本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及培養(yǎng)基及其在發(fā)酵生產(chǎn)丙酸中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

丙酸及其鈣鹽作為一種防腐保鮮劑，對(duì)于霉菌、酵母菌及細(xì)菌等具有廣泛的抗菌作用，尤其是丙酸鈣，在酸性條件下，產(chǎn)生游離丙酸，具有抗菌作用。丙酸鈣其抑菌作用受環(huán)境pH值的影響，在pH值5.0時(shí)霉菌的抑制作用最佳；pH值6.0時(shí)抑菌能力明顯降低，最小抑菌濃度為0.01％。在酸性介質(zhì)(淀粉、含蛋白質(zhì)和油脂物質(zhì))中丙酸及其鈣鹽對(duì)各類霉菌、革蘭氏陰性桿菌或好氧芽孢桿菌有較強(qiáng)的抑制作用，還可以抑制黃曲霉素的產(chǎn)生，而對(duì)酵母菌無害，對(duì)人畜無害，無毒副作用，并能給人畜提供必需的鈣。因此丙酸及其鈣鹽是食品、釀造、飼料、中藥制劑諸方面的一種新型、安全、高效的食品與飼料用防霉劑，被廣泛的應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥等方面。

丙酸還是種重要的精細(xì)化工原料及產(chǎn)品，在有機(jī)合成工業(yè)、涂料、油漆、染料、化妝品、醫(yī)藥、農(nóng)藥、香料、林產(chǎn)化學(xué)產(chǎn)業(yè)及其它一些部門有著廣泛的應(yīng)用。以丙酸作原料可制得DL-丙氨酸，進(jìn)而可生產(chǎn)維生素B6；用丙酸、乙酸和纖維素反應(yīng)生成CAP，可生成一種生物可降解塑料；還用于生產(chǎn)農(nóng)藥除草劑的2-氯丙酸，用于工業(yè)、建筑等的粘著劑、防水劑的丙酸乙烯酯等，都是以丙酸作為原料；丙酸另外還可用作電鍍助劑等。

現(xiàn)有丙酸及其鈣鹽生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。國際上主要采用化學(xué)合成法以石油為原料工業(yè)化生產(chǎn)丙酸及其鈣鹽，然而，化學(xué)合成法污染重、成本高、操作條件苛刻，不符合全球環(huán)保意識(shí)不斷增強(qiáng)的潮流，因此，人們逐漸把注意力投向了微生物發(fā)酵法。

目前，國內(nèi)工業(yè)上常使用甘油作為碳源發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)丙酸，所得丙酸與堿或鹽進(jìn)一步反應(yīng)生成相應(yīng)的丙酸鹽，但是以甘油為碳源丙酸菌菌體生長速度緩慢，達(dá)到所需菌體密度時(shí)間較長，從而使發(fā)酵時(shí)間延長，所以縮短發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行高密度培養(yǎng)提高產(chǎn)量已成為微生物法發(fā)酵丙酸鈣研究的主要方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供培養(yǎng)基及其在發(fā)酵生產(chǎn)丙酸中的應(yīng)用，本發(fā)明在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氯化血紅素、無機(jī)鹽，并以葡萄糖作為碳源，從而使丙酸桿菌生長旺盛，提高了丙酸的產(chǎn)量。

本發(fā)明提供了一種活化產(chǎn)酸丙酸桿菌種子的培養(yǎng)基，包括：

本發(fā)明實(shí)施例中，活化產(chǎn)酸丙酸桿菌種子的培養(yǎng)基的pH值為7.0。

其中，葡萄糖的濃度為20g/L。

酵母提取物為酵母粉，蛋白胨為胰蛋白胨大豆肉湯。

本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵培養(yǎng)基，包括水和：

本發(fā)明實(shí)施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基中包括：

本發(fā)明實(shí)施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基中包括：

本發(fā)明實(shí)施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基中包括：

本發(fā)明實(shí)施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基中包括：

本發(fā)明實(shí)施例中，活化產(chǎn)酸丙酸桿菌種子的培養(yǎng)基的pH值為7.0。

其中，葡萄糖的濃度為20g/L。

酵母提取物為酵母膏。

本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基以葡萄糖為碳源，其中添加氯化血紅素及硫酸錳、氯化鎂，從而能夠提高產(chǎn)酸丙酸桿菌的活性，使菌種生長良好，并且提高丙酸的產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)表明，采用本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)丙酸，丙酸的在培養(yǎng)液中的含量可達(dá)244.7ppm。發(fā)酵生產(chǎn)率為0.213g/(L·h)，生產(chǎn)速率比原發(fā)酵生產(chǎn)率0.143g/(L·h)提高了48.83％。

