專利名稱：使用繩狀青霉菌imi378536酶的生物增碳劑制備的制作方法
使用繩狀青霉菌IMI378536酶的生物增碳劑制備本發(fā)明涉及通過繩狀青霉菌(Penicillium funiculosum)獲得的酶混合物的用于 生物乙醇制造的生物量的酶促糖化作用。所述繩狀青霉菌根據(jù)布達佩斯條約保藏在國際真 菌研究所(International Mycological Institute)，保藏號 IMI 378536。本發(fā)明尤其涉及生物乙醇制造的生物量處理方法，所述方法使用纖維素酶、β _葡 聚糖酶、纖維素二糖水解酶、β -葡糖苷酶和可選地木聚糖酶?？稍偕举|(zhì)纖維素(lingocellulosic)生物量至乙醇的生物轉(zhuǎn)化作為獲得液體 燃料的可選方案已經(jīng)在最近的十多年里被廣泛的研究。生物乙醇制造的成本十分高而產(chǎn)能卻很低，人們進行持續(xù)的研究以使該方法更加 經(jīng)濟。酶法水解被認為是將纖維質(zhì)生物量轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的最有發(fā)展前景的技術(shù)。酶促步 驟的成本是該方法的主要經(jīng)濟因素之一。人們致力于提高纖維素材料的酶法水解的效率。Vidmantiene等(2006)描述了將多糖水解為谷類衍生廢物的方法以產(chǎn)生適于發(fā) 酵為乙醇的糖原料，其中使用兩種酶制劑，第一種酶制劑用于淀粉水解和糖化作用，其包括 來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)的α -淀粉酶和β -葡聚糖酶。此步驟在65°C 下持續(xù)90分鐘。第二種酶制劑包括來自泡盛曲酶(Aspergillus awamori)的葡糖淀粉酶、 α -淀粉酶和β -葡聚糖酶和β -木聚糖酶、纖維素酶和來自木霉菌(Trichoderma reesei) 的β -葡聚糖酶，該第二種酶制劑在55-60°C使用持續(xù)120分鐘。Ohgren等(2006)表示預水解處理對整體的乙醇產(chǎn)量沒有負面作用，所述預處理 或者在48°C下用補充有β -葡糖苷酶的市售纖維素酶混合物或者用在55°C下的熱活性酶 的培育組合物來進行，所述培育組合物包括來自嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus) 的改性的纖維二糖水解酶、來自嗜熱毛殼菌(Acremonium thermophilum)的葡聚糖內(nèi)切酶、 來自嗜熱子囊菌(T. auriantiacus)的β -葡糖苷酶和木聚糖酶蛋白質(zhì)。Tabka等(2006)描述了真菌木質(zhì)纖維素酶類將木質(zhì)纖維生物量轉(zhuǎn)化為用于發(fā)酵 糖類的用途的改良條件，該發(fā)酵糖類用于生物乙醇的制造。用稀釋的硫酸預處理麥秸，隨后 蒸汽蒸餾。源于不同真菌的酶之間的協(xié)同效應(yīng)顯現(xiàn)纖維素酶、來自里氏木霉(Trichoderma reesei)的木聚糖酶和來自黑曲霉菌(Aspergillus niger)阿魏酸酯酶，以嚴格的酶濃度 (10U/g纖維素酶、3U/g木聚糖酶和10U/g的阿魏酸酯酶)進行。通過將溫度從37°C提高到 50 0C來增加酶法水解的產(chǎn)量。需要降解纖維素基質(zhì)的新方法，尤其木質(zhì)纖維素基質(zhì)，且需要新的酶和酶混合物， 他們能夠提高降解的效率。還需要在低溫下操作的方法和酶，能夠使用高生物量一致性并 導致高糖和高乙醇濃度。本方法可以顯著節(jié)能并減少投資成本。本發(fā)明致力于達到以上需 求。本發(fā)明涉及使用來自特定的非遺傳修飾的繩狀青霉菌的至少一種酶混合物進行 生物量處理的方法，所述繩狀青霉菌保藏在國際真菌研究所，保藏號IMI 378536，其包括提 供生物量的步驟，并隨后在上文描述的條件下將所述生物量與酶混合物接觸，其中發(fā)生所 述生物量的糖化作用。根據(jù)本發(fā)明，從單獨的真菌類的繩狀青霉菌(根據(jù)布達佩斯條約保藏在國際真菌研究所，保藏號IMI 378536)獲得的酶混合物在歐洲專利申請No. 1007743中描述，其內(nèi)容 以引用的方式并入本文。根據(jù)EP1007743的描述，以上所述的繩狀青霉菌由保藏的菌株發(fā)酵而得，所述發(fā) 酵首先在27°C至36°C之間的孵化溫度下，種子培養(yǎng)基中(優(yōu)選由以下組成(重量)玉米 漿至4%，恰好防止發(fā)泡的止泡劑，加水至100%，在培養(yǎng)基滅菌之前，加入足以將pH調(diào) 整到約pH3. 0到約pH6. 0的NaOH)。產(chǎn)物培養(yǎng)基優(yōu)選地具有如下組成(重量)玉米漿0至4.0%，分批處理和給料 纖維素0. 8至14 %，鈣鹽0至0. 8 %，硫酸銨0至1. 0 %，恰好防止發(fā)泡的止泡劑，加水至 100%,在培養(yǎng)基滅菌之前，加入足以將ρΗ調(diào)整到約pH3. 0到約pH6. 0的NaOH ；及足以將ρΗ 保持在約3. 0至6. 0的H2SO4,足以將ρΗ保持在約3. 0至6. 0的氣體氨或液體氨；產(chǎn)物培養(yǎng) 基在27°C至36 °C之間的孵化溫度下使用。在發(fā)酵過程期間加入的主要碳源是纖維素；在這些不同的纖維素源當優(yōu)選使用不 同級別的 ARBOCEL、S0LKAFL0C、CLAROCEL、ALPHACEL 或 FIBRACEL。
