專利名稱：：具有木聚糖酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性的分離的多肽和編碼該多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。相關(guān)技術(shù)描述植物細(xì)胞壁多糖構(gòu)成植物細(xì)胞壁的大約90%并且能夠分成以下三組纖維素、半纖維素和果膠。纖維素是細(xì)胞壁多糖的主要成分。半纖維素是植物細(xì)胞壁中第二豐富的成分。主要的半纖維素聚合物是木聚糖。植物細(xì)胞壁中存在的木聚糖的結(jié)構(gòu)取決于它們的來源可能差異顯著，但是它們總是含有β-1，4-連接的D-木糖主鏈。β-1，4-連接的D-木糖主鏈能夠用多個(gè)側(cè)基取代，所述側(cè)基如L-阿拉伯糖(L-aribinose)、D-半乳糖、乙?；⑽乎；?feruloyl)、對(duì)-香豆?；?p-coumaroyl)和葡糖醛酸殘基。木聚糖主鏈的生物降解依賴于兩類酶內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶。內(nèi)切木聚糖酶(EC3.2.1.8)將木聚糖主鏈切割成較小的寡糖，這些寡糖能夠進(jìn)一步通過β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)降解成木糖。木聚糖的降解中涉及的其它酶包括，例如，乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯糖酶、α“葡糖醛酸糖苷酶、阿魏酸酯酶和對(duì)_香豆酸酯酶。Merchant等，1988，BiotechnologyLetters10:513_516描述了由土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)產(chǎn)生木聚糖酶。Gilbert等，1993，AppliedMicrobiologyandBiotechnology40:508_514公開了來自土生梭孢霉和甲殼嗜熱霉(Thermoascuscrustaceus)的兩種木聚糖酶的比較。WO1997/027293公開了來自土生梭孢霉的顯示木聚糖酶活性的酶。本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及選自下組的具有木聚糖酶活性的分離的多肽(a)多肽，其包含與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少60%同一性或與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少80%同一性的氨基酸序列；(b)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中等到高嚴(yán)緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或在至少高嚴(yán)緊條件下與以下雜交(iv)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ν)包含SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(vi)(iv)或(ν)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。(c)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性或與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少80%同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO2或SEQIDNO4的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。本發(fā)明還涉及選自下組的分離的多核苷酸，其編碼具有木聚糖酶活性的多肽(a)多核苷酸，其編碼包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO4的成熟多肽具有至少60%同一性或與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少80%同一性；(b)多核苷酸，其在至少高嚴(yán)緊條件下與以下雜交(i)SEQIDN0:3的成熟多肽編碼序列，()包含SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或其在至少高嚴(yán)緊條件下與以下雜交(iv)SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列，(ν)包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(vi)(iv)或(ν)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。(c)多核苷酸，其包含與SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性或與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少80%同一性的核苷酸序列；和(d)多核苷酸，其編碼SEQIDNO:2或SEQIDNO4的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達(dá)載體、重組宿主細(xì)胞，和產(chǎn)生具有木聚糖酶活性的多肽的方法。本發(fā)明還涉及抑制細(xì)胞中具有木聚糖酶活性的多肽表達(dá)的方法，包括向所述細(xì)胞施用或在所述細(xì)胞中表達(dá)雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本發(fā)明的多核苷酸的亞序列。本發(fā)明還涉及雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任選地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。本發(fā)明還涉及用具有木聚糖酶活性的多肽降解含有木聚糖的材料的方法。本發(fā)明還涉及包含分離的多核苷酸的植物，所述多核苷酸編碼具有木聚糖酶活性的多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生具有木聚糖酶(活性)的多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含編碼具有木聚糖酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及包含編碼蛋白質(zhì)的基因的核酸構(gòu)建體，其中所述基因與編碼信號(hào)肽的核苷酸序列可操作地連接，所述信號(hào)肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1-19或SEQIDNO4的氨基酸1-18，或者由SEQIDNO2的氨基酸1-19或SEQIDNO4的氨基酸1-18組成，其中所述基因?qū)τ谒龊塑账嵝蛄惺峭庠吹?。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示土生梭孢霉NRRL8126GHlOA木聚糖酶的cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO1和2)。圖2顯示土生梭孢霉NRRL8126GHlOB木聚糖酶的cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO3和4)。圖3顯示pTterlOA的限制圖譜。圖4顯示pTterlOB的限制圖譜。定義木聚糖酶活性術(shù)語“木聚糖酶活性”在本文中定義為l，4-i3_D-木聚糖-木聚糖水解酶活性(EC3.2.1.8)，其催化木聚糖中l(wèi)，4-i3-D-木糖苷鍵的內(nèi)水解。就本發(fā)明而言，木聚糖酶活性使用0.01%TritonX-100和200mM磷酸鈉pH6中的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物在37°C測(cè)定。一個(gè)單位的木聚糖酶活性定義為在37°C和pH6自作為底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖在200mM磷酸鈉pH6緩沖液中每分鐘產(chǎn)生1.0μmol天青精(azurine)。本發(fā)明的多肽具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的成熟多肽的木聚糖酶活性的至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少100%。家族10或家族GHlO或GHlO術(shù)語“家族10”或“家族GH10”或“GH10”在本文中定義為按照HenrissatB·,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309_316,以及Henrissat禾口Bairoch,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695_696.屬于糖苷水解酶家族10的多肽。含有木聚糖的材料術(shù)語“含有木聚糖的材料”在本文中定義為任何包含木聚糖作為組分的材料。木聚糖是含有β-1，4-連接的木糖殘基骨架的植物細(xì)胞壁多糖。4-0-甲基葡糖醛酸和阿拉伯糖側(cè)鏈與乙酰基或阿魏?；黄鹜ǔＲ圆煌牧看嬖凇Ｄ揪厶鞘前肜w維素的主要組分。分離的多肽術(shù)語“分離的多肽”用于本文中指從來源分離的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，如通過SDS-PAGE測(cè)定的，所述多肽為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純?；旧霞兊亩嚯男g(shù)語“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物含有按重量計(jì)至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計(jì)至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。例如，這能夠通過如下實(shí)現(xiàn)通過公知的重組方法或通過經(jīng)典純化方法制備多肽。成熟多肽術(shù)語“成熟多肽”在本文中定義為以其在翻譯和任何翻譯后修飾(如6N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后的最終形式存在的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，基于預(yù)測(cè)SEQIDNO2的氨基酸1-19是信號(hào)肽的SignalP軟件程序(Nielsen等，1997,ProteinEngineering101-6)，所述成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸20-369。在另一個(gè)優(yōu)選方面，基于預(yù)測(cè)SEQIDNO:4的氨基酸1-18是信號(hào)肽的SignalP軟件程序，所述成熟多肽是SEQIDNO4的氨基酸19-414。成熟多肽編碼序列術(shù)語“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有木聚糖酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的方面，基于SignalP軟件程序所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:1的核苷酸58-1107，該程序預(yù)測(cè)核苷酸1-57編碼信號(hào)肽。在另一個(gè)優(yōu)選方面，基于SignalP軟件程序所述成熟多肽編碼序列是SEQIDNO:3的核苷酸55-1242，該程序預(yù)測(cè)核苷酸1-54編碼信號(hào)肽。同一性兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)“同一性”來描述。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16:276_277)(優(yōu)選版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443_453)來測(cè)定的。使用的可選參數(shù)是缺口產(chǎn)生罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)用作百分比同一性并且是如下計(jì)算的(相同的殘基χ100)/(比對(duì)的長(zhǎng)度-比對(duì)中的缺口總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，見上)(優(yōu)選版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，見上)測(cè)定。使用的可選參數(shù)是缺口產(chǎn)生罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)用作百分比同一性并且是如下計(jì)算的(相同的脫氧核糖核苷酸χ100)/(比對(duì)的長(zhǎng)度-比對(duì)中的缺口總數(shù))同源序列術(shù)語“同源序列”在本文中定義為用SEQIDNO2或SEQIDNO4的土生梭孢霉木聚糖酶或其成熟多肽，在tfasty檢索(Pearson，W.R.，1999，于BioinformaticsMethodsandProtocols，S.Misener和S.A.Krawetz編，185-219頁)中具有小于0.001的E值(或預(yù)期分?jǐn)?shù))的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)。