 或凋亡前基因的第二 ORF序列。在此實(shí)施方案中，第二 ORF提供推定毒性基因產(chǎn)物的翻譯， 其刺激由帽子依賴性向帽子非依賴性翻譯轉(zhuǎn)變，這可隨后通過由TR調(diào)控的第一 OFR翻譯所 產(chǎn)生的報(bào)告基因活性來衡量。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地制備任何這些組合。例示性的單 順反子和雙順反子盒示于表1-4。另外，SEQ ID N0:3_4及SEQ ID NO :5_6分別描述了單順反子和雙順反子TR表達(dá) 盒具體實(shí)例的核酸序列。TRdm單順反子盒(PCMV-TTdm-Luc) (SEQ ID NO 3)含有有效連接于螢火蟲熒光素酶 編碼序列的TRdm核酸序列。該盒的核苷酸1至589對(duì)應(yīng)于來自pEYFP-Nl質(zhì)粒(Clontech)的 人巨細(xì)胞病毒即時(shí)早期啟動(dòng)子。核苷酸590至630對(duì)應(yīng)于人工接頭序列，其由原始pEYFP-Nl 形式廣泛修飾而來。核苷酸631至1356對(duì)應(yīng)于TRdm。接下來的8個(gè)核苷酸是人工接頭。核 苷酸1369至1371對(duì)應(yīng)于源自pEYFP-Nl質(zhì)粒的Kozak共有翻譯起始位點(diǎn)。核苷酸1372至 3024對(duì)應(yīng)于源自phCMV-Luc-FSR質(zhì)粒(Genlantis)的螢火蟲熒光素酶可讀框。核苷酸3025 至3171、3179至3200、及3207至3223對(duì)應(yīng)于源自pEYFP-Nl質(zhì)粒的接頭DNA。核苷酸3172 至3178、及3201至3207對(duì)應(yīng)于源自pEYFP-Nl質(zhì)粒的猿猴病毒40 (SV40)早期基因多聚腺 苷酸化信號(hào)。由此盒轉(zhuǎn)錄的mRNA始于核苷酸583，而止于核苷酸3211或3223。TRplp單順反子盒(pCMV-TRplp-Luc) (SEQ ID NO 4)含有有效連接于螢火蟲熒 光素酶編碼序列的TRplp核酸序列。該盒的核苷酸1至589對(duì)應(yīng)于來自pEYFP-Nl質(zhì)粒 (Clontech)的人巨細(xì)胞病毒即時(shí)早期啟動(dòng)子。核苷酸590至630對(duì)應(yīng)于人工接頭序列(由 原始pEYFP-Nl形式廣泛修飾而來)。核苷酸631至1461對(duì)應(yīng)于TRplp。接下來的8個(gè)核苷 酸是人工接頭。核苷酸1470至1476對(duì)應(yīng)于源自pEYFP-Nl質(zhì)粒的Kozak共有翻譯起始位點(diǎn)。核苷酸1477至3129對(duì)應(yīng)于源自phCMV-Luc-FSR質(zhì)粒(Genlantis)的螢火蟲熒光素酶 可讀框。核苷酸3230至3276、3284至3305、及3313至3328對(duì)應(yīng)于源自pEYFP-Nl質(zhì)粒的 接頭DNA。核苷酸3277至3283、及3306至3312對(duì)應(yīng)于源自pEYFP-Nl質(zhì)粒的SV40早期基 因多聚腺苷酸化信號(hào)。由此盒轉(zhuǎn)錄的mRNA始于核苷酸583，而止于核苷酸3316或3328。TRdm 雙順反子盒(PCMV-Luc-TRdm-EYFP) (SEQ ID NO 5)含有這樣的Rdm 核酸序列， 其具有編碼螢火蟲熒光素酶編碼序列的第二 ORF和編碼EYFP編碼序列(維多利亞多管水 母(Aequorea victoria)綠色熒光蛋白增強(qiáng)型黃綠色變體)的有效連接的第一 0RF。該盒 的核苷酸1至589對(duì)應(yīng)于來自pEYFP-m質(zhì)粒(Clontech)的人巨細(xì)胞病毒即時(shí)早期啟動(dòng)子。 核苷酸590至630對(duì)應(yīng)于人工接頭序列(由原始pEYFP-Nl形式廣泛修飾而來)。核苷酸 631至2283對(duì)應(yīng)于源自phCMV-Luc-FSR質(zhì)粒(Genlantis)的螢火蟲熒光素酶可讀框。接 下來的6個(gè)核苷酸是人工接頭。核苷酸2290至3015對(duì)應(yīng)于TRd^接下來的23個(gè)核苷酸 (3016至3038)對(duì)應(yīng)于源自pEYFP-Nl質(zhì)粒的人工接頭DNA。核苷酸3039至3045對(duì)應(yīng)于源自 pEYFP-Nl質(zhì)粒的Kozak共有翻譯起始位點(diǎn)。核苷酸3046至3760對(duì)應(yīng)于源自pEYFP-Nl質(zhì)粒 的EYFP可讀框。核苷酸3761至3912、3920至3941、及3949至3964對(duì)應(yīng)于源自pEYFP-Nl 質(zhì)粒的接頭DNA。核苷酸3913至3919、及3942至3948對(duì)應(yīng)于源自pEYFP-Nl質(zhì)粒的SV40 早期基因多聚腺苷酸化信號(hào)。由此盒轉(zhuǎn)錄的mRNA始于核苷酸583，而止于核苷酸3952或 3964。TRplp 雙順反子盒(PCMV-Luc-TRplp-EYFP) (SEQ ID NO 6)含有這樣的 TRplp 核酸序 列，其具有編碼螢火蟲熒光素酶編碼序列的第二 ORF和編碼EYFP編碼序列(維多利亞多管 水母(Aequorea victoria)綠色熒光蛋白增強(qiáng)型黃綠色變體)的有效連接的第一 0RF。該 盒的核苷酸1至589對(duì)應(yīng)于來自pEYFP-Nl質(zhì)粒(Clontech)的人巨細(xì)胞病毒即時(shí)早期啟動(dòng) 子。核苷酸590至630對(duì)應(yīng)于人工接頭序列(由原始pEYFP-Nl形式廣泛修飾而來)。核苷 酸631至2283對(duì)應(yīng)于源自phCMV-Luc-FSR質(zhì)粒(Genlantis)的螢火蟲熒光素酶可讀框。接 下來的6個(gè)核苷酸是人工接頭。核苷酸2290至3120對(duì)應(yīng)于TRplp。接下來的23個(gè)核苷酸 (3121至3143)對(duì)應(yīng)于源自pEYFP-Nl質(zhì)粒的人工接頭DNA。核苷酸3144至3150對(duì)應(yīng)于源自 pEYFP-Nl質(zhì)粒的Kozak共有翻譯起始位點(diǎn)。核苷酸3151至3865對(duì)應(yīng)于源自pEYFP-Nl質(zhì)粒 的EYFP可讀框。核苷酸3866至4017、4025至4046、及4054至4069對(duì)應(yīng)于源自pEYFP-Nl 質(zhì)粒的接頭DNA。核苷酸4018至4024、及4047至4053對(duì)應(yīng)于源自pEYFP-Nl質(zhì)粒的SV40 早期基因多聚腺苷酸化信號(hào)。由此盒轉(zhuǎn)錄的mRNA將始于核苷酸583，而止于核苷酸4057或 4069。多聚腺苷酸化序列本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)容易地意識(shí)到任何多聚腺苷酸化(polyA)信號(hào)可摻入在本 文所述單順反子或雙順反子TR表達(dá)盒的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)?？捎糜诒炯夹g(shù)的polyA序 列的實(shí)例包括SV40早期和晚期基因、HSV-TK、和人生長(zhǎng)激素(hGH)序列。在優(yōu)選的實(shí)施方 案中，polyA序列是SV40早期基因序列。任選元件在多個(gè)實(shí)施方案中，TR盒序列的3’ UTR可包括一個(gè)或多個(gè)通過改變mRNA穩(wěn)定性 調(diào)控TR基因表達(dá)的元件。一般，mRNA衰變例示為mRNApolyA尾巴的喪失、將去腺苷酸化的 RNA募集至外來體、及核糖核酸酶(RNAse)降解。在選擇mRNA方面，此過程通過促進(jìn)細(xì)胞降解系統(tǒng)選擇性識(shí)別mRNA的特異性RNA去穩(wěn)定元件加速。在本發(fā)明中，不穩(wěn)定TR盒mRNA含 有源自編碼細(xì)胞反應(yīng)/恢復(fù)基因的mRNA物質(zhì)的3’ UTR AU富含元件(“ARE")序列?？捎糜诖思夹g(shù)的ARE序列的實(shí)例包括來自c-fos、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)、c-jun、腫瘤壞死因子α (TNF- α )、和IL_8mRNA的3’UTR序列。在優(yōu)選的實(shí)施方 案中，應(yīng)用來自c-fos基因的ARE序列。本技術(shù)的單順反子和雙順反子表達(dá)盒還可包括5’非翻譯區(qū)(5’ UTR)，其位于啟 動(dòng)子的3’和TR元件的5’。在一些實(shí)施方案中，這樣的區(qū)域包含mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。在 其他實(shí)施方案中，5’非翻譯 區(qū)包含內(nèi)含子序列，其指導(dǎo)mRNA剪接，并且是在體內(nèi)有效加 工一些mRNA物質(zhì)所必需的。真核細(xì)胞中mRNA剪接的通用機(jī)制在Sharp (Science 235 736-771 (1987))中定義和綜述。有四種mRNA剪接所必需的核酸序列5’剪接供體、分支 點(diǎn)、多嘧啶片和3，剪接接納體。共有5，和3，剪接匯合處(Mount, Nucl. Acids. Res. 10 459-472(1992))和分支位點(diǎn)序列(Zhuang等人，PNAS 86 =2752-2756 (1989))是本領(lǐng)域已知 的。在一些實(shí)施方案中，5’ UTR序列包含存在于天然基因序列中的天然內(nèi)含子或者人 工內(nèi)含子，例如pAAV-MCS載體(Stratagene)中存在的人β _珠蛋白免疫球蛋白序列。另外，本技術(shù)的表達(dá)盒可包括如下一種或多種位于啟動(dòng)子序列5’的約15-50個(gè)核苷酸的序列，其包括一個(gè)或多個(gè)用于將TR盒 插入質(zhì)粒、穿梭載體或病毒載體的限制性位點(diǎn)；位于TR元件3’和ORF序列5’的約15_50個(gè)核苷酸的序列，其包括一個(gè)或多個(gè)用 于插入和有效連接TR元件與ORF序列的限制性位點(diǎn)；位于ORF序列3’和多聚腺苷酸化信號(hào)5’的約15_50個(gè)核苷酸的序列，其包括一 個(gè)或多個(gè)用于插入和有效連接ORF序列與多聚腺苷酸化序列的限制性位點(diǎn)；和位于多聚腺苷酸化序列3’的約15-50個(gè)核苷酸的序列，其包括一個(gè)或多個(gè)用于將 TR盒插入質(zhì)粒、穿梭載體或病毒載體的限制性位點(diǎn)。本文所述的TR表達(dá)盒可插入到質(zhì)?；虿《?“穿梭”)載體中，這取決于用來 復(fù)制TR盒的宿主細(xì)胞。一般而言，TR DNA表達(dá)盒利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)插入到所公 開載體的適當(dāng)限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)處。可用于此目的的眾多載體廣為人知(Miller， Human Gene Therapy 15-14,1990 ；Friedman, Science 244 :1275_1281，1989 ;Eglitis 和 Anderson, BioTechniques 6 :608_614,1988；Tolstoshev 禾口 Anderson, Current Opinion in Biotechnology 1:55-61,1990 ；Sharp, The Lancet 337 1277-1278,1991 ；Cornetta 等 人，Nucleic AcidResearch and Molecular Biology 36 :311-322,1987 ；Anderson, Science226 :401-409，1984 ;Moen，Blood Cells 17 :407_416，1991 ;Miller 等人， Biotechniques 7:980-990,1989 ；Le Gal La Salle 等人，Science 259 :988_990，1993 ；和 Johnson, Chest 107 :77S_83S，1995)。質(zhì)粒載體部分地基于待用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞來選擇。例如，質(zhì)粒中存在的 細(xì)菌或哺乳動(dòng)物選擇標(biāo)記的存在、復(fù)制起點(diǎn)、質(zhì)粒拷貝數(shù)、指導(dǎo)與染色體DNA隨機(jī)或位點(diǎn) 特異性重組的能力等等，可影響適當(dāng)載體的選擇。在一些實(shí)施方案中，采用細(xì)菌質(zhì)粒如 pBluescript II、pET14、pUC19、pCMV_MCS和pCMVneo在細(xì)菌細(xì)胞中增殖本技術(shù)的TR盒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，質(zhì)粒是pCMVneo載體。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，質(zhì)粒是pBluescript II載體。在另一實(shí)施方案中，TR表達(dá)盒插入到哺乳動(dòng)物或病毒穿梭載體中。哺乳動(dòng)物穿 梭載體含有哺乳動(dòng)物選擇標(biāo)記并確保分離含有穩(wěn)定基因組整合體的細(xì)胞，而病毒穿梭載體 利用重組或遺傳互補(bǔ)確保重構(gòu)病毒基因組。在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物穿梭載體選自 pCMV、pEYFP-Nl、pEGFP-Nl或pEGFP-Cl質(zhì)粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物穿梭載體是 PEYFP-Nl。在一些實(shí)施方案中，病毒穿梭載體選自pAAV-MCS (腺伴隨病毒血清型2或AAV2 基因組)或pBac-1、pBacPAK8/9(苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)桿狀病毒基因 組)質(zhì)粒。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，病毒穿梭載體是PAAV-MCS。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案 中，病毒穿梭載體是PBac-I質(zhì)粒。為確保表達(dá)盒有效遞送至特定細(xì)胞、組織或器官中，可將其摻入到促進(jìn)細(xì)胞靶向 的非病毒遞送系統(tǒng)中。例如，可以將包括TR盒的哺乳動(dòng)物穿梭質(zhì)粒封裝在脂質(zhì)體中。脂質(zhì) 體包括乳液、泡沫、微團(tuán)、不溶性單層、液晶、磷脂分散體、片層(lamellar layer)等等。利 用脂質(zhì)體載體向靶細(xì)胞遞送DNA序列如同制備此類脂質(zhì)體的方法一樣在本領(lǐng)域公知。
可用于實(shí)施本技術(shù)的病毒包括重組修飾的被膜或非被膜DNA和RNA病毒，優(yōu)選 選自桿狀病毒科(baculoviridiae)、細(xì)小病毒科(parvoviridiae)、小核糖核酸病毒科 (picornoviridiae)、皰疫病毒禾斗(herpesviridiae)(例如 HSV)、痘病毒禾斗(poxviridiae) 和腺病毒科(adenoviridiae)病毒。在一些實(shí)施方案中，重組病毒是桿狀病毒科病毒。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，桿狀病毒是苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)衍生病毒。在其 他實(shí)施方案中，病毒是細(xì)小病毒科病毒，例如腺伴隨病毒(“AAV”)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中， AAV是AAV血清型2。在另一實(shí)施方案中，AAV是AAV血清型1。此清單并非是排他的，并且 可包括例如逆轉(zhuǎn)錄病毒科(retroviridae)，如慢病毒。選擇的病毒可為無毒性的，或者可作 為制備其病毒載體的一部分使之無毒性。病毒基因組優(yōu)選通過重組DNA技術(shù)修飾以包括TR表達(dá)盒，并且可以改造成復(fù)制缺 陷型、條件復(fù)制型或具有復(fù)制能力的。例如，利用條件復(fù)制型病毒將病毒復(fù)制限于特定、調(diào) 節(jié)的細(xì)胞培養(yǎng)條件可以證明是有用的。本文包括利用具有不止一個(gè)“親本”病毒特性的有利元件的嵌合病毒載體。還可 以在本發(fā)明中產(chǎn)生并使用最小載體系統(tǒng)，其中病毒骨架僅含有包裝病毒載體所需的序列， 且任選地包括表達(dá)盒。一般優(yōu)選采用來自待處理物種的病毒，例如當(dāng)用皰疹病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)人細(xì) 胞或人細(xì)胞系時(shí)，則采用人皰疹病毒。在一些情況下，可使用來源于不同于用其轉(zhuǎn)導(dǎo)的物種 的物種的病毒。例如，源自非人來源血清型的腺伴隨病毒(AAV)可以用于對(duì)人進(jìn)行處理，因 為該非人血清型不會(huì)立即被天然或既有的人抗體識(shí)別。通過最小化對(duì)載體的免疫反應(yīng)，避 免了載體的快速系統(tǒng)清除，且增加了體內(nèi)載體效力的持續(xù)時(shí)間。哺乳動(dòng)物細(xì)胞本技術(shù)含TR盒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可用來篩選影響代謝或細(xì)胞停滯以及誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng) 激或死亡的分子(例如化學(xué)品、藥物、肽和核酸)或環(huán)境條件(例如培養(yǎng)條件或操作)。這 些細(xì)胞還使我們能夠研究藥物吸收、代謝和安全性，鑒定影響藥物代謝的因素、以及評(píng)價(jià)和 驗(yàn)證藥理功效。上文所述任何哺乳動(dòng)物穿梭載體中的單順反子或雙順反子TR表達(dá)盒可轉(zhuǎn) 化到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。穿梭載體可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的任何技術(shù)引入到宿主細(xì)胞中。這些包括但不限于化學(xué)轉(zhuǎn)染(例如，氯化鈣法、磷酸鈣法)、脂轉(zhuǎn)染、電穿孔、細(xì)胞融合、 顯微注射和病毒感染(Ridgway，A. "Mammalian ExpressionVectors” 24 章，470-472 頁(yè)， Rodriguez 禾口 Denhardt 編輯，Butterworhs, Boston MA 1988)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可為分離自動(dòng)物的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(即原代細(xì)胞)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞 系。從動(dòng)物分離細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域公知。在一些實(shí)施方案中，原代細(xì)胞分離自小鼠。在其 他實(shí)施方案中，原代細(xì)胞分離自人。又在其他實(shí)施方案中，可利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。例示性 的細(xì)胞系包括HEK293 (人胚腎)、HT1080 (人纖維肉瘤)、NTera2D (人胚性畸胎瘤),HeLa (人 宮頸腺癌)、Caco2 (人結(jié)腸腺癌)、H印G2 (人肝臟肝細(xì)胞癌)、Cos-7 (猴腎)、ES-D3 (小鼠 胚胎干細(xì)胞)、BALBC/3T3(小鼠成纖維細(xì)胞)和hES Hl (人胚胎干細(xì)胞)。宿主細(xì)胞系一 般可由例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、任何批準(zhǔn)的布達(dá)佩斯條約地點(diǎn)或其他生物保 藏機(jī)構(gòu)獲得。又在其他實(shí)施方案中，可利用哺乳動(dòng)物胚胎干(ES)細(xì)胞，例如小鼠ES細(xì)胞mES_D3 或人ES細(xì)胞hES HI。 細(xì)胞詵擇前述方法需要制備哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物。測(cè)定中使用的細(xì)胞可以是特制表達(dá)TR 盒的重組細(xì)胞。一旦用本文所述的TR表達(dá)盒轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞系，則期望選擇第一 和/或第二 ORF高表達(dá)的細(xì)胞。進(jìn)行這些的若干方法在本領(lǐng)域已知，并在下文簡(jiǎn)要說明。利用存在于哺乳動(dòng)物穿梭載體中稱為的“顯性選擇標(biāo)記”的藥物抗性基因進(jìn)行這 樣的選擇。選擇標(biāo)記允許分離已經(jīng)將外源表達(dá)載體穩(wěn)定整合至其基因組DNA中的細(xì)胞，從 而功能性地?fù)饺肓送庠碊NA的細(xì)胞對(duì)相應(yīng)的藥物形成組成型抗性。這之后最典型的是細(xì)胞 在限制培養(yǎng)基中選擇性生長(zhǎng)，和確立持續(xù)供應(yīng)重組表達(dá)細(xì)胞。選擇標(biāo)記的實(shí)例包括新霉素 磷酸轉(zhuǎn)移酶(“NeoR或G418R”)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(“HygR”)和嘌呤霉素N-乙酰基轉(zhuǎn)移 酶("PurR")ο本領(lǐng)域一般采用兩種方法確立、表征和儲(chǔ)存表達(dá)細(xì)胞。第一種包括確立、收集和儲(chǔ) 存所有的轉(zhuǎn)化和藥物抗性細(xì)胞群，其中每個(gè)細(xì)胞都包含至少一個(gè)賦予藥物抗性的轉(zhuǎn)基因整 合事件，稱為“細(xì)胞庫(kù)”。第二種包括分離由單個(gè)藥物抗性細(xì)胞獲得的個(gè)體細(xì)胞集落/克隆， 篩選期望的性狀，和儲(chǔ)存稱為“細(xì)胞系”的細(xì)胞原液。與第一種方法提供具有分布廣泛的基因表達(dá)水平的混合抗性細(xì)胞群形成對(duì)照，第 二種方法需要從許多的分離細(xì)胞集落中選擇獨(dú)特的克隆，以鑒定以期望水平表達(dá)期望基因 產(chǎn)物的集落的選擇組。一旦鑒定了這些細(xì)胞，就對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，在細(xì)胞培養(yǎng)物中維持或冷凍 以備將來使用。胚胎干細(xì)胞干細(xì)胞尤其可應(yīng)用于本發(fā)明的方法。多能、成人、胚泡來源的、生殖巢、畸胎瘤來源 的、全能、多能、胚胎(ES)、胚胎生殖(EG)和胚胎癌(EC)細(xì)胞都是可用于這些方法的干細(xì)胞 的實(shí)例。多能干細(xì)胞可由任何動(dòng)物如任何哺乳動(dòng)物的胎兒材料產(chǎn)生。然而，在一個(gè)實(shí) 施方案中，哺乳動(dòng)物是嚙齒類動(dòng)物，例如小鼠、豚鼠或大鼠。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，小鼠 ES細(xì)胞是mES-D3。胎兒材料可來自牲畜，例如牛、馬、豬、綿羊、山羊等。胎兒材料還可 來自靈長(zhǎng)類動(dòng)物包括人。多能干細(xì)胞系已經(jīng)在例如但不限于雞(Pain，B.等人，(1996)Development (Cambridge, U. K.) 122, 2339-2348),貂(Sukoyan, M. A.等人，(1993)Mol. R印rod. Dev. 36，148-158)、倉(cāng)鼠(Doetschman，T.等人，(1988) Dev. Biol. 127，224-227)、 豬(Wheeler, M. B. (1994) Reprod. Fertil. Dev. 6, 563-568 ；Shim, H.等人，(1997)Biol. R印rod. 57，1089-1095)、恒河猴(Thomson，J. A.等人，(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,7844-7848)和絹毛狨(commonmarmoset) (Thomson, J. A.等人，(1996) Biol. Reprod. 55, 254-259)中報(bào)道。干細(xì)胞系的獲得描述在上一段引述的參考文獻(xiàn)中。干細(xì)胞呈現(xiàn)出許多獨(dú)特的特性和特性范疇。例如，一些形式的干細(xì)胞系能夠以未 分化的狀態(tài)延長(zhǎng)離體增殖(> 1年)。干細(xì)胞在增殖和/或分化的同時(shí)還能夠維持正常的 核型。干細(xì)胞還能夠呈現(xiàn)出形成生物體中每一種細(xì)胞類型的能力(即全能性狀)。其他干 細(xì)胞保留分化成中胚層、內(nèi)胚層和外胚層組織，包括生殖細(xì)胞、卵和精子的能力。一些干細(xì) 胞能夠在某些生長(zhǎng)條件下，例如不維持未分化狀態(tài)的培養(yǎng)條件下形成胚狀體(EB)。此外，干 細(xì)胞常常能夠通過與胚泡融合形成嵌合體，這是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所必需的。除保持未分化狀態(tài)之外，ES細(xì)胞可通過改變生長(zhǎng)條件來操作，以誘導(dǎo)分化為特定 的細(xì)胞類型(稱為"定向分化")。例如，多能干細(xì)胞可通過諸如藥物、前藥、肽和核酸等分 子而定向?yàn)樘囟ǖ淖V系，這些分子1)激活調(diào)控分化的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄程序；2)誘導(dǎo)遍在表達(dá)分化 特異性轉(zhuǎn)錄因子的外源核酸；3)提供培養(yǎng)基中含有誘導(dǎo)分化的生長(zhǎng)因子/調(diào)控分子的細(xì)胞 培養(yǎng)物；或4)允許共培養(yǎng)干細(xì)胞和能夠進(jìn)行譜系誘導(dǎo)的細(xì)胞類型。許多外胚層衍生物(ED) 定向分化方法在下文說明，并且可用于本發(fā)明的方法。在多個(gè)實(shí)施方案中，本技術(shù)提供了用于鑒定毒性劑的基于細(xì)胞的系統(tǒng)。更具體地， 用TR盒轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞可通過定向分化編程，以分化為特定的細(xì)胞譜系，以提供毒性 劑的離體細(xì)胞特異性篩選。在一個(gè)實(shí)施方案中，TR調(diào)控的0RF是報(bào)告基因，更具體地是螢 火蟲熒光素酶基因。在另一實(shí)施方案中，TR調(diào)控的0RF是EYFP蛋白?？衫眠z傳操作來改變干細(xì)胞的特性。修飾的干細(xì)胞是具有不同于細(xì)胞原始基因 型的遺傳背景的干細(xì)胞。例如，修飾的干細(xì)胞可為表達(dá)來自染色體外或整合DNA序列的蛋 白質(zhì)序列的干細(xì)胞?？衫蔑@性選擇標(biāo)記的選擇來修飾干細(xì)胞特性。例如，編碼抗生素抗性 基因的載體的轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)可用來選擇能夠在抗生素應(yīng)用中存活的細(xì)胞群。表達(dá)標(biāo)記基因的 細(xì)胞還可整合順式連接的轉(zhuǎn)基因如TR盒，從而這些轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定地?fù)饺牖蚪M中。本領(lǐng)域存 在多種方法制備遺傳修飾干細(xì)胞的細(xì)胞系。本技術(shù)的一種應(yīng)用是采用能夠表達(dá)TR盒的遺 傳修飾的干細(xì)胞系進(jìn)行基于細(xì)胞的細(xì)胞毒性測(cè)定的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，TR盒自CMV 啟動(dòng)子編碼報(bào)告基因如螢火蟲熒光素酶，提供了對(duì)細(xì)胞死亡進(jìn)行組成型成像的方法。在另 一實(shí)施方案中，TR盒自EGR-1啟動(dòng)子編碼報(bào)告基因如螢火蟲熒光素酶，提供了在早期應(yīng)激 反應(yīng)期間對(duì)細(xì)胞死亡進(jìn)行成像的方法。預(yù)期技術(shù)人員能夠基于特定需求或測(cè)量和/或誘導(dǎo) 細(xì)胞死亡的方法，來設(shè)計(jì)在轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞死亡成像的類似方法。作為舉例，本領(lǐng)域 描述了用于產(chǎn)生干細(xì)胞離體定向分化的許多方法。其中一些在隨后的章節(jié)中概述。外胚層 衍生細(xì)胞的形成在自發(fā)分化的干細(xì)胞中常見，并且一般認(rèn)為是默認(rèn)的發(fā)育通路?？蛇x擇性 地促進(jìn)神經(jīng)外胚層細(xì)胞命運(yùn)，以生成神經(jīng)先祖和分化的神經(jīng)細(xì)胞類型(例如，神經(jīng)元、星形 膠質(zhì)和少突膠質(zhì))(Carpenter M K等人2001)。少突膠質(zhì)細(xì)胞可利用FGF (例如FGF2)和表 皮生長(zhǎng)因子(EGF)、接著補(bǔ)充視黃酸(RA)而由干細(xì)胞系產(chǎn)生。這些少突膠質(zhì)細(xì)胞前體能夠 成熟，并使神經(jīng)元重新髓鞘化(Nistor G I等人2005)?？蛇x的多步驟方法能夠通過在RA
