專利名稱：使用mfg-e8預防和治療缺血/再灌注后的炎癥和器官損傷的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及使用乳脂肪球EGF-因子 8 (milk fat globuleEGF-factor 8，MFG_E8) 預防和治療缺血/再灌注后，特別地腸道(gut)或腸缺血/再灌注后的炎癥和器官損傷以 及治療肺損傷例如急性肺損傷。
背景技術：
在整個本申請中，在括號中提及各種出版物。這些參考文獻的完全引用可見于權 利要求之前的本說明書的結尾。這些出版物的公開內(nèi)容以它們的全文通過引用合并入本申 請以更全面地描述本申請所屬的領域。再灌注損傷是指當在一段時間的缺血后血液供給返回組織時引起的對組織的損 傷。腸缺血可在多種臨床狀況中發(fā)生，包括小腸移植、腸系膜上動脈閉塞、與低血流狀態(tài) (low flow state)相關的心功能不全以及出血性休克和壞死性小腸結腸炎。腸系膜缺血仍然是至關重要的問題，其導致高達60-80%的死亡率(1)。多器官功 能衰竭，包括急性肺損傷(ALI)是腸缺血/再灌注(I/R)損傷的常見并發(fā)癥并且促成其高 死亡人數(shù)(2)。ALI由因促炎細胞因子和細菌源性內(nèi)毒素從再灌注的缺血組織釋放而導致 的全身性炎性應答引起(3-6)。到目前為止，只發(fā)現(xiàn)有限數(shù)量的在I/R和急性肺損傷中提 供一些益處的藥物治療選擇，其中大多數(shù)靶向炎性介體(inflammatory mediator)和氧化 應激途徑(7)。I/R損傷的至關重要的方面是腸和支氣管上皮細胞以及II型肺泡巨噬細 胞的凋亡細胞死亡的增加的發(fā)生(2，8_11)。細胞凋亡與肺上皮細胞中的Fas和Fas-配體 的顯著上調以及胱天蛋白酶-3(CaSpaSe-3)的激活相關(12，13)。促炎細胞因子樣IL-Ιβ 或TNF- α似乎在牽涉BicUBax上調和Bcl_2下調的細胞凋亡誘導中起著重要作用(9，14， 15)。雖然平衡的細胞凋亡和吞噬作用維持著正常功能，但缺血后凋亡細胞的清除缺陷 可能導致增加的炎癥和受損的組織修復(16，17)。凋亡細胞暴露可被可溶性分子和受體識 別的磷脂酰絲氨酸(PS)，從而使得它們能夠被吞噬(18)。此類分子之一是乳脂肪球EGF-因 子8 (MFG-E8)，其對于凋亡細胞的清除是至關重要的(19)。例如Hanayama等人發(fā)現(xiàn)脾中凋 亡B細胞的有效清除預防了不適當?shù)拇傺酌庖邞鸷妥陨砜贵w的產(chǎn)生(20)。在使用盲腸結 扎和穿孔的大鼠膿毒癥模型中，MFG-E8在脾和肝中下調。這與此類動物中受損的凋亡細胞 清除和增加的死亡率相關(21)。與膿毒癥相似，腸道I/R損傷伴隨著全身性炎性應答。乳脂肪球EGF-因子8 (MFG-E8)是用于清除凋亡細胞的有效調理素(opsonin)，其由免疫活性器官包括脾和肺的單核細胞產(chǎn)生。腸道的缺血-再灌注(I/R)損傷誘導細胞凋 亡、嚴重的炎癥和遠隔器官損害包括急性肺損傷(ALI)。增強凋亡細胞清除在這樣的狀況下 是否有益仍然還不清楚。存在對I/R損傷的改善的治療和預防的明確需要。發(fā)明概述本發(fā)明涉及預防和/或治療受試者中缺血/再灌注后的炎癥和/或器官損傷的方 法，其包括以有效地預防和/或治療炎癥和/或器官損傷的量對受試者施用乳脂肪球表皮 生長因子-因子VIII (MFG-E8)。本發(fā)明還涉及以用于預防和/或治療缺血/再灌注后的炎癥和/或器官損傷的劑 型存在的包含乳脂肪球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8)的藥物組合物。本發(fā)明還提供了制備用于預防和/或治療缺血/再灌注后的炎癥和/或器官損傷 的藥物組合物的方法，所述方法包括以有效地預防和/或治療缺血/再灌注后的炎癥和/ 或器官損傷的量將乳脂肪球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8)配制于藥物組合物中。本發(fā)明還提供治療受試者中的肺損傷例如急性肺損傷的方法，其包括以有效地治 療受試者中的肺損傷的量對受試者施用乳脂肪球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8)。本發(fā)明提供了以用于治療肺損傷的劑型存在的包含乳脂肪球表皮生長因子-因 子VIII(MFG-E8)的藥物組合物。本發(fā)明還提供了用于制備用于治療肺損傷的藥物組合物的方法，所述方法包括以 有效地治療肺損傷的量將乳脂肪球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8)配制于藥物組合物 中。附圖概述