多肽片段術(shù)語“多肽片段”在本文定義為從SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失了一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的多肽；其中所述片段具有木聚糖酶活性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，片段含有SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的至少305個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少320個(gè)氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少335個(gè)氨基酸殘基。在另一個(gè)優(yōu)選方面，片段含有SEQIDNO:4的成熟多肽或其同源序列的至少340個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少360個(gè)氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少380個(gè)氨基酸殘基。亞序列術(shù)語“亞序列(subsequence)”在本文中定義為從SEQIDNO:1或SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列或其同源序列的5'和/或3'端缺失了一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))核苷酸的核苷酸序列；其中所述亞序列編碼具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，亞序列含有SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的至少915個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少960個(gè)核苷酸，并且最優(yōu)選至少1005個(gè)核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選方面，亞序列含有SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列或其同源序列的至少1020個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少1080個(gè)核苷酸，并且最優(yōu)選至少1140個(gè)核苷酸。等位變體(allelicvariant)術(shù)語“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術(shù)語“分離的多核苷酸”用于本文中指從來源分離的多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的方面，如通過瓊脂糖電泳測(cè)定的，所述多核苷酸為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純?；旧霞兊亩嗪塑账嵝g(shù)語“基本上純的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制備物，其不含其它外來的或不期望的核苷酸，并且處于適合于在遺傳工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計(jì)至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，如啟動(dòng)子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計(jì)至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式，即所述多核苷酸制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。編碼序列當(dāng)用于本文時(shí)術(shù)語“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的核苷酸序列。cDNA:術(shù)語“cDNA”在本文中定義為能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細(xì)胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少可能存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級(jí)的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過稱為剪接的過程去除內(nèi)含子序列。因而源自mRNA的cDNA沒有任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛聿淮嬖谟?nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段，或所述核酸分子是合成的。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達(dá)盒”同義。調(diào)控序列(controlsequence)術(shù)語“調(diào)控序列”在本文定義為包括對(duì)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達(dá)是必需的或有利的所有組分。各個(gè)調(diào)控序列對(duì)于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個(gè)調(diào)控序列對(duì)于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號(hào)。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點(diǎn)的接頭一起提供，所述特異性限制位點(diǎn)促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術(shù)語“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對(duì)于多核苷酸序列的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達(dá)。表達(dá)術(shù)語“表達(dá)”包括涉及所述多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體術(shù)語“表達(dá)載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。宿主細(xì)胞如本文中所使用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括任何細(xì)胞類型，所述細(xì)胞類型對(duì)于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)。修飾術(shù)語“修飾”在本文的意思是，對(duì)由SEQIDNO2或SEQIDNO4的成熟多肽或其同源序列組成的多肽的任何化學(xué)修飾，以及對(duì)編碼這樣的多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸側(cè)鏈的置換。人工變體當(dāng)用在本文時(shí)，術(shù)語“人工變體”的意思是具有木聚糖酶活性的多肽，所述多肽由表達(dá)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列或其同源序列的修飾的多核苷酸序列的生物體產(chǎn)生。所述修飾的核苷酸序列通過人為干預(yù)(humanintervention),通過修飾公開于SEQIDNO:1或SEQIDNO3的多核苷酸序列或其同源序列來獲得。發(fā)明詳述具有木聚糖酶活性的多肽在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含下述氨基酸序列的分離的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO2或SEQIDNO4的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度，所述多肽具有木聚糖酶活性(下文中的“同源多肽”)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述同源多肽具有氨基酸序列，其與SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的成熟多肽相差十個(gè)氨基酸，優(yōu)選相差五個(gè)氨基酸，更優(yōu)選相差四個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個(gè)氨基酸，最優(yōu)選相差兩個(gè)氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個(gè)氨基酸。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有木聚糖酶活性的片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO2的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO2的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO2的氨基酸20至369，或其等位變體；或它們的具有木聚糖酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO2的氨基酸20至369。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO2的氨基酸序列或其等位變體，或它們的具有木聚糖酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸20至369或其等位變體，或它們的具有木聚糖酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸20至369組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:4的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:4的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:4的氨基酸19至414，或其等位變體；或它們的具有木聚糖酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO4的氨基酸19至414。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO4的氨基酸序列或其等位變體，或它們的具有木聚糖酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:4的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:4的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:4的氨基酸19至414或其等位變體，或它們的具有木聚糖酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO4的氨基酸19至414組成。在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性的分離的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優(yōu)選極低嚴(yán)緊條件、更優(yōu)選低嚴(yán)緊條件、更優(yōu)選中嚴(yán)緊條件、更優(yōu)選中_高嚴(yán)緊條件、甚至更優(yōu)選高嚴(yán)緊條件、和最優(yōu)選非常高嚴(yán)緊條件下與下列雜交(i)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列的基因組序列，(iii)⑴或()的亞序列，或(iv)⑴、()或(iii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個(gè)連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)的(contiguous)核苷酸。此外，所述亞序列可以編碼具有木聚糖酶活性的多肽片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述互補(bǔ)鏈?zhǔn)荢EQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。SEQIDNO:1或SEQIDNO3的核苷酸序列或其亞序列；以及SEQIDNO2或SEQIDNO:4的氨基酸序列或其片段，可用于設(shè)計(jì)核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼具有木聚糖酶活性的多肽的DNA。具體而言，可將這些探針用于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定并從其中分離相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長(zhǎng)度上應(yīng)為至少14個(gè)，優(yōu)選至少25個(gè)，更優(yōu)選至少35個(gè)，并且最優(yōu)選至少70個(gè)核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針長(zhǎng)度上是至少100個(gè)核苷酸。例如，所述核酸探針長(zhǎng)度上可以是至少200個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少300個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少400個(gè)核苷酸，或最優(yōu)選至少500個(gè)核苷酸。