32和FGF-2中、然后是RA和sonic hedgehog (SHH)中、而最后是腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神 經(jīng)膠質(zhì)衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1 (IGF1)和低水平SHH中培養(yǎng)干細(xì)胞 而產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)元(Park S等人2004 ；Perrier A L等人2004)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。相反，用Noggin拮抗劑骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)處理干細(xì)胞培養(yǎng)物生成具有扁平上 皮形態(tài)和外胚胎內(nèi)胚層特征性基因表達(dá)譜的干細(xì)胞，一種常與發(fā)育中胚胎的卵黃囊和胎盤 相關(guān)的細(xì)胞類型。因而，在具有BMP4的無血清培養(yǎng)基中延長(zhǎng)培養(yǎng)干細(xì)胞將產(chǎn)生表達(dá)與滋養(yǎng) 層或胎盤發(fā)育相關(guān)的基因(例如，MSX2)和蛋白質(zhì)(例如人絨毛膜促性腺激素)的扁平上 皮細(xì)胞。與此類似，共培養(yǎng)干細(xì)胞與表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞衍生的誘導(dǎo)活性(SDIA)的小鼠骨髓間 充質(zhì)PA6細(xì)胞系，將產(chǎn)生酪氨酸水解酶陽(yáng)性(TH+)并表達(dá)nurrl和LMXlb基因的混合中腦神 經(jīng)元(Kawasaki H等人2002 ;Mizuseki K等人2003)，以及色素視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞。用BMP4 進(jìn)一步操縱培養(yǎng)條件誘導(dǎo)形成神經(jīng)嵴細(xì)胞和最背側(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞。抑制SHH促進(jìn)形成 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(Troimson A. 2004)。當(dāng)干細(xì)胞與小鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞系一起培養(yǎng)時(shí)，其還可定 向?yàn)橹心X多巴胺神經(jīng)元(例如MS5和S2細(xì)胞)，其中存在響應(yīng)FGF-8、SHH、抗壞血酸/維生 素C和BDNF(Perrier A L等人2004)的Pax2、Pax5和果蠅en_l轉(zhuǎn)錄因子的相繼表達(dá)。部分分化的神經(jīng)上皮衍生物對(duì)FGF-8和SHH的暴露促進(jìn)，產(chǎn)生具有前腦表型的多 巴胺能神經(jīng)元；然而，在神經(jīng)上皮特化期間早期接觸FGF-8，則促進(jìn)中腦表型和中腦多巴胺 能神經(jīng)元的分化通路。因此，給藥FGF-8和SHH的次序能夠決定神經(jīng)元命運(yùn)。共培養(yǎng)方法還已經(jīng)用來由干細(xì)胞產(chǎn)生分化的心肌細(xì)胞。15-20%的干細(xì)胞培養(yǎng)物 與小鼠內(nèi)臟內(nèi)胚層細(xì)胞類型END-2 —起培養(yǎng)，形成跳動(dòng)的心臟肌肉集落(例如心肌細(xì)胞) (Mummery C等人2002 ;Mummery C等人2003)。由干細(xì)胞獲得的跳動(dòng)的心臟肌肉細(xì)胞表達(dá) 心肌細(xì)胞標(biāo)記，包括a-肌球蛋白重鏈、心肌鈣蛋白和心房利尿鈉因子以及心肌細(xì)胞典型 的轉(zhuǎn)錄因子(例如GATA4和MEF3) (Kehat I等人2001 ；Xu C等人2002)。這些細(xì)胞響應(yīng)藥 理藥物，并呈現(xiàn)出在人胎兒左心室心肌細(xì)胞中最常觀察到的心肌細(xì)胞作用潛能，這可容易 地與小鼠心肌細(xì)胞區(qū)分開來(Mummery C等人2003 ;He J Q等人2003)。還可在分化的干 細(xì)胞培養(yǎng)物中形成心房和起搏點(diǎn)樣細(xì)胞。這些干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞與移植的嚙齒類動(dòng)物 和豬科動(dòng)物(porcine)心臟肌肉正常地成為一體，在干細(xì)胞肌細(xì)胞和受體小鼠成年心肌細(xì) 胞之間形成正常的間隙連接(gap junction connections) (Xue T等人2005 ;Kehat I等人 2004 ；Hassink R J 等人 2003)。通過共培養(yǎng)干細(xì)胞與小鼠胚胎前腸間充質(zhì)，可生成表達(dá)呼吸道特異性標(biāo)記表面活 性蛋白C(SPC)的II型肺細(xì)胞(Denham M等人2002)。當(dāng)干細(xì)胞作為胚狀體分化或在I型 膠原上培養(yǎng)時(shí)，還可誘導(dǎo)形成氣道(airway)上皮組織，然后所得的Clara細(xì)胞在氣-流體 界面上生長(zhǎng)，形成假?gòu)?fù)層的表面上皮(Coraux C等人2005)。角質(zhì)形成細(xì)胞可由干細(xì)胞通過胚狀體重新鋪板而獲得(Green H等人2003)。在二 代培養(yǎng)物周圍表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子P63的細(xì)胞識(shí)別角質(zhì)形成細(xì)胞先祖，其產(chǎn)生檢測(cè)到細(xì)胞角蛋白 14和堿性核蛋白的更成熟細(xì)胞類型。這些細(xì)胞能夠形成終端分化的分層上皮，但與從新生 兒或成人皮膚中分離的角質(zhì)形成細(xì)胞上皮不同。胚狀體(EB)還可利用造血細(xì)胞因子和BMP-4混合物用來產(chǎn)生造血先祖(Kaufman D S，2001，Chadwick K等人2003)。EB通過從ES細(xì)胞培養(yǎng)物中撤去白血病抑制因子(LIF)而形成，并呈現(xiàn)為細(xì)胞簇或球形多細(xì)胞聚集物。這些先祖與背主動(dòng)脈的造血先祖在免疫學(xué) 上類似。生長(zhǎng)因子如干細(xì)胞因子(SCF)、白介素-3和-6(IL-3、IL-6)、粒細(xì)胞集落刺激因子 (GCSF)、Flt-3配體、以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A(VEGF-A) (Cerdan C等人2004)。在接觸激活蛋白A之后可在干細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測(cè)到內(nèi)皮細(xì)胞(Kubo A等人2004)。 胰島素生產(chǎn)細(xì)胞可利用Lumelsky等人的方法通過分化神經(jīng)外胚層細(xì)胞而形成(Lumelsky N等人2001)。與此類似，Segev等人(Segev H等人2004)通過在含有胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、 硒和纖連蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚狀體產(chǎn)生了胰島樣簇。使解聚的簇在含F(xiàn)GF-2的培養(yǎng)基中 形成簇，然后在懸浮培養(yǎng)物中接觸具有低糖的煙酰胺。高百分比的細(xì)胞簇表達(dá)胰島素、胰高 血糖素和生長(zhǎng)抑素，類似于不成熟的胰腺細(xì)胞。對(duì)葡萄糖和其他拮抗劑的反應(yīng)性表明這些 細(xì)胞是不成熟的胎兒樣胰腺胰島細(xì)胞。Rambhatla等人(2003)報(bào)道了干細(xì)胞分化成表達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)記(白蛋白、a -1-抗 胰蛋白酶、細(xì)胞角蛋白8和18)并積累糖原的細(xì)胞。用丁酸鈉處理胚狀體或用二甲基亞 砜、接著是丁酸鈉處理貼壁干細(xì)胞培養(yǎng)物得到肝樣內(nèi)胚層細(xì)胞(Lavon N等人2004)。分化 的貼壁干細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞形態(tài)可用來選擇表達(dá)胎肝標(biāo)記的內(nèi)胚層群(Stamp L A等人 2003)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本技術(shù)還涉及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其含有穩(wěn)定整合至其基因組中的TR表達(dá)盒。在一些實(shí) 施方案中，包含TR盒的靶向核酸構(gòu)建體引入到多能細(xì)胞(例如ES細(xì)胞，Robertson，E. J.， In Current Communications in MolecularBiology,Capecchi,M. R.(編輯)，Cold Spring Harbor Press, Cold SpringHarbor, N. Y. (1989)，39-44 頁(yè))中。適宜的 ES 細(xì)胞可由任何物 種或特定物種的任何品系獲得或分離。在一些實(shí)施方案中，物種是小鼠，如129或C57BL/6 品系。在其他實(shí)施方案中，物種是大鼠。雖然不是必需的，多能細(xì)胞一般源自與目的受體相 同的物種。ES細(xì)胞也可以獲自商業(yè)來源(例如GenomeSystems，Inc)、國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)(例 如 ATCC)、高校研究室(例如，the SitemanCancer Center Murine Embryonic Stem Cell Core, Washington University, St. Louis, M0)，或者可以如 Robertson (同上)所述獲得。 集落來源ES細(xì)胞系的實(shí)例包括129/SVJ、RW-4和C57BL/6ES細(xì)胞(Genome Systems, Inc.) 或 SCC 10、B6/Blu、EDJ22、R1 和 B6/GFP ES 細(xì)胞(Washington University)。ES細(xì)胞在適宜的條件下，例如，如 Ausubel 等人，CURRENIPR0T0C0LS IN MOLECULAR BIOLOGY所述培養(yǎng)。優(yōu)選地，如E. J. Robertson,同上，71-112頁(yè)所述，在非有絲分裂的基質(zhì) 細(xì)胞(例如ST0細(xì)胞(尤其是SNC4ST0細(xì)胞)和/或原代胚胎成纖維細(xì)胞)“飼養(yǎng)層”上 培養(yǎng)ES細(xì)胞。培養(yǎng)基優(yōu)選包括白細(xì)胞抑制因子(〃 lif" ) (Gough, N. M.等人，R印rod. Fertil. Dev. 1 :281-288 (1989) ；Yamamori, Y.等人，Science 246 :1412_1416 (1989))，其防 止ES細(xì)胞離體分化。轉(zhuǎn)化了或組成型地表達(dá)lif生長(zhǎng)因子的基質(zhì)細(xì)胞也可用作為飼養(yǎng)細(xì) 胞。靶向構(gòu)建體通過任何允許引入的分子在其同源區(qū)域進(jìn)行重組的方法，或通過隨 機(jī)整合例如但不限于顯微注射、磷酸鈣轉(zhuǎn)化、脂轉(zhuǎn)染、病毒載體或電穿孔，而引入到ES細(xì) 胞中(Toneguzzo, F.等人，Nucleic Acids Res. 16 :5515_5532(1988) ；Quillet, A.等 人，J. Immunol. 141 17-20 (1988) ；Machy, P 等人，Proc. Natl. Acad, Sci. (U. S. A. )85 8027-8031 (1988))。在一些實(shí)施方案中，利用顯微注射將構(gòu)建體插入到ES細(xì)胞中，其中核酸構(gòu)建體在引入ES細(xì)胞之前通過例如用限制性核酸酶消化進(jìn)行線性化。一方面，本技術(shù)提供了利用根據(jù)本發(fā)明的缺啟動(dòng)子DNA盒、使之定點(diǎn)重組到目的 靶基因的編碼序列中而在宿主細(xì)胞中表達(dá)TR盒的方法。相關(guān)方面提供了通過在將構(gòu)建體 引入到宿主基因組之前改造功能性表達(dá)構(gòu)建體而在宿主細(xì)胞中表達(dá)TR盒的方法。一種這 樣的“基因組轉(zhuǎn)基因”通過將TR盒插入到大基因組序列(即，包含目的靶基因0RF的粘粒 或人工真核染色體)中進(jìn)行離體改造，所述大基因組序列代替靶基因0RF，并驅(qū)動(dòng)TR盒由靶 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件表達(dá)。大基因組轉(zhuǎn)基因隨之利用靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)提供在隨機(jī)整合 到宿主細(xì)胞之后期望的TR盒表達(dá)模式。其中已經(jīng)整合了靶向構(gòu)建體的那些細(xì)胞的篩選和選擇可應(yīng)用構(gòu)建體中的陽(yáng)性選 擇標(biāo)記和/或陰性選擇標(biāo)記來實(shí)現(xiàn)。在多個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)建體中陽(yáng)性和陰性選擇標(biāo)記均 含有。一方面，應(yīng)用依賴于選擇標(biāo)記表達(dá)的方法，例如，通過添加適當(dāng)?shù)牡孜飦韮H選擇表達(dá) 陽(yáng)性選擇標(biāo)記產(chǎn)物的那些細(xì)胞，或消除表達(dá)陰性選擇標(biāo)記的那些細(xì)胞。例如，在陽(yáng)性選擇 標(biāo)記編碼新霉素抗性的情況下，向轉(zhuǎn)化的ES細(xì)胞培養(yǎng)基中以漸增的劑量添加G418。與此 類似，在應(yīng)用陰性選擇標(biāo)記的情況下，向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加適宜的底物(例如更昔洛韋，如 果陰性選擇標(biāo)記編碼HSV-TK的話)。在利用適當(dāng)?shù)牡孜镞x擇之前或之后，受體細(xì)胞中陽(yáng) 性和/或陰性選擇標(biāo)記的存在還可通過其他方法確定，例如雜交、檢測(cè)放射性標(biāo)記的核苷、 PCR等等。在多個(gè)實(shí)施方案中，首先通過添加陽(yáng)性和/或陰性選擇標(biāo)記的適當(dāng)?shù)孜飦磉x擇 具有整合的靶向構(gòu)建體的細(xì)胞。選擇過程中存活下來的細(xì)胞隨之通過其他方法，如PCR或 Southern印跡，對(duì)整合序列的存在進(jìn)行篩選。鑒定了在正確的位置含有構(gòu)建體的適宜ES細(xì)胞之后，可將細(xì)胞插入到胚胎、優(yōu)選 胚泡中。胚泡通過灌注妊娠雌性的子宮獲得。實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)的適宜方法技術(shù)人員已知，并由 例如Bradley等人，(1992)Biotechnology, 10 :534_539闡述。作為舉例，與雄性交配的自 然周期或超排卵的雌性小鼠可用來收獲胚胎進(jìn)行ES細(xì)胞植入。在成功交配后大約3. 5天 回收適齡的胚胎。交配的雌性通過C02窒息或斷頸處死，自切除的子宮角沖洗胚胎，并置于 Dulbecco改良基本培養(yǎng)基+10%牛血清中，以進(jìn)行ES細(xì)胞注射。用內(nèi)徑大約20 y m的玻璃 顯微針將大約10至20個(gè)ES細(xì)胞注射到胚泡中?？梢酝ㄟ^技術(shù)人員已知的多種方法實(shí)現(xiàn) 向胚胎中的插入；然而，優(yōu)選的方法是通過顯微注射。對(duì)于顯微注射，將約10-30個(gè)ES細(xì)胞 收集到微吸管中，并注射到胚胎中，所述胚胎處于適當(dāng)?shù)陌l(fā)育階段以允許含構(gòu)建體的外來 ES細(xì)胞整合到發(fā)育胚胎中。在一個(gè)實(shí)施方案中，從例如小鼠FVB/N品系中獲得胚泡，而從例 如小鼠C57BL/6品系中獲得ES細(xì)胞。就受體雌性小鼠而言，將隨機(jī)周期的成年雌性與切除 輸精管的雄性配對(duì)。小鼠品系如SwissWebster、ICR或其他可用于此目的。在一個(gè)實(shí)施方 案中，受體雌性進(jìn)行交配，從當(dāng)需要植入含ES細(xì)胞的胚泡時(shí)，它們處于交配后的2. 5至3. 5 天。在胚胎轉(zhuǎn)移時(shí)，麻醉受體雌性，每克體重腹膜內(nèi)注射0.015ml 2. 5%阿佛丁。通過直接 在輸卵管上方的體壁中切口露出卵巢，并使卵巢和子宮露出體表。用25號(hào)針在子宮角上穿 孔，通過此處轉(zhuǎn)移胚泡。轉(zhuǎn)移后，將卵巢和子宮推回體內(nèi)，以兩針縫合切口。如果要進(jìn)行其 他轉(zhuǎn)移，在相對(duì)側(cè)重復(fù)此操作。雖然任何處于正確發(fā)育階段的胚胎均適合使用，但優(yōu)選使用胚泡。另外，優(yōu)選的 胚泡是雄性的，而且優(yōu)選具有編碼與ES細(xì)胞基因所編碼的不同毛色的基因。以這種方式， 通過查看嵌合毛色(說明ES細(xì)胞摻入發(fā)育胚胎中)可容易地對(duì)后代中敲除構(gòu)建體的存在進(jìn)行篩選。因而，例如，如果ES細(xì)胞系攜帶黑色皮毛的基因，則選擇的胚泡將攜帶白色或棕 色皮毛的基因。也可以利用Southern印跡和/或PCR來確定目的序列的存在。鑲嵌(嵌 合)后代隨之彼此交配以生成純合動(dòng)物。純合體和雜合體可以通過對(duì)等量的來自為此雜交 產(chǎn)物的小鼠以及為已知雜合體的小鼠和野生型小鼠的基因組DNA進(jìn)行Southern印跡來鑒 定。可選地，可利用Northern印跡來探測(cè)mRNA以鑒定編碼TR盒的轉(zhuǎn)錄物、0RF核酸序列 或兩者的存在或不存在。另外，可利用Western印跡來評(píng)估0RF編碼多肽的表達(dá)水平，如果 針對(duì)此類多肽的適宜抗體存在的話。作為舉例而非限制，如果多肽是GFP，可利用抗GFP的 抗體。最后，可利用適宜抗體對(duì)來自后代的多種細(xì)胞進(jìn)行原位分析(例如固定細(xì)胞并用抗 體標(biāo)記)和/或FACS (熒光激活細(xì)胞分選)分析，以查看靶向構(gòu)建體的存在或不存在。在另一實(shí)施方案中，可制備僅在特定器官、組織、細(xì)胞或細(xì)胞條件下表達(dá)TR盒和 0RF核酸序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。制備此類動(dòng)物的方案與上文所述相同，除了靶向構(gòu)建體包含僅 在期望細(xì)胞、組織或器官以及細(xì)胞條件如重金屬應(yīng)用下表達(dá)的啟動(dòng)子，從而使TR盒和0RF 編碼多肽的表達(dá)限于之。例如，如果期望靶向序列在肝和小腸中表達(dá)，則可應(yīng)用脂肪酸結(jié)合 蛋白(FABP)啟動(dòng)子。在另一實(shí)例中，運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR) (Ye等人，Mol Cell Biol. , 1999 年12月，19 (12)，8570-80)啟動(dòng)子也是為實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的肝特異性表達(dá)而予以充分說明和廣 泛應(yīng)用的啟動(dòng)子。實(shí)現(xiàn)基因的組織特異性表達(dá)的其他啟動(dòng)子在本領(lǐng)域公知，且可容易獲得。檢測(cè)報(bào)告蛋白或報(bào)告核酸的方法本技術(shù)包括檢測(cè)在用其中第一 0RF序列為報(bào)告基因的TR表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表 達(dá)的報(bào)告蛋白的方法。簡(jiǎn)言之，該方法包括使表達(dá)此類TR盒的細(xì)胞接觸適合于報(bào)告多肽翻 譯的條件，和檢測(cè)報(bào)告多肽的存在?？蓱?yīng)用任何細(xì)胞，如原代細(xì)胞、細(xì)胞系、已在受試者內(nèi)轉(zhuǎn) 導(dǎo)的細(xì)胞，或者植入受試者內(nèi)的供體細(xì)胞。本領(lǐng)域已知多種離體蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。例如，多肽可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知特異于該 多肽的方法來檢測(cè)。這些檢測(cè)方法可以包括應(yīng)用特異性抗體、形成酶產(chǎn)物或酶底物的消失。 因而，報(bào)告蛋白的檢測(cè)可應(yīng)用本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)現(xiàn)，例如熒光顯微鏡檢、免疫組 織化學(xué)或ELISA實(shí)驗(yàn)。例如，熒光顯微鏡檢可用來檢測(cè)EYFP和mRFPl。與此類似，針對(duì)螢火 蟲熒光素酶或3“半乳糖甘酶的抗體可用來在免疫熒光染色之后對(duì)其存在進(jìn)行檢測(cè)。本領(lǐng)域有許多非侵入性的方法體內(nèi)檢測(cè)蛋白質(zhì)合成。作為舉例，置于TR元件下 游的1型單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVl-TK)ORF可用來通過代謝物示蹤物對(duì)體內(nèi)細(xì)胞死亡 進(jìn)行檢測(cè)。與哺乳動(dòng)物胸苷激酶不同，此酶能夠有效地磷酸化核苷類似物(例如，更昔洛 韋、噴昔洛韋)以及多種放射性衍生物如(9-(4-[18F]_氟-3-羥甲基丁基)鳥嘌呤；[18F] FHBG)，其隨之保留并累積在表達(dá)細(xì)胞內(nèi)。因而，如果細(xì)胞正經(jīng)歷應(yīng)激/死亡，則HSV1-TK會(huì) 由TR盒翻譯，導(dǎo)致放射性示蹤物的累積。放射性可應(yīng)用正電子成像術(shù)(PET)來檢測(cè)，其允 許監(jiān)測(cè)報(bào)告基因表達(dá)的詳細(xì)定位、量級(jí)和持續(xù)。還提供了呈現(xiàn)出增強(qiáng)的酶活和/或結(jié)合常 數(shù)的突變HSV1-TK酶(例如TKsr39)的方法，其通過增強(qiáng)放射性示蹤物的細(xì)胞累積而提高 PET成像的靈敏度。在具體實(shí)施方案中，說明了表達(dá)TR調(diào)控的發(fā)光蛋白例如螢火蟲熒光素酶的轉(zhuǎn)基 因細(xì)胞和動(dòng)物。如在具體實(shí)施例中所證明的那樣，TR調(diào)控的熒光素酶表達(dá)起著細(xì)胞應(yīng)激/ 死亡的生物發(fā)光報(bào)告者的作用。在此實(shí)施方案中，熒光素酶尤其可用作為活細(xì)胞和生物體 中生物發(fā)光低光度成像的報(bào)告者。雖然分辨率低于MRI或PET，生物發(fā)光成像一般伴有靈敏的電荷耦合器件(CCD)相機(jī)，允許進(jìn)行快速、高通量(同時(shí)由多個(gè)動(dòng)物進(jìn)行簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)收 集)、進(jìn)行性(對(duì)同一動(dòng)物進(jìn)行重復(fù)分析)、非侵入性、非破壞性的體內(nèi)數(shù)據(jù)收集。本領(lǐng)域有 多種檢測(cè)裝置、成像處理器和成像分析系統(tǒng)。本技術(shù)還提供了利用含有有效連接于應(yīng)激和反應(yīng)特異性啟動(dòng)子的TR盒的轉(zhuǎn)基因 細(xì)胞和動(dòng)物而將TR mRNA合成限于選擇性細(xì)胞應(yīng)激和反應(yīng)條件的方法。在該方法中，TR核 酸(mRNA)和TR調(diào)控的蛋白質(zhì)翻譯提供了對(duì)細(xì)胞應(yīng)激和死亡的獨(dú)立衡量。預(yù)期該方法將允 許檢測(cè)受細(xì)胞應(yīng)激調(diào)控的轉(zhuǎn)錄活性，其并不導(dǎo)致TR盒所檢測(cè)的應(yīng)激/死亡特異性翻譯變 化。本領(lǐng)域有多種方法分離、純化和定量TR mRNA水平，例如定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)、 實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR)、反轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)、原位雜交、或者液相或固相支持物中核酸雜交。檢測(cè)細(xì)胞應(yīng)激和凋亡的方法在一個(gè)實(shí)施方案中，如上文所述的檢測(cè)報(bào)告蛋白的方法尤其可用于檢測(cè)細(xì)胞應(yīng)激 和死亡。細(xì)胞應(yīng)激和死亡檢測(cè)可離體或體內(nèi)進(jìn)行。因而，本方法可用來研究正常生物過程， 細(xì)胞對(duì)損傷或藥物治療、接觸據(jù)認(rèn)為誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的化合物或條件的反應(yīng)，等等。例如，作 為研究生物過程的一部分，技術(shù)人員可能希望確定凋亡是否、及以何種程度在例如細(xì)胞分 化方面起作用。其還可以用于確定細(xì)胞在身體損傷如脊髓創(chuàng)傷之后或在接觸癌癥治療藥物 之后的凋亡可能性。另外，凋亡檢測(cè)可用于評(píng)價(jià)例如新藥的細(xì)胞毒性。在檢測(cè)離體進(jìn)行的實(shí)施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可應(yīng)用原代細(xì)胞、細(xì)胞系或從動(dòng) 物分離的細(xì)胞，如上面的章節(jié)所討論的那樣。簡(jiǎn)言之，待評(píng)價(jià)應(yīng)激或死亡的細(xì)胞最初用TR 表達(dá)盒轉(zhuǎn)化，其中第一 0RF序列是報(bào)告基因，例如EYFP。轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法在上文討論。細(xì)胞 在毒性條件下培養(yǎng)適量的時(shí)間，之后應(yīng)用任何上述方法檢測(cè)報(bào)告蛋白表達(dá)。作為舉例，熒光 顯微鏡檢可用來評(píng)價(jià)翻譯TR-EYFP盒和呈現(xiàn)毒性表型的細(xì)胞數(shù)目。另外，針對(duì)報(bào)告蛋白如 EYFP的抗體可用來通過Western印跡分析確定報(bào)告蛋白表達(dá)的水平。對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用，可通過任何目前使用的轉(zhuǎn)化方法如脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射等， 將TR盒插入到ES細(xì)胞系和按照所述產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中。對(duì)于TR盒的組織特異性表達(dá)， 可應(yīng)用組織特異性啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，應(yīng)激特異性啟動(dòng)子可以有效連接于TR盒， 以進(jìn)一步將TR表達(dá)限于應(yīng)激細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，應(yīng)用哺乳動(dòng)物穿梭載體將TR 盒遞送至ES細(xì)胞中。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將與推定的毒性藥物或條件接觸適量的時(shí)間，之后可利用 上述方法檢測(cè)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。此外，利用尸檢動(dòng)物組織切片來測(cè)定基因表達(dá)和蛋白 質(zhì)合成的多種標(biāo)準(zhǔn)方法在本領(lǐng)域公知。一個(gè)實(shí)例是應(yīng)用針對(duì)報(bào)告蛋白如EYFP的抗體來評(píng) 價(jià)組織切片中應(yīng)激和垂死細(xì)胞中的細(xì)胞和組織特異蛋白質(zhì)合成以及蛋白質(zhì)表達(dá)水平。在其 他實(shí)施方案中，TR盒提供了對(duì)細(xì)胞應(yīng)激和死亡進(jìn)行非破壞性體內(nèi)成像的方法。作為舉例， 顯微PET掃描可用來評(píng)價(jià)翻譯TR-TKsr39盒的細(xì)胞的定位和數(shù)目。胚胎毒性和細(xì)胞毒性測(cè)定本技術(shù)提供了基于來自小鼠和大鼠的分化的轉(zhuǎn)基因多能胚胎干細(xì)胞(ESC)系、以 及由已經(jīng)用TR表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的嚙齒類動(dòng)物胚胎的原生殖細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)基因胚胎生殖細(xì)胞 (EGC)，來檢測(cè)化學(xué)誘導(dǎo)的胚胎毒性和畸胎發(fā)生(tetratogenic)效應(yīng)的體外檢驗(yàn)方法。以 前采用ESC細(xì)胞系檢測(cè)胚胎毒性和誘變化合物的體外嘗試稱為胚胎干細(xì)胞檢驗(yàn)或EST，為 本領(lǐng)域已知(Laschinski 等人，Reproductive Toxicol. 5，57—65 (1991) ；Spielmann 等人， Exvivo Toxicol. 10 :119-27(1997))。概括地說，測(cè)定體外ES分化的紊亂可與胚胎胚層異常相關(guān)。由于異常哺乳動(dòng)物發(fā)育還可引起增強(qiáng)的細(xì)胞死亡和由此產(chǎn)生的植入前胚胎死亡、 發(fā)育缺陷、發(fā)育異?；蚧?，早期檢驗(yàn)方法應(yīng)用MTT檢驗(yàn)測(cè)量細(xì)胞毒性效應(yīng)。在該實(shí)施方案 中，將改良EST方法以利用TR特異性翻譯來研究導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激/死亡的細(xì)胞毒性，這將作 為畸胎發(fā)生/胚胎毒性物質(zhì)殺胚胎(embryocidal)特性的衡量。在一些實(shí)施方案中，可檢驗(yàn)物質(zhì)對(duì)轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞的毒性。技術(shù)人員可容易地選擇 用于特定物質(zhì)的適當(dāng)ES細(xì)胞、以及選擇諸如物質(zhì)濃度、物質(zhì)與ES細(xì)胞孵育的持續(xù)時(shí)間、和 檢測(cè)方法等因素。一般而言，此類測(cè)定利用用TR盒轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因ES或EG細(xì)胞培養(yǎng)物離體 進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，使所檢驗(yàn)的物質(zhì)與ESC群接觸一段時(shí)間，并如上所述測(cè)定TR介導(dǎo)的翻譯活 性。例如，物質(zhì)可與若干不同的ES細(xì)胞培養(yǎng)物孵育若干不同的時(shí)間段(例如，12小時(shí)，24 小時(shí)，48小時(shí)，72小時(shí))，其中對(duì)每種培養(yǎng)物應(yīng)用4-20種不同濃度的物質(zhì)。然后可如上所述 利用報(bào)告蛋白檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法來確定基于TR的毒性測(cè)定?；钚詣┑亩拘詽摿杀磉_(dá)為若 干方式，例如表達(dá)為達(dá)到細(xì)胞死亡所需的時(shí)間，或者在給定時(shí)間點(diǎn)可檢測(cè)的TR調(diào)控報(bào)告蛋 白的量。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，應(yīng)用生物發(fā)光來檢測(cè)TR調(diào)控的報(bào)告蛋白。作為舉例而非限制，如果檢驗(yàn)的物質(zhì)對(duì)檢驗(yàn)的細(xì)胞有毒性，則細(xì)胞將快速經(jīng)歷應(yīng) 激和死亡，導(dǎo)致翻譯TR盒和TR調(diào)控的報(bào)告蛋白，如EYFP或螢火蟲熒光素酶。然后可應(yīng)用 例如熒光或生物發(fā)光檢測(cè)來確定報(bào)告蛋白的存在和/或量。在另一實(shí)施方案中，可對(duì)事先 已向其至少一些細(xì)胞中摻入了 TR盒的動(dòng)物給藥物質(zhì)。例如，在向小鼠適當(dāng)?shù)臋z驗(yàn)組織或組 織部位注射了編碼TR盒(其中第一 0RF序列是報(bào)告基因)的病毒之后，可使之接觸潛在的 毒性物質(zhì)。這將導(dǎo)致注射部位的病灶感染和易感細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。本技術(shù)提供了通過應(yīng)用已經(jīng) 討論的任何體內(nèi)或離體方法檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞中的報(bào)告蛋白來測(cè)量物質(zhì)對(duì)所述動(dòng)物的毒性的 方法。又在另一實(shí)施方案中，利用標(biāo)準(zhǔn)方法并如上所述，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或源自轉(zhuǎn)基因 動(dòng)物的動(dòng)物細(xì)胞來篩選化合物或物質(zhì)的細(xì)胞毒性。作為例子，在此類篩選測(cè)定中，在一段時(shí) 間內(nèi)并以多種劑量，向動(dòng)物給藥物質(zhì)或?qū)⑽镔|(zhì)引入到源自這些動(dòng)物的細(xì)胞的培養(yǎng)基中，之 后研究動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞中指示細(xì)胞毒性的報(bào)告蛋白表達(dá)。除了上文的細(xì)胞毒性測(cè)定之外，還可預(yù)見在毒性細(xì)胞刺激的存在下評(píng)價(jià)向毒性表 型的“時(shí)間”轉(zhuǎn)換的測(cè)定。在這樣的測(cè)定中，人們可對(duì)應(yīng)激誘導(dǎo)的自TR盒的由誘導(dǎo)型或應(yīng) 激調(diào)控啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的RNA合成與死亡誘導(dǎo)的TR依賴性蛋白質(zhì)合成進(jìn)行比較。轉(zhuǎn)換測(cè)定的 另一實(shí)例采用細(xì)胞類型特異性或器官特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，以允許應(yīng)用任何以前說明的檢 測(cè)方法來檢測(cè)細(xì)胞類型特異性或器官特異性毒素。鑒定其他TR元件的方法本技術(shù)還提供了通過用在含未知靶mRNA的細(xì)胞中誘導(dǎo)應(yīng)激或死亡的毒性劑刺激 該靶mRNA翻譯，來鑒定在細(xì)胞應(yīng)激/死亡期間選擇性翻譯的翻譯調(diào)控(TR)基因的方法。在 用毒性劑如MG132或鈣離子載體A23187處理之后，收獲細(xì)胞mRNA，純化，并分離為活躍翻 譯和非翻譯mRNA庫(kù)。雖然不束縛于特定的理論，相信編碼迅速響應(yīng)毒性環(huán)境所需蛋白質(zhì)的 mRNA在接觸毒性劑后快速翻譯，故而所編碼的蛋白質(zhì)迅速出現(xiàn)。本技術(shù)的方法通過制備含 多個(gè)核糖體("多核糖體")和無核糖體非翻譯mRNA的mRNA庫(kù)，而鑒定在細(xì)胞死亡期間活 躍翻譯的mRNA。在應(yīng)用任何生理、化學(xué)或病理應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞/組織死亡之后，可利用諸如 蔗糖密度梯度分級(jí)分離、高效凝膠過濾色譜或聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)分離(Ogishima等人，1984，Menaker 等人，1974，Hirama 等人，1986，Mechler，1987，和 Bharucha 和 Murthy，1992) 等方法，將仍然參與翻譯的mRNA (推定的借助于帽子非依賴性翻譯翻譯的TR基因)與非翻 譯的那些分離開來，因?yàn)檎诜g的mRNA含有結(jié)合的核糖體，因此其遷移有別于無核糖體 的非翻譯mRNA。可通過用特異性地抑制或調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或翻譯以及防止mRNA-核糖體解離的藥物處 理靶細(xì)胞/組織，來增強(qiáng)mRNA-核糖體分級(jí)分離。此類藥物的實(shí)例分別是放線菌素D和環(huán) 己酰胺?？蓪?duì)多核糖體級(jí)分進(jìn)行進(jìn)一步的改進(jìn)，以通過本領(lǐng)域已知的方法來區(qū)分總多核糖 體或膜結(jié)合的核糖體(Mechler，1987)。在多核糖體分離以及區(qū)分為翻譯和非翻譯庫(kù)之后，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知 的禾口 描述在例如 “Molecular Cloning ；A Laboratory Manual，，(ColdSprings Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989)中的技術(shù)分離 mRNA?？蓱?yīng)用其他從 細(xì)胞/組織中分離和提取RNA的方法，并且這將是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的(Mach等人， 1986，Jefferies等人，1994)。利用poly A選擇進(jìn)一步純化mRNA，以除去任何污染核糖體 RNA，這在本領(lǐng)域公知。見于各庫(kù)中的許多mRNA物質(zhì)的相對(duì)豐度可利用任何本領(lǐng)域常見的差異分析技術(shù) 來比較，包括基因表達(dá)連續(xù)分析法(“SAGE”)、差別展示、寡核苷酸陣列、代表性差別分析 (RDA)、cDNA微陣列和阻抑性削減雜交(SSH)。來自翻譯和非翻譯級(jí)分的標(biāo)記mRNA(cDNA或 PCR產(chǎn)物的形式)可用作為探針來鑒定固定在固相矩陣樣微陣列(GEM)或任何類型的膜上 的cDNA、基因組克隆或mRNA物質(zhì)，其中克隆可通過電泳、直接上樣或毛細(xì)管作用而附著在 膜上。標(biāo)記可為放射性或熒光的，或摻入修飾堿基如地高辛配基或生物素。作為對(duì)照，將翻 譯級(jí)分中的mRNA水平與總的未分級(jí)材料進(jìn)行比較，以區(qū)分因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)所產(chǎn)生的表達(dá)水平 差異和因翻譯調(diào)節(jié)本身所致的表達(dá)水平差異。特定mRNA與翻譯mRNA庫(kù)強(qiáng)相關(guān)能夠表明所 述基因在細(xì)胞應(yīng)激/死亡期間選擇性地表達(dá)。在差異表達(dá)分析之后，已經(jīng)鑒定為推定受帽子非依賴性翻譯調(diào)控的基因可由任何 可用的基因組或cDNA基因收集物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并插入到所述的TR盒中，替換既有的TR 序列而產(chǎn)生“研究性”TR盒。將設(shè)計(jì)PCR引物以摻入類似于插入到先前所述TR元件中的突 變的突變，以防止自任何帽子依賴性翻譯起始位點(diǎn)的翻譯。將對(duì)任何研究性TR元件進(jìn)行比 較分析，以確定這些克隆是否呈現(xiàn)出選擇性細(xì)胞應(yīng)激和/或死亡特異性翻譯。在多個(gè)實(shí)施方案中，為呈現(xiàn)TR定義的活性，研究性TR克隆展示出如下翻譯參數(shù)a)正常有絲分裂細(xì)胞中的最小翻譯活性，通過本領(lǐng)域存在的任何標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法確 定，在這些培養(yǎng)物中未展示出大于細(xì)胞死亡正常水平的表達(dá)水平，b)在用急性劑量的毒性劑如MG132或鈣離子載體A23187處理的細(xì)胞中翻譯活性 快速增加，這始于處理后6個(gè)小時(shí)前但不超過9個(gè)小時(shí)，c)在超過95%的用研究性TR盒轉(zhuǎn)化并用急性毒性劑處理的任何細(xì)胞系中觀察到 的翻譯活性，d)翻譯水平升至急性毒性劑接觸后無有效連接的TR序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的0RF表達(dá) 水平的 50% 以上，優(yōu)選超過 60%、70%、80%、85%、90%、95%或 100%，e)接近有效連接0RF起始位點(diǎn)處發(fā)生的應(yīng)激或死亡特異性翻譯起始，f)在正?；虼顾兰?xì)胞中不存在任何有效連接的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)序列/啟動(dòng)子元件時(shí)無
39轉(zhuǎn)錄或翻譯活性，g)在正?；虼顾兰?xì)胞中在從研究性TR盒中除去了任何TR序列的表達(dá)細(xì)胞中無 TR特異性mRNA剪接證據(jù)，h)在包括不少于3種細(xì)胞系的多個(gè)細(xì)胞類型或代表3個(gè)截然不同組織類型的組織 中檢測(cè)到應(yīng)激或死亡特異性翻譯。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，研究性TR元件將源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞。在另一 實(shí)施方案中，研究性TR元件將源自嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選小鼠細(xì)胞。
影響細(xì)胞應(yīng)激或毒件的物質(zhì)的篩詵測(cè)定本技術(shù)的TR表達(dá)盒在毒性檢驗(yàn)中的應(yīng)用包括將表達(dá)TR盒的細(xì)胞系與待篩選的活 性劑混合(一般是將其添加到培養(yǎng)基中)。本技術(shù)還提供了誘導(dǎo)、改善或預(yù)防細(xì)胞應(yīng)激或毒 性的物質(zhì)或化合物的高通量篩選測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物的細(xì)胞毒性能力應(yīng)用上文所述的任何細(xì)胞毒性測(cè)定或 者通過檢測(cè)與TR元件共翻譯的報(bào)告蛋白來評(píng)價(jià)。簡(jiǎn)言之，化合物通過與事先已用TR表達(dá) 盒轉(zhuǎn)化細(xì)胞一起孵育來檢驗(yàn)，其中第一 ORF序列編碼報(bào)告蛋白。接下來，篩選細(xì)胞中報(bào)告蛋 白的表達(dá)，其中報(bào)告蛋白的存在指示化合物的細(xì)胞毒性潛力。而且，細(xì)胞中報(bào)告蛋白的濃度 越高，和/或表達(dá)報(bào)告蛋白的細(xì)胞的百分比越大與化合物細(xì)胞毒性增加相關(guān)。在另一實(shí)施方案中，為了鑒定能夠減輕或預(yù)防細(xì)胞毒性的物質(zhì)，在上文所述的任 何哺乳動(dòng)物細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物接觸促進(jìn)或誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的條件之后，向所述細(xì)胞或動(dòng)物給 藥推定的治療物質(zhì)。例如，細(xì)胞可最初接觸輻照或用誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的藥物如甲氨蝶呤處理。 在推定的治療物質(zhì)與細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物一起孵育之后，與未處理細(xì)胞或動(dòng)物相比，處理細(xì) 胞或動(dòng)物中報(bào)告蛋白的差異表達(dá)指示該物質(zhì)減輕或預(yù)防細(xì)胞毒性的能力。例如，如果報(bào)告 基因是GFP，與未處理的相比，處理細(xì)胞或動(dòng)物中GFP表達(dá)減小指示物質(zhì)減小細(xì)胞毒性的能 力。對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言將會(huì)顯而易見的是，處理細(xì)胞或動(dòng)物中報(bào)告蛋白表達(dá)減小 程度越大，用來處理此類細(xì)胞或動(dòng)物的物質(zhì)預(yù)防或減輕細(xì)胞死亡的能力越大。這種方法可以在鑒定具有對(duì)抗例如癌癥治療中應(yīng)用的許多藥物細(xì)胞毒性的能力 的物質(zhì)方面特別有用。此類藥物一般稱為“化療”劑，并且包括DNA破壞劑，例如甲氨蝶 呤、多柔比星(doxorubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、絲裂霉素(mitomycin)、放線菌素 D(actinomycin D)、博來霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicomycin)、紫杉醇(taxol)、長(zhǎng)春 新堿(vincristine)、長(zhǎng)春堿(vinblastine)、順鉬(cisplatin)、卡莫司汀(carmustine)、 _ 夕去☆ (melphalan) > ^F ^ Iit 月安(cyclophosphamide) > T Sl M ^f (chlorambucil)、 異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、亞硝基脲(nitosurea)、他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬 (raloxifene)、雌激素受體結(jié)合劑、吉西他濱(gemcitabien)、諾維本(navelbine)、法尼基 蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、反鉬transplatinum、5-氟尿嘧啶、替莫唑胺(temazolomide)，以及它 們的類似物和衍生物。每一種化療劑一般伴有若干副作用，包括皮膚、胃腸道、骨髓、肝和腎 中的應(yīng)激和死亡。同樣伴有毒性的其他藥物例示為鎮(zhèn)靜劑、抗炎劑、抗生素、止痛劑、麻醉劑、抗病毒 藥等通用范疇。例如，抗生素呈現(xiàn)出的毒性表型范圍從輕微的胃腸道癥狀，到更為嚴(yán)重的肝 毒性、腎毒性、貧血、肌痛、關(guān)節(jié)痛和心臟毒性不等。另外，減少常用化合物如食品添加劑、社會(huì)藥物(social drug)細(xì)胞毒性的物質(zhì)以及可選的醫(yī)學(xué)療法可應(yīng)用上述方法來鑒定。食品添加劑、同樣也用于藥物、化妝品和某些醫(yī) 療裝置(即隱形眼鏡)生產(chǎn)的一個(gè)實(shí)例是著色劑。酒石黃(FD&C Yellow No. 5)，一種用來 著色飲料、甜品粉、糖果、冰淇淋、蛋奶糊和其他食品的化合物，能夠在顯著比例的接觸個(gè)體 中引起皮膚創(chuàng)傷(蕁麻疹)和一般毒性。其他具有潛在細(xì)胞毒性作用的食品添加劑包括膽 固醇替代品蔗糖聚酯(olestera)、亞硫酸鹽和谷氨酸一鈉(MSG)。在MSG的情況下，小部分 人群罹患MSG綜合征，一種以細(xì)胞應(yīng)激/毒性為特征伴有神經(jīng)癥狀的病況，包括頸部灼傷 感、前臂和胸部麻木、向臂和背部輻射的麻刺感、上軀和頭部發(fā)熱/虛弱、胸痛、惡心、呼吸 困難、瞌睡和一般嗜睡。還可鑒定對(duì)抗社 會(huì)藥物如酒精飲料和咖啡因液體(例如，咖啡、可 樂、茶等)效應(yīng)的物質(zhì)。可選的醫(yī)學(xué)療法包括例如草藥如人參、銀杏(ginkgo biloba)、黑點(diǎn) 葉金絲桃(St. John' s wort)、麻黃和卡瓦胡椒(kavaZ)。任何物質(zhì)或化合物均可以用來檢驗(yàn)其誘導(dǎo)、改善或預(yù)防細(xì)胞死亡的能力。例如，可 應(yīng)用例如由商業(yè)來源獲得小分子文庫(kù)。篩選此類文庫(kù)，包括組合篩選文庫(kù)(例如，肽、化學(xué) 品或寡核苷酸文庫(kù))是研究大量物質(zhì)的快速有效方式。組合方法通過創(chuàng)建基于活性但否則 不期望物質(zhì)建模的二代、三代或四代物質(zhì)，還適于快速進(jìn)化潛在藥物。待篩選的物質(zhì)或化合物還可包括天然存在物質(zhì)的片段或部分，或者可以發(fā)現(xiàn)作為 已知物質(zhì)的活性組合，否則將是無活性的。除了由化學(xué)成分或人造物質(zhì)衍生或合成的化合 物之外，還可測(cè)定從天然來源如動(dòng)物、細(xì)菌、真菌、植物來源(包括葉子和莖皮)和海洋樣品 分離的化合物。此類化合物的非限制性實(shí)例包括蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、小分子、核酸、脂質(zhì)、營(yíng) 養(yǎng)補(bǔ)充物如維生素或礦物質(zhì)、藥物或任何其他可以由已知的毒性通路抑制劑或刺激物通過 理性藥物設(shè)計(jì)而設(shè)計(jì)的物質(zhì)。誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法本技術(shù)提供了誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的活性劑。此類誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的活性劑通過誘導(dǎo)因激 活細(xì)胞死亡或抑制抗細(xì)胞死亡細(xì)胞通路所致的細(xì)胞死亡而對(duì)多種疾病發(fā)揮期望的藥理作 用。此類活性劑包括這樣的藥物，其包含具有上述作用的物質(zhì)作為活性成分。本技術(shù)的一個(gè)應(yīng)用在于產(chǎn)生改進(jìn)患者治療功效，同時(shí)減小治療應(yīng)用的任何有害副 作用的療法。在許多情況下，應(yīng)用組合療法來解決多種臨床問題，包括與過度增生性疾病治 療的細(xì)胞抗性相關(guān)的那些問題。在本技術(shù)的上下文中，考慮基于TR調(diào)控多肽的補(bǔ)充療法能 夠與治療性手術(shù)、化療、放療、基因療法、激素療法或免疫療法治療、以及采用凋亡或細(xì)胞周 期調(diào)節(jié)劑治療這些病癥的可選療法結(jié)合使用。過度增生性疾病包括與任何類型的異常細(xì)胞 生長(zhǎng)或異常細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)的疾病和病況。在本技術(shù)的方法中，患者為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。多種過度增生性和退行性疾病可 按照本技術(shù)的方法治療?？紤]通過本技術(shù)治療的過度增生性疾病的非限制性實(shí)例有癌癥、 銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、骨關(guān)節(jié)炎、以及口腔、前列腺、乳腺、皮膚的瘤前病變寸。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是在受試者中通過殺死癌細(xì)胞、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、減小轉(zhuǎn)移 的發(fā)生或數(shù)目、減小腫瘤大小、抑制腫瘤生長(zhǎng)、減小腫瘤或癌細(xì)胞的血液供應(yīng)、促進(jìn)針對(duì)癌 細(xì)胞或腫瘤的免疫反應(yīng)、預(yù)防或抑制癌癥進(jìn)展、或通過組合基于TR的治療與有效殺死或抑 制細(xì)胞增生的其他治療而增加癌癥受試者壽命而負(fù)面影響癌癥的方法。例如，如果通過本 發(fā)明確定，來自患者的腫瘤細(xì)胞對(duì)治療無反應(yīng)且不經(jīng)歷細(xì)胞死亡，則可給藥通過腫瘤特異性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的編碼毒素基因、前藥激活基因、腫瘤抑制基因或免疫治療劑的TR盒以刺激凋亡。作為舉例，通過腫瘤特異性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的編碼胸苷激酶基因(例如HSVlTKsr39酶 衍生物)的TR盒，可例如利用重組病毒載體，遞送至腫瘤特異性啟動(dòng)子在其中優(yōu)先有活性 的特定腫瘤類型中。TR盒在這些細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄將允許此酶在因適度化療或放療治療而應(yīng)激 的腫瘤細(xì)胞中選擇性地翻譯。通過用特異性前毒性(protoxic)核苷類似物如阿昔洛韋和 更昔洛韋處理HSV-TKsr39表達(dá)細(xì)胞，觀察到特別的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榇嗣府a(chǎn)生一磷酸鹽中間體， 其隨之被細(xì)胞激酶磷酸化而提供強(qiáng)效DNA合成抑制劑。這使表達(dá)HSV-TK的細(xì)胞對(duì)更昔洛 韋的毒性作用極端敏感，而哺乳動(dòng)物TK酶相對(duì)不敏感，產(chǎn)生大的治療指數(shù)。應(yīng)用HSV-TK基 因遞送的腫瘤建模試驗(yàn)已經(jīng)證明了確立腫瘤的完全消退和長(zhǎng)期動(dòng)物存活，即使僅部分腫瘤 細(xì)胞真正用HSV-TK基因轉(zhuǎn)導(dǎo)也是如此。這種所謂的“旁觀者”殺細(xì)胞效應(yīng)提供了重要的治 療優(yōu)勢(shì)，因其避免了用HSV-TK基因感染/轉(zhuǎn)導(dǎo)100%的腫瘤細(xì)胞的需求。預(yù)期技術(shù)人員能 夠基于其中優(yōu)選細(xì)胞死亡的特定應(yīng)用而設(shè)計(jì)類似的治療方法。在本技術(shù)的上下文中，考慮TR調(diào)控的蛋白質(zhì)能夠與其他細(xì)胞死亡療法同時(shí)應(yīng)用。 可選地，TR補(bǔ)充療法可在其他治療之前或之后，時(shí)間間隔范圍從數(shù)分鐘到數(shù)周。在第一種治 療和TR治療分開應(yīng)用的情況下，人們將會(huì)確保在各遞送時(shí)間之間的重要時(shí)間段不會(huì)過期， 從而第一活性劑與TR調(diào)控的治療劑仍將發(fā)揮有利的組合效應(yīng)。另一實(shí)施方案考慮將基于TR的成像和細(xì)胞死亡系統(tǒng)與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞死亡療法組合的 方法。提供了作為醫(yī)學(xué)治療副作用而對(duì)細(xì)胞死亡成像的優(yōu)勢(shì)，而且這樣的話，給藥編碼報(bào) 告和促死亡(pro-death) 0RF的單順反子和雙順反子TR表達(dá)盒允許基于載體TR盒進(jìn)行時(shí) 間成像。在一個(gè)實(shí)例中，可向腫瘤細(xì)胞遞送兩種TR表達(dá)載體，從而一種載體表達(dá)TR調(diào)控的 報(bào)告0RF，而第二種載體表達(dá)TR調(diào)控的細(xì)胞死亡0RF。在這種情況下，在標(biāo)準(zhǔn)治療劑如化療 藥物所致的細(xì)胞應(yīng)激后的帽子非依賴性翻譯，將指導(dǎo)針對(duì)靶向腫瘤細(xì)胞的TR依賴性細(xì)胞 成像和TR促死亡活性的補(bǔ)充治療?？蛇x地，可將單個(gè)雙順反子TR盒轉(zhuǎn)導(dǎo)到腫瘤細(xì)胞中， 其中上游0RF編碼報(bào)告0RF，而TR調(diào)控的0RF是細(xì)胞死亡調(diào)控蛋白。在這個(gè)實(shí)例中，上游 0RF將允許帽子依賴性翻譯以及觀察死亡之前的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而可在化療應(yīng)用之前觀察轉(zhuǎn) 導(dǎo)效率，然后當(dāng)化療應(yīng)用誘導(dǎo)了帽子非依賴性翻譯時(shí)則消失。因此，可通過改變TR盒組成 和治療劑應(yīng)用的時(shí)機(jī)選擇來設(shè)計(jì)有效的成像_處理模式，預(yù)期這會(huì)允許最小化副作用和場(chǎng) 外(off-site)活性。而且，可應(yīng)用雙順反子TR表達(dá)盒，從而兩個(gè)0RF序列均編碼細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)。例 如，第一和第二 0RF序列可編碼任意組合的凋亡前、前藥激活、單鏈抗體和毒素基因，如下 面的非限制性組合所例示的那樣p53和白喉毒素、p53和sr39TK、sr39TK和篦麻毒蛋白毒 素、白喉毒素和篦麻毒蛋白毒素，以及P53和BRCA-1。TR盒可作為裸質(zhì)粒DNA應(yīng)用于細(xì)胞，或者可如上所述利用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞中。在 一個(gè)實(shí)施方案中，在特定細(xì)胞或組織類型中選擇性地表達(dá)TR盒可能是有益的。為此目的， 可應(yīng)用含有通過調(diào)控啟動(dòng)子選擇性轉(zhuǎn)錄的TR盒的組織、細(xì)胞及條件特異性病毒。例如，如 果欲靶向特定的癌細(xì)胞類型，則可如上所述應(yīng)用腫瘤特異性啟動(dòng)子。預(yù)防細(xì)胞死亡的方法本技術(shù)的一個(gè)實(shí)施方案在于提供抑制細(xì)胞死亡的治療劑。本技術(shù)提供了抑制細(xì)胞