本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵生產(chǎn)丙酸中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)丙酸的方法，包括：

步驟1：以活化產(chǎn)酸丙酸桿菌種子的培養(yǎng)基將保藏編號(hào)為CGMCC 1.2232的產(chǎn)酸丙酸桿菌活化，制得活化菌種；

步驟2：將活化菌種接種至本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)發(fā)酵至pH值恒定獲得含有丙酸的發(fā)酵液；

所述發(fā)酵至120h，補(bǔ)加甘油及氯化血紅素。

步驟1中所述活化為將保藏編號(hào)為CGMCC 1.2232的產(chǎn)酸丙酸桿菌接種于活化產(chǎn)酸丙酸桿菌種子的培養(yǎng)基，在無氧條件下，30℃培養(yǎng)48h。

活化步驟中，所述產(chǎn)酸丙酸桿菌與活化產(chǎn)酸丙酸桿菌種子的培養(yǎng)基的體積比為1:99。

活化步驟中，培養(yǎng)基的體積占培養(yǎng)用厭氧瓶體積的4/5。優(yōu)選為，250mL厭氧瓶裝200mL活化產(chǎn)酸丙酸桿菌種子的培養(yǎng)基。

其中，步驟2中活化菌種與本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:9。

為保持無氧條件需持續(xù)充入氮?dú)狻?/p>

本發(fā)明所述發(fā)酵生產(chǎn)丙酸的方法在發(fā)酵過程中對(duì)發(fā)酵pH進(jìn)行分段控制。

所述分段控制優(yōu)選為：發(fā)酵0～120小時(shí)的pH值為5.5～6.7；發(fā)酵120h后，pH值為6.8～6.99。

具體的，步驟2中發(fā)酵的條件為無氧發(fā)酵，溫度為30℃～35℃，攪拌轉(zhuǎn)速50rpm～150rpm，發(fā)酵前120h調(diào)節(jié)pH值為6.2；120h后調(diào)節(jié)pH值為6.9。

pH值的調(diào)節(jié)采用流加堿液的方式。

所述堿液為氫氧化鈣水溶液。其中，Ca(OH)₂的質(zhì)量-體積(g/mL)比為10％。

一些實(shí)施例中，步驟2中無氧發(fā)酵的溫度為30℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm。

氯化血紅素溶解于甘油；所述補(bǔ)加至發(fā)酵液中氯化血紅素的濃度為4mg/L；補(bǔ)加至發(fā)酵液中甘油的濃度為20g/L～40g/L。

本發(fā)明中，步驟2中無氧發(fā)酵于發(fā)酵罐中進(jìn)行，為保持無氧條件需持續(xù)充入氮?dú)?。發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基占發(fā)酵罐體積的3/5。優(yōu)選為，10L發(fā)酵罐裝6L發(fā)酵培養(yǎng)基。經(jīng)過流加堿液、補(bǔ)加含有氯化血紅素的甘油、發(fā)酵后，發(fā)酵液的體積為7L。

作為優(yōu)選，產(chǎn)酸丙酸桿菌在活化前經(jīng)過前處理；前處理為將保藏編號(hào)為CGMCC 1.2232的產(chǎn)酸丙酸桿菌接種于前處理培養(yǎng)基；在無氧條件下，30℃培養(yǎng)60h；所述前處理培養(yǎng)基包括：

前處理中，所述產(chǎn)酸丙酸桿菌與活化產(chǎn)酸丙酸桿菌種子的培養(yǎng)基的體積比為1:99。

為了制得丙酸產(chǎn)品，將步驟2中獲得的含有丙酸的發(fā)酵液經(jīng)離心機(jī)離心后，去除菌體，取上清液進(jìn)行噴霧干燥，獲得丙酸產(chǎn)品。

本發(fā)明提供培養(yǎng)基，并提供了利用培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)丙酸的方法，本發(fā)明以葡萄糖為碳源，其中添加氯化血紅素及硫酸錳、氯化鎂，從而能夠提高產(chǎn)酸丙酸桿菌的活性，使菌種生長良好，并且提高丙酸的產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)表明，采用本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)丙酸，丙酸在培養(yǎng)液中的含量可達(dá)48.95g/L。發(fā)酵生產(chǎn)率為0.213g/(L·h)，生產(chǎn)速率比原發(fā)酵生產(chǎn)率0.143g/(L·h)提高了48.83％。