甚至可以使用更長(zhǎng)的探針，例如，長(zhǎng)度是優(yōu)選至少600個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少700個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選至少800個(gè)核苷酸，或最優(yōu)選至少900個(gè)核苷酸的核酸探針。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標(biāo)記以探測(cè)相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標(biāo)記)。將這些探針包含于本發(fā)明中。因而，可從由這些其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有木聚糖酶活性的多肽?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過其它分離技術(shù)分離來自這些其它菌株的基因組或其它DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優(yōu)選用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴(yán)緊條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸探針對(duì)應(yīng)于SEQIDNO1或SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列；包含SEQIDNO:1或SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列的基因組序列；其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或其亞序列。可使用例如X射線片(X-rayfilm)檢測(cè)在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸58-1107。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌(E.coli)NRRLB-50079中的質(zhì)粒PTterlOA中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列編碼具有木聚糖酶活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50079中的質(zhì)粒pTterlOA中含有的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:3的核苷酸55-1242。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:4的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:3。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌(E.coli)NRRLB-50080中的質(zhì)粒PTterlOB中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列編碼具有木聚糖酶活性的多肽。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是包含在大腸桿菌NRRLB-50080中的質(zhì)粒pTterlOB中含有的成熟多肽編碼區(qū)。對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，將非常低至非常高的嚴(yán)緊條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200yg/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對(duì)于非常低和低嚴(yán)緊性為25%的甲酰胺、對(duì)于中和中-高嚴(yán)緊性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)緊性為50%的甲酰胺，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時(shí)。對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，使用2XSSC、0.2%SDS優(yōu)選在45°C(非常低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選在50°C(低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選在55°C(中嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選在60°C(中-高嚴(yán)緊性)，甚至更優(yōu)選在65°C(高嚴(yán)緊性)，并且最優(yōu)選在70°C(非常高嚴(yán)緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，將嚴(yán)緊條件定義為在比使用根據(jù)Bolton和McCarthy計(jì)算法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)計(jì)算得出的Tm低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA，0.5%NP-40，IXDenhardt溶液，ImM焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate)，ImM舞酸二Mi內(nèi)(sodiummonobasicphosphate),0.ImMATP禾口0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至24小時(shí)。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計(jì)算得出的T1Jg5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及由如下多核苷酸編碼的具有木聚糖酶活性的分離的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1或SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、甚至更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%、并且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%同一性程度的核苷酸序列或由所述核苷酸序列組成，其編碼具有木聚糖酶活性的多肽。參見本文多核苷酸部分。在第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及SEQIDNO2或SEQIDNO4的成熟多肽或其同源序列的取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(或幾個(gè))氨基酸的人工變體。優(yōu)選地，氨基酸改變對(duì)性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為1至大約30個(gè)氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸序列(poly-histidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hi11，1979，于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu禾口Asp/Gly。除了20個(gè)基本氨基酸，非基本氨基酸(如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上可得到的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑燒羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸?？晒┻x擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個(gè)殘基，并且測(cè)試所得突變分子的生物活性(即，木聚糖酶活性)以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699_4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測(cè)定，如通過以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推定的接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來測(cè)定。參見例如deVos等，1992，Science255:306-312;Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899_904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBSLett.309:59_64。必12需氨基酸的身份(identity)也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson禾ΠSauer,1988，Science241:53_57；Bowie禾ΠSauer,1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152_2156；WO95/17413；或W095/22625公開的那些方法來進(jìn)行并測(cè)試單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失、和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯(cuò)PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30:10832_10837；美國專利5，223，409號(hào)；WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46145；Ner等，1988，DNA7127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動(dòng)化的篩選方法組合以檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測(cè)序。這些方法允許快速測(cè)定感興趣的多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。SEQIDNO:2或SEQIDNO4的成熟多肽如SEQIDNO2的氨基酸20-369的氨基酸或SEQIDNO4的氨基酸17-413的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選1。具有木聚糖酶活性的多肽的來源本發(fā)明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語“獲得自”，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產(chǎn)生。在一個(gè)優(yōu)選的方面，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。本發(fā)明具有木聚糖酶活性的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細(xì)菌多肽如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有木聚糖酶活性；或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬(Ureaplasma)多肽，所述多肽具有木聚糖酶活性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有木聚糖酶活性的嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、!軍定^1Ur包!f胃(Bacillusamyloliquefaciens)lif(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有木聚糖酶活性的似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、酉良月農(nóng)鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有木聚糖酶活性的不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍(lán)鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)多月太。本發(fā)明具有木聚糖酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽如念珠菌屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)多肽，其具有木聚糖酶活性；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬錯(cuò)菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium.鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、耙齒菌屬(Irpex)、蘑燕屬(Lentinula)、Leptospaeria、梨抱菌屬(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasia、假漂盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長(zhǎng)毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽，其具有木聚糖酶活性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有木聚糖酶活性的卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽是具有木聚糖酶活性的解纖維枝頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、漂曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、ChrysosporiumqueenslandicumΛChrysosporiumzonatum、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫威,廉抱(Fusariumcrookwellense)、大刀,廉抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色,廉抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱,廉抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)毒(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)毒(Humicolalanuginosa)、白奉巴齒菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長(zhǎng)枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)多月太。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽是具有木聚糖酶活性的Thielaviaachromatica、Thielaviaalbomyces、Thielaviaalbopilosa、澳洲梭抱殼(Thielaviaaustraleinsis)、Thielaviafimeti、小抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱殼(Thielaviaovispora)、Thielaviaperuviana、瘤抱梭抱殼(Thielaviaspededonium)、毛梭抱殼(Thielaviasetosa)ΛThielaviasubthermophila、zht—胃(Thielaviaterrestris)多肽。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述多肽是具有木聚糖酶活性的土生梭孢霉多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有木聚糖酶活性的土生梭孢霉NRRL8126多肽，例如，包含SEQIDNO2或SEQIDNO4的成熟多肽的多肽。可理解的是對(duì)于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectmdimperfectstates)，和其它分類學(xué)的等同物(equivalent)，例如無性型(mamorph)，而無論它們已知的種名。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員會(huì)容易地識(shí)別適合的等同物的身份(identity)。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)對(duì)于公眾能夠容易地取得，所述保藏機(jī)構(gòu)如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物禾口細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)0此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測(cè)到編碼多肽的多核苷酸序列，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989，見上)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一個(gè)多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們?cè)陂喿x框中，并且使融合多肽的表達(dá)在相同啟動(dòng)子和終止子的控制下。融合多肽還可以包括切割位點(diǎn)。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位點(diǎn)，從融合蛋白質(zhì)釋放具有木聚糖酶活性的多肽。切割位點(diǎn)的實(shí)例包括，但不限于，編碼二肽Lys-Arg的Kex2位點(diǎn)(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568_76；Svetina等，2000，J.Biotechnol.76:245_251；Rasmussen-ffiIson等，1997,Appl.Environ.Microbiol.633488-3493；Ward等，1995，Biotechnology13:498—503;禾口Contreras等，1991，Biotechnology9:378_381)；Ile_(Glu或Asp)-Gly-Arg位點(diǎn)，其在精氨酸殘基后通過因子Xa蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點(diǎn)，其在賴氨酸后通過腸激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982-987)；His-Tyr-Glu位點(diǎn)或His-Tyr-Asp位點(diǎn)，其通過GenenaseI切割(Carter等，1989，Proteins-Structure,Function,andGenetics6:240_248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點(diǎn)，其在Arg后通過凝血酶切割(Stevens，2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點(diǎn)，其在Gln后通過TEV蛋白酶切割(Stevens，2003，見上)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點(diǎn)，其在Gln后通過遺傳工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，見上)。多核苷酸本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼本發(fā)明具有木聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列，或由該核苷酸序列組成。在一個(gè)優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1或由SEQIDNO=I組成。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLB-50079中所含質(zhì)粒pTterlOA中的序列，或由該序列組成。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列組成。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸58-1107或由SEQIDNO:1的核苷酸58-1107組成。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLB-50079中所含質(zhì)粒pTterlOA中的成熟多肽編碼序列或由該成熟多肽編碼序列組成。本發(fā)明還包含編碼如下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽組成；由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:1或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO1的亞序列，其編碼具有木聚糖酶活性的SEQIDNO2的片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO3或由SEQIDNO3組成。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLB-50080中所含質(zhì)粒pTterlOB中的序列，或由該序列組成。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列組成。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO3的核苷酸55-1242或由SEQIDNO3的核苷酸55-1242組成。在另一更優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含大腸桿菌NRRLB-50080中所含質(zhì)粒pTter10B中的成熟多肽編碼序列或由該成熟多肽編碼序列組成。本發(fā)明還包含編碼如下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ16IDNO:4的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQIDNO:4的氨基酸序列或其成熟多肽組成；由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:3或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO3的亞序列，其編碼具有木聚糖酶活性的SEQIDNO4的片段。本發(fā)明還涉及突變的多核苷酸，其在SEQIDNO:1或SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列中包含至少一個(gè)突變或由具有至少一個(gè)突變的SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列組成，其中突變的核苷酸序列分別編碼SEQIDNO2或SEQIDNO4的成熟多肽。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，且包括從基因組DNA分離，從CDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá)文庫的抗體篩選來檢測(cè)具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸擴(kuò)增方法，如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的擴(kuò)增(NASBA)?？蓮乃箧邭倬?，或另外的或相關(guān)的生物體克隆所述多核苷酸，并因此可為例如所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含下述核苷酸序列或由其組成，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度，所述多核苷酸編碼活性多肽。修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列對(duì)于合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術(shù)語與所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適PH等方面不同的人工變體?？梢栽谧鳛镾EQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎(chǔ)上，和/或通過引入如下核苷酸取代來構(gòu)建變體序列所述取代不產(chǎn)生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關(guān)于核苷酸取代的概述，參見，例如，F(xiàn)ord等，1991，ProteinExpressionandPurification2:95-107。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，這些取代能夠在對(duì)于分子功能重要的區(qū)域之外進(jìn)行，并且仍然產(chǎn)生活性多肽。對(duì)于由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關(guān)鍵的并且因此優(yōu)選不進(jìn)行取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法，如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(參見，例如，Cunningham和Wells，1989，見上)來鑒定。在后一技術(shù)中，將突變引入到分子中的每個(gè)荷正電的殘基處，并且測(cè)試所得突變分子的木聚糖酶活性，以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。底物_酶相互作用的位點(diǎn)也能夠通過分析三維結(jié)構(gòu)測(cè)定，通過如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標(biāo)記這樣的技術(shù)來測(cè)定(參見，例如，deVos等，1992，見上；Smith等，1992，見上；Wlodaver等，1992，見上)。