圖1A-1B.腸I/R后脾MFG-E8的抑制。使腸系膜上動脈(SMA)閉塞90分鐘，然后 進行4小時的再灌注。(A)通過qPCR測量脾中MFG-E8mRNA的水平，(B)通過Western印跡 評估MFG-E8蛋白的水平。數(shù)據(jù)表示為平均值士SEM，*P < . 05對模擬(Sham)，利用學生氏 t檢驗，η = 6。圖2A-2F.腸I/R后重組鼠MFG-E8 (rmMFG_E8)減弱器官損傷。使SMA閉塞90分 鐘，然后進行4小時的再灌注。(A)腸I/R后小腸的H&E染色顯示廣泛的粘膜損傷(中 圖)，而使用rmMFG-E8的治療顯示有益的局部作用(右圖)。左圖模擬對照。在再灌注后 4小時測量(B)乳酸鹽、(C)LDH, (D)ALT、(E)AST和(F)肌酐。數(shù)據(jù)表示為平均值士SEM， *P < . 05對模擬，#P < . 05對媒介物，利用單因素方差分析(One-WayANOVA)和Student Newman Keul ‘ s 檢驗，η = 6。圖3A-3C.腸I/R后rmMFG_E8抑制血漿細胞因子。使SMA閉塞90分鐘，然后進行 4小時的再灌注。通過ELISA評估血液細胞因子(TNF-α ,IL-I β和IL-6)。數(shù)據(jù)表示為平 均值士SEM，*P < . 05對模擬，#P < . 05對媒介物，利用單因素方差分析和Student Newman Keul' s 檢驗，η = 6。圖4A-4C. rmMFG-E8減弱急性肺損傷(ALI)。使SMA閉塞90分鐘，然后進行4小時 的再灌注。固定肺并且用H&E進行染色。(A) IOOx和400x(插圖)放大率的代表性顯微照 片。(B)如方法部分中所述，對組織損傷進行評分。(C)通過MPO測定評估嗜中性粒細胞的 活性。數(shù)據(jù)表示為平均值士SEM，*P < . 05對模擬，#P < . 05對媒介物，利用單因素方差分 析禾口 Student Newman Keul' s 檢驗，η = 6。
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圖5A-5C.腸I/R后的減少的肺MFG-E8以及rmMFG_E8治療恢復凋亡細胞清除。 (A)通過qPCR測量MFG-E8mRNA的水平，(B)通過Western印跡評估MFG-E8蛋白的水平。數(shù) 據(jù)表示為平均值士SEM，*P < 0. 05對模擬，利用學生氏t檢驗，η = 6。(C)肺用TUNEL進 行染色，然后用碘化丙啶進行復染。圖6Α-6Β. MFG-E8缺乏使得在腸道I/R后小鼠肺中的炎性應答惡化。在再灌注后4 小時，收集肺組織并且就(A)IL-Iii和(B)IL-6對其進行評估。數(shù)據(jù)表示為平均值士SEM， *P < . 05對模擬，#P < . 05對WT，利用兩因素方差分析和Student Newman Keul ‘ s檢驗， η = 6。WT 野生型小鼠；KO 敲除小鼠。圖7A-7C. MFG-E8缺乏使ALI惡化。使SMA閉塞90分鐘，然后進行4小時的再灌 注。固定肺，并且用Η&Ε進行染色。(A) IOOx和400χ(插圖)放大率的顯微照片。(B)如方 法部分中所述對組織進行評分。(C)通過MPO測定評估嗜中性粒細胞的活性。數(shù)據(jù)表示為 平均值士SEM，*Ρ < . 05對模擬，#Ρ < . 05對WT，利用兩因素方差分析和StudentNewman Keul' s 檢驗，η = 6。圖8.腸道I/R損傷后rmMFG-E8治療的小鼠中的存活益處。使SMA閉塞90分鐘，然 后進行4小時的再灌注。各組小鼠在再灌注開始時i. p.接受一個劑量的rmMFG-E8或生理 鹽水(媒介物)，觀察24小時。*P < . 05對媒介物，利用Kaplan Meyer時序檢驗(Log-rank test), η = 15。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及預防和/或治療受試者中缺血/再灌注后的炎癥和/或器官損傷的方 法，其包括以有效地預防和/或治療炎癥和/或器官損傷的量對受試者施用乳脂肪球表皮 生長因子-因子VIII (MFG-E8)。缺血/再灌注包括，但不限于胃腸道、肝、肺、腎、心臟、腦、 脊髓和/或受擠壓的四肢的缺血/再灌注。特別地，本發(fā)明涉及預防和/或治療受試者中 腸缺血/再灌注后的炎癥和/或器官損傷的方法，其包括以有效地預防和/或治療炎癥和 /或器官損傷的量對受試者施用乳脂肪球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8)。優(yōu)選，該方法預防或降低了腫瘤壞死因子_ α、白細胞介素_6、白細胞介素-1 β、 天冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶、乳酸鹽或乳酸脫氫酶中的一個或多個的血清升 尚ο優(yōu)選，其中預防或治療器官損傷的器官包括但不限于胃腸道、肝、肺、腎、心臟、腦、 脊髓和受擠壓的四肢。肺損傷可以是急性肺損傷(ALI)。優(yōu)選，受試者的存活得到改善。