發(fā)酵期間的ρΗ值優(yōu)選通過添加硫酸或其他酸、及氣體氨或液體氨或另外的堿來 控制。在發(fā)酵時間結(jié)束時，通過固體-液體分離方法去除固體，所述分離方法諸如過濾 或離心，液相被收集并離心，例如通過有機膜或礦物質(zhì)膜上的超過濾。根據(jù)本發(fā)明，可以用分離的純酶制劑的形式或粗制酶制劑的形式提供酶混合物， 所述粗制酶制劑諸如已經(jīng)生長有繩狀青霉菌的培養(yǎng)基。所述純酶制劑以商品名Rovabio LC市售。本發(fā)明的酶混合物可以用另外的純的或粗制的酶制劑(諸如木聚糖酶)來補充。根據(jù)本發(fā)明的生物量是指或的或剛剛死亡的植物材料，其可以用作燃料或其工業(yè) 上的制造。生物量包括碳水化合物和非碳水化合物材料。碳水化合物可以被細分為纖維素、 β _1，4連接的葡萄糖部分的線型聚合物、及半纖維素、復合的支化聚合物——其包括β-1， 4連接的木糖的主鏈及樹膠醛糖、半乳糖、甘露糖和葡糖醛酸支鏈。有時，木糖可以被乙酰化 為半纖維素鏈或至木質(zhì)素，樹膠醛糖可以包含阿魏酸或桂皮酸酯。生物量的最后主要成分 是木質(zhì)素，一種高度交聯(lián)的類苯基丙烷結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的方法可以用木質(zhì)纖維素生物量的主要成分實施，或者包含生物素(木質(zhì) 纖維素生物量還包括木質(zhì)素)的任何組合物，如種子、谷物、塊莖、植物廢物或食品加工或 工業(yè)加工的或產(chǎn)品(例如莖桿)、玉米(包括玉米棒、秸稈等)、草、木材(包括木片、加工廢 物)、紙、紙漿、回收紙(例如報紙)。在一個特定的方面，本發(fā)明的酶混合物用于水解纖維 素，所述纖維素包括β_1，4-連接的葡萄糖部分的線型鏈。但是在優(yōu)選的實施方式中，麥 秸、麥麩、大麻纖維、或剝皮大麻的莖被用作生物量。根據(jù)本發(fā)明處理的生物量包括由繩狀青霉菌獲得的酶混合物。根據(jù)布達佩斯條 約，所述繩狀青霉菌保藏在國際真菌研究所，保藏號IMI378536。其中，酶混合物包括至少木 聚糖酶、β-葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-葡糖苷酶、纖維素酶、果膠酶和阿魏酸酯酶，且 所述酶混合物能夠根據(jù)以上所述的方法獲得。在另外一個方面，根據(jù)本發(fā)明的方法可以包括在與至少一種酶混合物接觸之前的 生物量的預處理步驟。此預處理步驟致力于增加表面積和生物量與酶的可接觸性。預處理步驟可以是化學性質(zhì)的，諸如將生物量放置在98°C的硫酸水浴中，硫酸濃度為3g/升；或者預處理步驟可以是機械性質(zhì)的，諸如破碎所述生物量。本發(fā)明的另外一個方面涉及制造生物乙醇的方法，其包括如下步驟提供由繩狀 青霉菌獲得的至少一種酶混合物，所述繩狀青霉菌根據(jù)布達佩斯條約保藏在國際真菌研究 所，保藏號IMI 378536 ；提供生物量，在生物量的糖化作用發(fā)生的條件下使所述生物量與 酶混合物接觸；發(fā)酵所述糖化作用的產(chǎn)物。在本發(fā)明的特定的實施方式中，所述液體片段根 據(jù)糖化作用分離，所述分離可以通過離心培養(yǎng)基來制備，所述培養(yǎng)基包括生物量和酶混合 物。由繩狀青霉菌獲得的所述酶混合物，根據(jù)布達佩斯條約保藏在國際真菌研究所， 保藏號IMI 378536，所述酶混合物可以用作生物量的糖化作用。


圖1 使用Rovabio LC的纖維素消化性A.用100 μ 1 Rovabio LC/g底物進行水解，在37°C下，分別持續(xù)24、48、72和96
小時。纖維素水解的百分比通過干物質(zhì)稱重確定。B.糖的量由水解上清液的HPLC分析來測定。此圖表顯示在纖維素水解期間所釋 放的各種不同的糖的量。Ml 在溫和條件下的各種木質(zhì)纖維素底物的水解A. 100 μ 1 Rovabio LC/g底物進行麥秸和麥麩的水解。在28°C下進行72小時孵 化。B.此圖表顯示所有底物釋放的葡萄糖，且主要來自麥麩(0. 094g/g的初始S)。Ml 酶濃度對水解麥秸和麥麩的作用所述水解在在28°C下孵化72小時。A.麥秸和麥麩的水解的變化作為酶濃度的函數(shù)。B.所釋放的葡萄糖的量作為酶濃度的函數(shù)。圖4 由麥麩釋放的葡萄糖的量作為Rovabio LC濃度和水解時間的函數(shù)釋放的 葡萄糖的量的最大值是0.094g/g Si, 100 μ 1 Rovabio LC/g底物在28°C下作用72小時。S5 溫度對麥麩水解的作用用100 μ 1 Rovabio LC/g底物進行麥麩水解A.生物量的水解變化作為溫度和時間的函數(shù)。B.葡萄糖釋放量的變化作為溫度和水解持續(xù)時間的函數(shù)。M6 用稀釋酸進行的預處理對麥秸和麥麩水解的影響所述底物在50ml的3%的硫酸中，在98°C下孵化20分鐘，隨后用100ml的超純水 進行漂洗。在37°C下，用100 μ 1 Rovabio LC/g底物對兩種底物(A)進行水解。預處理 促進底物水解，但是對葡萄糖(B)的釋放有相反作用。Ml 用木聚糖酶水解麥麩繩狀青霉菌木聚糖酶B在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達，木聚糖酶 C在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中表達。木聚糖酶濃度使得木聚糖酶活性與包 含在200 μ 1 Rovabio LC的活性。Rov.-Xyn B是一種混合物，其中50%的木聚糖酶活性 來自Rovabio LC,另一半由木聚糖酶B來提供(同理，對于Rov. -Xyn C混合物，其中XynC是木聚糖酶C)。麥麩水解在37°C下進行72小時。A.用各種酶進行麥麩水解的比較。B.用各種酶從麥麩釋放的木糖和葡萄糖。