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴(yán)緊條件下，優(yōu)選低嚴(yán)緊條件，更優(yōu)選中嚴(yán)緊條件，更優(yōu)選中_高嚴(yán)緊條件，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)緊條件，并且最優(yōu)選非常高的嚴(yán)緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDNO:1或SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列，()包含SEQIDNO:1或SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈，或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，同上)，如本文所定義的。在一個(gè)優(yōu)選的方面，互補(bǔ)鏈?zhǔn)荢EQIDNO:1或SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。本發(fā)明還涉及通過如下獲得的分離的多核苷酸(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴(yán)緊條件下，將DNA的群體與以下雜交(i)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列，()包含SEQIDNO:1或SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述互補(bǔ)鏈?zhǔn)荢EQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸與一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細(xì)胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)?？梢杂迷S多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以供多肽的表達(dá)。依賴于表達(dá)載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對(duì)其進(jìn)行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可以是適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列，其是由用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞識(shí)別的核苷酸序列。啟動(dòng)子序列含有介導(dǎo)多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，特別是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下述獲得的啟動(dòng)子大腸桿菌Iac操縱子、天藍(lán)鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α_淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731),\)JsRtac(DeBoerφ,1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21—25)。另外的啟動(dòng)子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"于ScientificAmerican，1980，242:74_94中；和在Sambrook等，1989，見上中描述。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下列酶的基因獲得的啟動(dòng)子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(WC)00/56900)、鑲片鐮孢Quirm(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2_tpi啟動(dòng)子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子。在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的啟動(dòng)子由Romanos等，1992,Yeast8:423_488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其是由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其是對(duì)于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’-末端?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列用在本發(fā)明中。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時(shí)，宿主細(xì)胞將其識(shí)別為向轉(zhuǎn)錄的mRNA添加聚腺苷殘基的信號(hào)。可以將在所選宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，MolecularCellularBiology15:5983_5990描述。調(diào)控序列還可以是信號(hào)肽編碼序列，其編碼與多肽的氨基末端相連的氨基酸序列，并且指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可固有地包含信號(hào)肽編碼序列，該信號(hào)肽編碼序列與編碼分泌多肽的編碼序列區(qū)段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?；蛘?，編碼序列5’端可含有對(duì)于所述編碼序列為外源的信號(hào)肽編碼序列。外源信號(hào)肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號(hào)肽編碼序列時(shí)可為必需的?；蛘?，外源信號(hào)肽編碼序列可以簡(jiǎn)單地取代天然信號(hào)肽編碼序列以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞的分泌途徑(即，分泌至培養(yǎng)基中)的任何信號(hào)肽編碼序列可在本發(fā)明中使用。對(duì)于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS,nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號(hào)肽由Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews57:109_137描述。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的信號(hào)肽從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號(hào)肽編碼序列由Romanos等，1992，見上描述。在一個(gè)優(yōu)選的方面，信號(hào)肽包含SEQIDNO2的氨基酸1至19或由SEQIDNO2的氨基酸1至19組成。在另一優(yōu)選的方面，信號(hào)肽編碼序列包含SEQIDNO:1的核苷酸1至57或由SEQIDNO1的核苷酸1至57組成。在另一優(yōu)選的方面，信號(hào)肽包含SEQIDNO4的氨基酸1至18或由SEQIDNO4的氨基酸1至18組成。在另一優(yōu)選的方面，信號(hào)肽編碼序列包含SEQIDNO3的核苷酸1至54或由SEQIDNO3的核苷酸1至54組成。調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))0前(多)肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為成熟活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)的基因獲得前肽編碼區(qū)。當(dāng)信號(hào)肽和前肽序列二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時(shí)，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且將信號(hào)肽序列置于緊接著前肽序列的氨基末端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)來調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是引起基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。本文所述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))方便的限制位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的核苷酸序列?？晒┻x擇的是，可以通過在適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體來表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸序列。在制備表達(dá)載體的過程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)用調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)。或者，載體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單獨(dú)的載體或質(zhì)?；騼蓚€(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))選擇性標(biāo)記，其允許簡(jiǎn)單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、對(duì)營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，所述抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶)(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase),sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因禾口吸水鏈霄菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組的自主復(fù)制。為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件。或者，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對(duì)，優(yōu)選400至10，000堿基對(duì)，并且最優(yōu)選800至10，000堿基對(duì)，其與相應(yīng)的目標(biāo)序列具有高度同一性以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以還包含復(fù)制起點(diǎn)，其使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(r印licator)，其在細(xì)胞中發(fā)揮功能。術(shù)語“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”在本文定義為能夠使質(zhì)粒或載體體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)，ARSl,ARS4，ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch159163-9175；WO00/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)粒或載體能夠根據(jù)公開于WO00/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€(gè)拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細(xì)胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得將至少一個(gè)額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組，或?qū)⒖蓴U(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因包括于多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來選擇含有選擇性標(biāo)記基因的擴(kuò)增拷貝，從而也含有多核苷酸的額外拷貝的細(xì)胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸，將所述重組宿主細(xì)胞有利地用于多肽的重組產(chǎn)生。將包含本發(fā)明的多核苷酸的載體引入宿主細(xì)胞從而將所述載體作為染色體整合體或作為自復(fù)制的染色體外載體保持，如前文所述。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包含親本細(xì)胞的任何子代，其因?yàn)樵趶?fù)制過程中發(fā)生的突變而與該親本細(xì)胞不同。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上會(huì)依賴于編碼多肽的基因及其來源。