優(yōu)選，MFG-E8具有與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2 (其分別為人MFG-E8和小鼠 MFG-E8的序列)至少80 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選95 %，更優(yōu)選99 %同一的氨基酸序列。 最優(yōu)選，MFG-E8序列與SEQ IDNO :1完全同源。此類方法可用于任何哺乳動物，包括人。此類實施方案中的MFG-E8可以為純化的形式，例如從天然來源純化的蛋白質或 從重組細胞表達的轉基因蛋白質。備選地，MFG-E8可以只是部分純化的(例如，還包含細 胞組分，例如為來源于骨髓樹突細胞或來自其他哺乳動物細胞(包括用轉基因MFG-E8轉化 的細胞)的富含MFG-E8的外來體(exosome)形式)。在MFG-E8來自富含MFG-E8的外來 體的情況下，外來體優(yōu)選來自與治療的哺乳動物相同的物種；更優(yōu)選，外來體來自相同的個 體。MFG-E8可具有來自任何哺乳動物物種的野生型序列，或可包含突變，只要突變不消除蛋白質的預防和/或治療炎癥和/或器官損傷的活性?？僧a(chǎn)生這樣的突變體而無需過度的實 驗。此類突變體的活性還可通過已知的方法和本文中描述的方法來容易地測定。MFG-E8還可包含擬肽(piiptidomimetic)。如本文中所使用的，氨基酸模擬物或擬 肽是能夠模擬蛋白質中的天然親本氨基酸的化合物，因為用擬肽置換氨基酸不顯著影響蛋 白質的目的活性(在本發(fā)明中，外源MFG-E8的治療活性)。包含擬肽的蛋白質通常是蛋白 酶的不良底物并且與天然蛋白質相比較，可能在體內(nèi)具有更長期的活性。此外，它們的抗原 性較低并且顯示總體更高的生物利用度。本領域技術人員理解，包含擬肽的水溶性蛋白質 的設計和合成不需要過度的實驗(例如，39-41)。本發(fā)明還提供了以用于預防和/或治療缺血/再灌注后的炎癥和/或器官損傷的 劑型存在的包含乳脂肪球表皮生長因子-因子VI I I(MFG-ES)的藥物組合物。缺血/再 灌注包括但不限于胃腸道、肝、肺、腎、心臟、腦、脊髓和/或受擠壓的四肢的缺血/再灌注。 腸缺血/再灌注是缺血/再灌注的優(yōu)選的形式。本發(fā)明還提供了制備用于預防和/或治療缺血/再灌注后的炎癥和/或器官損傷 的藥物組合物方法，該方法包括以有效地預防和/或治療缺血/再灌注后的炎癥和/或器 官損傷的量將乳脂肪球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8)配制于藥物組合物中。缺血/再 灌注包括但不限于胃腸道、肝、肺、腎、心臟、腦、脊髓和/或受擠壓的四肢的缺血/再灌注。 腸缺血/再灌注是優(yōu)選的缺血/再灌注。優(yōu)選將上述MFG-E8制劑配制于藥物組合物中。根據(jù)特定應用的需要，可配制用于 給哺乳動物包括人施用的此類組合物而無需過度實驗。此外，可使用標準劑量應答方案確 定組合物的適當劑量而無需過度實驗。因此，可利用本領域內(nèi)熟知的方法，例如使用惰性稀釋劑或使用可食用載體制備 經(jīng)設計用于口服、經(jīng)舌、舌下、口腔和口內(nèi)施用的組合物而無需過度實驗。可將組合物封裝 在明膠膠囊中或壓制成片劑。為了進行口服治療施用，可將本發(fā)明的藥物組合物與賦形劑 混合并且以片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙囊劑(wafer)、口香糖等形式使用。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等還可包含粘合劑、受體(recipient)、崩解劑、潤滑劑、甜 味劑和芳香劑。粘合劑的一些實例包括微晶纖維素、黃蓍膠或明膠。賦形劑的實例包括淀 粉或乳糖。崩解劑的一些實例包括海藻酸、玉米淀粉等。潤滑劑的實例包括硬脂酸鎂或硬 脂酸鉀。助流劑的實例是二氧化硅膠體。甜味劑的一些實例包括蔗糖、糖精等。芳香劑的 實例包括薄荷(P印permint)、水楊酸甲酯、桔子香精(orangeflavoring)等。用于制備此類 不同組合物的材料應當是藥學上純的并且在所用的量上是無毒的?？梢岳缤ㄟ^靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、鞘內(nèi)或皮下注射容易地胃腸外施用本發(fā)明的組合物。 可以通過將本發(fā)明的組合物摻入溶液或懸浮液來進行胃腸外施用。此類溶液或懸浮液還可 包含無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成 溶劑。胃腸外制劑還可包括抗菌劑例如苯甲醇或尼泊金甲酯，抗氧化劑例如抗壞血酸或亞 硫酸氫鈉，和螯合劑例如EDTA。還可加入緩沖劑例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用于調 整張力的試劑例如氯化鈉或葡萄糖?？蓪⑽改c外制劑封裝入安瓿、一次性注射器或多劑量 小瓶(由玻璃或塑料制造)中。直腸施用包括將藥物組合物施用入直腸或大腸。