42死亡的治療劑，其由于激活細(xì)胞存活或抑制細(xì)胞死亡細(xì)胞通路通過抑制細(xì)胞死亡而能夠?qū)?多種疾病發(fā)揮期望藥理作用。此類藥物包含具有上述作用的物質(zhì)作為活性成分。本技術(shù)的一個(gè)應(yīng)用在于產(chǎn)生改進(jìn)患者治療功效，同時(shí)減小治療應(yīng)用的有害副作用 的療法。一般而言，應(yīng)用抗細(xì)胞死亡療法來解決與慢性和急性細(xì)胞死亡相關(guān)的臨床問題。在 本技術(shù)的上下文中，考慮TR調(diào)控的多肽能夠與其他治療如治療性手術(shù)、化療、放療、基因療 法、激素療法或免疫療法治療、以及可選的物理療法如誘導(dǎo)的低溫結(jié)合使用，以預(yù)防細(xì)胞死 亡。慢性退行性疾病將例示為任何在患者大部分的壽命中造成漸進(jìn)性細(xì)胞死亡的疾病或病 況。急性退行性疾病將例示為任何造成即刻細(xì)胞死亡的劇烈創(chuàng)傷或病況。在本技術(shù)的方法中，優(yōu)選患者是哺乳動(dòng)物，更特別是人。多種退行性疾病可按照本 技術(shù)的方法治療。慢性退行性疾病的非限制性實(shí)例將包括神經(jīng)疾病如阿爾茨海默病、帕金 森氏病以及其他組織疾病如肝臟壞死。與此類似，急性退行性疾病將例示為創(chuàng)傷性損傷，例 如急性脊髓損傷、急性神經(jīng)損傷、創(chuàng)傷性腦損傷、骨折、中風(fēng)、充血性心力衰竭和嚴(yán)重?zé)齻?。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是在受試者中由于原位TR調(diào)控的基因表達(dá)或組合有效抑制 細(xì)胞死亡的其他治療而通過阻斷細(xì)胞死亡來預(yù)防細(xì)胞死亡的方法。作為舉例，TR調(diào)控的抗 凋亡基因的表達(dá)能夠減小凋亡細(xì)胞中的細(xì)胞死亡。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“凋亡”是指稱為程序 性細(xì)胞死亡的生理過程。凋亡不同于其他形式的因?yàn)槔缛毖驂乃蓝l(fā)生的細(xì)胞死亡， 因?yàn)榈蛲鍪侵鲃?dòng)的、ATP依賴性形式的細(xì)胞死亡，其一般需要新RNA和蛋白質(zhì)合成。通過細(xì) 胞特異性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的、編碼抗凋亡基因如BCL2(B細(xì)胞CLL/淋巴瘤2)、BCL2L1 (Bcl-xl ； BCL2 樣 1)、BCL2A1 (Bfl-1/Al ；BCL2 相關(guān)蛋白 Al)、BAG1 (BCL2 相關(guān)抗死亡基因)、TRAF1 (腫 瘤壞死因子受體相關(guān)因子1)、BIRC3(C-IAP2 ；含3個(gè)重復(fù)的桿狀病毒凋亡蛋白抑制劑 (baculoviralinhibitor of apoptosis protein repeat-containing))、BIRC5 (存活蛋 白；含5個(gè)重復(fù)的桿狀病毒凋亡蛋白抑制劑)、BAK1(BCL2拮抗劑/殺傷蛋白(killer) 1)或 API5 (凋亡抑制劑5)的TR盒可例如應(yīng)用重組病毒載體遞送到啟動(dòng)子在其中優(yōu)先有活性的 脊髓神經(jīng)元中。TR盒在這些細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄將允許在因創(chuàng)傷性脊髓損傷而經(jīng)歷凋亡的脊髓神經(jīng) 元中選擇性地翻譯抗凋亡蛋白。預(yù)期技術(shù)人員能夠基于其中優(yōu)選預(yù)防細(xì)胞死亡的特定應(yīng)用 而設(shè)計(jì)類似的治療方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗凋亡基因?yàn)锽CL2。在另一優(yōu)選的實(shí) 施方案中，優(yōu)選的抗凋亡基因?yàn)門RAF 1。在本技術(shù)的上下文中，考慮TR調(diào)控的蛋白質(zhì)能夠與其他細(xì)胞死亡療法同時(shí)應(yīng)用。 TR補(bǔ)充療法可在其他治療之前或之后，時(shí)間間隔范圍從數(shù)分鐘到數(shù)周。在第一種治療和TR 治療分開應(yīng)用的情況下，人們將會(huì)確保在各遞送時(shí)間之間的重要時(shí)間段不會(huì)過期，從而第 一活性劑與TR調(diào)控的治療劑仍將發(fā)揮有利的組合效應(yīng)。另一實(shí)施方案考慮將基于TR的成像和抗凋亡/細(xì)胞死亡與標(biāo)準(zhǔn)死亡預(yù)防療法組 合的方法。提供了作為醫(yī)學(xué)治療副作用而對(duì)細(xì)胞死亡成像的優(yōu)勢(shì)，而且這樣的話，給藥編碼 報(bào)告和抗死亡0RF的單順反子和雙順反子TR表達(dá)盒允許基于載體TR盒進(jìn)行時(shí)間成像。例 如，癌癥患者中的健康細(xì)胞由于通常靶向特定敏感器官的化療治療的副作用而往往經(jīng)歷凋 亡。在一個(gè)實(shí)例中，可例如通過注射病毒載體向敏感器官遞送兩種TR表達(dá)載體，從而一種 載體表達(dá)TR調(diào)控的報(bào)告0RF，而第二種載體表達(dá)TR調(diào)控的抗凋亡0RF。在這種情況下，在 化療劑所致的細(xì)胞應(yīng)激后的帽子非依賴性翻譯，將指導(dǎo)靶向器官中的TR依賴性細(xì)胞成像 和TR抗凋亡活性的補(bǔ)充治療。可選地，可將單個(gè)雙順反子TR盒轉(zhuǎn)導(dǎo)到敏感器官中，其中上游0RF編碼報(bào)告0RF，而TR調(diào)控的0RF是抗凋亡蛋白。在這個(gè)實(shí)例中，上游0RF將允許帽子 依賴性翻譯以及觀察應(yīng)激之前的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而可在化療應(yīng)用之前觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，然后當(dāng) 化療調(diào)控的死亡誘導(dǎo)了帽子非依賴性翻譯時(shí)則消失。因此，可通過改變TR盒組成和治療劑 應(yīng)用的時(shí)機(jī)選擇來設(shè)計(jì)有效的成像_處理模式，預(yù)期這會(huì)最小化副作用和場(chǎng)外(off-site) 活性。為利用本方法，TR表達(dá)盒可作為裸質(zhì)粒DNA應(yīng)用于潛在的垂死細(xì)胞，即經(jīng)歷應(yīng)激 或細(xì)胞死亡的細(xì)胞，或者可如所述的那樣利用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞中。給藥路徑根據(jù)細(xì)胞損傷 類型、細(xì)胞在體內(nèi)的定位之處等因素而變化多樣。技術(shù)人員能夠容易地確定特定情形下優(yōu) 選的給藥路徑。例如，對(duì)于肌肉損傷，可應(yīng)用含TR盒的脂質(zhì)體或載體。在一個(gè)實(shí)施方案中， 在特定細(xì)胞或組織類型中選擇性地轉(zhuǎn)錄TR盒可能是有益的。為此目的，已經(jīng)構(gòu)建通過調(diào)控 啟動(dòng)子選擇性轉(zhuǎn)錄的組織、細(xì)胞及條件特異性盒。例如，如果特定的細(xì)胞類型對(duì)治療誘導(dǎo)的 細(xì)胞死亡/凋亡敏感，則可如上所述應(yīng)用細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。在另一實(shí)例中，如果特定的細(xì) 胞條件誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，則由反應(yīng)啟動(dòng)子調(diào)控的TR盒可以作為治療劑應(yīng)用。還考慮本方法可用來培養(yǎng)大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)物。一般而言，當(dāng)擴(kuò)增細(xì)胞時(shí)，至少其中 的一些由于混合等原因會(huì)經(jīng)歷細(xì)胞應(yīng)激和/或凋亡。因而，通過用含抗凋亡基因的TR盒 轉(zhuǎn)化細(xì)胞，更少的細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷凋亡。例如，本方法可用在生物反應(yīng)器如Wave Bioreactor 中，組合Cellbag —次性袋(disposable bag)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。參見例如美國(guó)專利 No. 6，544，788。試劑盒本技術(shù)提供了向期望檢驗(yàn)化合物或活性劑對(duì)細(xì)胞應(yīng)激/死亡的影響的實(shí)體提供 服務(wù)的方法。方法包括向?qū)嶓w提供本技術(shù)的細(xì)胞、組合和試劑用于藥理學(xué)篩選。當(dāng)與體內(nèi) 治療劑治療結(jié)合應(yīng)用時(shí)，本技術(shù)提供了用于確定、成像和定量就在細(xì)胞或組織內(nèi)造成的細(xì) 胞應(yīng)激/死亡而言的醫(yī)學(xué)治療毒性的診斷試劑盒和方法。本文還提供了以任何數(shù)目的獨(dú)立容器、包裝、管、瓶等包含一種或多種本文所述組 分的試劑盒，或者所述組分可以以任意組合在此類容器中混合。試劑盒含有如上所述的TR 表達(dá)盒或用TR表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，這種試劑盒中的多個(gè)細(xì)胞 源自單個(gè)細(xì)胞系，其中每個(gè)細(xì)胞均含有在誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激/死亡時(shí)經(jīng)歷帽子非依賴性翻譯的 特異性TR盒。任選地，本技術(shù)的試劑盒還可以含有一種或多種試劑用于檢測(cè)TR盒的轉(zhuǎn)錄 (例如用于PCR擴(kuò)增的盒特異性寡核苷酸)、來自TR盒的翻譯(例如抗體或酶底物)的試 劑，一種或多種已知誘導(dǎo)或抑制啟動(dòng)子活性(從而是TR盒的表達(dá))的對(duì)照化合物，一種或 多種產(chǎn)生明確的毒性反應(yīng)(從而促進(jìn)TR盒的應(yīng)激/死亡特異性翻譯)的對(duì)照化合物，一種 或多種抑制、影響或激活藥物靶標(biāo)或由TR盒表達(dá)的藥物代謝酶的分子或其他化合物，和/ 或有關(guān)使用試劑盒的載體、細(xì)胞或其他組分進(jìn)行藥物篩選或驗(yàn)證的書面信息。上述試劑盒 和本技術(shù)方法中所采用的寡核苷酸基于其在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由TR盒合成的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行 特異性雜交的能力來選擇。選擇寡核苷酸序列的多種方法在本領(lǐng)域已知。在提供TR表達(dá)盒的情況下，優(yōu)選表達(dá)盒作為載體例如質(zhì)?；虿《镜囊徊糠侄?供。本文所述的任何TR表達(dá)盒均可在試劑盒中應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，在試劑盒中應(yīng)用 的單順反子TR表達(dá)盒含有報(bào)告基因例如GFP或EGFP作為第一 0RF序列。在其他實(shí)施方案 中，雙順反子TR表達(dá)盒包括相同或者不同的兩個(gè)報(bào)告基因。試劑盒中提供的哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，例如HEK293。藥物組合物本技術(shù)還提供了包含TR表達(dá)盒和可藥用載體的藥物組合物。TR表達(dá)盒可作為其 自身、作為載體的一部分或作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞的一部分提供。藥物組合物優(yōu)選以生物有效量或治療有效量、單獨(dú)或組合一種或多種其他活性劑 向受試者給藥。治療有效量是當(dāng)給予有效的時(shí)間段時(shí)實(shí)現(xiàn)期望的治療或臨床效果的劑量。核酸構(gòu)建體的治療活性量可以根據(jù)諸如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重以及 組合物在個(gè)體體內(nèi)引發(fā)期望反應(yīng)的能力等因素而變化不等?？梢哉{(diào)整劑量方案以提供最佳 治療反應(yīng)。例如，可以每日給藥數(shù)個(gè)分份劑量，或者如治療情況的緊急所表明的那樣成比例 減小劑量。細(xì)胞結(jié)合形式核酸的治療有效量可以按照核酸的量或者以細(xì)胞當(dāng)量來規(guī)定。因而有效量為約lng至約lg/kg受體體重，更優(yōu)選約lng至10mg/kg，更優(yōu)選約 lug至約lmg/kg。適合于內(nèi)部給藥的劑量?jī)?yōu)選每單位含有(對(duì)于后面的劑量范圍)約 0. lmg至約lOOmg活性成分。活性成分基于組合物總重可以以重量計(jì)從約0. 5%到約95% 不等?？蛇x地，表達(dá)核酸的細(xì)胞的有效劑量為每個(gè)受試者約104至約109個(gè)細(xì)胞，更優(yōu)選約 106至約108個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選是分次劑量。細(xì)胞治療領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠容易地調(diào)整這些劑量 而無需過度實(shí)驗(yàn)。包含TR表達(dá)盒或由其轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的藥物組合物可通過任何便利的方式，例如通 過注射或輸注給藥。優(yōu)選的給藥路徑包括靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、腦室內(nèi)、皮下、皮內(nèi)和肌肉內(nèi)路徑。 其他可能的路徑包括口服給藥、吸入或直腸給藥。視給藥路徑而定，本技術(shù)的藥物組合物可以包被在保護(hù)組合物免受可以使組合物 失活的酶、酸和其他自然條件作用的材料中。例如，可應(yīng)用載體如脂質(zhì)體(包括水包油包水 乳劑以及傳統(tǒng)脂質(zhì)體(Strejan等人，(1984) J. Neuroimmunol 7:27))。在這樣的情況下， TR表達(dá)盒自身或作為載體的一部分可分散或各自存在于由附于脂質(zhì)層的水性同心層構(gòu)成 的微粒中。活性蛋白質(zhì)優(yōu)選存在于水性層中以及脂質(zhì)層中、內(nèi)側(cè)或外側(cè)，或者，無論如何存 在于一般稱為脂質(zhì)體懸浮液的非均質(zhì)系統(tǒng)中。疏水層或脂質(zhì)層一般包含磷脂如卵磷脂和 鞘磷脂，類固醇如膽固醇，或多或少的離子表面活性物質(zhì)如雙十六烷基磷酸、硬脂胺或磷脂 酸，和/或其他疏水性質(zhì)的材料?？伤幱幂d體(本文還稱為“載體”)在本領(lǐng)域還稱為賦形劑、運(yùn)載體(vehicle)、 助劑(auxiliary)、佐劑或稀釋劑，一般為藥學(xué)惰性物質(zhì)，賦予組合物適宜的稠度或形式， 而不減小組合物的功效。如果載體在給藥哺乳動(dòng)物尤其是人時(shí)不產(chǎn)生不可接受的有害、 過敏或其他不適宜反應(yīng)，則一般認(rèn)為是可藥用的或藥理上可接受的?！翱伤幱幂d體”包括 例如任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、以及等滲劑和吸收延遲劑。 此類介質(zhì)和活性劑用于藥物活性物質(zhì)的用途在本領(lǐng)域公知。藥物的制劑在例如Hoover， John E. , Remington ' s Pharmaceutical Sciences, MackPublishing Co., Easton, Pennsylvania (1975)以及 Liberman, H. A.禾口 Lachman, L.編輯，Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, NewYork, N. Y. (1980)中討論。可注射制品例如無菌可注射水性或油質(zhì)懸浮液可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)利用適宜的分散 劑或潤(rùn)濕劑及懸浮劑來配制。無菌可注射制品還可以是處于無毒可接受稀釋劑或溶劑中的 無菌可注射溶液或懸浮液?？山邮艿倪\(yùn)載體和溶劑中可以采用的有水、Ringer溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，傳統(tǒng)上采用無菌不揮發(fā)油作為溶劑或懸浮介質(zhì)。另外，脂肪酸如油酸可 用于制備注射物。可應(yīng)用二甲基乙酰胺，表面活性劑，包括離子型和非離子型去垢劑，以及 聚乙二醇。溶劑和潤(rùn)濕劑如上文所討論的那些的混合物也是有益的?？勺⑸浣M合物的延長(zhǎng) 吸收可通過在組合物中納入延遲吸收的活性劑例如，單硬脂酸鋁和明膠而實(shí)現(xiàn)。用于本文所討論化合物直腸給藥的栓劑可通過混合活性活性劑與適宜的非刺激 性賦形劑來制備，如可可脂、合成的單酸_、雙酸_或三酸甘油酯、脂肪酸或聚乙二醇，它們 在常溫為固態(tài)，但在直腸溫度為液態(tài)，因此將會(huì)在直腸中溶解而釋放組合物。用于口服給藥的固體劑型可以包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。在此類固 體劑型中，化合物通常與一種或多種適合于所示給藥路徑的佐劑混合。如果口服給藥，則化 合物可與乳糖、蔗糖、淀粉粉末、鏈烷酸纖維素酯、纖維素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、 氧化鎂、磷酸和硫酸的鈉鹽及鈣鹽、明膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙 烯醇混合，然后壓片或裝入膠囊以便利地給藥。此類膠囊劑或片劑可含有控釋制劑，這可通 過將活性化合物分散在中羥丙基甲基纖維素中提供。在膠囊劑、片劑和丸劑的情況下，劑型 還可包含緩沖劑如檸檬酸鈉、或碳酸鎂或鈣或碳酸氫鎂或鈣。片劑和丸劑可另外制備為具 有腸衣。出于治療目的，用于胃腸外給藥的制劑可為水性或非水性等滲無菌注射液或懸浮 液的形式。這些溶液和懸浮液可由具有一種或多種提及用于口服給藥制劑的載體或稀釋劑 的無菌散劑或顆粒劑來制備?；衔锟扇苡谒⒕垡叶?、丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花 生油、芝麻油、苯甲醇、氯化鈉和/或多種緩沖液中。其他佐劑和給藥模式在藥學(xué)領(lǐng)域廣為 人知。用于口服給藥的液體劑型可包括含有本領(lǐng)域常用惰性稀釋劑如水的可藥用乳液、 溶液、懸浮液、糖漿和酏劑。此類組合物還可包含佐劑，例如潤(rùn)濕劑、乳化劑和懸浮劑以及甜 味劑、矯味劑和芳香劑。在可霧化的氣霧劑制品中，本技術(shù)的藥物組合物可與固態(tài)或液態(tài)惰性載體材料組 合提供。此類制品可包裝在擠瓶(squeeze)中，或與加壓的揮發(fā)性、通常是氣態(tài)推進(jìn)劑混 合。氣霧劑制品除了本技術(shù)的組成外，還可含有溶劑、緩沖劑、表面活性劑和抗氧化劑。微生物作用的預(yù)防可以通過多種抗菌劑和抗真菌劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯、三氯叔 丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等來實(shí)現(xiàn)。例示性的表達(dá)盒下表1和2分別描述了眾多單順反子和雙順反子TR盒。如先前所討論的那樣，單 順反子TR盒包含有效連接于3’ 0RF序列的TR元件之一，而雙順反子盒包含有效連接于上 游和下游0RF序列的TR元件。例示性的單順反子盒如SEQ ID NO :3_4所示，而雙順反子序 列例示為SEQ ID N0:5-6。出于兩個(gè)表格的目的，能夠應(yīng)用的具體啟動(dòng)子、TR元件和0RF序 列在上文更詳細(xì)地說明。表1.單順反子TR表達(dá)盒啟動(dòng)子TR元件 0RF序列組成型TR& 報(bào)告基因組成型TRplp 報(bào)告基因誘導(dǎo)型TR& 報(bào)告基因
46誘導(dǎo)型 組織特異性 組織特異性 腫瘤特異性 腫瘤特異性 反應(yīng)基因 反應(yīng)基因 組成型 組成型 誘導(dǎo)型 誘導(dǎo)型 組織特異性 組織特異性 腫瘤特異性 腫瘤特異性 反應(yīng)基因 反應(yīng)基因 組成型 組成型 誘導(dǎo)型 誘導(dǎo)型 組織特異性 組織特異性 腫瘤特異性 腫瘤特異性 反應(yīng)基因 反應(yīng)基因 組成型 組成型 誘導(dǎo)型 誘導(dǎo)型 組織特異性 組織特異性 腫瘤特異性 腫瘤特異性 反應(yīng)基因 反應(yīng)基因 組成型 組成型
TR, TR,
pip
dm
TR, TR, TR, TR, TR, TR, TR, TR,
-pip
dm
-pip
dm
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dm
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TR, TR, TR, TR, TR, TR, TR, TR,
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TR, TR, TR, TR, TR
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TR, TR, TR,
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TR, TR, TR, TR, TR, TR, TR, TR,
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pip
dm
TR, TR, TR, TR, TR
-pip
dm
-pip
dm
pip
報(bào)告基因 報(bào)告基因 報(bào)告基因 報(bào)告基因 報(bào)告基因 報(bào)告基因 報(bào)告基因
細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 毒素基因 毒素基因 毒素基因 毒素基因 毒素基因 毒素基因
毒素基因 毒素基因 毒素基因 毒素基因 前藥激活基因 前藥激活基因 前藥激活基因 前藥激活基因 前藥激活基因 前藥激活基因 前藥激活基因 前藥激活基因 前藥激活基因 前藥激活基因 凋亡前基因 凋亡前基因
誘導(dǎo)型TRdm
誘導(dǎo)型TRplp
組織特異性TRdm
組織特異性TRplp
腫瘤特異性TRdm
腫瘤特異性TRplp
反應(yīng)基因TRdm
反應(yīng)基因TRplp
表2.雙順反子TR表達(dá)盒
啟動(dòng)子 第一 0RF序列
組成型報(bào)告基因
組成型報(bào)告基因
誘導(dǎo)型報(bào)告基因
誘導(dǎo)型報(bào)告基因
組織特異性報(bào)告基因
組織特異性報(bào)告基因
腫瘤特異性報(bào)告基因
腫瘤特異性報(bào)告基因
反應(yīng)基因報(bào)告基因
反應(yīng)基因報(bào)告基因
組成型報(bào)告基因
組成型報(bào)告基因
誘導(dǎo)型報(bào)告基因
誘導(dǎo)型報(bào)告基因
組織特異性報(bào)告基因
組織特異性報(bào)告基因
腫瘤特異性報(bào)告基因
腫瘤特異性報(bào)告基因
反應(yīng)基因報(bào)告基因
反應(yīng)基因報(bào)告基因
組成型報(bào)告基因
組成型報(bào)告基因
誘導(dǎo)型報(bào)告基因
誘導(dǎo)型報(bào)告基因
組織特異性報(bào)告基因
組織特異性報(bào)告基因
腫瘤特異性報(bào)告基因
腫瘤特異性報(bào)告基因
反應(yīng)基因報(bào)告基因
凋亡前基因 凋亡前基因 凋亡前基因 凋亡前基因 凋亡前基因 凋亡前基因 凋亡前基因 凋亡前基因