宿主細(xì)胞可以是在本發(fā)明的多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細(xì)胞，例如，原核或真核細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于，大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施中有用的芽孢桿菌屬細(xì)胞包括但不限于，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是克勞氏芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施中有用的鏈球菌屬細(xì)胞包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是似馬鏈球菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是釀膿鏈球菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是乳房鏈球菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施中有用的鏈霉菌屬細(xì)胞包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是不產(chǎn)色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是除蟲鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是天藍(lán)鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是灰色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是淺青紫鏈霉菌細(xì)胞?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111_115)，使用感受態(tài)細(xì)胞(參見，例如，Young和Spizizen，1961，JournalofBacteriology81:823_829或Dubnau禾口Davidoff-Abelson,1971，JournalofMolecularBiology56:209_221)，電穿孑L(參見，例如，Shigekawa禾口Dower，1988，Biotechniques6742-751)或接合(參見，例如，Koehler和Thome，1987，JournalofBacteriologyl69:5271_5278)。可通過如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166557-580)或電穿孑L(參見，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.16:6127_6145)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004，F(xiàn)oliaMicrobiol.(Praha)49:399_405)，接合(參見，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583_3585)，或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98=6289-6294)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細(xì)胞例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets，2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51_57)?？赏ㄟ^如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細(xì)胞例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32:1295_1297)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt和Jollick,1991，Microbios.68189-207)，電穿孔(參見，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.653800-3804)或接合(參見，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45409-436)。然而，可以使用任何已知的將DNA引入宿主細(xì)胞的方法。宿主細(xì)胞還可以是真核生物，如哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物或真菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。“真菌”用在本文包括以下門子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi，第八版，1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢^^^(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995,)。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞?！敖湍浮庇迷诒疚陌óa(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，可將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner，F(xiàn).A.，Passmore,S.Μ.，禾口Davenport，23R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是念珠菌屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細(xì)胞。在一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowialipolytica)細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進(jìn)行營養(yǎng)生長(zhǎng)，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長(zhǎng)通過單細(xì)胞菌體的出芽生殖(budding)進(jìn)行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Filibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細(xì)胞。在一個(gè)最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)>zFifaIif(Ceriporiopsisaneirina)>zFifa|1>Ceriporiopsiscaregiea>Ceriporiopsisgilvescens>Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬M菌(Ceriporiopsissubvermispora)、B譽(yù)角質(zhì)金包子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、|￡金包子菌、Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium),輻射射脈菌(Phlebiaradiata)、刺芹側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、長(zhǎng)絨毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細(xì)胞。可以將真菌細(xì)胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023和Yelton^,1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA811470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I(xiàn)描述的方法轉(zhuǎn)化酵母=Becker和Guarente，于Abelson,J.N.禾口Simon,Μ.I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,182-187頁，AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明具有木聚糖酶活性的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是梭孢殼屬的。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是土生梭孢霉。在最優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是土生梭孢霉NRRL8126。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)如本文所述的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDNO:1或SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列中具有至少一個(gè)突變，其中所述突變核苷酸序列編碼多肽，所述多肽分別包含SEQIDNO2或SEQIDNO4的成熟多肽或由SEQIDNO2或SEQIDNO4的成熟多肽組成，和(b)回收所述多肽。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細(xì)胞裂解物(Iysate)回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對(duì)于所述多肽是特異性的方法來檢測(cè)多肽。這些檢測(cè)方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶試驗(yàn)(enzymeassay)可用于測(cè)定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(pr印arative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS_PAGE或提取(參見，例如，ProteinPurification，J.-C.Janson禾口LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本發(fā)明還涉及植物，例如，轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其包含分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有木聚糖酶活性的多肽，從而以可回收的量表達(dá)和產(chǎn)生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收?；蛘?，可以將含有該重組多肽的植物或植物部分按原樣(assuch)用于改進(jìn)食品或飼料的質(zhì)量，例如，改進(jìn)營養(yǎng)價(jià)值、適口性25(palatability)和流變性質(zhì)(rheologicalproperties)，或用于破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實(shí)例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadowgrass)(藍(lán)草(bluegrass)，早熟禾屬(Poa))；飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)；寒地型牧草(temperategrass)，如Agrostis(剪股穎屬)；和谷類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實(shí)例是煙草(tobacco)，豆類(legumes)，如羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet),豌豆,豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rapeseed)和緊密相關(guān)的模型生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。植物部分的實(shí)例是莖(stem)、愈傷組織(callus)、葉(leaf),^(root)、果實(shí)(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber)，以及包含這些部分的獨(dú)立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyme)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的植物細(xì)胞區(qū)室(compartments)，如葉綠體(chloroplast)、質(zhì)夕卜體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過氧化物酶體(peroxisome)和細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)也被認(rèn)為是植物部分。此外，任何植物細(xì)胞，無論什么組織來源，都被認(rèn)為是植物部分。同樣地，植物部分，如為了促進(jìn)本發(fā)明的應(yīng)用而分離的具體組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)0同樣包含于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有這些植物、植物部分和植物細(xì)胞的后代。表達(dá)本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可以依照本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建。