這可使用栓劑或灌腸劑來進行。 可利用本領域內(nèi)已知的方法來容易地制備栓劑。例如，可通過將甘油加熱至大約120°C，將組合物溶解在甘油中，混合加熱的甘油(之后可加入純水)，然后將熱混合物倒入栓劑模來 制備栓劑。經(jīng)皮施用包括組合物通過皮膚的經(jīng)皮膚吸收。經(jīng)皮制劑包括貼劑(例如熟知的尼 古丁貼劑)、軟膏、乳膏、凝膠、藥膏等。本發(fā)明包括經(jīng)鼻給哺乳動物施用治療有效量的組合物。如本文中所使用的，經(jīng)鼻 施用或鼻腔施用包括給患者的鼻道或鼻腔的粘膜施用組合物。如本文中所使用的，用于組 合物的鼻腔施用的藥物組合物包含治療有效量的待施用的通過熟知的方法制備的組合物， 例如作為鼻腔噴霧劑、滴鼻劑、懸浮液、凝膠、軟膏、乳膏或粉劑。還可使用鼻塞或鼻腔海綿 (nasal sponge)進行組合物的施用。本發(fā)明還提供了乳脂肪球表皮生長因子_因子VIII (MFG-E8)用于預防和/或治 療缺血/再灌注后的炎癥和/或器官損傷的用途。本發(fā)明還提供了乳脂肪球表皮生長因 子-因子VIII (MFG-E8)用于制備用于預防和/或治療缺血/再灌注后的炎癥和/或器官 損傷的藥物組合物的用途。本發(fā)明還提供了治療受試者中的肺損傷例如急性肺損傷的方法，其包括以有效地 治療受試者中的肺損傷的量對受試者施用乳脂肪球表皮生長因子_因子VIII (MFG-E8)。 本發(fā)明提供了以用于治療肺損傷的劑型存在的包含乳脂肪球表皮生長因子-因子 VIIKMFG-E8)的藥物組合物。本發(fā)明還提供了制備用于治療肺損傷的藥物組合物的方法， 該方法包括以有效地治療肺損傷的量將乳脂肪球表皮生長因子_因子VIII (MFG-E8)配制 于藥物組合物中。本發(fā)明還提供了乳脂肪球表皮生長因子_因子VIII (MFG-E8)用于治療肺損傷例 如急性肺損傷的用途。本發(fā)明還提供了乳脂肪球表皮生長因子-因子VIII(MFG-ES)用于 制備用于治療肺損傷的藥物組合物的用途。根據(jù)下面的實驗詳述可更好地理解本發(fā)明。然而，本領域技術人員將容易地理解， 所述的特定方法和結果只是舉例說明本發(fā)明，如在之后的權利要求中更詳盡地描述的。實驗詳述材料和方法實驗模型在使用異氟烷進行全身麻醉的情況下通過夾緊腸系膜上動脈(SMA)90 分鐘來在C57BL/6J野生型(WT)小鼠和MFG-E8敲除(KO)小鼠中誘導缺血。用0. 5ml鹽 水使小鼠蘇醒，然后用重組鼠MFG-E8 (rmMFG-E8) (0. 4mg/kg于0. 5ml生理鹽水中，腹膜內(nèi) 注射)或生理鹽水(媒介物)處理小鼠。除了 SMA夾緊外，對照動物經(jīng)歷相同的操作過程 (模擬I/R) (η = 6)。在再灌注后4小時，麻醉動物，并收集EDTA血液(用于血漿)和組織 樣品，立即冷凍于液氮中，在-80°C下貯藏直至測量。進行另外的實驗以觀察24小時內(nèi)的 存活(η = 15)。所有實驗按照美國國立衛(wèi)生研究院(Bethesda，MD)的實驗動物使用指南 ^ τ^ ^-Ι Β ^ Ι Feinstein Institute for Medical Research (Manhasset, NY)白勺 Institutional Animal Care and Use Committee 的批準。MFG-E8 Western印跡和基因表達在Bis-Tris凝膠上分級分離25 μ g來自脾和肺 樣品的蛋白質，將其轉移至0.22-μπι硝酸纖維素膜。用含有0.1% v/v Tween 20的Tris 緩沖鹽溶液中的5 % BSA封閉印跡，然后用倉鼠抗小鼠MFG-E8mAb (克隆2422，MBL，Nagoya, Japan)進行溫育。在用5% BSA-TBST中的HRP-標記的山羊抗倉鼠IgG(SantaCruz，CA)
7溫育和用TBST清洗后，通過使用化學發(fā)光過氧化物酶底物(ECLplus，Amersham, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)和將其暴露于射線膠片上來檢測條帶。使用TRIzol試 劑(Invitrogen，Carlsbad, CA)從脾和肺組織樣品提取RNA。使用鼠白血病病毒逆轉錄 酶(Applied Biosystems, Foster City, CA)將 5yg RNA 逆轉錄成 cDNA，然后使用 SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems)通過qPCR進行擴增。使用下列引物組小鼠 MFG-E8(正向5' -GGG CCT GAAGAA TAA CAC GA—3' (SEQ ID NO 3)；反向5' -AGG GCA ACT TGG ACAACA AC-3' (SEQ ID NO 4))；小鼠 β-肌動蛋白(內(nèi)源對照；正向5' -TGTTAC CAA CTG GGA CGA CA-3，(SEQ ID NO 5)；反向5' -GGG GTG TTGAAG GTC TCA ΑΑ-3' (SEQ ID NO :6))。