實施例實施例1 材料和方法1.酶和底物Rovabio LC是來自繩狀青霉菌(根據(jù)布達佩斯條約保藏在國際真菌研究所，保藏號IMI 378536)的酶混合物，其主要的已知活性是纖維素酶、木聚糖酶和β _葡聚糖酶活 性。還對繩狀青霉菌木聚糖酶進行測試。在巴斯德畢赤酵母菌中克隆的繩狀青霉菌的 木聚糖酶B和在解脂耶氏酵母中克隆的繩狀青霉菌木聚糖酶C。繩狀青霉菌發(fā)酵果汁也被使用。因為Rovabio LC是發(fā)酵產(chǎn)物，因此需要測試粗 制酶混合物的水解能力。所選擇的底物是最佳質(zhì)量的麥秸(Val Agro，批次37600205113)、麥麩(源頭未 知)、麥秸(源頭未知)和纖維素(JRS, Arbocel批次1600680121)。2.底物制備對于被研究的兩種底物，混合步驟是必要的以便優(yōu)化酶與底物的接觸性。它們是 最佳質(zhì)量的麥秸和麥麩。使用攪拌器進行分解，最終的顆粒尺寸是厘米數(shù)量級。在隨后的步驟中，所有的底物被等同地處理。所述底物被稱出并放置到錐形瓶當 中，隨后添加50ml的0. IM醋酸鹽緩沖液(pH 5. 4)。所述錐形瓶隨后在121°C下加壓滅菌 20分鐘。3.化學預處理與溫和條件下實施的試驗相平行，麥秸和麥麩進行化學預處理。預處理的目標是 改變生物量的物理結(jié)構(gòu)和分離各種片段以便使得纖維素更易于接近所述酶，這將能夠?qū)⑵?轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖。這些底物與20ml的濃度3g/l的硫酸相接觸，隨后在98°C下水浴中孵化 20分鐘。它們隨后用100ml的超純水洗滌。洗滌水被去除且預處理底物隨后使用與處理其 他底物相同的方式處理，即添加醋酸鹽并隨后進行高壓蒸汽滅菌。4.酶法水解錐形瓶冷卻到室溫后，酶溶液在滅菌條件下被添加到錐形瓶中。每種條件被測試 兩次，對照被整合到每個測試中。所述對照包括不含有酶的錐形瓶。測試不同濃度的酶以 便確定酶量/底物量的比率，這是最有效的，即最可能的比率。對包含除Rovabio LC之外 的酶的測試，測定所使用的量，使纖維素和/或木聚糖酶活性與Rovabio LC的活性相同。錐形瓶隨后孵化24、48或72小時，并在給定溫度下以150rpm攪拌。在不同的測 試期間，被測試的溫度分別是28、30和37°C。5.可溶解和不可溶解片段的分離孵化后，不同樣本的可溶解片段通過4°C下IOOOOg力持續(xù)離心15分鐘來回收。等 分上清液并在_20°C下保存以便隨后通過HPLC分析。至于片劑，首先用50ml水洗滌，隨后 用40ml水再次洗滌。每次洗滌后，片劑通過離心(之前的相同條件)回收且洗滌的上清液也被等分以便通過HPLC分析。此外，為了估計轉(zhuǎn)化為底物的可溶性糖的百分比，片劑在120°C下干燥24小時， 隨后稱重。水解后保留的可溶性生物量的百分比等于(保留的干物質(zhì)/初始的干物 質(zhì))X 100。為了確定初始干物質(zhì)，不依賴于水解測試，每種底物被稱重且在121°C下干燥24 小時。因此，新鮮底物和干物質(zhì)之間的質(zhì)量差使得我們能夠確定包含在生物量中的濕度百 分比。隨后能夠?qū)穸劝俜直仁┯玫矫看涡迈r底物稱重以便確定其干質(zhì)量。6.上清液的HPLC分析 為了測定可溶性片段的糖組合物，離心上清液以及洗滌上清液使用HPLC(Agilent 1100)進行分析。層析系統(tǒng)包括等度抽運系統(tǒng)、樣本轉(zhuǎn)換器、前置柱(Bio-Rad， Micro-Guard Carbo P)、Aminex HPX-87P 柱(Bi0-Rad)、RID (示差折光檢測)檢測 器或折射計和數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)。注射到層析住中之前，4°C下用I6i00g力離心處理上 清液30分鐘以便使雜質(zhì)成球。其隨后通過0. 45 μ m纖維素薄膜過濾。分析條件如下色譜 法在80°C下進行，移動相是超純水，流速0. 6ml/分鐘，注射20 μ 1樣本，隨后用100 μ 1水 洗滌。樣本組分通過他們保留時間來鑒定，通過預先確定的校準范圍。此范圍由4種糖組 成，所述糖的濃度范圍在0. 5g/l到25g/l之間。用于校準范圍的糖是纖維二糖、D-葡萄糖、 D-木糖和L-阿拉伯糖。它們是主要在木質(zhì)纖維素生物量的水解期間主要釋放的糖。7.纖維素酶和木聚糖酶活性的分析酶活性通過3，5- 二硝基水楊酸(DNS)測定方法(G. L. Miller, 1959)來測量。纖 維素酶和木聚糖酶活性的單位限定為在限定的酶促條件下，每分鐘和每克產(chǎn)物分別釋放 一微摩爾葡萄糖當量或木糖當量所需的酶量，所述限定的酶促條件即，對于纖維素酶活性 是pH5和對于木聚糖酶活性是pH4，溫度是50°C。對于纖維素酶活性，測試是根據(jù)羧甲基纖維素(CMC)的酶水解進行的，其是通過 β -1，4連接的葡萄糖聚合物。酶法水解釋放葡萄糖單體，其濃度在比色測定反應(yīng)結(jié)束時測 定，并使用葡萄糖標準曲線，其吸光度在540nm下測定。酶的稀釋液在超純水中制造。每個 樣本測定兩次以便獲得平均活性且對照也被制備。1.75ml底物(1.5%w/v CMC)置于試管 中，隨后在50°C下在水浴中孵化5分鐘。反應(yīng)隨后通過加入250 μ 1的酶稀釋物觸發(fā)，對照 管中無此操作。隨后嚴格的10分鐘后通過添加2ml 1%。(w/v)的DNS使其停止，溫度仍舊 是50°C。在此階段，從水浴中移出試管，250 μ 1的酶稀釋劑被添加到對照管中，隨后所有的 管被停止反應(yīng)并轉(zhuǎn)移到95°C的第二水浴中持續(xù)5分鐘(嚴格)。通過釋放葡萄糖，此步驟 使DNS (橙色染色)分解為3-氨基-5-硝基水楊酸(橙-紅顯色)。試管隨后置于冷水浴 中以便使其回復到室溫。最后，通過加入IOml水進行另外的稀釋，吸光度在540nm讀取。對于木聚糖酶活性，含量測定原則相同。因為底物是1.5% (w/v)樺木的木聚糖， 酶法水解釋放木糖單體，其對于纖維素酶活性具有與葡糖糖相同的水解作用。另一方面，用 木糖制備標準范圍。實施例2 通過使用Rovabiolg LC進行簡單底物轉(zhuǎn)化的評價纖維素我們使用的市售纖維素實際上是純纖維素和半纖維素的混合物。纖維素是β_1， 4連接的D-葡萄糖。利用Rovabio LC的纖維素酶活性(內(nèi)-1，4_ β -葡聚糖酶、纖維二 糖水解酶和β “葡糖苷酶)，Rovabio LC因此將纖維素水解并釋放葡萄糖單體，在生物乙 醇合成的基礎(chǔ)上。半纖維素是D-木糖單體(β_1，4連接)聚合物，并支化不同的糖，例如甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖等。其還通過Rovabio LC水解，利用Rovabio LC的木聚糖酶 活性(內(nèi)-1，4-β-木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖酶等)。