附圖說明

圖1示實(shí)施例1測(cè)量丙酸含量的色譜圖，其中橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為高度；

圖2示實(shí)施例2測(cè)量丙酸含量的色譜圖，其中橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為高度；

圖3示實(shí)施例3測(cè)量丙酸含量的色譜圖，其中橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為高度；

圖4示實(shí)施例4測(cè)量丙酸含量的色譜圖，其中橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為高度；

圖5示實(shí)施例5測(cè)量丙酸含量的色譜圖，其中橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為高度；

圖6示對(duì)比例1測(cè)量丙酸含量的色譜圖，其中橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為高度；

圖7示對(duì)比例2測(cè)量丙酸含量的色譜圖，其中橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為高度。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了培養(yǎng)基及其在發(fā)酵生產(chǎn)丙酸中的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明采用的儀器皆為普通市售品，皆可于市場(chǎng)購得。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實(shí)施例1本發(fā)明發(fā)酵工藝生產(chǎn)丙酸

一、預(yù)處理

將常規(guī)甘油保藏的產(chǎn)酸丙酸桿菌按照1％的接種量接種于裝有種子培養(yǎng)基的厭氧瓶(100ml厭氧瓶裝100ml種子培養(yǎng)基)中，向厭氧瓶中充氮?dú)夂?，置?0℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)60h。按重量體積百分比(g/ml)計(jì)，種子培養(yǎng)基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：40g/L，余量為水，pH 7.0。

二、種子液

將上述厭氧瓶培養(yǎng)所得菌種按照1％的接種量無菌轉(zhuǎn)入裝有種子培養(yǎng)基的厭氧瓶(250ml厭氧瓶裝200ml種子培養(yǎng)基)，充入無菌氮?dú)猓囵B(yǎng)溫度為30℃，時(shí)間為48h。按重量體積百分比(g/ml)計(jì)，二級(jí)種子培養(yǎng)基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：20g/L、丙酸：1g/L，余量為水，pH 7.0。

三、生產(chǎn)發(fā)酵

1、在10L發(fā)酵罐中投入6L發(fā)酵培養(yǎng)基，初始發(fā)酵培養(yǎng)基成分：按重量百分比計(jì)，酵母膏：10g/L、蛋白胨：5g/L、氯化血紅素3mg/L、硫酸錳0.015g/L、氯化鎂0.02g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L，葡萄糖：10g/L，余量為水，發(fā)酵120小時(shí)后，按發(fā)酵液體積計(jì)算，補(bǔ)加30g/L的甘油及4mg/L的氯化血紅素。

2、將種子液按照10％的接種量接種于發(fā)酵罐中；

發(fā)酵生產(chǎn)：培養(yǎng)溫度為30℃，攪拌速率150rpm，并保持氮?dú)獾某掷m(xù)充入。通過流加重量體積比(g/ml)為10％的Ca(OH)₂溶液，發(fā)酵前120小時(shí)將pH值維持在6.2，發(fā)酵120小時(shí)后將pH維持在6.9。

3、發(fā)酵過程結(jié)束：

pH值不再變化，發(fā)酵停止，離子色譜法測(cè)量丙酸含量(樣品稀釋200倍)，丙酸含量為37.25g/L(圖1)，發(fā)酵所用時(shí)間為216h，丙酸生產(chǎn)速率為0.172g/(L·h)，生產(chǎn)率提高20.58％。

實(shí)施例2本發(fā)明發(fā)酵工藝生產(chǎn)丙酸

一、預(yù)處理

將常規(guī)甘油保藏的產(chǎn)酸丙酸桿菌按照1％的接種量接種于裝有種子培養(yǎng)基的厭氧瓶(100ml厭氧瓶裝100ml種子培養(yǎng)基)中，向厭氧瓶中充氮?dú)夂?，置?0℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)60h。按重量體積百分比(g/ml)計(jì)，種子培養(yǎng)基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：40g/L，余量為水，pH 7.0。

二、種子液

將上述厭氧瓶培養(yǎng)所得菌種按照1％的接種量無菌轉(zhuǎn)入裝有種子培養(yǎng)基的厭氧瓶(250ml厭氧瓶裝200ml種子培養(yǎng)基)，充入無菌氮?dú)?，培養(yǎng)溫度為30℃，時(shí)間為48h。按重量體積百分比(g/ml)計(jì)，二級(jí)種子培養(yǎng)基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：20g/L、丙酸：1g/L，余量為水，pH 7.0。