細胞因子和器官損傷參數(shù)使用特異性小鼠ELISA試劑盒(BDPharmingen， Franklin Lakes, NJ)定量EDTA血漿、小腸和肺組織中的TNF-α、IL-1 β和IL-6。使用商 業(yè)測定試劑盒(Pointe Scientific, Canton, MI)測定AST、ALT、LDH、乳酸鹽和肌酐的血漿 水平。組織病理學將小腸(非壞死區(qū)域)和肺的樣品固定在10%福爾馬林中，然后包 埋在石蠟中。將組織塊切成5μπι厚的切片，轉移至載玻片上，用蘇木精/曙紅染色。使用 光學顯微鏡進行形態(tài)學檢查，由富有經(jīng)驗的不知情的研究者基于滲出物(exudate)、充血/ 淤血(congestion)、嗜中性粒細胞浸潤、肺泡內(nèi)出血/碎片和細胞增生的存在將肺損傷分 析為不存在損傷、輕微損傷、中度損傷或嚴重損傷(評分0-3) (22)。計算不同動物的評分 之和的平均值。根據(jù)Stallion等人，通過評估絨毛對隱窩的比(正常5比1)、淋巴細胞浸 潤、上皮細胞變性/壞死、糜爛(erosion)、腺擴張和透壁變化(transmural change)給腸損 傷評分(評分0-4) (23)。細胞凋亡測定將樣品組織脫蠟，用蛋白酶K溫育，用綠色熒光標記的TUNEL試劑 盒(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)染色，用碘化丙啶復染，在熒光顯微鏡下進行檢 查。凋亡細胞在紅色背景染色上呈現(xiàn)綠色熒光。組織髓過氧化物酶(MPO)測定在含有0. 5%十六烷基三甲基溴化銨的KPO4緩沖 液中勻漿組織(在60°C下進行2小時)。在離心后，將上清液稀釋于反應溶液中，在460nm 處測量Δ OD以計算MPO活性(24)。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表示為平均值士 SEM，并且使用Student-Newman-Keuls'檢驗通過方 差分析進行比較。如果只存在兩個組，則使用學生t檢驗。使用Kaplan-Meier時序檢驗分 析存活研究。如果P < 0. 05，則差異被認為是顯著的。結果腸道I/R后脾中的MFG-E8的抑制為了研究MFG-E8水平在腸I/R損傷后是否發(fā) 生改變，在90分鐘缺血后的再灌注后4小時測量WT小鼠中的MFG-E8mRNA和蛋白質的水平。 結果顯示，在腸道I/R后，脾的mRNA水平平均顯著下降63% (圖1A)，蛋白質水平下降68% (圖 1B)。rmMFG-E8的施用在腸I/R后減弱多器官損傷腸道I/R引起廣泛的肉眼可 見的壞死，在緊靠肉眼可見的缺血的腸的腸區(qū)域中存在嚴重的腸粘膜損傷(平均評分 2. 25士0. 14)(圖2A)。類似地，與經(jīng)模擬手術的動物相比較，遠隔器官損害的多個血液標 志物顯著升高，包括乳酸鹽(80%的增加)、乳酸脫氫酶(LDH) (17. 5倍的增加)、 氨酸氨基轉移酶(ALT) (4. 8倍的增加)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST) (18. 3倍的增加)和肌酐(2 倍的增加)(圖2B-F)，這表明在該模型中誘導了系統(tǒng)性程度的損傷。在再灌注開始時使 用一個劑量的rmMFG-E8(0.4yg/20g Bff, i. p.)的治療極大地減弱了 I/R誘導的多器官損 傷。在組織病理學上，甚至大部分的腸在治療后得到保護而免受二次粘膜損害(損傷評分 1. 25士0. 14)(圖2A)。使用rmMFG-E8的治療也完全阻止了乳酸鹽、AST和ALT的升高，同 時其對LDH和肌酐水平分別抑制了 58 %和21 %。因此rmMFG-E8對腸粘膜、一般性灌注、肝 損傷具有重大的保護作用，并且對普通組織損害和腎功能具有較低但仍然顯著的保護作用 (圖 2B-F)。rmMFG-E8的施用抑制了腸I/R后的全身性炎性應答促炎細胞因子是腸I/R后造 成遠隔器官損傷的主要原因。因此，調查3種細胞因子腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細胞 介素-6(IL-6)和白細胞介素-1 β (IL-1 β )是否受到使用rmMFG-E8的治療的影響。雖然 細胞因子的血液水平在腸道I/R后顯著增加(TNF-α增加5. 6倍，IL-I β增加3. 9倍以 及IL-6增加96倍)，但rmMFG-E8顯著減少了促炎反應(分別減少72 %、42 %和48 %，圖 3A-C)。為了研究MFG-E8是否影響組織中細胞因子的產(chǎn)生，使用ELISA分析小腸和肺中細 胞因子的蛋白質水平?？稍诮M織細胞因子水平上發(fā)現(xiàn)rmMFG-E8的相似抑制作用，這表明 MFG-E8通過減少細胞因子產(chǎn)生和從損傷源以及從靶器官釋放而具有抗炎作用(表1)。表1.