因為纖維素是99. 5%純的(根據(jù)供應(yīng)商)，因此可以評估Rovabio LC的在試驗 條件下的最大水解能力(主要是其纖維素酶活性還有木聚糖酶活性)，其接近于生物量轉(zhuǎn) 化試驗而不是酶活性試驗。為了評估纖維素轉(zhuǎn)化為可溶性糖的產(chǎn)量，我們使用兩種方法作 為基礎(chǔ)。第一種方法包括稱重干物質(zhì)；第二種方法使得我們能夠通過水解和洗滌上清液的 HPLC分析釋放的糖的量和性質(zhì)。對于此底物，在100 μ Ι/g底物的Rovabio LC濃度進行所述酶法水解，溫度37°C。 在24和96小時之間監(jiān)測孵化期。1.干物質(zhì)水解產(chǎn)量通過反應(yīng)后保留的干生物量百分比來估算。由于纖維素是簡單聚合物，與余其他被研究的生物量不同，其水解程度是最大 的，即應(yīng)當接近90-99%的范圍，并且非常必定在相對短的時間內(nèi)，如已經(jīng)對酶復合物 Accelerase 1000 (技術(shù)公告 No. 1，Genencor)所觀察到的。但是，如在圖IA中所示，纖維素水解在96小時后僅到達27. 3%。實際上，水解后， 回收大約70%的不溶性片段。根據(jù)水解條件和底物性質(zhì)，這個結(jié)果是令人驚訝的。對于這樣 的結(jié)果的一種解釋是水解條件過于溫和(溫度、PH等)，或相對于底物的量酶濃度過低，或 者相反地是由于通過纖維素二糖水解酶釋放的纖維素二糖抑制某些纖維素酶(Valjamie P.等，2001)。為了核實此假設(shè)，上清液的HPLC分析的結(jié)果應(yīng)該被檢驗。2.釋放的糖的分析因為纖維素是99. 5%純的，我們可以期望所水解的28%對應(yīng)為葡萄糖、數(shù)量稍 少的纖維二糖、源自半纖維素片段的木糖。圖IB顯示在纖維素水解期間釋放的各種不同的 糖。所釋放的木糖的量達到0. 08g/g的初始固體(Si)，即從IOOg纖維素釋放8g木糖。至于釋放的葡萄糖，在96小時后，釋放0.225g/g Si。此結(jié)果與以上所述干物質(zhì)的 差相一致。實際上，纖維素的可溶型水解是28%，其以葡萄糖(22.5%)和木糖(8%)為形 式。邏輯上，從纖維素釋放的葡萄糖的量應(yīng)當代表使用Rovabio LC水解木質(zhì)纖維素生物 量期間所能夠釋放的最大量。最后上清液分析還顯示存在纖維二糖。該纖維二糖利用酶合劑的纖維二糖水解酶 活性而從纖維素釋放出來。纖維素二糖的濃度是恒定的且在24和96小時之間相對低的 (大約0.026g/g Si)。因此不存在底物抑制，否則纖維二糖濃度將隨著水解時間增加，而葡 萄糖濃度保持恒定。因此，低水平纖維素水解可能是由于酶濃度不足或由于水解條件過于 溫和。但是，我們選擇在相對溫和的條件下進行試驗，與那些在現(xiàn)在工業(yè)上實施的條件相比 較。這種選擇受到在相對便宜條件下Rovabio LC有效性的需要的引導。因此，隨后在復 雜生物量上進行的測試在初始設(shè)置的條件下進行。實施例3 在溫和條件下進行的各種生物量的水解在隨后的試驗中，測試的底物量是2g，Rovabio LC的濃度是100 μ 1/g底物，水解 條件如下28°C下持續(xù)水解72小時。生物量水解結(jié)果在圖2A中顯示，HPLC分析結(jié)果在圖 2B中顯示。1.小麥
在法國，小麥是最廣泛用于生物乙醇生產(chǎn)中的一種底物。其也是能夠得到最好結(jié) 果的Rovabio LC水解產(chǎn)量的底物。我們研究它的兩種形式麥秸和麥麩。 1. 1 麥秸麥秸由以下成份組成33%至43%的纖維素，20%至25%的半纖維素和15%至 20%之間的木質(zhì)素(IFP源，2007)。因為標準尺寸過大，通過攪拌將其分解。最終顆粒尺寸 在厘米數(shù)量級。酶法水解后，回收的不溶性生物量的數(shù)量是80%，從對照回收的量是90%。水解 因此導致生物量減少11. 2%。至于上清液的HPLC分析，這種底物觀察到用于我們的校準范圍的四種糖的釋 放。存在少量(0.005g/g Si)纖維二糖，其表示可能通過葡糖苷酶的有效水解。阿拉 伯糖也被檢測到，不過是痕量，同樣地木糖的釋放濃度是0.009g/g Sio這兩種糖的存在是 Rovabio LC的半纖維素酶活性(特別是內(nèi)-1，4_β-木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖酶和 β-木糖苷酶)的特征。水解期間釋放的葡萄糖的量是0.034g/g Sio即使其是主要在這 些水解條件下釋放的糖，其濃度保持過低以將麥秸設(shè)計為生物乙醇合成的基本底物。不管是否被混合麥秸保持為原料。但是酶法水解通過使用所述底物促進，所述底 物表面積小而且木質(zhì)素比例低，其中纖維素結(jié)晶性低。麥麩是具有這些特征的底物。1. 2 麥麩難于精確地確定麥麩的每種組分的比例，因此這種組合物根據(jù)小麥的源和根據(jù)所 述小麥的制粉而不同，并且根據(jù)所使用分析的方法而有所不同。