TR元件 第二 0RF序列 TRdffl 報(bào)告基因 TRplp 報(bào)告基因 TRdffl 報(bào)告基因 TRplp 報(bào)告基因 TRdffl 報(bào)告基因 TRplp 報(bào)告基因 TRdffl 報(bào)告基因 TRplp 報(bào)告基因 TRdffl 報(bào)告基因 TRplp 報(bào)告基因 TRdffl 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 TRplp 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 TRdffl 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 TRplp 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 TRdffl 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 TRplp 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 TRdffl 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 TRplp 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 TRdffl 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 TRplp 細(xì)胞毒性腫瘤抑制子 TRdffl 毒素基因 TRplp 毒素基因 TRdffl 毒素基因 TRplp 毒素基因 TRdffl 毒素基因 TRplp 毒素基因 TRdffl 毒素基因 TRplp 毒素基因 TRdffl毒素基因
反應(yīng)基因毒素基因TRdm報(bào)告基因
反應(yīng)基因毒素基因TRpip報(bào)告基因
組成型前藥激活基因TRdm報(bào)告基因
組成型前藥激活基因TRpip報(bào)告基因
誘導(dǎo)型前藥激活基因TRdm報(bào)告基因
誘導(dǎo)型前藥激活基因TRpip報(bào)告基因
組織特異性前藥激活基因TRdm報(bào)告基因
組織特異性前藥激活基因TRpip報(bào)告基因
腫瘤特異性前藥激活基因TRdm報(bào)告基因
腫瘤特異性前藥激活基因TRpip報(bào)告基因
反應(yīng)基因前藥激活基因TRdm報(bào)告基因
反應(yīng)基因前藥激活基因TRpip報(bào)告基因
組成型凋亡前基因TRdm報(bào)告基因
組成型凋亡前基因TRpip報(bào)告基因
誘導(dǎo)型凋亡前基因TRdm報(bào)告基因
誘導(dǎo)型凋亡前基因TRpip報(bào)告基因
組織特異性凋亡前基因TRdm報(bào)告基因
組織特異性凋亡前基因TRpip報(bào)告基因
腫瘤特異性凋亡前基因TRdm報(bào)告基因
腫瘤特異性凋亡前基因TRpip報(bào)告基因
反應(yīng)基因凋亡前基因TRdm報(bào)告基因
反應(yīng)基因凋亡前基因TRpip報(bào)告基因
除表1和2所示的表達(dá)盒之外，下表3和4還描述了單順反子和雙順反子TR表達(dá)
盒的具體實(shí)例。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地意識(shí)到，表3和4中描述的組合是作為舉例顯 示而非限制。表3.單順反子TR表達(dá)碧監(jiān)的具體實(shí)例
啟動(dòng)子TR元件ORF序列
巨細(xì)胞病毒即時(shí)早期(CMV) TRdm螢火蟲熒光素酶
CMVTRpip螢火蟲熒光素酶
金屬硫蛋白-ITRdm螢火蟲熒光素酶
金屬硫蛋白-ITRpip螢火蟲熒光素酶
突觸蛋白ITRdm螢火蟲熒光素酶
突觸蛋白ITRpip螢火蟲熒光素酶
甲胎蛋白TRdm螢火蟲熒光素酶
甲胎蛋白TRpip螢火蟲熒光素酶
熱擊蛋白70TRdm螢火蟲熒光素酶
熱擊蛋白70TRpip螢火蟲熒光素酶
CMVTRdmp53
CMVTRpipp53
50
甲胎蛋白花蟲熒光素酶TRpip胸苷激酶sr39
熱擊蛋白70花蟲熒光素酶TRdm胸苷激酶sr39
熱擊蛋白70花蟲熒光素酶TRpip胸苷激酶sr39
CMV花蟲熒光素酶TRdm胱天蛋白酶3
CMV花蟲熒光素酶TRpip胱天蛋白酶3
金屬硫蛋白-I花蟲熒光素酶TRdm胱天蛋白酶3
金屬硫蛋白-I花蟲熒光素酶TRpip胱天蛋白酶3
突觸蛋白I花蟲熒光素酶TRdm胱天蛋白酶3
突觸蛋白I花蟲熒光素酶TRpip胱天蛋白酶3
甲胎蛋白花蟲熒光素酶TRdm胱天蛋白酶3
甲胎蛋白花蟲熒光素酶TRpip胱天蛋白酶3
熱擊蛋白70花蟲熒光素酶TRdm胱天蛋白酶3
熱擊蛋白70花蟲熒光素酶TRpip胱天蛋白酶3一般方法如本文所用的分子生物學(xué)技術(shù)、生物化學(xué)技術(shù)和微生物技術(shù)在本領(lǐng)域公知 常用，并描述在例如 Sambrook J 等人(1989)，Molecular Cloning :ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor (2001)及其第三版；Ausubel，F(xiàn). M. (1987)，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub.Associatesand Wiley-interscience ； Ausubel, F. M. (1989)，Short Protocols inMolecular Biology :A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology, Greene Pub.Associates and Wiley-interscience ；Innis，M. A. (1990)，PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications，Academic Press ；Ausubel, F. M. (1992)，Short Protocols in MolecularBiology :A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology，Greene Pub. Associates ；Ausubel，F(xiàn). M. (1995)，Short Protocols inMolecular Biology :A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology, Greene Pub. Associates ；Innis, M. A.等人(1995)，PCRStrategies，Academic Press ；Ausubel，F(xiàn). M. (1999)，Short Protocols inMolecular Biology :A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology，Wiley，且為年更新；Sninsky， J.J.等人(1999)，PCRApplications Protocols for Functional Genomics，Academic Press ；Specialissue， Jikken Igaku [Experimental Medicine] 〃 Idenshi Donyu &Hatsugenkaiseki Jikkenho [Experimental Method for Gene introduction&Expression Analysis] ，Yodo-sha，1997等出版物中。每一種這些出版物中的相關(guān)部分(或者很可能 是全文)并入本文作為參考。任何技術(shù)可以用在本文將核酸分子引入到細(xì)胞中，包括例如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn) 染等。此類核酸分子引入技術(shù)在本領(lǐng)域公知常用，并描述在例如Ausubel F.A.等人 編 輯(1988)，Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York，N. Y.； Sambrook J 等人(1987)Molecular Cloning :ALaboratory Manual，第 二片反及其第 三 片反，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N. Y. ；Special issue，Jikken Igaku [Experimental Medicine] Experimental Method for Geneintroduction&Expression Analysis"，Yodo-sha，1997 等出版物中?；蛞肟赏ㄟ^如 本文所述的方法如Northern印跡分析和Western印跡分析或其他公知常用技術(shù)來確認(rèn)。本技術(shù)多肽的氨基酸缺失、取代或添加可通過作為公知技術(shù)的位點(diǎn)特異性 誘變方法來進(jìn)行。一個(gè)或幾個(gè)氨基酸缺失、取代或添加可按照Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第 二 片反，Cold Spring HarborLaboratory Press (1989) ；Current Protocols in Molecular Biology，增刊 1 至 38，John ffiley&Sons (1987-1997) ；Nucleic Acids Research,10,6487(1982) ；Proc. Natl. Acad. Sci. , USA,79,6409(1982) ；Gene,34, 315 (1985) ；Nucleic Acids Research,13,4431 (1985) ；Proc. Natl. Acad. Sci.USA,82, 488(1985) ；Proc. Natl. Acad. Sci. , USA,81,5662(1984) ；Science,224，1431(1984) ；PCT W085/00817(1985) ；Nature, 316,601 (1985)等出版物中所述的方法來進(jìn)行。
實(shí)施例提供如下非限制性的實(shí)施例以進(jìn)一步舉例說明本技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理 解，如下實(shí)施例中公開的技術(shù)代表發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在實(shí)施本技術(shù)方面運(yùn)轉(zhuǎn)良好的方法，因而可 視為構(gòu)成其實(shí)施方式的實(shí)施例。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明公開應(yīng)當(dāng)理解，可對(duì)公開 的具體實(shí)施方案做出許多改變而依然獲得同樣或相似的結(jié)果，而不偏離本技術(shù)的精神和范圍。 實(shí)施例I-構(gòu)建單順反子TR盒該實(shí)施例描述了含有“單順反子”盒(圖2)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的制備，其允許 在細(xì)胞應(yīng)激和死亡期間在翻譯調(diào)控(TR)序列的控制下選擇性地翻譯可讀框(0RF)。該實(shí)施 例中描述的PTR-0RF質(zhì)粒構(gòu)建體含有哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子，有效連接于單個(gè)蛋白質(zhì)編碼序列的 TR元件，以及mRNA多聚腺苷酸化信號(hào)(即，TR表達(dá)盒)。A.制備TR調(diào)控的表達(dá)盒為了證明TR調(diào)控翻譯的可行性和功效，制備了初始系列的含TR表達(dá)盒的哺乳 動(dòng)物表達(dá)載體。pTR-EYFP表達(dá)載體基本如下構(gòu)建。將對(duì)應(yīng)于PLP-16至+858的DNA片段 和DM20cDNA序列克隆到pEYFP-Nl載體中，生成pPLPeyfp和pDM20eyfp表達(dá)載體(圖1)。 PEYFP-N1質(zhì)粒的哺乳動(dòng)物表達(dá)序列含有CMV早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，EYFP 0RF和SV40早期 多聚腺苷酸化信號(hào)。pEYFP-m骨架中的其他哺乳動(dòng)物特異性元件包括SV40復(fù)制起點(diǎn)，由融 合于新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的SV40早期(大T)基因啟動(dòng)子和來自單純皰疹病毒胸苷激酶 基因的多聚腺苷酸化信號(hào)組成的盒。此表達(dá)盒所提供的新霉素抗性可用作為可選擇標(biāo)記， 來制備穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。為在大腸桿菌中選擇和生長(zhǎng)，SV40啟動(dòng)子上游的細(xì)菌啟 動(dòng)子提供了卡那霉素抗性，而PUC19復(fù)制起點(diǎn)允許質(zhì)粒在大腸桿菌中增殖。pPLPeyfp和pDM20eyfp表達(dá)載體的第一輪寡核苷酸定點(diǎn)誘變應(yīng)用內(nèi)部寡核苷酸 引物集合[L205. 5w(SEQ ID NO 7)和 L205.3w(SEQ ID NO 8) ；L235. 5(SEQ ID NO 9)和 L235. 3(SEQ ID NO :10)]，以分別去除TR&序列中核苷酸511和598處以及TRplp序列中核 苷酸616和703處的翻譯起始密碼子。該嘗試中所用的誘變方法如TK 0RF的QuikChange 誘變所述那樣，參見后續(xù)章節(jié)。應(yīng)用5’特異性引物集合[RI-st0p_s(SEQ ID N0:11)和 RI-stop_a(SEQ ID NO :12)]的接著發(fā)生的突變改變了兩種TR序列，從而通過插入終止密 碼子并去除5’鄰近AUG起始密碼子而消除了帽子依賴性翻譯。隨后，3’特異性引物集合
55[H-Xh-Xb_s (SEQ ID NO 13)和 H_Xh_Xb_a (SEQ ID NO 14)去除了 PLP/DM20 翻譯終止密碼 子，并在TR序列和EYFPAUG密碼子之間的間插序列中引入了 Hindlll、Xhol和Xbal位點(diǎn)。 定點(diǎn)誘變的方法在本領(lǐng)域公知(例如，QuikChange誘變?cè)噭┖?，Stratagene)，并在該實(shí)施 例的后續(xù)章節(jié)討論。這些構(gòu)建體命名為pTRplp_EYFP和PTR&-EYFP (圖2)。因而，PTRplp_EYFP 質(zhì)粒中的TR表達(dá)盒由CMV即時(shí)早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、PLP TR序列、EYFP 0RF和SV40多聚 腺苷酸化信號(hào)組成。與此類似，pTRdffl-EYFP質(zhì)粒中的TR表達(dá)盒含有CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、 DM20TR序列、EFYP 0RF和SV40多聚腺苷酸化信號(hào)。這些構(gòu)建體及后續(xù)衍生物的序列身份利用任何或全部如下測(cè)序引物得到了證實(shí) SK15(SEQ ID NO :15)、SK16(SEQ ID NO 16)、SK17 (SEQ IDNO : 17)、EYFP (-) 1 (SEQ ID NO: 18)、EYFP(-)2(SEQ ID NO :19)、BAC_1(SEQ ID NO :20)、BAC_2(SEQ ID NO :21)或BAC-3(SEQ ID NO 22)。B.選擇ORF并克隆到TR盒中為證明多種ORF的TR調(diào)控，通過改變TR調(diào)控的ORF創(chuàng)建了許多不同的質(zhì)粒。利 用單順反子PTRplp/dm-EYFP質(zhì)粒的衍生物通過修飾一些或所有這些功能元件來構(gòu)建其他 單順反子TR-0RF載體，包括(a)交換pCMV IE啟動(dòng)子，(b)去除EYFP 0RF，和/或(c)視 需要添加或減少限制性位點(diǎn)。為將非EYFP ORF克隆到與EYFP ORF相同的位置，利用定 點(diǎn)誘變以 AUGback_s(SEQ ID NO :23)和 AUGback_a (SEQ ID NO :24)引物集合在 H-Xh-Xb 序列上游插入了兩個(gè)核苷酸。這允許后續(xù)的0RF特異性PCR引物集合包括1)共同的5’ 序列，以完全相同的Kozak共有序列替換了天然的翻譯起始密碼子，和2)5’ Hindlll和 3，Xhol限制性酶位點(diǎn)，其允許定向克隆。在用Hindlll和Xhol消化后，將這些0RF特異性 PCR 片段克隆到 pTRplp-0RF 和 PTR&-0RF 載體中。EYFP、fLuc、TK、CAT 和 LacZ ORF 分別由 pEYFP-Nl (Clontech)、phCMV-LUC-FSR (Gen 1 antis)、pHSV106 (GenBank sequenceV00470)、 pCAT-增強(qiáng)子(Promega)和pAAV_LacZ (Stratagene)質(zhì)粒載體進(jìn)行PCR擴(kuò)增。制備了如下 例示性的質(zhì)粒pTRplp-fLuc，其包括pip TR元件以及利用 Luc-1(SEQ ID NO :25)和 Luc_2 (SEQ ID NO 26)引物集合PCR擴(kuò)增的螢火蟲熒光素酶(fLUC)ORF;pTI^-fLuc，其包括dm20TR元件以及利用Luc_l和Luc_2引物集合PCR擴(kuò)增的fLUC 0RF ；pTRplp-TK，其包括 pip TR 元件以及利用 TK-1(SEQ ID NO :27)和 TK-2 (SEQ ID NO: 28)引物集合PCR擴(kuò)增的HSV胸苷激酶(TK) ORF ；pTR^-TK,其包括dm20TR元件以及利用TK-1和TK-2引物集合PCR擴(kuò)增的TK 0RF ；pTRplp-CAT，其包括 pip TR 元件和利用 CAT-1 (SEQ ID NO :29)和 CAT-2 (SEQ ID NO: 30)引物集合PCR擴(kuò)增的細(xì)菌氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)ORF;pTR^-CAT,其包括dm20TR序列以及利用CAT-1和CAT-2引物集合PCR擴(kuò)增的CAT 0RF ；pTRplp-LacZ,其包括 pip TR 序列以及利用 LacZ-1 (SEQ ID NO 31)和 LacZ-2 (SEQ ID NO 32)引物集合PCR擴(kuò)增的、編碼半乳糖甘酶蛋白的細(xì)菌LacZ 0RF ；和pTR^-LacZ,其包括dm20TR元件以及利用LacZ_l和LacZ_2引物集合PCR擴(kuò)增的 LacZ 0RF。
C.定點(diǎn)誘變TR調(diào)控的0RF該實(shí)施例表明可改變TR調(diào)控的0RF，以改善由TR盒翻譯的蛋白質(zhì)的功能特征，或 消除任何可能干擾TR調(diào)控的RNA序列/結(jié)構(gòu)。在該實(shí)施例中，利用Sr39-1 (SEQ ID NO 33) 和Sr39-2(SEQ ID NO 34)引物集合在TKORF中插入了 5個(gè)TK sr39氨基酸突變(Gambhir 等人；Proc Natl Acad SciUSA ；97 :2785_2790)。與野生型TK蛋白相比，TKsr39蛋白展示出有益的動(dòng)力學(xué)特性，例如前藥結(jié)合增強(qiáng) (對(duì)GCV比野生型蛋白高83倍)，在較低前藥濃度時(shí)前藥介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷增加，以及代謝物 示蹤物結(jié)合更優(yōu)(例如18F標(biāo)記的噴昔洛韋)。在后一種情況下，這種增強(qiáng)的結(jié)合效率改進(jìn) 了非侵入性成像技術(shù)如正電子成像術(shù)。為驗(yàn)證TR盒中的定點(diǎn)誘變過程和產(chǎn)生改進(jìn)的TK標(biāo)記蛋白，利用寡核苷酸指導(dǎo)的 誘變?cè)谝吧蚑R-0RF序列中插入TKsr39DNA突變。定點(diǎn)誘變方法在本領(lǐng)域公知(例如， QuikChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖校琒tratagene)?；旧?，構(gòu)建了含有期望突變的寡核苷酸引物 (例如Sr39-1和Sr39-2)。以Sr39引物集合對(duì)pTRplp_TK和pTRdm_TK模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增 (95 °C 30秒，1個(gè)循環(huán)；95°C 30秒、55°C 1分鐘、68°C 12分鐘，12個(gè)循環(huán))，在呈指數(shù)擴(kuò)增的 DNA鏈中摻入了突變。擴(kuò)增后，DNA用特異性識(shí)別甲基化和半甲基化DNA的Dpnl限制性酶 消化。由于PTRplp-TK和pTRdm-TK模板在甲基化陽(yáng)性細(xì)菌菌株中生長(zhǎng)，Dpnl消化在細(xì)菌轉(zhuǎn)化 之前除去了親本模板。轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在選擇性培養(yǎng)基中涂板，并利用分離的菌落制備DNA小 量制備物，通過限制性圖譜分析和DNA測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行分析。所得的質(zhì)粒稱為PTRplp-TKsr39 和 pTI^-TKsrfg。PTRplp_TKsr39 載體在 pHSV106TK 0RF 中包括 pip TR 元件以及 HSV-lTKsr39 突變(SEQ IDN0 ;39)。與此類似，pTRdm_TKsr39 質(zhì)粒在 pHSV106TK 0RF 中含有 dm20TR 元件以及 TKsr39 突變(SEQ ID NO 40)。實(shí)施例II-構(gòu)建雙順反子TR盒該實(shí)施例描述了含有雙順反子TR盒(圖3)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的制備，其允許 帽子依賴性地翻譯TR盒上游的0RF，和在細(xì)胞應(yīng)激和死亡期間在翻譯調(diào)控(TR)元件的控制 下帽子非依賴性地翻譯0RF。這些載體允許由單個(gè)mRNA研究帽子依賴性和帽子非依賴性翻 譯過程。A.在TR-EYFP盒上游插入螢火蟲熒光素酶0RF通過在含EYFP基因(0RF1)的TR盒上游插入螢火蟲熒光素酶(fLuc)ORF(稱為 0RF2)來構(gòu)建雙順反子載體。phCMV-LUC-FSR載體(Genlantis)用EcoRI消化，純化含fLuc 序列的限制性片段，并克隆到PTRplp-EYFP和PTR&-EYFP載體(圖3)的EcoRI位點(diǎn)中。fLuc 0RF的取向通過限制性圖譜分析來驗(yàn)證，并回收正向(有義)和反向(反義)插入體。有義 載體稱為 pfLuc-TRplp-EYFP 和 pfLuc-TI^-EYFP 質(zhì)粒，而反義載體稱為 pcuLf-TRplp_EYFP 和 pcuLf-TR^-EYFP 質(zhì)粒。有義p0RF-TR-0RF載體編碼單個(gè)mRNA物質(zhì)，其允許上游0RF組成型、穩(wěn)態(tài)、帽子依 賴性地翻譯，而有效連接于TR元件的0RF在細(xì)胞應(yīng)激和死亡期間選擇性、帽子非依賴性地 翻譯。反義雙順反子載體作為TR活性的對(duì)照，提供大段的上游mRNA序列，其在結(jié)構(gòu)上阻斷 TR調(diào)控的0RF在正常細(xì)胞中的帽子依賴性翻譯。在應(yīng)激和垂死細(xì)胞中，來自反義載體的蛋 白質(zhì)合成是TR調(diào)控的帽子非依賴性翻譯。例如，pfLuc-TRplp-EYFP載體編碼單個(gè)mRNA物質(zhì)，其組成型地呈現(xiàn)出fLuc 0RF的帽子依賴性翻譯，和在細(xì)胞應(yīng)激和死亡期間EYFP 0RF自pip TR元件的選擇性帽子非依賴 性翻譯。與此類似，單個(gè)mRNA物質(zhì)由pfLuc-TI^-EYFP盒轉(zhuǎn)錄，其提供fLUC 0RF的帽子依 賴性翻譯，和在細(xì)胞應(yīng)激和死亡期間EYFP 0RF自dm20TR元件的帽子非依賴性翻譯(圖4)。實(shí)施例III-構(gòu)建和產(chǎn)生用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)TR盒的重組病毒載體設(shè)計(jì)重組腺病毒相關(guān)病毒(rAAV)和桿狀病毒(rBAC)載體，以產(chǎn)生能夠以TR表達(dá) 盒轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的感染性病毒粒體。為舉例說明，制備了一系列指導(dǎo)TR表達(dá)盒在哺乳 動(dòng)物細(xì)胞中由CMV-IE啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組成型表達(dá)的rAAV和rBAC病毒。A.向重組AAV (rAAV)病毒粒體中插入TR盒 PAAV-TRplp 和 pAAV_TRdm 轉(zhuǎn)移(或穿梭)載體衍生自 pAAV-MCS 載體(Stratagene)。 為允許細(xì)菌繁殖，pAAV-MCS骨架提供了(1)細(xì)菌內(nèi)酰胺酶基因，(2)pUC19復(fù)制起點(diǎn)，和 ⑶進(jìn)行單鏈DNA合成的H復(fù)制起點(diǎn)。為進(jìn)行AAV病毒生產(chǎn)和哺乳動(dòng)物基因表達(dá)，pAAV-MCS 質(zhì)粒含有側(cè)接CMV IE啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的左側(cè)和右側(cè)腺伴隨病毒-2 (AAV2)反向末端重復(fù) (ITR)、CMV IE轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、珠蛋白內(nèi)含子、用于克隆的多個(gè)獨(dú)特的限制性位點(diǎn)(多克 隆位點(diǎn)或MCS)和人生長(zhǎng)激素多聚腺苷酸化信號(hào)(圖5)。通過用EcoRI/XhoI消化適當(dāng)?shù)腡R-0RF表達(dá)質(zhì)粒并克隆到pAAV-MCS載體的 EcoRI/XhoI 位點(diǎn)來產(chǎn)生 TR-0RF 盒。例如，PTRplp-fLUC 和 pTRdm-fLUC 質(zhì)?？捎?EcoRI/XhoI 消化，并克隆到pAAV-MCS載體的EcoRI/XhoI位點(diǎn)，以創(chuàng)建下文所列的pAAV_TR_LUC穿梭載 體。在限制性圖譜分析和/或DNA測(cè)序后，可產(chǎn)生如下pAAV-TR-0RF穿梭載體的實(shí)例pAAV-TRplp-EYFP,其含有 pip TR 序列和 EYFP 0RF ；pAAV-TR^-EYFP,其含有 dm20TR 元件和 EYFP 0RF ；PAAV-TRplp-fLuc，其含有pip TR元件和螢火蟲熒光素酶0RF ；pAAV-TI^-fLuc，其含有 dm20TR 序列和 fLUC 0RF ；pAAV-TRplp-TK,其含有 pip TR 元件和 HSV-1TK 0RF ；pAAV-TR^-TK,其含有 dm20TR 元件和 HSV-1TK 0RF ；PAAV-TRplp-TKsr39，其含有 pip TR 序列和 HSV-1TK 0RF 的 sr39 衍生物；pAAV-TRm-TKsrfg，其含有 dm20TR 元件和 HSV-1TK 0RF 的 sr39 衍生物；pAAV-TRplp_CAT，其含有pip TR元件和細(xì)菌氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT) 0RF ；pAAV-TR^-CAT,其含有 dm20TR 序列和 CAT 0RF ；PAAV-TRplp-LacZ,其含有 pip TR 序列和細(xì)菌 LacZ 0RF ；禾口pAAV-TR^-LacZ,其含有 dm20TR 元件和 LacZ 0RF.為回收重組AAV2病毒顆粒，利用需要pAAV穿梭載體、pAAV-RC(具有復(fù)制能力的 輔助質(zhì)粒)和pHelper (腺病毒輔助質(zhì)粒)的三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。rAAV三 質(zhì)粒方法在本領(lǐng)域公知，并在下文簡(jiǎn)要說明。pAAV穿梭載體與7. 3kb的pAAV-RC載體和 11. 6kb的pHelper載體一起共轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞系中。pAAV-RC載體編碼感染性病毒粒體所 需的r印(DNA復(fù)制蛋白)和cap (AAV2衣殼蛋白)基因。pHelper載體含有缺失的腺病毒基 因組，其表達(dá)AAV生產(chǎn)所需的多種腺病毒基因。由三種質(zhì)粒表達(dá)的蛋白質(zhì)與腺病毒E1A和 E1B蛋白(由HEK293細(xì)胞提供)之間的遺傳互補(bǔ)允許在pAAV穿梭載體中左側(cè)和右側(cè)反向 末端重復(fù)(L-ITR和R-ITR)處的重組之后生成包裝的病毒粒體。