腸I/R后rmMFG_E8對局部細胞因子的抑制 C57BL6/J小鼠經(jīng)歷SMA I/R 90分鐘，然后進行4小時的再灌注。6只小鼠在再灌 注開始時還接受rmMFG-ESaXAyg/^Og BW，腹膜內(nèi)注射)。通過ELISA測定組織細胞因子 水平，其表示為平均值士SEM，*P < 0. 05對模擬，#P < 0. 05對媒介物，利用單因素方差分 析禾口 StudentNewman Keul' s 檢驗，η = 6。rmMFG-E8的施用在腸I/R后減弱了 ALI 肺是受腸I/R損傷影響最嚴重的器官之 一(25)。肺的組織病理學分析顯示中度至嚴重損傷，滲出物、充血、細胞浸潤和細胞內(nèi)出血 平均達到9. 7士0. 8的組織病理學評分(圖4A-B)。細胞形態(tài)學和細胞肺浸潤的時間選擇 (timing)表明嗜中性性質。因此，評估肺中的髓過氧化物酶的活性，該酶的活性在腸道I/ R后同樣升高3. 3倍(圖4C)。使用rmMFG-E8的治療在組織病理學以及生物化學上顯著減 少了急性肺損傷(圖4A-C)。組織病理學評分減少了 38%并且MPO活性被抑制了 47% (圖 4B-C)。腸I/R后肺MFG-E8的抑制和細胞凋亡雖然Northern印跡顯示脾為產(chǎn)生MFG-E8的主要免疫活性器官(20)，但肺仍表達大量的MFG-E8mRNA (大約50%的脾水平；未公開的 觀察結果)。J inushi等人顯示在正常條件下肺泡巨噬細胞包含肺中大部分MFG-E8蛋白 (26)。定量PCR和Western印跡表明，腸道I/R還在mRNA水平上抑制MFG-E8水平48%且 在蛋白質水平上抑制49% (圖5A-B)。同時，通過TUNEL染色在肺組織中發(fā)現(xiàn)增加的凋亡 細胞的數(shù)量(圖5C)，這與胱天蛋白酶3的活化相關(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，使用rmMFG-E8 的治療顯著抑制了腸道I/R損傷后肺中可檢測的凋亡細胞的數(shù)量(圖5C)。MFG-E8缺乏增加了肺炎癥和使ALI惡化為了進一步闡明MFG-E8在腸道I/R介 導的ALI中的作用，在MFG-E8缺陷型小鼠中研究炎性應答和肺組織損傷。與WT小鼠相 比較，MFG-E8K0小鼠在腸道I/R后于肺中產(chǎn)生幾乎增加2倍的IL-I β和IL-6蛋白水平 (圖6Α-Β)。肺中促炎細胞因子產(chǎn)量的該顯著增加與MFG-E8K0小鼠中進一步惡化(與它 們的WT對照相比)的ALI相關，所述惡化包括增加的充血、滲出物、間質細胞浸潤和硬化 (consolidation)(圖7A-B)。在MFG-E8K0小鼠中，肺嗜中性粒細胞的活性在腸道I/R后也 顯著增加(圖7C)?？傊?，這清楚地表明MFG-E8的不存在在該模型中引起更嚴重的炎癥和 對肺的損害。使用rmMFG-E8的治療改善了腸I/R損傷后的存活上述結果表明MFG-E8在I/R 介導的損傷中是有益的。因此，在15只在再灌注開始時接受rmMFG-E8的小鼠中進行存活 研究，將其與用生理鹽水處理的對照小鼠相比較。所有對照小鼠在24小時內(nèi)死亡，中位存 活時間為8小時(95% CI 5. 5-10. 5小時，圖8)。然而用rmMFG_E8治療的15只動物中有 7只在腸道I/R后24小時仍然存活(中位存活時間20小時，圖8)。存活時間的該顯著提 高顯示MFG-E8對于由受腸I/R損傷引起的多器官功能衰竭和死亡具有保護作用。討論本研究證明腸I/R負面影響肺形態(tài)學，增加ΜΡ0，和局部細胞因子的產(chǎn)量(與ALI 一致)以及證明使用rmMFG-E8的治療減弱器官損傷、炎癥和改善存活。治療的動物在它們 的肺中也顯示較少的細胞凋亡，從而表明增強的MFG-E8介導的凋亡細胞的清除。MFG-E8K0 小鼠顯示顯著惡化的ALI和炎癥，從而為MFG-E8在I/R介導的遠隔器官損傷中的至關重要 的作用提供了進一步的證據(jù)。急性肺損傷是由急性肺水腫和炎癥引起的呼吸衰竭的綜合征(2)。據(jù)美國國立衛(wèi) 生研究院估計，在美國ALI和ARDS的聯(lián)合發(fā)病率為每100，000人口 75例，來自Scandinavia 的最新數(shù)據(jù)顯示單獨的ALI占據(jù)大約每100，000人口 18例(25，27)。雖然在過去20至30 年中，ALI和ARDS的死亡率下降，但它們?nèi)匀皇遣豢山邮艿母咚劳雎?25)。多種因素可在 患者中導致ALI，包括膿毒癥、帶休克的嚴重創(chuàng)傷和多次輸血(25)。在這些病理狀況下，ALI 由壓倒性全身性炎性應答驅動，并且通常與其他器官的功能衰竭一起發(fā)生(3)。因SMA的 短暫閉塞而引起的腸缺血，例如，引起大量局部組織損傷，并且缺血的腸的再灌注導致炎性 應答的強烈激活，從而導致具有多器官功能衰竭(包括ALI)的非常嚴重的臨床現(xiàn)象(28)。 在病理生理學上，ALI與肺泡滲出物和出血、免疫細胞的流入和活化(釋放大量的細胞因子 和酶)相關，這可進一步并發(fā)感染和機械通氣誘導的損傷(ventilation-induced injury) (3，25)。