但是，其含有平均在3%和 7%之間的木質(zhì)素(Schwartz等，1988)且其可溶性糖組合物顯示為如下2. 的半乳糖、 23. 7%的阿拉伯糖、29. 的葡萄糖和43. 7%的木糖(Benamrouche等，2002)。在測試的過程中，麥麩是顯示了酶法水解的最佳特性的底物。具體地，在水解后觀 察到生物量減少32. 5%。此外，上清液的HPLC分析顯示可溶性片段由以下組成0. 048g纖 維二糖/g Si ;0.034g阿拉伯糖/g Si ;0.076g木糖/g Si和0. 094g葡萄糖/g S”因此，在 溫和水解條件下，量為大約10%的水解底物以葡萄糖形式釋放。我們獲得的可溶性糖的比 例與Benamrouche等人預測的那些并不相似，因此另一方面，酶法水解可能不完全，另一方 面，麥麩的糖組合物可以顯著地根據(jù)其源頭和麥粉的磨粉而有所不同。對于釋放葡萄糖，麥麩顯示為一種理想的底物。這些第一試驗在相對溫和的水解條件下進行(28°C持續(xù)72小時，酶濃度100 μ 1/g 底物)。實施例4 水解條件的優(yōu)化這種優(yōu)化包括3個必要因素酶濃度、水解溫度和化學預處理以便提高底物和酶 的可接觸性。1.酶濃度的效果為了增加從底物釋放的葡萄糖，符合邏輯的推理是增加酶濃度。但是至今，生物燃 料發(fā)展的主要障礙是用于木質(zhì)纖維素生物量的糖化作用步驟總所使用的酶的成本。出于這 個原因，必要的是限制酶濃度。我們因此測試酶濃度對兩種底物(麥秸和麥麩)的效果，這兩種底物在之前的條 件下得出最好的結(jié)果。除了所使用的酶的量，分析條件未改變，即在150rpm的攪拌速度下，28°C下孵化72小時。主要感興趣的是水解的生物量的百分比以及釋放的葡萄糖的量。對于麥秸，評估三種濃度濃度40 μ 1 Rovabiο LC/g底物、100 μ IRovabiο LC/ g底物和200 μ 1 Rovabio LC/g底物。根據(jù)100 μ 1 R0Vabi0TMLC/g麥秸的濃度獲得的結(jié) 果，不論處理成本而測試更高的濃度。至于干生物量的水解效果濃度40 μ 1 Rovabio LC/g底物、100 μ IRovabio LC/ g底物和200μ1 Rovabio LC/g底物，分別觀察到干生物量減少1. 2%、11. 2%和15% (圖 7A)。應(yīng)當注意Rovabio LC濃度的加倍并不導致相同比例的麥秸水解。正如所期待的，對于200yl/g底物的酶濃度觀察到葡萄糖的最大釋放量。特別地，對于增加Rovabio LC濃度，分別得到0. 025,0. 034和0. 067g葡萄糖/g Si (圖7B)。 在這個例子中，隨著酶濃度增加，所釋放的葡萄糖的量增加。有利地，應(yīng)當注意，對于40μ 1 Rovabio LC/g底物的濃度，每100μ IRovabio LC/g底物所釋放73%葡萄糖當量。這個 結(jié)果顯示了使用較少的酶同時保持纖維素酶有效性的可能性。水解還使木糖釋放實際等量 于 40 和 100 μ 1/g 底物濃度(分別是 0. 007 和 0. 009g/g Si)，對于 100 μ IRovabio LC/g 底物濃度，是0.018g木糖/g Si。對于麥麩，我們研究四種不同濃度20 μ 1 Rovabio LC/g底物、40 μ IRovabio LC/g底物、50 μ 1 Rovabio LC/g底物和 100 μ 1 Rovabio LC/g底物。Rovabiο LC濃度的 增加對于增加麥麩水解有效果，但是對于麥秸效果并不是按比例的。實際上，遞增濃度時， 伴隨著獲得干生物量減少水解的麥麩為23%、25%、32%和32. 5%。50 μ 1 Rovabio LC/ g底物的濃度因此足以達到最大程度水解。其將顯示為對于所使用的水解條件即pH 5.4， 溫度28°C，Rovabio LC底物的最大水解不超過約30%。上清液的HPLC分析還顯示使用較高酶濃度的益處。實際上，釋放的葡萄糖的量 隨著被使用進行水解的Rovabio LC濃度而增加。釋放的量如下0. 04,0. 058,0. 068和 0.094g的葡萄糖/g Si，分別對于20、40、50和100 μ Ι/g底物的各種RoVabioTMLC濃度(圖 3)。重要的是需要注意到，最高RoVabioTMLC濃度所獲得的葡萄糖釋放的最大量的同時，增 加50%酶濃度，釋放葡萄糖僅增加28%。因此，減少所使用的酶量，但不過分減少所釋放葡 萄糖的量是可能的。此外，我們還分析使用不同濃度的R0Vabi0TMLC進行水解所得到的上清液，所述水 解持續(xù)24、48和72小時(圖4)。于是得出若干結(jié)論，首先，對于相同的水解時間(24、48或 72小時)，最大量的葡萄糖總是通過最高酶濃度來釋放。此外，對于相同的R0Vabi0 LC濃 度，釋放的最大量的葡萄糖在72小時后獲得。但是，在此之前48小時，出現(xiàn)對應(yīng)于可釋放 葡萄糖的最大量的80%的一個平臺。觀察到木糖的相同釋放分布，72小時水解和100μ 1/ g底物的Rovabi0TMLC濃度獲得的Si的0. 076g/g的最大濃度。所有這些結(jié)果清楚地確定了這樣一個事實可以進行水解，或者以低濃度的 Rovabio LC且經(jīng)歷更長的水解時間，或者用高的酶濃度但是經(jīng)歷較短水解時間。2.溫度效應(yīng)之前的測試在溫度28°C下進行，但是這不是R0Vabi0TMLC活性的最佳溫度。實際 上，此酶合劑由各種活性組成，通常在50°C下進行測試。此外，R0Vabi0TMLC首先是用于動物 飼料中的一種營養(yǎng)添加劑。其因此必須能夠在動物消化道溫度(根據(jù)不同物種，該溫度在 38和41°C之間變化)下顯示活性。因此，木質(zhì)纖維素生物量的水解測試不得不在28°C以上的溫度進行。為了評估溫度對于用R0Vabi0 LC對木質(zhì)纖維素生物量進行水解的影響，我們進 行一系列試驗，麥麩作為底物，RovabioTMLC濃度為100 μ Ι/g底物，在3種不同溫度(28、30 或37°C )下持續(xù)24、48和72小時(圖5A)。