對(duì)于該實(shí)施例，利用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣轉(zhuǎn)染方案用15iig pAAV-TR-ORF穿梭載體或 15 u gpAAV-PLP/DM20eyfp 質(zhì)粒、10 u g pAAV-RC 質(zhì)粒和 10 u gpHelper 載體轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì) 胞。轉(zhuǎn)染后，HEK293細(xì)胞孵育總計(jì)72小時(shí)。此時(shí)收集細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，并利用三次凍融 循環(huán)產(chǎn)生裂解物。通過2500rpm離心10分鐘制備澄清的裂解物。能夠以這種方式生成的rAAV-TR-ORF病毒的具體實(shí)例包括rAAV-TRplp-EYFP，其含有有效連接于 EYFP 0RF 的 pip TR 元件；rAAV-TR^-EYFP,其含有連接于 EYFP 0RF 的 dm20TR 序列；rAAV-TRplp-fLuc，其包括pip TR元件和螢火蟲熒光素酶0RF ；rAAV-TR^-fLuc，其含有 dm20TR 序列和 fLUC 0RF ；rAAV-TRplp-TK,其含有 pip TR 元件和 HSV-1TK 0RF ；rAAV-TR^-TK,其含有 dm20TR 元件和 HSV-1TK 0RF ；rAAV-TRplp-TKsr39，其含有 pip TR 序列和 HSV-1TK 0RF 的 sr39 衍生物；rAAV-TRm-TKsrfg，其含有 dm20TR 元件和 HSV-1TK 0RF 的 sr39 衍生物；rAAV-TRplp-CAT,其含有 pip TR 元件和 CAT 0RF ；rAAV-TR^-CAT,其含有 dm20TR 序列和 CAT 0RF ；rAAV-TRplp-LacZ,其含有 pip TR 序列和細(xì)菌 LacZ ORF ；禾口rAAV-TR^-LacZ,其含有 dm20TR 元件和 LacZ ORF.B.制備轉(zhuǎn)導(dǎo)TR表達(dá)盒的重組桿狀病毒(rBAC)病毒粒體利用pBAC-1穿梭轉(zhuǎn)移骨架(Novagen)制備一組哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。商業(yè)pBAC -l 載體是設(shè)計(jì)用來通過polh啟動(dòng)子在昆蟲細(xì)胞中克隆和表達(dá)重組蛋白質(zhì)的桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì) 粒。該商業(yè)pBAC-1質(zhì)粒含有(1)細(xì)菌0 -內(nèi)酰胺酶基因，以及(2)pUC19復(fù)制起點(diǎn)和(3)fl 復(fù)制起點(diǎn)(圖5)。該載體還含有polh啟動(dòng)子和一系列常用來克隆0RF以在昆蟲細(xì)胞中表 達(dá)的獨(dú)特的限制性位點(diǎn)。側(cè)接昆蟲表達(dá)元件的是DNA重組所需的桿狀病毒序列，即晚期表 達(dá)因子2(lef-2)和可讀框1629 (orf 1629)基因。以pBAC穿梭載體和復(fù)制缺陷型桿狀病毒 DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，允許lef-2/orfl629穿梭載體序列與病毒DNA中同源序列之間的重組， 并生成具有復(fù)制能力的重組病毒。為提供哺乳動(dòng)物表達(dá)，通過連接以Bglll和BamHI消化的pBAC_l載體，除去了病 毒polh啟動(dòng)子和polh轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，從而產(chǎn)生了 pBAC polh-質(zhì)粒。對(duì)于該實(shí)施例，CMV IE啟動(dòng)子/增強(qiáng)子利用向PCR片段中引入5’StuI位點(diǎn)和3’EcoRI位點(diǎn)的寡核苷酸引物集 合[CMV-1(SEQ ID NO 35)和 CMV-2 (SEQ ID NO 36)]進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增的 DNA 用 StuI 和EcoRI切割，并定向克隆到pBAC polh-載體的StuI/EcoRI位點(diǎn)中，得到pBAC_CMV質(zhì)粒。 為引入mRNA多聚腺苷酸化信號(hào)，使兩種含有側(cè)接Avrll和SphI限制性位點(diǎn)的SV40早期多 聚腺苷酸化信號(hào)的互補(bǔ)寡核苷酸[PolyA-l(SEQ ID NO :37)和PolyA-2 (SEQ ID N0:38)]退 火，并克隆到pBAC-CMV載體的Avrll/SphI位點(diǎn)，以創(chuàng)建pBAC-CMV-PolyA質(zhì)粒。用EcoRI/NotI 從 PTRplp_EYFP 和 pTRdm_EYFP 質(zhì)粒中移出 TR-0RF 盒，并克隆到 pBAC-CMV-PolyA載體的EcoRI/NotI位點(diǎn)，以創(chuàng)建下文所列的pBAC穿梭載體。在相關(guān)的方 法中，下文所列的其他pBAC穿梭載體通過用EcoRI/XhoI消化適當(dāng)?shù)腡R-0RF表達(dá)質(zhì)粒并克 隆到pBAC-CMV-PolyA載體的EcoRI/Xhol位點(diǎn)中而產(chǎn)生。在限制性圖譜分析和/或DNA測(cè)序后，產(chǎn)生了如下pBAC-TR-0RF穿梭載體的具體
59實(shí)例pBAC-TRplp-EYFP,其含有 pip TR 序列和 EYFP 0RF ；pBAC-TR^-EYFP,其包括 dm20TR 元件和 EYFP 0RF ；PBAC-TRplp-fLuc，其包括pip TR元件和螢火蟲熒光素酶0RF ；pBAC-TI^-fLuc，其含有 dm20TR 序列和 fLUC 0RF ；pBAC-TRplp-TK,其含有 pip TR 元件和 HSV-1TK 0RF ；
pBAC-TR^-TK,其含有 dm20TR 元件和 HSV-1TK 0RF ；PBAC-TRplp-TKsr39，其含有 pip TR 序列和 HSV-1TK 0RF 的 sr39 衍生物；pBAC-TRm-TKsrfg，其含有 dm20TR 元件和 HSV-1TK 0RF 的 sr39 衍生物；PBAC-TRplp-CAT,其含有pip TR元件和細(xì)菌氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT) 0RF ；pBAC-TR^-CAT,其含有 dm20TR 序列和 CAT 0RF ；PBAC-TRplp-LacZ,其包括 pip TR 序列和細(xì)菌 LacZ 0RF ；禾口pBAC-TR^-LacZ,其包括 dm20TR 元件和 LacZ 0RF.產(chǎn)生感染性rBAC病毒粒體的方法在本領(lǐng)域公知。簡(jiǎn)言之，過程可如下文所概述的 那樣予以說明。重組桿狀病毒顆粒的回收通過用pBAC-TR穿梭載體和BacVector-2000 (或 BacVector-3000)三重切割病毒 DNA (Novagen)轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda) (Sf9)細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。遺傳重組導(dǎo)致CMV-TR盒插入到桿狀病毒基因組中，并包裝到BAC病毒 粒體中。在該實(shí)施例中，將500ng穿梭載體與lOOng BacVector三重切割病毒DNA混合，并 利用昆蟲Genejuice轉(zhuǎn)染試劑(Novagen)轉(zhuǎn)染500，000Sf-9細(xì)胞1小時(shí)。細(xì)胞在無血清 BacVector昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中洗滌，并覆上完全培養(yǎng)基(含5%胎牛血清)4_5天。此時(shí)收集 培養(yǎng)基覆蓋物(overlay)中的細(xì)胞，并通過2000rpm離心10分鐘沉淀。將這種原代病毒培 養(yǎng)基原液轉(zhuǎn)移到無菌管中，并于4°C貯存。利用上文所述的培養(yǎng)基覆蓋物方法通過Sf-9細(xì) 胞低滴度感染(感染性0. lpfu/細(xì)胞)來制備高滴度rBAC病毒原液(稱為二代或三代原 液)。rBAC滴度通過標(biāo)準(zhǔn)蝕斑覆蓋物(plaque overlay)技術(shù)來確定。利用rBAC病毒DNA 制備物的限制性圖譜分析來驗(yàn)證病毒的完整性和組成。能夠以這種方式生成的rBAC-TR-0RF病毒的具體實(shí)例包括rBAC-TRplp-EYFP,其包括有效連接于 EYFP 0RF 的 pip TR 元件；
rBAC-TR^-EYFP,其包括連接于 EYFP 0RF 的 dm20TR 序列；rBAC-TRplp_fLuc，其包括pip TR元件和螢火蟲熒光素酶0RF ；rBAC-TR^-fLuc，其含有 dm20TR 序列和 fLUC 0RF ；rBAC-TRplp-TK,其含有 pip TR 元件和 HSV-1TK 0RF ；rBAC-TR^-TK,其含有 dm20TR 元件和 HSV-1TK 0RF ；rBAC-TRplp-TKsr39，其含有 pip TR 序列和 HSV-1TK 0RF 的 sr39 衍生物；rBAC-TRm-TKsrfg，其含有 dm20TR 元件和 HSV-1TK 0RF 的 sr39 衍生物；rBAC-TRplp-CAT,其含有 pip TR 元件和 CAT 0RF ；rBAC-TR^-CAT,其含有 dm20TR 序列和 CAT 0RF ；rBAC-TRplp-LacZ,其包括 pip TR 序列和細(xì)菌 LacZ 0RF ；
和 rBAC-TRdm-LacZ，其包括 dm20TR 元件和 LacZ 0RF。
實(shí)施例IV-制備穩(wěn)定表達(dá)TR-0RF盒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞
A.細(xì)胞培養(yǎng)所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞于37°C、5% C02維持在完全培養(yǎng)基中，其為Dulbecco改良 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM) (Invitrogen Life Technologies)，補(bǔ)充有 10%胎牛血清(Hyclone)、 3. 7g/L 碳酸氫鈉和 30-50mg/L 硫酸慶大霉素(Invitrogen Life Tech nologies)。B.轉(zhuǎn)染并分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法(利用試劑如Prefeetion 哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染系 統(tǒng)，Promega)或非脂質(zhì)Transfectol轉(zhuǎn)染試劑(Continental LabProducts)如賣主所述進(jìn) 行。在該實(shí)施例中，用多種單順反子pTR-ORF載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，這包括PTRplp_EYFP、 pTR^-EYFP、pTRplp-fLuc、pTR^-fLuc、pTRplp_TK、pTRdm_TK、pTRplp_CAT、pTRdm_CAT、pTRplp_LacZ 和pTRdm-LacZ載體。在相關(guān)的嘗試中，將雙順反子載體pfLuC-TRplp-EYFP、pfLuC-TRdm-EYFP、 pcuLf-TRplp-EYFP 和 pcuLf-TRm-EYFP 引入到 HEK293 細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染之前，哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)至50-70%匯合，并在添加DNA/轉(zhuǎn)染試劑混合物 之前1-3小時(shí)補(bǔ)料。標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)含15iig質(zhì)粒DNA。各DNA/轉(zhuǎn)染試劑混合物與細(xì)胞一 起孵育過夜。此時(shí)替換培養(yǎng)基，再孵育24小時(shí)，并在轉(zhuǎn)染后大約48小時(shí)應(yīng)用G418選擇性 DMEM培養(yǎng)基(500 u g/mL)。每?jī)商旄鼡Q選擇培養(yǎng)基，為期2_3周，期間大部分細(xì)胞剝落，而 G418抗性“原代”集落出現(xiàn)。視集落的數(shù)目和密度而定，在庫(kù)分離或集落亞克隆之前使存活細(xì)胞在無G418培 養(yǎng)基中生長(zhǎng)3-5天。一旦集落達(dá)到適當(dāng)大小，通過相差或熒光顯微鏡檢研究各板，并標(biāo)出 集落進(jìn)行亞克隆。將火焰消毒的克隆環(huán)置于具有薄涂層脂肪的集落周圍，并通過胰蛋白 酶-EDTA(Invitrogen)處理取出細(xì)胞。傳代至24孔板之后，在鋪板后24-48小時(shí)對(duì)亞克隆 補(bǔ)料，并生長(zhǎng)至80%匯合?？蛇x地，選擇板上的所有“原代”集落收集在一起于一份樣品，轉(zhuǎn) 移到100mm皿或T-75燒瓶中，鋪板后24小時(shí)補(bǔ)料，并生長(zhǎng)至80%匯合。收集的集落被稱為 穩(wěn)定細(xì)胞“庫(kù)”。在一些情形下，由合并的樣品制備穩(wěn)定集落。對(duì)于這種嘗試，在集落亞克隆之前稀 釋細(xì)胞并重新鋪板。細(xì)胞庫(kù)以1 2500至1 5000范圍的比例進(jìn)行稀釋，傳代至100mm 皿中，并使之生長(zhǎng)成為集落(約1周)。所得集落隨之如原始選擇板所述進(jìn)行加工。每種細(xì)胞分離物利用一種或多種實(shí)施例V-VIII中所述的細(xì)胞毒性測(cè)定法來測(cè) 定，以驗(yàn)證TR-0RF mRNA在應(yīng)激或垂死細(xì)胞中的表達(dá)和選擇性翻譯。候選細(xì)胞來源，不論是 亞克隆還是庫(kù)，冷凍貯存。對(duì)于冷凍，細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合，用胰蛋白酶-EDTA處理(室溫 1分鐘)，每100mm皿收集在2mL冷凍培養(yǎng)基(90%胎牛血清，10% DMS0)中，并轉(zhuǎn)移到冷凍 管(1ml細(xì)胞/管)中。冷凍管于慢速冷凍容器的-70/-80°C冷凍器中放置16-24小時(shí)，然 后浸入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期貯存。對(duì)于該實(shí)施例，從PTRplp-EYFP、pTRdm-EYFP、PTRplp-fLuc 和 pTRdm-fLuc 質(zhì)粒 轉(zhuǎn)染后分離的集落中制備穩(wěn)定的HEK293細(xì)胞系?？蛇x地，在用pTRplp-TK、pTRdm_TK、 pTRplp-CAT,pTR^-CAT,PTRplp-LacZ 和 pTRdm_LacZ 表達(dá)載體以及雙順反子 pfLuc_TRplp-EYFP、 pfLuc-TR^-EYFP, pcuLf-TRplp-EYFP 和 pcuLf-TRdm_EYFP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后分離 HEK293 庫(kù)。如下 文描述的細(xì)胞毒性測(cè)定之一所確定的那樣，每種細(xì)胞分離物組成型地表達(dá)獨(dú)特的單順反子 TR-0RF或自CMV IE啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的雙順反子0RF2_TR-0RFlmRNA，和在應(yīng)激或垂死細(xì)胞 中選擇性地翻譯有效連接于TR元件的0RF。
實(shí)施例V-利用Western印跡分析進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定的方法A.表達(dá)單順反子TR表達(dá)盒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的Western印跡分析對(duì)于該實(shí)施例，利用Western 印跡分析證實(shí)了 TRplp_EYFP、TRdm_EYFP、TRplp-fLUC或 TR^-fLUC表達(dá)盒在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的HEK293細(xì)胞中的表達(dá)和調(diào)控。細(xì)胞系或庫(kù)在6孔板或60mm 皿中生長(zhǎng)至約60%匯合，并用補(bǔ)充毒性化學(xué)品的完全培養(yǎng)基處理。對(duì)于該實(shí)施例，毒性劑為 蛋白酶體抑制劑MG132(50微摩)或鈣離子載體A23187(5-6. 7微摩)，如通過臺(tái)盼藍(lán)染色 所確定的那樣，顯示它們?cè)斐蒆EK293細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)徹底的細(xì)胞死亡。對(duì)照樣品用新鮮 培養(yǎng)基處理。處理和對(duì)照細(xì)胞通過移液管移取，收集在培養(yǎng)基中，800rpm沉淀5分鐘(室 溫)，并貯存在-70/-80°C或立即加工得到總蛋白質(zhì)。對(duì)于蛋白質(zhì)提取，將細(xì)胞重懸于等體積的懸浮緩沖液(lOOmM NaCl, 10mM Tris-HCl [pH 7. 6]，ImM EDTA, lmg/mL 抑酶肽，100 u g/mLPMSF)和 2 X SDS 緩沖液(lOOmM Tris-HCl[pH 6. 8]，4% SDS，20%甘油，200mM DTT)中。冷凍細(xì)胞在重懸之前在冰上解凍。 提取物幾次通過配有26G針的注射器而均質(zhì)化。樣品隨后于室溫孵育1-2小時(shí)。將樣品轉(zhuǎn) 移至-70/-80°C貯存或加到SDS PAGE凝膠上并通過Western印跡分析研究。為確保Western印跡上等同的蛋白質(zhì)上樣水平，最初通過SDS PAGE分離10 yL各 蛋白質(zhì)提取物，在Preblot凝膠固定劑(25%異丙醇，10%乙酸)中固定過夜，并在0. 05% 考馬斯藍(lán)(0. 05%亮藍(lán)R，50%甲醇，10%乙酸)中室溫染色20分鐘。凝膠在10%乙酸中脫 色，并真空干燥。在Western印跡之前利用干燥的凝膠對(duì)樣品進(jìn)行任何必要的體積調(diào)整。Western印跡分析是本領(lǐng)域充分確立的技術(shù)，并在下文概述。在SDSPAGE凝膠分離 和通過電泳使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜支持物上以后，膜干燥過夜。隨后的Western分析需要 膜再水合，用蛋白質(zhì)溶液(5%奶粉或3%BSA)洗滌，以封閉濾膜上偶見的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)， 與識(shí)別TR調(diào)控的0RF的抗體一起孵育，并利用標(biāo)記的二抗進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。對(duì)于EYFP 蛋白而言，一抗是抗GFP抗體(Molecular Probes ； 1 500至1 1500稀釋)。與此類似， fLUC蛋白利用抗fLUC抗體(Sigma;l 1000稀釋)檢測(cè)。在與一抗一起孵育和大規(guī)模洗 滌(1XPBS-T)之后，通過與辣根過氧化物酶(HRP)綴合的抗兔或抗小鼠抗體(Amersham; 1 5000至1 10000稀釋)一起孵育來檢測(cè)結(jié)合一抗的蛋白質(zhì)。在與二抗一起孵育和大 規(guī)模洗滌之后，由ECL試劑系統(tǒng)(Amersham)如賣主所述檢測(cè)反應(yīng)蛋白質(zhì)。對(duì)于該實(shí)施例，表達(dá)TRplp-fLUC、TR^-fLUC或fLUC mRNA的HEK293細(xì)胞系的結(jié)果 示于圖6。在用毒性水平的鈣離子載體A23187處理后，在應(yīng)激和垂死細(xì)胞中觀察到fLuc 蛋白水平非常顯著地增加，而未處理培養(yǎng)物中不明顯。個(gè)體蛋白質(zhì)帶在Beckman DU7400 分光光度計(jì)上通過光密度測(cè)定法定量。用鈣離子載體A23187處理的細(xì)胞庫(kù)和細(xì)胞系呈現(xiàn) 出fLUC蛋白質(zhì)水平增加，范圍為未處理TR^-fLUC/TI^-fLUC細(xì)胞中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)水平 的160-800%。在應(yīng)激和垂死HEK293TRplp-fLuc表達(dá)細(xì)胞中觀察到fLuc蛋白水平的平均 增加是402. 8% (n = 5)，這類似于在鈣離子載體處理的HEK293TRdm-fLuc細(xì)胞中觀察到的 524. 3% (n = 6)增加。而且，在應(yīng)激和垂死細(xì)胞中，表達(dá)TR-fLUC盒的細(xì)胞所呈現(xiàn)出的fLUC 蛋白水平高至表達(dá)帽子依賴性CMV-fLuc序列的細(xì)胞所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水平的110% (圖6)。B.應(yīng)用穩(wěn)定表達(dá)雙順反子TR盒的細(xì)胞進(jìn)行的細(xì)胞毒性測(cè)定在該實(shí)施例中，表達(dá)fLUC-TRplp-EYFP、fLUC-TRdm_EYFP、pcuLf-TRplp-EYFP 或 pcuLf-TR^-EYFP表達(dá)盒的HEK293細(xì)胞庫(kù)如上所述以鈣離子載體A23187和MG132處理。簡(jiǎn)言之，如上所述利用Western印跡細(xì)胞毒性方法測(cè)定了兩種報(bào)告蛋白的翻譯。有義載體中 上游報(bào)告蛋白(fLUC)的翻譯反映了帽子依賴性翻譯，而下游報(bào)告蛋白(EYFP)的水平與帽 子非依賴性(即TR調(diào)控的)翻譯相關(guān)。雖然帽子依賴性翻譯可能在反義構(gòu)建體中測(cè)量不 到，但是帽子非依賴性翻譯能夠由有效連接于TR元件的0RF檢測(cè)到。這些測(cè)定中使用的一 抗和二抗以及測(cè)定方法同上。在誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激和死亡之后，在所有表達(dá)TR表達(dá)盒的細(xì)胞庫(kù)中檢測(cè)到通過EYFP 蛋白水平增加所測(cè)量的TR介導(dǎo)的翻譯。EYFP蛋白水平增至未處理細(xì)胞水平的130-750%。 雖然抗EYFP和抗fLuc抗體可能無法應(yīng)用于單個(gè)印跡，但是來自單順反子TR盒的帽子非依 賴性翻譯比雙順反子取向的更為有效(圖4)。同樣明顯的是，帽子非依賴性TR介導(dǎo)的翻譯 不因在TR表達(dá)盒上游插入反義fLuc 0RF而受抑制。實(shí)施例VI-利用熒光顯微鏡檢的細(xì)胞毒性測(cè)定方法可通過若干方法來檢測(cè)和定量單細(xì)胞、組織或細(xì)胞懸液的熒光，例如在顯微鏡下 視覺檢查、自動(dòng)化或半自動(dòng)化熒光成像、流式細(xì)胞儀分析、在熒光計(jì)或微板讀數(shù)器中利用適 當(dāng)?shù)臑V波器裝置進(jìn)行熒光光譜分析。對(duì)于該實(shí)施例，利用在顯微鏡(Nikon TE2000-S)下 的視覺檢查來驗(yàn)證表達(dá)TRplp-EYFP、TRdm-EYFP、TRplp-fLUC和TRdm-fLUC mRNA的應(yīng)激和垂死 HEK293細(xì)胞中的TR翻譯調(diào)控。A.直接觀察細(xì)胞毒性事件期間TR介導(dǎo)的EYFP翻譯在本研究中，用CMV-EYFP、TRplp_EYFP或TRdm_EYFP表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的HEK293細(xì)胞在 自發(fā)熒光EYFP蛋白翻譯后直接予以觀察。在毒素添加前一天，將200，000細(xì)胞(HEK293、 HEK293CMV-EYFP、HEK293TRplp-EYFP 或 HEK293TRdm_EYFP)鋪板至含火焰消毒玻璃載玻片的 6 孔板中。細(xì)胞在完全DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。應(yīng)用補(bǔ)充5i!m鈣離子載體A23187的新 鮮培養(yǎng)基，并于Ohr、2hr、4hr、6hr、9hr、1 Ohr、1 lhr和25hr收集載玻片。載玻片于4%多聚 甲醛中固定10分鐘，以1XPBS大規(guī)模洗滌，并封固進(jìn)行熒光顯微鏡檢。利用EYFP選擇性濾波器裝置(filter set) (Nikon)于6hr和10hr時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行熒 光細(xì)胞計(jì)數(shù)，并示于圖7。在未處理細(xì)胞培養(yǎng)物中，EYFP陽(yáng)性細(xì)胞頻率范圍在1. 5-2. 5%, 與這些培養(yǎng)物中通過臺(tái)盼藍(lán)染色所確定的非存活細(xì)胞頻率一致。在毒素處理之后，來自 TR-EYFP盒的EYFP翻譯，定義為至少5個(gè)含有總計(jì)不少于500個(gè)細(xì)胞的隨機(jī)切片中的 熒光細(xì)胞數(shù)，作為時(shí)間的函數(shù)增加。相反，未在HEK293或HEK CMV-EYFP細(xì)胞中檢測(cè)到 熒光細(xì)胞數(shù)的顯著變化。TRplp-EYFP表達(dá)細(xì)胞中熒光細(xì)胞頻率升至未處理對(duì)照培養(yǎng)物的 1000-2300%。在TRdm-EYFP表達(dá)細(xì)胞中觀察到類似的增加，其細(xì)胞數(shù)升至對(duì)照培養(yǎng)物的 600-1465% (圖 7)。B.直接觀察細(xì)胞毒性事件期間TR介導(dǎo)的fLUC翻譯為研究來自TR-fLUC盒的TR介導(dǎo)的翻譯，翻譯的fLUC蛋白需要用熒光抗體進(jìn)行 免疫標(biāo)記。在本研究中，用CMV-fLUC、TRplp-fLUC或TR-fLUC表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的HEK293細(xì)胞在 應(yīng)用一抗抗fLUC抗體(Sigma)和物種特異性的羅丹明標(biāo)記的二抗(Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.)免疫檢測(cè)fLUC蛋白之后予以觀察。核DNA的DAPI標(biāo)記是本領(lǐng)域公 知的方法，故而用來標(biāo)記細(xì)胞核。在毒素接觸前40 小時(shí)，將 300,000 細(xì)胞(HEK293、HEK293CMV_fLUC、 HEK293TRplp-fLUC 亞克隆 #3、HEK293TRplp-fLUC 亞克隆 #17、HEK293TRdm-fLUC 亞克隆 #12 或