簡(jiǎn)而言之，通過如下方法構(gòu)建所述植物或植物細(xì)胞將編碼本發(fā)明多肽的一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))表達(dá)構(gòu)建體并入植物宿主基因組或葉綠體基因組，并且將所得的修飾植物或植物細(xì)胞繁殖為轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。表達(dá)載體便利地是包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達(dá)該多核苷酸序列所需的適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。此外，表達(dá)構(gòu)建體可以包含對(duì)于鑒定宿主細(xì)胞有用的選擇性標(biāo)記，在所述宿主細(xì)胞中整合了表達(dá)構(gòu)建體和將該構(gòu)建體引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依賴于使用的DNA引入方法)。調(diào)節(jié)序列的選擇，例如啟動(dòng)子和終止子序列和任選地信號(hào)或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選擇，舉例來說，基于期望何時(shí)、何處以及如何表達(dá)多肽而確定。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達(dá)可以是組成型的或誘導(dǎo)型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以靶向特定的組織或植物部分例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如Tague等，1988，PlantPhysiology86506所述。對(duì)于組成性表達(dá)，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1和稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子(Franck等，1980，Cell21:285_294，Christensen等，1992，PlantMo.Biol.18:675_689；Zhang等，1991，PlantCell3:1155-1165)。器官特異性啟動(dòng)子可以是例如來自貯藏庫組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊蓮和果實(shí)的啟動(dòng)子(Edwards&Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或來自代謝庫組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動(dòng)子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863_878)，種子特異性啟動(dòng)子諸如來自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動(dòng)子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885_889)，來自豆球蛋白(Iegumin)B4和蠶豆(Viciafaba)的未知種子蛋白基因的蠶豆啟動(dòng)子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiology152:708_711)、來自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動(dòng)子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935_941)，來自歐洲油菜(Brassicanapus)的貯藏蛋白napA啟動(dòng)子，或本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的任何其它種子特異性的啟動(dòng)子，例如，在TO91/14772中所描述的。此外，啟動(dòng)子可為葉特異性的啟動(dòng)子，如來自稻或番茄的rbcs啟動(dòng)子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiologyl02:991_1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動(dòng)子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology26:85_93)，或來自稻的aldP基因啟動(dòng)子(Kagaya等，1995，MolecularandGeneralGenetics248:668_674)，或傷口誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573_588)。同樣地，所述啟動(dòng)子可通過非生物的處理誘導(dǎo)，所述非生物的處理諸如溫度、干旱或鹽度變化，或通過外源施加的激活所述啟動(dòng)子的物質(zhì)誘導(dǎo)，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellicacid)，和重金屬。啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件也可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明多肽在植物中的較高表達(dá)。例如，啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件可以是內(nèi)含子，其置于啟動(dòng)子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間。例如Xu等，1993，見上，公開了使用稻肌動(dòng)蛋白1基因的第一內(nèi)含子以增強(qiáng)表達(dá)。選擇性標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其它部分可以選自本領(lǐng)域內(nèi)可用的那些。將核酸構(gòu)建體根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)并入植物基因組，所述常規(guī)技術(shù)包括土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等，1990，Science2441293；Potrykus,1990,Bio/Technology8535；Shimamoto等，1989，Nature338274)。目前，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)，是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(為了參考，見Hooykas和Schilperoort，1992，PlantMolecularBiology19:15_38)，而且它也可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，雖然對(duì)于這些植物其它的轉(zhuǎn)化方法是常用的。目前，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的優(yōu)選的方法，是用粒子(用轉(zhuǎn)化DNA涂覆的微觀的金或鎢粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚(developingembryos)(Christou,1992,PlantJournal2275-281;Shimamoto,1994，CurrentOpinionBiotechnology5:158_162；Vasil等，1992，Bio/Technology10667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的可供選擇的方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如由Omirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21:415_428所描述的。轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選擇并入了表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并且再生成為完整植物。通常設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化方法用于通過如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩種獨(dú)立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過特異性重組酶位點(diǎn)特異性地切除選擇基因。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)包含多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有木聚糖酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。去除或減少木聚糖酶活性本發(fā)明還涉及產(chǎn)生親本細(xì)胞突變體的方法，其包括破壞或缺失編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸序列或其部分，所述方法導(dǎo)致在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，與親本細(xì)胞相比突變的細(xì)胞產(chǎn)生較少的所述多肽。可以使用本領(lǐng)域熟知的方法(例如，插入、破壞、替代或缺失)通過減少或消除編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的表達(dá)來構(gòu)建突變細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列是失活的。待修飾或失活的核苷酸序列可以是，例如，編碼區(qū)或其對(duì)活性關(guān)鍵的部分，或表達(dá)編碼區(qū)所需的調(diào)節(jié)元件。這種調(diào)節(jié)或調(diào)控序列的實(shí)例可以是啟動(dòng)子序列或其功能部分，即，足以影響核苷酸序列表達(dá)的部分。用于可能的修飾的其它調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號(hào)肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活子?？梢酝ㄟ^向親本細(xì)胞施以誘變，并且選擇其中已將所述核苷酸序列的表達(dá)減少或消除的突變細(xì)胞來進(jìn)行核苷酸序列的修飾或失活。誘變可能是特異性的或隨機(jī)的，可以通過例如使用合適的物理或化學(xué)誘變劑進(jìn)行，通過使用合適的寡核苷酸進(jìn)行，或通過將所述DNA序列進(jìn)行PCR產(chǎn)生的誘變。此外，可以通過使用這些誘變劑的任何組合來進(jìn)行誘變。適合于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、0_甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲烷磺酸酯(ethylmethanesulphonate)(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。當(dāng)使用這些試劑時(shí)，通常通過如下方法來進(jìn)行所述誘變?cè)诤线m條件下在優(yōu)選的誘變劑存在時(shí)溫育待誘變的親本細(xì)胞，并篩選和/或選擇顯示基因表達(dá)減少的或無基因表達(dá)的突變體細(xì)胞。通過導(dǎo)入、取代或去除基因中的一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))核苷酸或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)節(jié)元件可以實(shí)現(xiàn)所述核苷酸序列的修飾或失活。例如，可以插入或去除核苷酸從而導(dǎo)致引入終止密碼子，去除起始密碼子，或改變開放閱讀框。按照本領(lǐng)域已知的方法通過定位誘變或PCR產(chǎn)生的誘變可以實(shí)現(xiàn)這種修飾或失活。盡管在理論上所述修飾可以在體內(nèi)進(jìn)行，即，直接在表達(dá)待修飾核苷酸序列的細(xì)胞上進(jìn)行，但優(yōu)選如下面所示例的那樣在體外進(jìn)行所述修飾。消除或減少核苷酸序列通過細(xì)胞表達(dá)的便利方式的例子是基于基因替代，基因缺失，或基因破壞的技術(shù)。例如，在基因破壞方法中，將相應(yīng)于內(nèi)源核苷酸序列的核酸序列在體外進(jìn)行誘變以產(chǎn)生缺陷性的核酸序列，隨后將其轉(zhuǎn)化入親本細(xì)胞中以產(chǎn)生缺陷基因。通過同源重組，所述缺陷性核酸序列替代了內(nèi)源性核苷酸序列。可能理想的是所述缺陷性核苷酸序列還編碼標(biāo)記，其可用于選擇其中核苷酸序列被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化子。在一個(gè)特別優(yōu)選的方面，用可選擇的標(biāo)記(如本文所述的那些)來破壞所述核苷酸序列?；蛘?，可以使用與所述核苷酸序列互補(bǔ)的序列通過確定的反義或RNAi技術(shù)來進(jìn)行所述核苷酸序列的修飾或失活。更具體地，通過導(dǎo)入與所述基因的核苷酸序列互補(bǔ)的序列可以減少或消除所述核苷酸序列通過細(xì)胞的表達(dá)，所述互補(bǔ)序列可以在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并且能夠與細(xì)胞中產(chǎn)生的mRNA雜交。