肺上皮和內(nèi)皮的受損的屏障功能在ALI和ARDS的發(fā)展中起著主要作用，并且該 衰竭的一個至關重要的方面是細胞通過細胞凋亡喪失(2)。特別地I I型肺細胞經(jīng)歷由 Fas-配體-Fas途徑的活化和胱天蛋白酶-3的活化介導的細胞凋亡(12，13)，本實驗中凋亡細胞的性質也極可能是上皮的。特別地已報導，細胞因子如IL-I β或TNF-α在肺中在 細胞凋亡誘導中起著主要作用(9，14，15)。腸系膜I/R損傷主要由從再灌注的腸釋放的促 炎介體介導，這可能促成遠隔器官中細胞凋亡的誘導(29)。然而，活性氧在I/R后肺細胞 死亡的誘導中的作用不應當被低佑(30)。II型肺泡肺細胞的細胞凋亡直接引起肺水腫且 減少表面活性物質的產(chǎn)生。然而，細胞凋亡還在組織損傷的起始期之外起作用，因為其對于 疾病晚期中的炎癥消退與ALI的進展之間的不平衡是關鍵的(31)。通過調節(jié)細胞凋亡或 凋亡細胞的吞噬作用進行的受控的組織修復可阻止肺纖維化、疾病的進展和其總體嚴重性 (2，12,25,31)。MFG-E8是分泌分子并且主要在脾中產(chǎn)生。然而，其還可以以顯著的量發(fā)現(xiàn)于淋巴 結和肺中(20，26)。其主要由巨噬細胞和樹突細胞產(chǎn)生并且到目前為止主要與凋亡細胞的 調理作用相關。Hanayama等人發(fā)現(xiàn)MFG-E8在脾中在凋亡B細胞的清除中起著主要作用，其 防止了自身免疫疾病的發(fā)展(16，19，20)。在小鼠中，MFG-E8是具有兩個EGF樣結構域(El 和E2)的64kDa糖蛋白，所述結構域含有可結合某些在巨噬細胞和其他吞噬細胞上高度表 達的整聯(lián)蛋白(體外連接蛋白受體(vitronectin receptor), ανβ3或ανβ5)的RGD-基 序。該結構域通過富含Ρ/Τ的區(qū)域與兩個凝血因子V/VIII樣結構域(Cl和C2)(具有對 磷脂酰絲氨酸(PS)的強親和力)相分隔。這些性質使其在將凋亡細胞(所述細胞在它們 的表面上表達大量PS)結合至吞噬細胞中成為重要因子(19)。雖然表達PS的凋亡細胞還 可結合至巨噬細胞上的其他受體，包括假定的PS受體和⑶36，但通過MFG-E8與α ν β 3或 ανβ5_整聯(lián)蛋白的結合是誘導它們的吞噬所必需的(19)。在非常高的濃度上，也已顯示 MFG-E8調節(jié)固有凝血級聯(lián)(由于其競爭PS結合部位)和增加凝血酶原50% (32)。其還參 與VEGF-依賴性新生血管形成(33)和參與腸細胞的遷移和腸修復(34)。已提出其在動脈 粥樣硬化(35)和阿爾茨海默病(36)中是有益的，雖然機制仍然不清楚。在慢性和急性炎 性疾病中，MFG-E8明確地在凋亡細胞的吞噬作用與炎癥之間的層次上起著重要作用。凋亡 細胞清除的MFG-E8-依賴性增加可阻止因膿毒癥引起的死亡(21)。膿毒癥和腸系膜I/R損傷共有事實，即兩者都導致全身性炎性應答(23)。也已顯 示腸道I/R導致增加的微生物移位(microbialtranslocation)和細菌毒素至血流內(nèi)的釋 放(4，5)。事實上已顯示，toll樣受體的活化在體外和體內(nèi)抑制MFG-E8水平((26)和未公 開的數(shù)據(jù))。到目前為止，僅已知粒細胞/單核細胞集落刺激因子調節(jié)MFG-E8的表達(26)。 其他細胞因子是否具有改變MFG-E8的表達的潛能以及以什么樣的動力學改變所述表達目 前還不清楚。本研究已顯示在缺血90分鐘的腸道的再灌注后4小時脾和肺中MFG-E8被顯 著抑制。如在腸道I/R小鼠的肺中發(fā)現(xiàn)的，抑制MFG-E850%似乎足以削弱凋亡細胞的吞噬 作用，如之前在膿毒癥模型中所報導的(21)。雖然肺中凋亡細胞的數(shù)量不是很高，但受影響 的細胞很可能是II型肺細胞，這將促成ALI的進展(9)。使用rmMFG-E8的治療減少了凋 亡細胞的數(shù)量且抑制了局部炎癥。減少的細胞凋亡不由直接的抗凋亡作用介導而是通過刺 激凋亡細胞的清除來介導(21)。本研究還發(fā)現(xiàn)，在用rmMFG-E8治療后，腸道I/R后的肺損 傷減弱，如通過改善的組織損傷和減少的嗜中性粒細胞活性所證明的。雖然促炎細胞因子 在用rmMFG-E8治療后在小腸、肺和血液中通常被抑制，但在缺血的腸的再灌注后4小時，在 MFG-E8K0小鼠與它們的WT對照之間的小腸和血液的細胞因子水平上不存在差異。然而，在 MFG-E8K0小鼠中，肺顯示了 IL-6和IL-I β的2倍增加，這表明在該模型中MFG-E8的缺乏主要影響肺。這是相當有趣的，因為這暗示肺不僅是全身性炎性應答的受害者而且還強烈 地促成炎癥。MFG-E8的該抗炎效應在該ALI模型中是如何起作用的仍然不清楚。凋亡細胞的 清除明確地抑制了巨噬細胞的炎癥應答性(17，31)。