根據(jù)之前試驗的獲得的最佳結(jié)果測定底物和 酶濃度。當觀察在此試驗中水解的生物量的百分 比時，注意到若干令人驚訝之處(圖5B)。 首先，不考慮水解時間，在30和37°C的水解之間僅有輕微差別。另一方面，如果他們與在 28°C進行的水解相比較，注意到水解生物量百分比的輕微增加(平均32%、39%和39%的 麥麩在28、30和37°C的溫度下水解)。因此，清楚的是在28°C以上的溫度促進水解。對于不同酶活性的溫度的效果，更特別地觀察到對纖維素酶活性的效果。與處理干生物量獲得的結(jié)果不同，由分析上清液所得結(jié)果更加具有一致性。實際 上，所釋放葡萄糖的量隨著時間增加，在并37°c下進行的試驗中達到最大值。具體地，所得 到37°C下水解72小時的最大濃度是0. Ilg葡萄糖/g Si。在此測試中，溫度增加為大約 10°C，因此能夠使水解葡萄糖量增加14. 5%。至于木糖，釋放曲線與葡萄糖釋放曲線相似，所釋放木糖的最大量是0.096g/g Sit5這是數(shù)值上的釋放量，因為木糖還可以從生物乙醇生產(chǎn)過程中回收。即使所測試的溫度非常相似，釋放的可溶性糖的量的增加與水解溫度的增加相平 行。由于在R0Vabi0TMLC活性試驗中所使用的溫度是50°C，因此能夠設(shè)計在37°C以上再次 優(yōu)化木質(zhì)纖維素生物量的水解。盡管需要確定較經(jīng)濟的水解條件，在某些條件下，糖化作用方法的添加步驟是不 可避免的，尤其是當?shù)孜锞哂羞^高的半纖維素或木質(zhì)素組合物時。3.化學預處理的效果用于制造生物乙醇的底物是相對原始的并可以在酶法水解之前的預處理。各種類 型的預處理存在，他們所有的目的是提高底物與酶的可接觸性，通過減少顆粒尺寸或通過 減少半纖維素和/或纖維素片段。已經(jīng)開發(fā)出許多預處理物理預處理(加壓底物)、熱預 處理(蒸汽噴發(fā))(MosierN.等，2005)或其他化學(酸的或堿的)預處理?；瘜W預處理到 目前為止是最為廣泛應(yīng)用的，不僅是在實驗室條件下，還在工業(yè)發(fā)展中(Schell D.J.等， 2003)。我們所選擇實施的一種是用3%硫酸在98°C的溫度下進行的預處理。這些預處理 條件不同于習慣上所用的那些。實際上，預處理在更高的溫度(100至200°C)以及低的酸濃 度(相比濃縮的大致稀釋六倍)條件下進行(Lloyd Τ. Α.等，2005 ；Wyman C. Ε.等，2005)。 我們之前所見的，麥秸具有高百分比的半纖維素和木質(zhì)素，他們是纖維素保護層。酸預處理 具有去除半纖維素片段以及改變木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的特性，因此使得纖維素易于接觸酶。我們比 較酸預處理對于以上所研究的兩種底物(麥秸和麥麩)的有效性，其中麥秸在溫和條件下 不能顯著水解。經(jīng)預處理且隨后用R0Vabi0TMLC水解的生物量百分比是17. 5%的麥秸水解，未預 處理，且39. 6%的麥麩水解，未預處理，水解達到20% (圖6A)。預處理因此顯示出對使用 Rovabio LC水解底物的正面效應(yīng)。另一方面，當處理釋放的葡萄糖的量，預處理有效性是較不明顯的(圖6B)。對于麥秸，釋放的葡萄糖的量是0.063g/g Si,即與無預處理水解相比損失30%。最后，對于麥 麩，釋放的葡萄糖的量是0.062g/g Si,即與無預處理水解相比少了 34%。隨后的結(jié)果，明 顯的是預處理對從生物量中釋放葡萄糖不具有預期的效果?？梢蕴岢鰞煞N解釋或者所述 酸預處理降解纖維素，在該例子中葡萄糖加熱后處于酸溶液中，或者是預處理后底物PH過 低，且使R0Vabi0TMLC的纖維素酶活性失活。為了證實這些假定，我們首先在預處理后通過HPLC分析洗滌上清液。該分析未顯 示存在任何可溶性糖，纖維素因此不能通過預處理而能夠溶解。其次，我們驗證在50ml的 PH 5. 4 (水解之前混合)的0. IM醋酸鹽緩沖液中的預處理底物pH，PH 5. 4以及在相同緩 沖液中的未預處理底物的PH。預處理混合物的pH是5. 1，未預處理底物的pH是5. 6。我們 因此通過DNS實驗方法在pH 5. 1和pH 5. 6測定R0Vabi0 LC的纖維素酶活性，以便確實所 述活性是否受到PH減少的影響(DNS試驗通常在pH 5下進行)。觀察到的兩種試驗條件之 間的差別為7%，然而其不能解釋預處理對底物的影響，首先是因為活性的差別很小，第二 是因為對于施加到我們試驗中的較低的PH值，纖維素酶活性更高。但是，另一種解釋是可能使用稀酸預處理可能導致糖的降解，由于PH過于酸性 (Ogier et al.，1999)。這些降解將改變底物，其因此酶將不能夠識別這些改變的底物。
到目前為止，我們已經(jīng)致力于R0Vabi0TMLC在木質(zhì)纖維素生物量的糖化作用過程 中的特性，其主要目的在于由這些生物量產(chǎn)生葡萄糖。這是因為葡萄糖是到目前為止優(yōu)選 的制造生物乙醇所使用的生物體底物。但是，能夠?qū)⑵咸烟呛湍咎峭癁樘荚吹男碌霓D(zhuǎn)基 因修飾的生物已經(jīng)開始使用。因此有利地是研究純木聚糖酶對木質(zhì)纖維素底物的效果。此 夕卜，生物乙醇產(chǎn)物必須以較經(jīng)濟的方式實施。目前，R0Vabi0TMLC是配制產(chǎn)品；我們因此還要 研究繩狀青霉菌發(fā)酵果汁水解木質(zhì)纖維素底物的能力。實施例5 用木聚糖酶和發(fā)酵果汁水解以下試驗僅對麥麩進行。分析條件如下37°C下水解(最有效溫度)72小時。酶 濃度進行如下定義，對于木聚糖酶，活性相當于200μ lR0Vabi0TMLC，對于發(fā)酵果汁，所保持 的纖維素酶活性與200 μ 1 RoVabioTMLC相似。