63HEK293TRdm-fLUC亞克隆#45)鋪板在12孔板中的火焰消毒玻璃蓋片上。細(xì)胞在完全DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。應(yīng)用補(bǔ)充6. 7iim鈣離子載體A23187的新鮮培養(yǎng)基，并于12小時(shí)收集載玻 片。蓋片于4%多聚甲醛中固定(室溫10分鐘)，以1 XPBS大規(guī)模洗滌，于100%甲醇中 透化(室溫2分鐘)，以1XPBS洗滌，于3%BSA中封閉(室溫5分鐘)，并與一抗抗fLUC 抗體(Sigma;l 500稀釋)室溫孵育1小時(shí)。在一抗染色后，蓋片以1 XPBS大規(guī)模洗滌， 并與羅丹明標(biāo)記的抗兔二抗(Kirkegaard and PerryLaboratories ； 1 100 至 1 200 稀 釋)室溫孵育1小時(shí)。此后，蓋片于1 XPBS中洗滌，以DAPI標(biāo)記(室溫30秒)，于1 XPBS 中洗滌，并封固進(jìn)行熒光顯微鏡檢。利用羅丹明選擇性和DAPI濾波器裝置(Nikon)進(jìn)行熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)，并示于圖8。 在未處理細(xì)胞培養(yǎng)物中，fLUC陽(yáng)性細(xì)胞頻率范圍在2. 4-7. 2%,比通過臺(tái)盼藍(lán)染色所確定 的非存活細(xì)胞的正常頻率高1-3倍。隨后經(jīng)視覺檢查DAPI染色的細(xì)胞核確立，抗fLUC抗體 與分裂末期的細(xì)胞選擇性地交叉反應(yīng)，這導(dǎo)致對(duì)未處理培養(yǎng)物中細(xì)胞應(yīng)激的估算提高。在 毒素處理后，與未處理樣品中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相比，HEK293TRplp-fLUC亞克隆#3和#17細(xì)胞系 中的fLUC陽(yáng)性細(xì)胞頻率分別增加了 1150%和2245%。與此類似，HEK293TRdm-fLUC亞克隆 #12和#45細(xì)胞系中的fLUC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別增加了 3640%和1440%。實(shí)施例VII-利用微板讀數(shù)器的細(xì)胞毒性測(cè)定方法設(shè)計(jì)微板讀數(shù)器以利用高密度樣品陣列上的吸光度、熒光和發(fā)光來掃描、分析和 獲得數(shù)值結(jié)果。在該實(shí)施例中，利用微板讀數(shù)器測(cè)量由TR-0RF盒翻譯的熒光和發(fā)光標(biāo)記蛋 白。A.微板讀數(shù)器測(cè)定方法對(duì)于該實(shí)施例，利用微板讀數(shù)器評(píng)價(jià)表達(dá)TRplp_EYFP、TRdm_EYFP、TRplp-fLUC和 TR^-fLUC表達(dá)盒的HEK293細(xì)胞。為定量TR翻譯反應(yīng)，將24，000細(xì)胞鋪板在96孔微量滴 定板中，使之生長(zhǎng)約40小時(shí)，以在與毒性劑孵育之前達(dá)到合適的細(xì)胞密度。各孔用不含毒 素或含明確濃度毒素的完全DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并在37°C孵育特定的時(shí)間段。在那時(shí)，利用 FLU0star0ptima(BMG Labtech)微板讀數(shù)器上的熒光或化學(xué)發(fā)光來測(cè)量TR-0RF反應(yīng)。直接檢測(cè)自發(fā)熒光EYFP蛋白的熒光團(tuán)通過用熒光素濾波器(545nm)或YFP濾波 器(YFPex)激發(fā)處于黑色光學(xué)底96孔板中的樣品，并利用1000-2000的增益測(cè)量590nm或 544nm的發(fā)射來實(shí)現(xiàn)。為減小與培養(yǎng)基組分相關(guān)的背景熒光，板在1200rpm室溫離心3分 鐘，以收集任何漂浮細(xì)胞，并在檢測(cè)之前將培養(yǎng)基替換為200 u 11 XPBS。對(duì)于fLUC蛋白，通 過活細(xì)胞或裂解細(xì)胞熒光素酶測(cè)定期間產(chǎn)生的發(fā)光來定量蛋白活性。對(duì)于活細(xì)胞測(cè)定，細(xì) 胞如上但在白色光學(xué)底96孔板中培養(yǎng)。毒素孵育后，96孔板在1200rpm離心3分鐘以沉淀 剝落的細(xì)胞。通過注射20 yl溶于檸檬酸鈉/DMS0測(cè)定緩沖液中的D-螢光素溶液(50% lOOmM檸檬酸鈉，pH 5. 2,50% DMS0,6. 7mM ATP和3. 35mM D_螢光素)并孵育45秒允許細(xì) 胞透入而形成發(fā)光。利用透鏡濾波器以2000-3000的增益檢測(cè)發(fā)光。對(duì)于裂解細(xì)胞測(cè)定，細(xì)胞如上但在常規(guī)平底96孔板中培養(yǎng)。毒素孵育后，96孔板 如上離心。除去培養(yǎng)基，替換為50iU細(xì)胞裂解緩沖液(25mMTris-磷酸(pH 7. 8)、10%甘 油，TritonX-100，lmg/ml BSA, 2mM EGTA 和 2mM DTT)，并在室溫孵育 10 分鐘。細(xì)胞裂 解利用相差顯微鏡來驗(yàn)證，并將裂解物轉(zhuǎn)移到白底96孔板中。通過注射5iU溶于反應(yīng)緩 沖液中的D-螢光素溶液(25mM甘氨酰甘氨酸(pH 7. 8)、15mM MgS04,4mM EDTA，15mM磷酸鉀，ImM DTT，lmM輔酶A，6. 7mM ATP和3. 35mM D_螢光素)形成發(fā)光。振蕩4秒后，利用透 鏡濾波器以2000-3000的增益測(cè)量發(fā)光值。B.以固定的時(shí)間和毒素濃度測(cè)量細(xì)胞毒性事件利用基于固定的時(shí)間和毒性劑濃度的測(cè)定來鑒定呈現(xiàn)出TR介導(dǎo)的翻譯的細(xì)胞 集落 / 庫(kù)。在該實(shí)施例中，用 CMV-EYFP、TRplp-EYFP、TRdm_EYFP、CMV-fLUC、TRplp-fLUC 或 TR^-fLUC表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的HEK293集落在用補(bǔ)充有6. 7 y m鈣離子載體A23187 (由臺(tái)盼藍(lán)染 色定義的毒性濃度)的DMEM培養(yǎng)基孵育12小時(shí)后進(jìn)行TR特異性翻譯反應(yīng)篩選。集落最 初在60-100mm皿中增殖至70-80%匯合，轉(zhuǎn)移到96孔板中，并利用細(xì)胞毒性培養(yǎng)基如上文 所述測(cè)定。顯示了獨(dú)立組的HEK293TRplp-EYFP集落(圖9)以及選擇的HEK293TRplp-fLUC 和TL-fLUC集落(圖9，活細(xì)胞測(cè)定)的特征性結(jié)果。作為該篩選測(cè)定的實(shí)例， HEK293TRplp-EYFP亞克隆#41和HEK293TRplp-fLUC亞克隆#3展示出顯著的TR反應(yīng)，故而選 擇進(jìn)行隨后的Western印跡和顯微鏡檢驗(yàn)證。C.作為毒素濃度的函數(shù)測(cè)量細(xì)胞毒性事件(劑量反應(yīng))劑量反應(yīng)測(cè)定是定義候選細(xì)胞毒性劑的毒性濃度所必需的。為確立TR介導(dǎo)的細(xì) 胞反應(yīng)和鑒定TR有效劑量，使TRplp-fLUC (亞克隆#3)和TI^-fLUC (亞克隆#45)表達(dá)盒轉(zhuǎn) 化的HEK293細(xì)胞接觸一系列亞毒性至毒性濃度的鈣離子載體A23187 (0、InM、10nM、lOOnM、 1 ii M、2 ii M、4 ii M、6 u M、8 u MUO u M) 12小時(shí)，并如上文所述利用裂解細(xì)胞熒光素酶測(cè)定進(jìn) 行分析(圖10)。在12hr的時(shí)間點(diǎn)，利用原始熒光素酶數(shù)(圖10，圖A和B)，最初在1 y M時(shí)檢測(cè)到 各盒TR介導(dǎo)的翻譯，其中fLUC峰值處于6 y M。更低的亞毒性劑量不產(chǎn)生明顯的TR特異性 翻譯活性，而8-10 yM毒素濃度呈現(xiàn)出fLuc活性下降。然而，將帽子依賴性與帽子非依賴 性熒光素酶值進(jìn)行關(guān)聯(lián)時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果。針對(duì)Ohr時(shí)間點(diǎn)的均值(表達(dá)為100% )調(diào) 整各熒光素酶值的均值，產(chǎn)生了類似于原始數(shù)據(jù)結(jié)果的劑量反應(yīng)曲線(圖10，圖C)。相反， 針對(duì)HEK293CMV-fLUC對(duì)照細(xì)胞所呈現(xiàn)出的帽子依賴性核糖體活性顯著下降來調(diào)整TR表達(dá) 盒所生成的帽子非依賴性fLuc值，導(dǎo)致顯著更高的表觀翻譯率和即使在測(cè)試的最高毒素 劑量時(shí)帽子非依賴性翻譯不太顯著的下降。D.作為時(shí)間的函數(shù)測(cè)量細(xì)胞毒性事件(時(shí)間反應(yīng))利用時(shí)間反應(yīng)測(cè)定來定義在毒性水平細(xì)胞毒性劑孵育期間TR調(diào)控的翻譯的時(shí) 機(jī)選擇。HEK293TRplp-fLUC 亞克隆 #3 和 HEK293TRdm-fLUC 亞克隆 #45 在 6. 7 ii m 鈣離子 載體 A23187 中培養(yǎng)不同的時(shí)間(0hr、l. 5hr、3hr、4. 5hr、6hr、7. 5hr、9hr、10. 5hr、12hr 和 13. 5hr)，并如上文所述利用裂解細(xì)胞熒光素酶測(cè)定進(jìn)行分析(圖11)。到孵育后1. 5小時(shí)，利用原始熒光素酶數(shù)，在各種TR轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中能夠檢測(cè)到 顯著的TR特異性翻譯(圖11，圖A和B)。1. 5小時(shí)之后，翻譯活性線性增加，直至孵育后9 小時(shí)，此時(shí)翻譯呈現(xiàn)出明顯的平臺(tái)或稍有降低的活性。然而，同前面一樣，將帽子依賴性與 帽子非依賴性翻譯進(jìn)行關(guān)聯(lián)時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同的圖形。針對(duì)Ohr時(shí)間點(diǎn)的均值(表達(dá)為100%) 調(diào)整各熒光素酶值的均值，產(chǎn)生了類似于原始數(shù)據(jù)結(jié)果的劑量反應(yīng)曲線(圖11，圖C)。相 反，針對(duì)在HEK293CMV-fLUC細(xì)胞中所觀察到的帽子依賴性翻譯顯著下降來調(diào)整TR表達(dá)盒 所生成的帽子非依賴性fLuc值，導(dǎo)致顯著更高的表觀翻譯活性和直至12小時(shí)的翻譯活性線性增加，之后是表觀翻譯下降。實(shí)施例VIII-利用重組病毒將TR表達(dá)盒轉(zhuǎn)導(dǎo)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中和在細(xì)胞毒性事 件期間測(cè)定TR介導(dǎo)的翻譯的方法A.用rAAV-TR-ORF病毒粒體轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法該實(shí)施例欲顯示利用rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)將TRplp_EYFP和TRdm_EYFP盒遞送到HEK293和 HT1080細(xì)胞中。HEK293或HT1080細(xì)胞涂布在火焰消毒的玻璃載玻片上，生長(zhǎng)至60-70%匯 合(1-2天)，以L-DMEM(含2%胎牛血清的DMEM)洗滌，并用rAAV感染2小時(shí)。將培養(yǎng)基 替換為DMEM，10% FBS,并使細(xì)胞孵育24小時(shí)。在如上文所述進(jìn)行直接顯微鏡檢或Western 分析之前，感染的細(xì)胞用補(bǔ)充毒性水平MG132(25iiM)的DMEM，10% FBS處理24小時(shí)。與未 感染的對(duì)照細(xì)胞相比，用rAAV病毒粒體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞呈現(xiàn)出熒光EYFP蛋白的選擇性翻譯。B.利用rAAV基因遞送測(cè)定細(xì)胞毒性事件HT1080細(xì)胞鋪板在6孔板中，并使之生長(zhǎng)直至70-80 %匯合。這些細(xì)胞用 rAAV-TR^-EYFP病毒粒體(感染復(fù)數(shù)l_10pfu/細(xì)胞)轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時(shí)，然后用含有已知誘導(dǎo) 凋亡/細(xì)胞死亡的培養(yǎng)基處理。對(duì)于該實(shí)施例，向轉(zhuǎn)導(dǎo)的HT1080細(xì)胞中分開或混合添加 含有50iiM MG132、2iiM毒胡蘿卜內(nèi)酯、ly g/ml放線菌素D、20 y g/ml放線菌酮、ImM 二丁 基環(huán)狀-腺昔單憐酸酉旨(dibutrylcyclic-adenosine monophosphate) (dbcAMP) >200 u g/ ml G418、5iiM鈣離子載體A23187、10ii g/ml絲裂霉素D、5%甲醇或10%乙醇的DMEM，培養(yǎng) 24hr。此時(shí)加工未處理和處理的細(xì)胞，并通過Western印跡分析、直接顯微鏡檢分析或板讀 數(shù)器分析如上文所述進(jìn)行研究。預(yù)期TRdm-EYFP盒在于細(xì)胞毒性培養(yǎng)基中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)HT1080細(xì)胞中有翻譯活性。C.利用rBAC病毒粒體以TR-0RF盒轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞該實(shí)施例欲顯示利用rBAC轉(zhuǎn)導(dǎo)將TRplp_EYFP和TRdm_EYFP盒遞送到HEK293細(xì)胞 中。HEK293細(xì)胞涂布在火焰消毒的玻璃載玻片上，生長(zhǎng)至60-70%匯合(1_2天)，以無血清 DMEM洗滌，并用rBAC感染1_2小時(shí)。將培養(yǎng)基替換為DMEM，10% FBS,并使細(xì)胞孵育24小 時(shí)。在直接顯微鏡檢研究之前，感染的細(xì)胞用補(bǔ)充5iiM鈣離子載體A23187的DMEM，10% FBS處理24小時(shí)。與未感染的對(duì)照細(xì)胞相比，用rBAC病毒粒體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞呈現(xiàn)出熒光EYFP 蛋白的選擇性翻譯。D.利用rBAC基因遞送系統(tǒng)測(cè)定細(xì)胞毒性事件HT1080細(xì)胞鋪板在6孔板中，并使之生長(zhǎng)直至70-80%匯合。兩組HT1080細(xì)胞用 rBAC-TR^-EYFP病毒粒體(感染復(fù)數(shù)lOpfu/細(xì)胞和25pfu/細(xì)胞)轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時(shí)，然后用含 5iiM鈣離子載體A23187的培養(yǎng)基處理13. 5hr和23hr。此時(shí)加工未處理和處理的細(xì)胞，并 通過熒光顯微鏡檢分析如上文所述進(jìn)行研究。如圖12所示，TRdm-EYFP盒在于細(xì)胞毒性培養(yǎng)基中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)HT1080細(xì)胞中有翻 譯活性。與感染(10pfu/ml)但未處理的細(xì)胞樣品相比，在13. 5hr (lOpfu/細(xì)胞時(shí)3344%, 以及25pfu/細(xì)胞時(shí)4925 % )和23hr (lOpfu/細(xì)胞時(shí)725 %，以及25pfu/細(xì)胞時(shí)875 % )時(shí) 觀察到EYFP陽(yáng)性細(xì)胞的顯著增加?？偧?xì)胞計(jì)數(shù)顯示在23hr時(shí)細(xì)胞剝落增加造成陽(yáng)性細(xì)胞 總數(shù)表觀下降，因?yàn)?3hr時(shí)貼壁細(xì)胞數(shù)下降超過50%。實(shí)施例IX-利用從TR表達(dá)盒表達(dá)的前藥0RF誘導(dǎo)細(xì)胞毒性事件的方法由于正常細(xì)胞毒性事件(即，細(xì)胞接觸抑制、失巢凋亡等)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中一般含有1-10%的非存活細(xì)胞。如果這些細(xì)胞轉(zhuǎn)錄有效連接于TR盒的前藥0RF，則應(yīng)激 或垂死細(xì)胞會(huì)選擇性地翻譯前藥0RF，并使這些應(yīng)激細(xì)胞對(duì)正常并不影響親本細(xì)胞類型的 前藥敏感。A.通過改變毒素濃度和變量時(shí)間來誘導(dǎo)細(xì)胞毒性事件在該實(shí)施例中，HEK293、HEK CMV-EYFP和HEK TRplp_TKsr39細(xì)胞用不同量的前藥 更昔洛韋處理，并在孵育4天后利用臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定來檢驗(yàn)細(xì)胞死亡。細(xì)胞鋪板在6孔板 中，生長(zhǎng)至70-80%匯合，并用補(bǔ)充更昔洛韋(0、10碰、100碰、111] 、511]\1或1011]\0的DMEM， 10% FBS處理4天。在孵育后3天和4天進(jìn)行存活細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖13)。 HEK293或HEK CMV-EYFP細(xì)胞在任何濃度的更昔洛韋中培養(yǎng)3或4天后并不呈現(xiàn) 任何顯著增加的細(xì)胞死亡。在這些培養(yǎng)物中，98-100%的細(xì)胞在整個(gè)處理期中保持臺(tái)盼藍(lán) 存活。相反，如通過具有變形的細(xì)胞形態(tài)、濃縮的核和臺(tái)盼藍(lán)反應(yīng)性的剝落細(xì)胞所例示的那 樣，HEK293TRplp-TKsr39細(xì)胞在3天內(nèi)呈現(xiàn)出一些顯微鏡檢細(xì)胞死亡。此時(shí)在10 y M更昔 洛韋培養(yǎng)基中，細(xì)胞生存力從未處理培養(yǎng)物中的98. 5%降至低至86%的細(xì)胞生存力。3天 后，與未處理細(xì)胞相比，lOnM培養(yǎng)物不呈現(xiàn)任何細(xì)胞生存力的下降，不過在lOOnM樣品中檢 測(cè)到輕微下降。再過24小時(shí)后，顯微鏡檢分析確立，很大比例的用高于lOnM劑量更昔洛韋處理的 HEK293TRplp-TKsr39細(xì)胞培養(yǎng)物剝落并明顯死亡(圖13)。這通過臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞生存力測(cè)定得 到了證實(shí)，其檢測(cè)到在所有更昔洛韋劑量下的細(xì)胞生存力下降，從lOnM培養(yǎng)物中的99. 7% 細(xì)胞存活力到10y M更昔洛韋培養(yǎng)基中33. 7%的生存力。該實(shí)施例確立，應(yīng)激或垂死細(xì)胞 中TR盒的翻譯能夠用來選擇性地合成在前藥應(yīng)用后能增強(qiáng)細(xì)胞死亡的前藥蛋白。TKsr39 蛋白的應(yīng)用提供了依賴于選擇性翻譯起始的旁觀者殺傷的實(shí)例，并彰顯了選擇性翻譯在補(bǔ) 充基因療法中的用途。在詳細(xì)說明了本技術(shù)之后，不脫離所附權(quán)利要求書中界定的本技術(shù)范圍的改變和 變動(dòng)是可行的，這是顯而易見的。而且，應(yīng)當(dāng)理解，本公開中的所有實(shí)例雖然舉例說明了本 技術(shù)，但是作為非限制性實(shí)例提供的，因此不應(yīng)理解為限制如此舉例說明的本技術(shù)的各個(gè)方面。
6權(quán)利要求
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可表達(dá)的核酸表達(dá)盒，其中所述表達(dá)盒以5’至3’方向包含如下元件至少一種轉(zhuǎn)錄效應(yīng)序列，TR元件，其編碼在應(yīng)激和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA分子，有效連接于TR元件的核苷酸序列，其為第一可讀框(ORF)序列，編碼多肽或其片段，并與TR元件共翻譯，和多聚腺苷酸化序列。
2.權(quán)利要求1的表達(dá)盒，其中TR元件來自小鼠。
3.權(quán)利要求1的表達(dá)盒，其中TR元件選自SEQID NO 1和SEQ ID NO :2。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的表達(dá)盒，其中轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子選自組成型、誘導(dǎo)型、組織特異 性、腫瘤特異性和反應(yīng)基因啟動(dòng)子。
5.權(quán)利要求4的表達(dá)盒，其中組成型啟動(dòng)子選自逆轉(zhuǎn)錄病毒勞斯肉瘤病毒(RSV)長(zhǎng) 末端重復(fù)(LTR)啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒即時(shí)早期基因(CMV)啟動(dòng)子、猿猴病毒早期(SV40)啟 動(dòng)子、胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子和磷酸甘油激酶(PGK)啟動(dòng)子。
6.權(quán)利要求5的表達(dá)盒，其中組成型啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。
7.權(quán)利要求4的表達(dá)盒，其中誘導(dǎo)型啟動(dòng)子選自hMT-IIA啟動(dòng)子、Dex誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、 MMTV啟動(dòng)子、蛻皮素反應(yīng)昆蟲啟動(dòng)子、Tet-0n啟動(dòng)子、Tet-Off啟動(dòng)子、RU486誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子和雷帕霉素反應(yīng)啟動(dòng)子。
8.權(quán)利要求7的表達(dá)盒，其中誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是hMT-IIA啟動(dòng)子。
9.權(quán)利要求4的表達(dá)盒，其中組織特異性啟動(dòng)子選自TF啟動(dòng)子、TYR啟動(dòng)子、ALB啟 動(dòng)子、CKM啟動(dòng)子、MBP啟動(dòng)子、GFAP啟動(dòng)子、NSE啟動(dòng)子和SYN1啟動(dòng)子。
10.權(quán)利要求9的表達(dá)盒，其中組織特異性啟動(dòng)子是SYN1啟動(dòng)子。
11.權(quán)利要求4的表達(dá)盒，其中腫瘤特異性啟動(dòng)子選自VEGF、KDR、AFP、CEA、erbB2、 muc-l/DF3、ALA、BGLAP、SLPl、HRE、Grp78/BIP 和 HK2 的啟動(dòng)子。
12.權(quán)利要求11的表達(dá)盒，其中腫瘤特異性啟動(dòng)子是HK2啟動(dòng)子。
13.權(quán)利要求4的表達(dá)盒，其中反應(yīng)基因啟動(dòng)子選自EGRl、t-PA、mdr-l、hSp70、c-fOS、 c-jun、E2F-l、HSPA5、CCNAl 和 cdc25C 的啟動(dòng)子。
14.權(quán)利要求13的表達(dá)盒，其中反應(yīng)基因啟動(dòng)子是HSPA5啟動(dòng)子。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的表達(dá)盒，其中第一0RF序列選自報(bào)告基因、細(xì)胞毒性腫 瘤抑制子、毒素基因、前藥激活基因和凋亡前基因。
16.權(quán)利要求15的表達(dá)盒，其中第一0RF序列是報(bào)告基因。
17.權(quán)利要求16的表達(dá)盒，其中報(bào)告基因選自疋6 、6 3￥ 、熒光素酶、1^以、〔八!\ TK 和 TKsr390
18.權(quán)利要求17的表達(dá)盒，其中報(bào)告基因是熒光素酶。
19.權(quán)利要求15的表達(dá)盒，其中細(xì)胞毒性腫瘤抑制子選自p53、APC、BRCA-l、BRCA-2、 WT-1、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、NF-1、NF-2和VHL。
20.權(quán)利要求19的表達(dá)盒，其中細(xì)胞毒性腫瘤抑制子是p53。
21.權(quán)利要求15的表達(dá)盒，其中毒素基因選自假單胞菌外毒素、蓖麻毒蛋白毒素和白喉毒素。
22.權(quán)利要求21的表達(dá)盒，其中毒素基因是白喉毒素。
23.權(quán)利要求15的表達(dá)盒，其中前藥激活基因選自TK和TKsr39。
24.權(quán)利要求23的表達(dá)盒，其中前藥激活基因是TKsr39。
25.權(quán)利要求15的表達(dá)盒，其中凋亡前基因選自p53、APC、BRCA-l、BRCA-2、WT-l、Rb、 NF-UNF-2 和 VHL 基因。
26.權(quán)利要求25的表達(dá)盒，其中凋亡前基因是p53。
27.權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的表達(dá)盒，其中所述核苷酸序列還包含位于TR元件5’的 第二可讀框(0RF)序列，其并不與TR元件有效連接。
28.權(quán)利要求27的表達(dá)盒，其中第二0RF序列選自報(bào)告基因、細(xì)胞毒性腫瘤抑制子、 毒素基因、前藥激活基因和凋亡前基因。
29.權(quán)利要求28的表達(dá)盒，其中報(bào)告基因選自疋6 、6 工￥ 、熒光素酶、1^以、〔八!\ TK 和 TKsr390
30.權(quán)利要求29的表達(dá)盒，其中報(bào)告基因是熒光素酶。
31.權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)的表達(dá)盒，其中所述核苷酸序列還包含位于TR元件5’ 的第二可讀框(0RF)序列，其并不與TR元件有效連接，且編碼細(xì)胞毒性腫瘤抑制子、毒素基 因、前藥激活基因或凋亡前基因。
32.權(quán)利要求31的表達(dá)盒，其中細(xì)胞毒性腫瘤抑制子選自p53、APC、BRCA-l、BRCA-2、 WT-1、Rb、NF-1、NF-2 和 VHL 基因。
33.權(quán)利要求32的表達(dá)盒，其中細(xì)胞毒性腫瘤抑制子是p53。
34.權(quán)利要求31的表達(dá)盒，其中毒素基因選自假單胞菌外毒素、蓖麻毒蛋白毒素和白 喉毒素。
35.權(quán)利要求34的表達(dá)盒，其中毒素基因是白喉毒素。
36.權(quán)利要求31的表達(dá)盒，其中前藥激活基因選自TK和TKsr39。
37.權(quán)利要求36的表達(dá)盒，其中前藥激活基因是TKsr39。
38.權(quán)利要求31的表達(dá)盒，其中凋亡前基因選自p53、APC、BRCA-l、BRCA-2、WT-l、Rb、 NF-1、NF-2 和 VHL 基因。
39.權(quán)利要求38的表達(dá)盒，其中凋亡前基因是p53。
40.權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)的表達(dá)盒，其中多聚腺苷酸化序列選自SV40早期基因、 SV40晚期基因、HSV-TK和hGH polyA尾巴。
41.權(quán)利要求40的表達(dá)盒，其中polyA尾巴是SV40早期基因polyA尾巴。
42.權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)的表達(dá)盒，其中所述核苷酸序列還包含位于啟動(dòng)子序列3’ 和TR元件5’的5’非翻譯區(qū)，并包含mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。