三、生產(chǎn)發(fā)酵

1、在10L發(fā)酵罐中投入6L發(fā)酵培養(yǎng)基，初始發(fā)酵培養(yǎng)基成分：按重量百分比計(jì)，酵母膏：10g/L、蛋白胨：5g/L、氯化血紅素3mg/L、硫酸錳0.015g/L、氯化鎂0.02g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L，葡萄糖：20g/L，余量為水，發(fā)酵120小時(shí)后，按發(fā)酵液體積計(jì)算，補(bǔ)加30g/L的甘油及4mg/L氯化血紅素。

2、將種子液按照10％的接種量接種于發(fā)酵罐中；

發(fā)酵生產(chǎn)：培養(yǎng)溫度為30℃，攪拌速率150rpm，并保持氮?dú)獾某掷m(xù)充入。通過流加重量體積比(g/ml)為10％的Ca(OH)₂溶液，發(fā)酵前120小時(shí)將pH值維持在6.2，發(fā)酵120小時(shí)后將pH維持在6.9。

3、發(fā)酵過程結(jié)束：

pH值不再變化，發(fā)酵停止，離子色譜法測(cè)量丙酸含量(樣品稀釋200倍)，丙酸含量為38.70g/L(圖2)，發(fā)酵所用時(shí)間為214h，丙酸生產(chǎn)速率為0.181g/(L·h)，生產(chǎn)率提高26.47％。

實(shí)施例3本發(fā)明發(fā)酵工藝生產(chǎn)丙酸

一、預(yù)處理

將常規(guī)甘油保藏的產(chǎn)酸丙酸桿菌按照1％的接種量接種于裝有種子培養(yǎng)基的厭氧瓶(100ml厭氧瓶裝100ml種子培養(yǎng)基)中，向厭氧瓶中充氮?dú)夂?，置?0℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)60h。按重量體積百分比(g/ml)計(jì)，種子培養(yǎng)基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：40g/L，余量為水，pH 7.0。

二、種子液

將上述厭氧瓶培養(yǎng)所得菌種按照1％的接種量無菌轉(zhuǎn)入裝有種子培養(yǎng)基的厭氧瓶(250ml厭氧瓶裝200ml種子培養(yǎng)基)，充入無菌氮?dú)?，培養(yǎng)溫度為30℃，時(shí)間為48h。按重量體積百分比(g/ml)計(jì)，二級(jí)種子培養(yǎng)基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：20g/L、丙酸：1g/L，余量為水，pH 7.0。

三、生產(chǎn)發(fā)酵

1、在10L發(fā)酵罐中投入6L發(fā)酵培養(yǎng)基，初始發(fā)酵培養(yǎng)基成分：按重量百分比計(jì)，酵母膏：10g/L、蛋白胨：5g/L、氯化血紅素3mg/L、硫酸錳0.015g/L、氯化鎂0.02g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L，葡萄糖：30g/L，余量為水，發(fā)酵120小時(shí)后，按發(fā)酵液體積計(jì)算，補(bǔ)加30g/L的甘油及4mg/L氯化血紅素。

2、將種子液按照10％的接種量接種于發(fā)酵罐中；

發(fā)酵生產(chǎn)：培養(yǎng)溫度為30℃，攪拌速率150rpm，并保持氮?dú)獾某掷m(xù)充入。通過流加重量體積比(g/ml)為10％的Ca(OH)₂溶液，發(fā)酵前120小時(shí)將pH值維持在6.2，發(fā)酵120小時(shí)后將pH維持在6.9。

3、發(fā)酵過程結(jié)束：

pH值不再變化，發(fā)酵停止，離子色譜法測(cè)量丙酸含量(樣品稀釋200倍)，丙酸含量為40.35g/L(圖3)，發(fā)酵所用時(shí)間為210h，丙酸生產(chǎn)速率為0.192g/(L·h)，生產(chǎn)率提高34.37％。

實(shí)施例4本發(fā)明發(fā)酵工藝生產(chǎn)丙酸

一、預(yù)處理

將常規(guī)甘油保藏的產(chǎn)酸丙酸桿菌按照1％的接種量接種于裝有種子培養(yǎng)基的厭氧瓶(100ml厭氧瓶裝100ml種子培養(yǎng)基)中，向厭氧瓶中充氮?dú)夂?，置?0℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)60h。按重量體積百分比(g/ml)計(jì)，種子培養(yǎng)基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：40g/L，余量為水，pH 7.0。