由于肺泡巨噬細胞可能是I/R后喪失 MFG-E8的細胞，因此通過凋亡細胞吞噬作用的抑制作用的不足，可能引發(fā)這些肺泡巨噬細 胞產(chǎn)生和釋放更多的炎性細胞因子(17)。這可解釋肺中增加的炎癥和損傷以及炎性介體 至循環(huán)內(nèi)的釋放。該機制可牽涉肺泡巨噬細胞中的細胞內(nèi)抗炎途徑、抗炎細胞因子(例如 IL-10和TGF-β)的釋放(31,37)以及免疫抑制細胞例如調節(jié)性T細胞的產(chǎn)生(26，35)。只 除去具有釋放毒性和促炎內(nèi)容物的潛能的瀕死細胞可以是MFG-E8籍以賦予其有益作用的 另一個可能機制(38)。本研究已明確地顯示，MFG-E8在體內(nèi)具有抗炎作用并且在腸道I/R后保護免受多 器官功能障礙，包括肺損傷。這與顯著提高的存活率相關。因此，通過促進組織修復和正面 影響受影響的患者的發(fā)病率和死亡率，MFG-E8可用作I/R后或其他病因學的ALI的新型治 療選擇。參考文獻1. 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權利要求
預防和/或治療受試者中缺血/再灌注后的炎癥和/或器官損傷的方法，其包括以有效地預防和/或治療炎癥和/或器官損傷的量對所述受試者施用乳脂肪球表皮生長因子 因子VIII(MFG E8)。
2.權利要求1的方法，其中所述MFG-E8具有與SEQID NO :1或SEQ ID NO :2至少90% 同一的氨基酸序列。
3.權利要求1或2的方法，其中所述MFG-E8是重組MFG-E8。
4.權利要求1至3的任一項的方法，其中所述方法預防或減少腫瘤壞死因子-α、白細 胞介素_6、白細胞介素-1 β、天冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶、乳酸鹽或乳酸脫氫 酶中的一種或多種的血清升高。
5.權利要求1至4的任一項的方法，其中受試者的存活得到改善。
6.權利要求1至5的任一項的方法，其中炎癥得到預防或治療。
7.權利要求1至6的任一項的方法，其中器官損傷得到預防或治療。
8.權利要求7的方法，其中所述器官是胃腸道、肝、肺、腎、心臟、腦、脊髓或受擠壓的四 肢中的一個或多個。
9.權利要求7的方法，其中所述器官損傷是急性肺損傷。
10.權利要求1至9的任一項的方法，其中所述缺血/再灌注是胃腸道、肝、肺、腎、心 臟、腦、脊髓或受擠壓的四肢的缺血/再灌注中的一個或多個。
11.權利要求1至9的任一項的方法，其中所述缺血/再灌注是腸缺血/再灌注。
12.包含乳脂肪球表皮生長因子-因子VIII(MFG-ES)的藥物組合物，其以用于預防和 /或治療缺血/再灌注后的炎癥和/或器官損傷的劑型存在。
13.權利要求12的藥物組合物，其中所述缺血/再灌注是胃腸道、肝、肺、腎、心臟、腦、 脊髓或受擠壓的四肢的缺血/再灌注中的一個或多個。
14.權利要求12的藥物組合物，其中所述缺血/再灌注是腸缺血/再灌注。
15.用于制備藥物組合物的方法，所述藥物組合物用于預防和/或治療缺血/再灌注后 的炎癥和/或器官損傷，所述方法包括以有效地預防和/或治療缺血/再灌注后的炎癥和 /或器官損傷的量將乳脂肪球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8)配制于藥物組合物中。
16.權利要求15的方法，其中所述缺血/再灌注是胃腸道、肝、肺、腎、心臟、腦、脊髓或 受擠壓的四肢的缺血/再灌注中的一個或多個。
17.權利要求15的方法，其中所述缺血/再灌注是腸缺血/再灌注。
18.治療受試者中的肺損傷的方法，其包括以有效地治療受試者中的肺損傷的量對所 述受試者施用乳脂肪球表皮生長因子-因子VIII (MFG-E8)。
19.權利要求18的方法，其中所述MFG-E8具有與SEQID NO 1或SEQ ID NO 2至少 90%同一的氨基酸序列。
20.權利要求18或19的方法，其中所述MFG-E8是重組MFG-E8。
21.權利要求18至20的任一項的方法，其中所述肺損傷是急性肺損傷。
22.包含乳脂肪球表皮生長因子-因子VIII(MFG-ES)的藥物組合物，其以用于治療肺 損傷的劑型存在。
23.用于制備藥物組合物的方法，所述藥物組合物用于治療肺損傷，所述方法包括以有 效地治療肺損傷的量將乳脂肪球表皮生長因子-因子VIII(MFG-ES)配制于藥物組合物中。
全文摘要
提供了用于預防和治療缺血/再灌注后的炎癥和器官損傷的方法，和用于治療肺損傷的方法，其包括對受試者施用乳脂肪球表皮生長因子-因子VIII(MFG-E8)。還提供了包含MFG-E8的藥物組合物，其以用于預防和治療缺血/再灌注后的炎癥和器官損傷以及用于治療肺損傷的劑型存在，以及制備用于預防和治療缺血/再灌注后的炎癥和器官損傷以及用于治療肺損傷的藥物組合物的方法，其包括將MFG-E8配制于藥物組合物中。
文檔編號C12N5/16GK101910411SQ200880122777
公開日2010年12月8日 申請日期2008年11月13日 優(yōu)先權日2007年11月15日
發(fā)明者P·王 申請人:范斯坦醫(yī)藥研究院