43.權(quán)利要求42的表達(dá)盒，其中5’非翻譯區(qū)包含指導(dǎo)mRNA剪接的內(nèi)含子序列。
44.權(quán)利要求1-43中任一項(xiàng)的表達(dá)盒，其中所述核酸序列還包含如下一種或多種位于啟動(dòng)子5’的約15-50個(gè)核苷酸的序列，其包含一個(gè)或多個(gè)用于將所述盒插入質(zhì)粒、穿梭載體或病毒載體的限制性位點(diǎn)；位于TR元件3’和0RF序列5’的約15-50個(gè)核苷酸的序列，其包含一個(gè)或多個(gè)用于插 入和有效連接TR元件與0RF序列的限制性位點(diǎn)；位于0RF序列3’和多聚腺苷酸化序列5’的約15-50個(gè)核苷酸的序列，其包含一個(gè)或多個(gè)用于插入和有效連接0RF序列與多聚腺苷酸化序列的限制性位點(diǎn)；和位于多聚腺苷酸化序列3’的約15-50個(gè)核苷酸的序列，其包含一個(gè)或多個(gè)用于將所述 盒插入質(zhì)粒、穿梭載體或病毒載體的限制性位點(diǎn)，其中添加任何所述序列均使翻譯保持符 合讀框。
45.權(quán)利要求1-44中任一項(xiàng)的表達(dá)盒，其中所述表達(dá)盒包含在質(zhì)粒、穿梭載體或病毒 載體之中。
46.權(quán)利要求45 的表達(dá)盒，其中質(zhì)粒選自pCMVneo、pCMV-MCS、pBluescript II、pET14 和 pUC19。
47.權(quán)利要求46的表達(dá)盒，其中質(zhì)粒是pCMVneo。
48.權(quán)利要求45的表達(dá)盒，其中穿梭載體選自pCMV、pEYFP-Nl、pEGFP-Nl和 pEGFP-Cl。
49.權(quán)利要求48的表達(dá)盒，其中穿梭載體是pEYFP-Nl。
50.權(quán)利要求45的表達(dá)盒，其中病毒載體選自pAAV-MCS、pBac-l和pBacPAK8/9。
51.權(quán)利要求50的表達(dá)盒，其中病毒載體是pAAV-MCS。
52.用權(quán)利要求1-51中任一項(xiàng)的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
53.權(quán)利要求52的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自HEK293、HT1080、 NTERA-2D、HeLa、Caco2、H印G2、BALBC/3T3 和 Cos_7。
54.權(quán)利要求52的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
55.權(quán)利要求54的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中胚胎干細(xì)胞是鼠胚胎干細(xì)胞mES-D3或人胚胎干 細(xì)胞hES。
56.確定物質(zhì)毒性的方法，其中所述方法包括(a)使根據(jù)權(quán)利要求52-55中任一項(xiàng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞與所述物質(zhì)接觸，其中所述第一 0RF序列編碼報(bào)告多肽；和(b)檢測(cè)報(bào)告多肽的存在或測(cè)量其水平，其中與未接觸所述物質(zhì)或未轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞 相比，所述物質(zhì)的毒性與報(bào)告多肽的存在或其水平增加相關(guān)。
57.權(quán)利要求56的方法，其中測(cè)量報(bào)告多肽的蛋白質(zhì)水平。
58.權(quán)利要求56的方法，其中測(cè)量報(bào)告多肽mRNA的存在或水平。
59.權(quán)利要求56-58中任一項(xiàng)的方法，其中接觸哺乳動(dòng)物細(xì)胞的步驟離體進(jìn)行。
60.權(quán)利要求56-58中任一項(xiàng)的方法，其中接觸哺乳動(dòng)物細(xì)胞的步驟在體內(nèi)進(jìn)行。
61.權(quán)利要求56-60中任一項(xiàng)的方法，其中報(bào)告多肽是熒光素酶。
62.確定物質(zhì)對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性的方法，其中所述方法包括(a)用權(quán)利要求1-18和27-39中任一項(xiàng)的表達(dá)盒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞 系，其中所述第一 0RF序列編碼報(bào)告多肽；(b)使(a)中轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與所述物質(zhì)接觸；和(c)檢測(cè)報(bào)告多肽的存在或測(cè)量其水平，其中與未接觸所述物質(zhì)或未轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞 相比，所述物質(zhì)的毒性與報(bào)告多肽的存在或其水平增加相關(guān)。
63.權(quán)利要求62的方法，其中測(cè)量報(bào)告多肽的蛋白質(zhì)水平。
64.權(quán)利要求62的方法，其中測(cè)量報(bào)告多肽mRNA的存在或水平。
65.權(quán)利要求62-64中任一項(xiàng)的方法，其中報(bào)告多肽是熒光素酶。
66.用于毒性測(cè)定的試劑盒，其包含(a)權(quán)利要求1-51中任一項(xiàng)的表達(dá)盒；和(b)有關(guān)試劑盒使用的說明書。
67.用于毒性測(cè)定的試劑盒，其包含(a)權(quán)利要求52-55中任一項(xiàng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；和(b)有關(guān)試劑盒使用的說明書。
68.轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其包含穩(wěn)定整合到所述動(dòng)物基因組中的權(quán)利要求1-51中任一項(xiàng) 的表達(dá)盒。
69.權(quán)利要求68的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述動(dòng)物是小鼠。
70.在靶細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的方法，其包括用權(quán)利要求19-39中任一項(xiàng)的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化所 述細(xì)胞。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所述第一0RF序列是選自以下的細(xì)胞毒性腫瘤抑制基因 p53、APC、BRCA-1、BRCA-2、WT-1、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、NF-1、NF-2 和 VHL。
72.權(quán)利要求70的方法，其中所述第一0RF序列是選自以下的前藥激活基因TK和 TKsr39。
73.權(quán)利要求72的方法，其中前藥激活基因與前藥一起遞送。
74.權(quán)利要求70的方法，其中所述第一0RF序列是選自以下的凋亡前基因p53、APC、 BRCA-1、BRCA-2、WT_ 1、Rb、NF_ 1、NF-2 禾口 VHL 基因。
75.檢測(cè)細(xì)胞應(yīng)激和/或凋亡的方法，其中所述方法包括(a)獲得根據(jù)權(quán)利要求52-55中任一項(xiàng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述第一0RF序列編碼報(bào) 告多肽；和(b)檢測(cè)報(bào)告多肽的存在或測(cè)量其水平，其中與未轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞相比，細(xì)胞應(yīng)激和/ 或凋亡的水平與報(bào)告多肽的存在或其水平增加相關(guān)。
76.在哺乳動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中檢測(cè)細(xì)胞應(yīng)激和/或凋亡的方法，其中所述 方法包括(a)用權(quán)利要求1-18和27-39中任一項(xiàng)的表達(dá)盒轉(zhuǎn)染所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì) 胞系，其中所述第一 0RF序列編碼報(bào)告多肽；和(b)檢測(cè)報(bào)告多肽的存在或測(cè)量其水平，其中與未轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞相比，細(xì)胞應(yīng)激和/ 或凋亡的水平與報(bào)告多肽的存在或其水平增加相關(guān)。
77.權(quán)利要求75-76中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法在步驟(b)之前包括使哺乳動(dòng)物細(xì) 胞與能夠誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激和/或凋亡的物質(zhì)接觸的步驟。
78.權(quán)利要求75-77中任一項(xiàng)的方法，其中測(cè)量報(bào)告多肽的蛋白質(zhì)水平。
79.權(quán)利要求75-77中任一項(xiàng)的方法，其中測(cè)量報(bào)告多肽mRNA的存在或水平。
80.權(quán)利要求77的方法，其中接觸哺乳動(dòng)物細(xì)胞的步驟離體進(jìn)行。
81.權(quán)利要求77的方法，其中接觸哺乳動(dòng)物細(xì)胞的步驟在體內(nèi)進(jìn)行。
82.權(quán)利要求75-81中任一項(xiàng)的方法，其中報(bào)告多肽是熒光素酶。
83.鑒定在應(yīng)激和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的IRES元件的方法，其中所述方法包括(a)用能夠誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激和/或死亡的物質(zhì)處理真核細(xì)胞，以獲得處理的細(xì)胞；(b)從處理的細(xì)胞中獲得mRNA；(c)使結(jié)合在核糖體上的mRNA與未結(jié)合的mRNA分離；(d)獲得至少一種結(jié)合在核糖體上的mRNA的DNA序列；和(e)檢驗(yàn)所述DNA序列指導(dǎo)帽子非依賴性翻譯的能力。
84.權(quán)利要求83的方法，其中步驟(c)通過在蔗糖密度梯度上分級(jí)分離、高效凝膠過濾 色譜或聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)分離來進(jìn)行。
85.權(quán)利要求83的方法，其中真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
86.預(yù)防哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的方法，其包括用權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化所 述哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述第一 0RF序列編碼抗凋亡蛋白。
87.權(quán)利要求86的方法，其中抗凋亡蛋白選自:BCL2、BCL2L1、BCL2A1、BAG1、TRAF1、 BIRC3、BIRC5、BAK1 或API5。
88.權(quán)利要求87的方法，其中抗凋亡蛋白是BCL2。
89.權(quán)利要求87的方法，其中抗凋亡蛋白是TRAF1。
90.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-51中任一項(xiàng)的表達(dá)盒和可藥用載體。
91.TR元件，其包含與參照序列突變變體相同的核苷酸序列，所述參照序列包含(A)對(duì)應(yīng)于至少圖15PLP序列的核苷酸1-831、且與之具有至少62%序列同一性的PLP 核苷酸序列，或(B)對(duì)應(yīng)于至少圖15DM20序列的核苷酸1-726、且與之具有至少62%序列同一性的 DM20核苷酸序列；且所述參照序列包含(C)位于圖15 PLP 的核苷酸位置 41-48、50-56、75-81、150-156、200-205、227-244、 251-257和563-570、或與之對(duì)應(yīng)位置上的多嘧啶片，(D)位于圖15PLP的核苷酸位置1-3、616-618、703-705和811-813、或與之對(duì)應(yīng)位置 上的ATG序列，(E)位于圖15 PLP 的核苷酸位置 130-133、142-145、190-193、220-223 和 305-308、或 與之對(duì)應(yīng)位置上的GNRA序列，和(F)位于圖15PLP的核苷酸位置503-512、或與之對(duì)應(yīng)位置上的ISSrRNA結(jié)合位點(diǎn)；其中(G)所述突變變體(1)包含參照序列的如下突變，所述突變(a)消除ATG1、ATG616 和 ATG703，和(b)在圖15PLP的核苷酸位置2-4、6-8、16-18和19-21、或與之對(duì)應(yīng)的位置上引入終 止密碼子序列；和(2)保留了多嘧啶片(C)、GNRA序列(E)和18SrRNA結(jié)合位點(diǎn)(F)。
92.根據(jù)權(quán)利要求91的TR元件，其中(A)或⑶中的序列同一性至少或約為70%。
93.根據(jù)權(quán)利要求92的TR元件，其中(A)或⑶中的序列同一性至少或約為80%。
94.根據(jù)權(quán)利要求93的TR元件，其中(A)或⑶中的序列同一性至少或約為90%。
95.根據(jù)權(quán)利要求91的TR元件，其中消除ATG1、ATG616和ATG703的突變(G1)將各 ATG轉(zhuǎn)換為TTG。
96.根據(jù)權(quán)利要求91的TR元件，其中所述參照序列包含脊椎動(dòng)物PLP共有核苷酸序1atgggyykgywdgakkgytgyrynmgmtgymtbrtwggggymccmttygcytchbtsrtb61gccacwgkvytvtgyttykytggrgtsgcvctvttctgyggmtgyggrcaygargchytv121asygghacmgarmagytvatygagacmtayttytccaaraaytaccaagamtaygartay181ctcatyvaygtsatymaygcyttycagtaygtcatctatggaaywgccwyyttcttctty241cthtwyggrrycctvctkytggcygarggmttctacaccacmrsygchrtcargcavatc301ythggsgastwcmrrmccmcmryywkmrrsrrkggsctgakykcwacrgtracwggrggm361cmkaargggagrrghdcsmgrggmmvvcakcvagyycaywcywtrsagcksrtstgtcrb421tgyttgggaaartggctmggacayccygayaagtttgtsggyrtyacytatryyhtsacy481rtyktvtggmtmctrrysttygcctgctcdgcygtdccygtvtacatytayttyaayacc541tggrycacytgycagtctatygcckyccchrssaagacywcwrccagyrtmrgyasbcts601tgykcdgaygsymgvatgtayggtgtyctsccmtggaaygcbttycchggsaargtktgy661ggswccarcctkctbkccatctgcaaracmrsygagttccaratgacnttycayctbttt721atygckgcvttygtgggkgcwgcngchacwctdgtbkcmctgctcacytwyatgrthgsy781gcmwcwtwcaactwygcygtsctbmrastbaykggccgrrgcwcmaagttytga或包含所述脊椎動(dòng)物PLP共有序列、其中核苷酸349-453已經(jīng)缺失的脊椎動(dòng)物DM20共 有序列。
97.根據(jù)權(quán)利要求91的TR元件，其中所述參照序列具有哺乳動(dòng)物PLP共有核苷酸序列1atgggcytgttagagtgytgygcnagatgyctsgtaggggccccctttgcttccytggtg61gccactggattrtgtttctttggrgtggcactsttctgtggmtgtggacatgaagchytm121actggyacagaaaagytaattgagacmtatttctccaaaaaytaccaagactaygagtat181ctcatyaatgtgatycatgcyttccagtatgtcatctatggaactgcctctttcttcttc241ctttatggggccctcctgctggcygagggcttctacaccaccggygcwgtcaggcagatc301tttggcgactacaagaccaccatctgcggsaagggcctgagygcaacggtaacagggggc361cagaaggggaggggttccagaggccaacatcaagctcattctttggagcgggtgtgtcat421tgtttgggaaaatggctaggacatcccgacaagtttgtgggcatcacctatgccytgacy481gttgtrtggctcctrgtgtttgcctgctckgctgtrcctgtgtacatttayttcaayacc541tggaccacytgycagtctattgcckycccyagcaagacytctgccagyataggcastctc601tgygctgatgccagaatgtatggtgttctcccatggaatgctttyccwggcaargtktgt661ggctccaaccttctgtccatctgcaaaacagctgagttccaaatgacsttccayctgttt721attgctgcvttygtgggkgctgcrgcyacactrgtktccctgctcaccttcatgattgct781gccacttacaacttygccgtcctkaaactcatgggccgaggcaccaagttctga或包含所述哺乳動(dòng)物PLP共有序列、其中核苷酸349-453已經(jīng)缺失的哺乳動(dòng)物DM20共 有序列。
98.根據(jù)權(quán)利要求91的TR元件，其中所述參照序列包含天然PLP或DM20多肽的核苷酸序列。
99.根據(jù)權(quán)利要求98的TR元件，其中所述參照序列包含天然哺乳動(dòng)物PLP或DM20多 肽的核苷酸序列。
100.制備改進(jìn)的TR元件的方法，其包括(A)提供至少一種含TR元件的核酸，(B)通過定向進(jìn)化技術(shù)修飾所述核酸的核苷酸序列，以產(chǎn)生修飾的TR元件，和(C)通過操縱所述修飾的TR元件來表達(dá)由表達(dá)構(gòu)建體編碼的至少一種表達(dá)產(chǎn)物，所述 表達(dá)構(gòu)建體的可讀框序列通過所述修飾的TR元件選擇性地翻譯，和(D)檢測(cè)步驟(C)中進(jìn)行的表達(dá)相對(duì)于應(yīng)用步驟(A)的TR元件表達(dá)所觀察到的呈現(xiàn)出 改進(jìn)的至少一種特性，由此將所述修飾的TR元件鑒定為改進(jìn)的TR元件。
101.根據(jù)權(quán)利要求100的方法，其中定向進(jìn)化技術(shù)包括(1)對(duì)所述核酸進(jìn)行突變，(2) 對(duì)至少兩種具有不同TR元件核苷酸序列的同源核酸進(jìn)行剪接或同源重組，或(3)既包括 ⑴又包括⑵。
102.根據(jù)權(quán)利要求101的方法，其中(1)中的突變產(chǎn)生、或者(2)中的剪接或同源重組 應(yīng)用具有TR核苷酸序列的突變核酸，所述TR核苷酸序列為圖15 PLP或DM20序列的突變 形式。
103.根據(jù)權(quán)利要求102的方法，其中突變形式在序列上與圖15PLP或DM20序列至少是70%同一。
104.根據(jù)權(quán)利要求100的方法，其中(A)中的核酸包括至少一種具有圖15PLP或DM20 序列的核苷酸序列的核酸。
105.根據(jù)權(quán)利要求100的方法，其中⑶中的特性是如下任一改進(jìn)TR元件翻譯對(duì)應(yīng) 激條件的特異性、TR元件激活對(duì)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的敏感性、或經(jīng)TR元件激活后翻譯起始的效 率(即量度)。
106.根據(jù)權(quán)利要求100的方法，其中(D)中的表達(dá)包括在能夠表達(dá)所述表達(dá)產(chǎn)物的條 件下維持含有所述表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
107.根據(jù)權(quán)利要求106的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。
108.TR元件在鑒定誘導(dǎo)、增強(qiáng)或抑制細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的活性劑的方法中的用途。
109.根據(jù)權(quán)利要求108的用途，其中應(yīng)激包括熱應(yīng)激、冷應(yīng)激、氧化應(yīng)激、緊張應(yīng)激、中 毒、或其組合。
110.根據(jù)權(quán)利要求108的用途，其中細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)包括凋亡和/或壞死。
111.TR元件在鑒定活性劑誘導(dǎo)、增強(qiáng)、抑制或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)所達(dá)程度的方法中的 用途。
112.根據(jù)權(quán)利要求111的用途，其中細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的程度鑒定為與由在TR元件控制下 表達(dá)的報(bào)告分子所檢測(cè)的信號(hào)量度成比例。
113.TR元件在預(yù)防性、治療性或姑息性治療需要細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)防護(hù)的受試人的方法中 的用途，所述TR元件為構(gòu)建體的一部分，其中TR元件與包含編碼提供細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)防護(hù) 的表達(dá)產(chǎn)物的編碼序列的多核苷酸有效相連，且所述治療包括給藥包含所述構(gòu)建體的組合 物。
114.根據(jù)權(quán)利要求113的用途，其中所述防護(hù)是隔離或降解毒性劑(toxifying agent)、穩(wěn)定細(xì)胞中的生物分子、催化形成防護(hù)劑、或引起自不同編碼序列的防護(hù)劑表達(dá)的 活性。
115.用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可表達(dá)的核酸表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述表達(dá)盒以5’至3’方向包含如下元件(A)至少一種轉(zhuǎn)錄效應(yīng)序列，(B)包含根據(jù)權(quán)利要求91的TR元件、編碼PLP/DM20肽的TR元件，所述TR元件能夠被 哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，以形成能夠在其應(yīng)激和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA分子，(C)有效連接于TR元件的核苷酸序列，其包含編碼多肽的第一可讀框(0RF)，并能夠與 TR元件共轉(zhuǎn)錄及與所述mRNA分子共翻譯，和(D)多聚腺苷酸化序列。
116.權(quán)利要求115的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自HEK293、HT1080、 NTERA-2D、HeLa、Caco2、H印G2、BALBC/3T3 和 Cos_7。
117.權(quán)利要求115的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
118.權(quán)利要求117的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中胚胎干細(xì)胞是鼠胚胎干細(xì)胞mES-D3或人胚胎 干細(xì)胞hES。
119.轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其包含穩(wěn)定整合到所述動(dòng)物基因組中的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可表 達(dá)的核酸表達(dá)盒，其中所述表達(dá)盒以5’至3’方向包含如下元件(A)至少一種轉(zhuǎn)錄效應(yīng)序列，(B)包含根據(jù)權(quán)利要求91的TR元件、編碼PLP/DM20肽的TR元件，所述TR元件能夠被 哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，以形成能夠在其應(yīng)激和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA分子，(C)有效連接于TR元件的核苷酸序列，其包含編碼多肽的第一可讀框(0RF)，并能夠與 TR元件共轉(zhuǎn)錄和與所述mRNA分子共翻譯，和(D)多聚腺苷酸化序列。
120.權(quán)利要求119的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，其中所述動(dòng)物是小鼠。
121.用于毒性測(cè)定的試劑盒，其包含(A)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可表達(dá)的核酸表達(dá)盒，其中所述表達(dá)盒以5’至3’方向包含如下 元件(1)至少一種轉(zhuǎn)錄效應(yīng)序列，(2)包含根據(jù)權(quán)利要求91的TR元件、編碼PLP/DM20肽的TR元件，所述TR元件能夠被 哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，以形成能夠在其應(yīng)激和/或垂死細(xì)胞中選擇性翻譯的mRNA分子，(3)有效連接于TR元件的核苷酸序列，其包含編碼多肽的第一可讀框(0RF)，并能夠與 TR元件共轉(zhuǎn)錄和與所述mRNA分子共翻譯，和(4)多聚腺苷酸化序列；和(B)有關(guān)試劑盒使用的說明書。
122.用于毒性測(cè)定的試劑盒，其包含(a)權(quán)利要求115-118中任一項(xiàng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；和(b)有關(guān)試劑盒使用的說明書。
全文摘要
本技術(shù)涉及包含TR元件和有效連接于TR元件的核苷酸序列的核酸表達(dá)盒，其中所述TR元件編碼在應(yīng)激和/或垂死細(xì)胞中翻譯的mRNA分子，所述核苷酸序列為第一可讀框(ORF)序列，編碼多肽或其片段，并與TR元件共翻譯。本技術(shù)還涉及包含此類表達(dá)盒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。此外還包括的是包含所述表達(dá)盒的試劑盒，以及用于確定毒性和殺死靶細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101861391SQ200880110916
公開日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2008年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月10日
發(fā)明者L·卡洛克, M·齊普赫爾 申請(qǐng)人:韋恩州立大學(xué)