二、種子液

將上述厭氧瓶培養(yǎng)所得菌種按照1％的接種量無菌轉(zhuǎn)入裝有種子培養(yǎng)基的厭氧瓶(250ml厭氧瓶裝200ml種子培養(yǎng)基)，充入無菌氮?dú)?，培養(yǎng)溫度為30℃，時(shí)間為48h。按重量體積百分比(g/ml)計(jì)，二級(jí)種子培養(yǎng)基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：20g/L、丙酸：1g/L，余量為水，pH 7.0。

三、生產(chǎn)發(fā)酵

1、在10L發(fā)酵罐中投入6L發(fā)酵培養(yǎng)基，初始發(fā)酵培養(yǎng)基成分：按重量百分比計(jì)，酵母膏：10g/L、蛋白胨：5g/L、氯化血紅素2mg/L、硫酸錳0.01g/L、氯化鎂0.01g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L，葡萄糖：20g/L，余量為水，發(fā)酵120小時(shí)后，按發(fā)酵液體積計(jì)算，補(bǔ)加20g/L的甘油及4mg/L的氯化血紅素。

2、將種子液按照10％的接種量接種于發(fā)酵罐中；

發(fā)酵生產(chǎn)：培養(yǎng)溫度為30℃，攪拌速率150rpm，并保持氮?dú)獾某掷m(xù)充入。通過流加重量體積比(g/ml)為10％的Ca(OH)₂溶液，發(fā)酵前120小時(shí)將pH值維持在6.2，發(fā)酵120小時(shí)后將pH維持在6.9。

3、發(fā)酵過程結(jié)束：

pH值不再變化，發(fā)酵停止，離子色譜法測(cè)量丙酸含量(樣品稀釋200倍)，丙酸含量為36.13g/L(圖4)，發(fā)酵所用時(shí)間為217h，丙酸生產(chǎn)速率為0.166g/(L·h)，生產(chǎn)率提高16.43％。

實(shí)施例5本發(fā)明發(fā)酵工藝生產(chǎn)丙酸

一、預(yù)處理

將常規(guī)甘油保藏的產(chǎn)酸丙酸桿菌按照1％的接種量接種于裝有種子培養(yǎng)基的厭氧瓶(100ml厭氧瓶裝100ml種子培養(yǎng)基)中，向厭氧瓶中充氮?dú)夂螅糜?0℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)60h。按重量體積百分比(g/ml)計(jì)，種子培養(yǎng)基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：40g/L，余量為水，pH 7.0。

二、種子液

將上述厭氧瓶培養(yǎng)所得菌種按照1％的接種量無菌轉(zhuǎn)入裝有種子培養(yǎng)基的厭氧瓶(250ml厭氧瓶裝200ml種子培養(yǎng)基)，充入無菌氮?dú)?，培養(yǎng)溫度為30℃，時(shí)間為48h。按重量體積百分比(g/ml)計(jì)，二級(jí)種子培養(yǎng)基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：20g/L、丙酸：1g/L，余量為水，pH 7.0。

三、生產(chǎn)發(fā)酵

1、在10L發(fā)酵罐中投入6L發(fā)酵培養(yǎng)基，初始發(fā)酵培養(yǎng)基成分：按重量百分比計(jì)，酵母膏：10g/L、蛋白胨：5g/L、氯化血紅素4mg/L、硫酸錳0.025g/L、氯化鎂0.03g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L，葡萄糖：20g/L，余量為水，發(fā)酵120小時(shí)后，按發(fā)酵液體積計(jì)算，補(bǔ)加40g/L的甘油及4mg/L的氯化血紅素。

2、將種子液按照10％的接種量接種于發(fā)酵罐中；

發(fā)酵生產(chǎn)：培養(yǎng)溫度為30℃，攪拌速率150rpm，并保持氮?dú)獾某掷m(xù)充入。通過流加重量體積比(g/ml)為10％的Ca(OH)₂溶液，發(fā)酵前120小時(shí)將pH值維持在6.2，發(fā)酵120小時(shí)后將pH維持在6.9。

3、發(fā)酵過程結(jié)束：

pH值不再變化，發(fā)酵停止，離子色譜法測(cè)量丙酸含量(樣品稀釋200倍)，丙酸含量為48.95g/L(圖5)，發(fā)酵所用時(shí)間為230h，丙酸生產(chǎn)速率為0.213g/(L·h)，生產(chǎn)率提高48.83％。