結(jié)果在圖7中顯示。1.木聚糖酶B所需木聚糖酶B的濃度是150 μ Ι/g底物，使其具有與R0Vabi0TMLC相當?shù)幕钚浴?用木聚糖酶B水解后，回收79%的麥麩，其意味著水解達到21%。此外，上清液的HPLC的分析顯示存在單糖0.021g木糖/g Si,即在相同水解條件 下比R0Vabi0 LC少4. 6倍。此結(jié)果可以通過如下事實來解釋，即R0Vabi0 LC是包括各種 活性的酶合劑，它們彼此協(xié)同作用，因此有利于復合底物降解為可溶性糖。另一種繩狀青霉菌的聚糖酶被過表達其是木聚糖酶C。2.木聚糖酶C用于這些試驗中的木聚糖酶C濃度是850 μ Ι/g的底物。僅18%的麥麩在72小時 后用木聚糖酶C水解。看上去木聚糖酶C相比木聚糖酶B對于水解此類型底物是效果較差 的。另一方面，HPLC分析結(jié)果是令人驚訝的。具體地，水解上清液中發(fā)現(xiàn)痕量木糖 (0. 004g/g Sj)，葡萄糖濃度是0.057g/g Si。釋放的木糖的量是較低的，盡管努力保持木聚 糖酶活性與Rovabi0TMLC活性相當。除此之外，如果檢驗出木聚糖酶，則不期望存在葡萄糖。因此，將存在繩狀青霉菌木聚糖酶也具有纖維素酶活性。僅木聚糖酶自身不具有與R0Vabi0TMLC相同的從麥麩中釋放木糖的活性，可能是 因為純木聚糖酶活性不能得益于R0Vabi0TMLC的各種活性的互補性。3. Rovabio 和木聚糖酶協(xié)同如下試驗包 括用R0Vabi0TMLC提供的50%木聚糖酶活性對麥麩進行酶法水解，余 下的是50%木聚糖酶B或木聚糖酶C。所述反應(yīng)在37°C下進行72小時。Rovabio LC-木聚糖酶B混合物使得麥麩水解41 %，而R0Vabi0TMLC-木聚糖酶C 混合物使得麥麩水解38%。用R0Vabi0TMLC的水解使得麥麩水解37%。因此整體水解效率 被保持；此處木聚糖酶補充RoVabioTMLC的作用。此外，通過R0Vabi0TMLC和木聚糖酶B的聯(lián)合作用，獲得釋放的0. 12g葡萄糖和 0. 095g的木糖/g Si。Rovabio LC-木聚糖酶C混合物部分地使得釋放0. 136g葡萄糖/g Si和0.07g的木糖/g Si。這些結(jié)果比那些水解麥麩或單獨使用R0Vabi0TMLC那些要好，因 此確定了 Rovabi0TMLC復合體的各種酶之間的相互作用的重要性。研究用木聚糖酶水解麥麩以后，一個測試留待去執(zhí)行對于木質(zhì)纖維素底物酶法水 解的此項研究用發(fā)酵果汁水解麥麩。4.發(fā)酵果汁因此我們分析了用587μ 1的繩狀青霉菌發(fā)酵果汁水解麥麩，在37°C和72小時的 條件下。這個測試使用的發(fā)酵果汁對應(yīng)于在在4°C下用ISOOg力離心的發(fā)酵上清液。獲得44%水解的麥麩，這表明與其他測試的整個過程相比本質(zhì)上更大程度的水 解。上清液得出0. 129g葡萄糖/g Si和0. 106g木糖/g Si。再次，所釋放的葡萄糖和木糖 的量略大于通過使用RoVabioTMLC水解麥麩所獲得量。參考文獻Benamrouche S, Cronier D, Debeire P, Chabbert B. (2002). A chemical and histological studyon the effect of(1 — 4)- β-endo-xylanase treatment on wheat bran. Journal of cereal science,36 (2) :253_260.Lloyd TA，Wyman C E. (2005). Total Sugar Yields for Pretreatment by HemicelluloseHydrolysis Coupled with Enzymatic Hydrolysis of the Remaining Solids. BioresourceTechnology,96(18) : 1967-1977，2005.Miller G. L. (1959) . Use of dinitrosal icy 1 ic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, vol. 31,p.426-428.Mosier N,ffyman C,Dale B,Elander R，Lee YY,Holtzapple M,Ladisch M. (2005 a). Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass.Bioresourcetechnology, 96(6) :673_86.Mosier N, Hendrickson R, Ho N, Sedlak M, Ladisch MR. (2005b). Optimization of pHcontrolled liquid hot water pretreatment of corn stover.Bioresource technology,96(18) 1986-93.Ohgren K, Vehmaanrera J Siika-Aho M, Galbe M, Viikari L, Zacchi G (2007). Hightemperature enzymatic prehydrolysis prior to simultaneous saccharification and fermentationof steam pretreated corn stover for ethanol production. Enzymeand Microbial Technology 40， 607_13· OgierJC，Leygue JP，Ballerini D，Pourquie J and Rigal L (1999). Production d ' ethanol a