對(duì)比例1現(xiàn)有發(fā)酵工藝生產(chǎn)丙酸

一、預(yù)處理

將常規(guī)甘油保藏的產(chǎn)酸丙酸桿菌按照1％的接種量接種于裝有種子培養(yǎng)基的厭氧瓶(100ml厭氧瓶裝100ml種子培養(yǎng)基)中，向厭氧瓶中充氮?dú)夂?，置?0℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)60h。按重量體積百分比(g/ml)計(jì)，種子培養(yǎng)基的成分為，酵母粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、甘油：40g/L，余量為水，pH 7.0。

二、種子液

將上述厭氧瓶培養(yǎng)所得菌種按照1％的接種量無菌轉(zhuǎn)入裝有種子培養(yǎng)基的厭氧瓶(250ml厭氧瓶裝200ml種子培養(yǎng)基)，充入無菌氮?dú)?，培養(yǎng)溫度為30℃，時(shí)間為60h。按重量體積百分比(g/ml)計(jì)，種子培養(yǎng)基的成分為，酵母粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、甘油：40g/L，余量為水，pH 7.0。

三、生產(chǎn)發(fā)酵

1、在10L發(fā)酵罐中投入6L發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基成分：按重量體積百分比計(jì)，酵母粉：10g/L、蛋白胨：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、甘油：40g/L，余量為水，pH 7.0。

2、將種子液按照5％的接種量接種于發(fā)酵罐中；

發(fā)酵生產(chǎn)：培養(yǎng)溫度為30℃，攪拌速率50rpm，并保持氮?dú)獾某掷m(xù)充入。通過流加重量體積比(g/ml)為10％的Ca(OH)₂溶液，將pH值維持在7.0。

3、發(fā)酵過程結(jié)束：

當(dāng)pH值不再變化，發(fā)酵停止，離子色譜法測(cè)量丙酸含量(樣品稀釋200倍)，丙酸含量為33.7g/L(圖6)，發(fā)酵所用時(shí)間為235h，丙酸生產(chǎn)速率為0.143g/(L·h)。

對(duì)比例2其它培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)丙酸

一、預(yù)處理

將常規(guī)甘油保藏的產(chǎn)酸丙酸桿菌按照1％的接種量接種于裝有種子培養(yǎng)基的厭氧瓶(100ml厭氧瓶裝100ml種子培養(yǎng)基)中，向厭氧瓶中充氮?dú)夂?，置?0℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)60h。按重量體積百分比(g/ml)計(jì)，種子培養(yǎng)基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：40g/L，余量為水，pH 7.0。

二、種子液

將上述厭氧瓶培養(yǎng)所得菌種按照1％的接種量無菌轉(zhuǎn)入裝有種子培養(yǎng)基的厭氧瓶(250ml厭氧瓶裝200ml種子培養(yǎng)基)，充入無菌氮?dú)?，培養(yǎng)溫度為30℃，時(shí)間為48h。按重量體積百分比(g/ml)計(jì)，二級(jí)種子培養(yǎng)基的成分為，酵母浸粉：10g/L、胰蛋白胨大豆肉湯：5g/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L、葡萄糖：20g/L、丙酸：1g/L，余量為水，pH 7.0。

三、生產(chǎn)發(fā)酵

1、在10L發(fā)酵罐中投入6L發(fā)酵培養(yǎng)基，初始發(fā)酵培養(yǎng)基成分：按重量百分比計(jì)，酵母膏：10g/L、蛋白胨：5g/L、氯化血紅素4mg/L、磷酸氫二鉀：2.5g/L、磷酸二氫鉀：1.5g/L，葡萄糖：20g/L，余量為水，發(fā)酵120小時(shí)后，按發(fā)酵液體積計(jì)算，補(bǔ)加40g/L的甘油及4mg/L氯化血紅素。

2、將種子液按照5％的接種量接種于發(fā)酵罐中；

發(fā)酵生產(chǎn)：培養(yǎng)溫度為30℃，攪拌速率50rpm，并保持氮?dú)獾某掷m(xù)充入。通過流加重量體積比(g/ml)為10％的Ca(OH)₂溶液，將pH值維持在7.0。

3、發(fā)酵過程結(jié)束：

當(dāng)pH值不再變化，發(fā)酵停止，離子色譜法測(cè)量丙酸含量(樣品稀釋200倍)，丙酸含量為34.9g/L(圖7)，發(fā)酵所用時(shí)間為226h，丙酸生產(chǎn)速率為0.154g/(L·h)。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。