partirde biomasse ligno-cellulosique. Oil&Gas Science and Technology-Rev. IFP，54(1) :67_94·Schell DJ，F(xiàn)armer J，Newman M，McMillan JD. (2003) · Dilute—sulfuric acid pretreatment ofcorn stover in pilot-scale reactor !investigation of yields, kinetics，and enzymatic digestibilitiesof solids. Applied biochemistry and biotechnology,105-108 :69-85.Schwarz PB, Kunerth WH, Young VL. (1988). The distribution of lignin and othercomponents within hard red spring wheat bran. Chemical chemistry，65 :59_64.Tabka MG， Herpoel-Gimbert I, Monod F, Asther M, Sigoillot JC(2006). Enzymaticsaccharification of wheat straw for bioethanol production by combined cellulose，xylanase andferuloyl esterase treatment. Enzyme and Technology 39， 897-902.Valjamae P，Pettersson G，Johansson G. (2001). Mechanism of substrate inhibition in cellulosesynergistic degradation.Europeanjournal of biochemistry,268(16) :4520_6.Vidmantiene D， Juodeikeiene G， Basinskiene L. (2006)Technical ethanol production fromwaste of cereals and its products using a complex enzyme preparation. J. of the Sci. of Foo andAgric. 86 1732-1736.Wyman CE，Dale BE，Elander RT，Holtzapple M，Ladisch MR，Lee YY. (2005). Comparativesugar recovery data from laboratory scale application of leading pretreatment technologies tocorn stover.Bioresource technology,96 (18) :2026_32·
權(quán)利要求
一種處理生物量的方法，其包括如下步驟(a)提供由繩狀青霉菌獲得的至少一種酶混合物，所述繩狀青霉菌根據(jù)布達佩斯條約被保藏在國際真菌研究所，保藏號IMI 378536；(b)提供植物生物量；(c)在所述生物量發(fā)生糖化作用的條件下，使步驟(a)的所述酶混合物與步驟(b)的所述生物量接觸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的處理生物量的方法，其中，在與步驟(a)的所述酶混合物接觸 之前，所述生物量進行至少一個預處理步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述預處理步驟是化學預處理，其包括將所述生 物量置于98°C的硫酸水浴中，所述硫酸的濃度是3g/升。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述預處理步驟是機械預處理，其包括壓碎所述 生物量。
5.一種制造生物乙醇的方法，其包括(a)提供由繩狀青霉菌獲得的至少一種酶混合物，所述繩狀青霉菌根據(jù)布達佩斯條約 被保藏在國際真菌研究所，保藏號IMI 378536 ；(b)提供生物量；(c)在植物廢物產(chǎn)品發(fā)生糖化作用的條件下，使步驟(a)的所述酶混合物與步驟(b)的 所述生物量接觸；(d)發(fā)酵根據(jù)步驟(c)所獲得的產(chǎn)物。
6.根據(jù)要求1至5所述的方法，其中，所提供的所述酶混合物是分離的純酶制劑。
7.根據(jù)要求1至5所述的方法，其中，所提供的所述酶混合物是粗制的酶制劑。
8.根據(jù)要求1至7所述的方法，所述生物量選自麥秸、麥麩、大麻纖維或者剝皮大麻的莖。
9.包括由繩狀青霉菌獲得的至少一種酶混合物的組合物在生物量的所述糖化作用中 的用途，所述繩狀青霉菌根據(jù)布達佩斯條約被保藏在國際真菌研究所，保藏號IMI 378536。
10.一種被處理的生物量，其包括由繩狀青霉菌獲得的至少一種酶混合物，所述繩狀青 霉菌根據(jù)布達佩斯條約被保藏在國際真菌研究所，保藏號IMI378536。
全文摘要
本發(fā)明涉及處理生物量的方法，其包括如下步驟(a)提供由繩狀青霉菌獲得的至少一種酶混合物，所述繩狀青霉菌根據(jù)布達佩斯條約被保藏在國際真菌研究所，保藏號IMI378536；提供植物生物量；在糖化作用發(fā)生的條件下，使步驟(a)所述酶混合物與步驟(b)所述生物量接觸。
文檔編號C12P19/04GK101889093SQ200880119248
公開日2010年11月17日 申請日期2008年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月5日
發(fā)明者馬克·馬斯特拉斯 申請人:安迪蘇法國聯(lián)合股份有限公司