在允許所述互補(bǔ)反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，由此減少或消除翻譯的蛋白質(zhì)的量。本發(fā)明進(jìn)一步涉及親本細(xì)胞的突變體細(xì)胞，其包含編碼多肽的核苷酸序列或其調(diào)28控序列的破壞或缺失，這導(dǎo)致與親本細(xì)胞相比突變體細(xì)胞產(chǎn)生更少的多肽或不產(chǎn)生多肽。這樣生成的多肽缺陷型突變細(xì)胞作為表達(dá)天然和/或異源多肽的宿主細(xì)胞特別有用。所以，本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生天然或異源多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)突變細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。術(shù)語“異源多肽”在本文中定義為對(duì)宿主細(xì)胞不是天然的多肽，進(jìn)行了修飾以改變天然序列的天然蛋白，或作為通過重組DNA技術(shù)對(duì)宿主細(xì)胞操作的結(jié)果其表達(dá)在量上改變的天然蛋白。在另一方面，本發(fā)明涉及通過發(fā)酵產(chǎn)生本發(fā)明的多肽以及目標(biāo)蛋白產(chǎn)物的細(xì)胞來生產(chǎn)基本上無木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法在發(fā)酵之前、之中或發(fā)酵完成之后向發(fā)酵液(fermentationbroth)中添加有效量的能夠抑制木聚糖酶活性的試劑，從發(fā)酵液中回收目標(biāo)產(chǎn)物，和任選地將回收的產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步純化。在另一方面，本發(fā)明涉及如下生產(chǎn)基本上無木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法在允許產(chǎn)物表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行組合的PH和溫度處理以實(shí)質(zhì)上(substantially)減少木聚糖酶活性，和從發(fā)酵液中回收產(chǎn)物。或者，可以將從培養(yǎng)液回收的酶制備物進(jìn)行組合的PH和溫度處理。所述組合的pH和溫度處理可任選地與木聚糖酶抑制劑處理組合使用。依照本發(fā)明的這個(gè)方面，可能去除至少60%，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少85%，還更優(yōu)選至少95%，并且最優(yōu)選至少99%的木聚糖酶活性?？墒褂么朔椒ǐ@得木聚糖酶活性的完全去除。組合的pH和溫度處理優(yōu)選在2-4或9-11范圍內(nèi)的pH和至少60_70°C范圍內(nèi)的溫度進(jìn)行一段足夠的時(shí)間以達(dá)到期望的效果，通常30至60分鐘是足夠的。用于培養(yǎng)和純化感興趣的產(chǎn)物的方法可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。本發(fā)明用于產(chǎn)生基本上無木聚糖酶的產(chǎn)物的方法在真核多肽，特別是真菌蛋白質(zhì)例如酶的產(chǎn)生中是特別令人有興趣的。所述酶可以選自，例如，淀粉分解酶(amylolyticenzyme)、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶(cellulolyticenzyme)、氧化還原酶或植物細(xì)胞壁降解酶。這些酶的實(shí)例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶(chitinase)、角質(zhì)酶(cutinase)、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、半乳糖苷酶、β"半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、商素過氧化酶、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。木聚糖酶缺陷細(xì)胞也可以用于表達(dá)在制藥上引起興趣的異源蛋白質(zhì)如激素、生長(zhǎng)因子、受體等?？衫斫獾氖切g(shù)語“真核多肽”不僅包括天然多肽，也包括多肽例如酶，其通過氨基酸取代、缺失或添加或其它這樣的修飾而被修飾以增強(qiáng)活性、熱穩(wěn)定性、PH耐受性等。在另外的方面，本發(fā)明涉及基本上無木聚糖酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生。抑制具有木聚糖酶活性的多肽表達(dá)的方法本發(fā)明還涉及抑制具有木聚糖酶活性的多肽在細(xì)胞中表達(dá)的方法，其包括對(duì)細(xì)胞施用雙鏈RNA(dsRNA)分子或者在細(xì)胞中表達(dá)雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本發(fā)明多核苷酸的亞序列。在一個(gè)優(yōu)選的方面，dsRNA長(zhǎng)約15、16、17、18、19、20、21、22、23、2924、25或更多的雙鏈體核苷酸。dsRNA優(yōu)選是小干擾RNA(siRNA)或微RNA(miRNA)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，dsRNA是用于抑制轉(zhuǎn)錄的小干擾RNA(SiRNA)。在另一優(yōu)選的方面，dsRNA是用于抑制翻譯的微RNA(miRNA)。本發(fā)明還涉及用于抑制細(xì)胞中多肽表達(dá)的這些包含SEQIDNO:1或SEQIDNO3成熟多肽編碼序列的部分的雙鏈RNA(dsRNA)分子。雖然本發(fā)明不受限于任何特定作用機(jī)制，但dsRNA能進(jìn)入細(xì)胞，并引起相似或相同序列的單鏈RNA(ssRNA)的降解，所述RNA包括內(nèi)源mRNA。當(dāng)細(xì)胞接觸dsRNA時(shí)，來自同源基因的mRNA選擇性地受到稱為RNA干擾(RNAi)的過程的降解。本發(fā)明的dsRNA可以用于基因沉默療法。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供使用本發(fā)明的dsRNAi選擇性地降解RNA的方法。所述方法可以在體外、在活體外(exvivo)或在體內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)方面，dsRNA分子能夠用于在細(xì)胞、器官或動(dòng)物中產(chǎn)生功能喪失突變(loss-of-functionmutation)。制備或使用選擇性降解RNA的dsRNA分子的方法在本領(lǐng)域中公知，參見，例如，美國專利號(hào)6，506，559；美國專利號(hào)6，511，824；美國專利號(hào)6，515，109；和美國專利號(hào)6，489，127。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物。優(yōu)選地，所述組合物富含這種多肽。術(shù)語“富含”表示所述組合物的木聚糖酶活性，例如，以至少1.1的富集因數(shù)(enrichmentfactor)±曾力口。所述組合物可以包含本發(fā)明的多肽作為主要酶組分，例如，單成分組合物?；蛘?，所述組合物可以包含多種酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶(ρ印tidoglutaminase)、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。額外的酶可以通過例如屬于以下屬或種的微生物產(chǎn)生曲霉屬，優(yōu)選棘孢曲霉、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；鐮孢屬，優(yōu)選桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢；腐質(zhì)霉屬，優(yōu)選特異腐質(zhì)霉或疏棉狀腐質(zhì)霉；或木霉屬，優(yōu)選哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉或綠色木毒ο可以依照本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備多肽組合物，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知方法將包括于所述組合物中的多肽穩(wěn)定化。下面給出的是本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選的用途的實(shí)例。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其它條件可以基于本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法確定。用途本發(fā)明還涉及使用具有木聚糖酶活性的多肽的方法。本發(fā)明的多肽可用于降解或修飾植物細(xì)胞壁或任何來源于植物細(xì)胞壁的含有木聚糖的材料。多種用途的實(shí)例如下所述(對(duì)其它用途，參見W02002/18561)。本發(fā)明的多肽的劑量與使用制備物的其他條件可基于本領(lǐng)域已知方法加以確定。通過側(cè)鏈的全部或部分去除來促進(jìn)木聚糖的酶法降解。本發(fā)明的多肽優(yōu)選與其它木聚糖降解酶如乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯糖呋喃糖苷酶、木糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶及其組合一同用于待降解木聚糖的工藝。例如，乙?；鶊F(tuán)可通過乙酰木聚糖酯酶去除；阿拉伯糖基團(tuán)可通過α-阿拉伯糖苷酶去除；阿魏?；鶊F(tuán)可通過阿魏酸酯酶去除，而葡糖醛酸基團(tuán)通過α-葡糖醛酸苷酶去除。由木聚糖酶，或木聚糖酶與側(cè)鏈水解酶的組合釋放的寡聚物可進(jìn)一步由木糖苷酶降解為游離的木糖。本發(fā)明的多肽優(yōu)選為包含一種或多種(數(shù)種)木聚糖降解酶的組合物的組分。在下面所述的多種用途中，本發(fā)明的多肽優(yōu)選與一種或多種(數(shù)種)木聚糖降解酶組合使用。因而，本發(fā)明還涉及降解含有木聚糖的材料的方法，包括用具有木聚糖酶活性的多肽處理所述含有木聚糖的材料。在一個(gè)優(yōu)選方面，所述含有木聚糖的材料進(jìn)一步用木聚糖降解酶處理。所述木聚糖降解酶可選自下組乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯糖呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸苷酶及其組合。植物材料可經(jīng)降解以改善不同種類的加工，促進(jìn)純化或提取除木聚糖外的組分，如自谷物純化β-葡聚糖或β-葡聚糖寡聚物，改善飼料價(jià)值，減少水結(jié)合能力，改善廢水工廠中的可降解性，改善例如草和玉米到青貯飼料的轉(zhuǎn)換，等等。本發(fā)明的多肽可用于酶法水解多種來源于植物細(xì)胞壁的材料或廢材料，例如，來自造紙的廢材料，或農(nóng)業(yè)殘余物如麥稈、玉米穗軸、玉米纖維、玉米全植株、堅(jiān)果殼、草、植物皮/殼(vegetablehull)、豆莢、酒糟、糖甜菜漿等。所述多肽還可以用于改變來源于植物細(xì)胞壁的材料的粘度。例如，所述多肽可以用于減少含有木聚糖的材料的粘度，以促進(jìn)粘性的含有木聚糖的材料的加工，如在小麥分離中。本發(fā)明的多肽還可以與有限活性的其它分解木聚糖的酶一起使用以降解木聚糖供產(chǎn)生寡糖。所述寡糖可以用作填充劑(bulkingagent)，如自谷物細(xì)胞壁材料釋放的阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)寡糖，或多少經(jīng)部分純化的來自谷物的阿拉伯木聚糖。本發(fā)明的多肽還可以與其它分解木聚糖的酶組合使用以將木聚糖降解為木糖和其它單糖(美國專利5，658，765)。釋放的木糖可以轉(zhuǎn)換為其它化合物。本發(fā)明的多肽還可以用于降解木質(zhì)纖維質(zhì)生物質(zhì)或轉(zhuǎn)換為可發(fā)酵糖以產(chǎn)生，例如，燃料、飲用乙醇和/或發(fā)酵產(chǎn)物(例如，酸、醇、酮、氣體等)。所述多肽優(yōu)選與其它木聚糖降解酶和纖維素酶組合物(內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶)組合使用。本發(fā)明的多肽可與其它酶如葡聚糖酶一起使用以改善自富油植物材料中油的提取，如自玉米胚中提取玉米油。本發(fā)明的多肽還可以用于烘烤以改善生面團(tuán)的發(fā)面(development)、彈性和/或穩(wěn)定性，和/或烘烤產(chǎn)物的體積、碎屑結(jié)構(gòu)和/或抗腐敗性能。所述多肽可以用于制備自任何類型的面粉或粗粉(例如，基于小麥、黑麥、大麥、燕麥或玉米)制備的生面團(tuán)或烘烤產(chǎn)物。用本發(fā)明的多肽產(chǎn)生的烘烤產(chǎn)物包括面包、面包卷、法國面包(baguette)等。就烘烤而言，本發(fā)明的多肽可用作僅有或主要的酶活性，或可以與其它酶如脂肪酶、淀粉酶、氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶，過氧化物酶)、漆酶和/或蛋白酶組合使用。本發(fā)明的多肽還可以用于修飾動(dòng)物飼料，且可以在體外(通過修飾所述飼料的組31分)或在體內(nèi)發(fā)揮其作用?？蓪⑺龆嚯奶砑拥胶懈甙⒗揪厶呛推咸侨┧崮揪厶橇康膭?dòng)物飼料組合物中，例如，含有谷物如大麥、小麥、黑麥、燕麥或玉米的飼料。當(dāng)添加到飼料中時(shí)，所述多肽將改善植物細(xì)胞壁的體內(nèi)降解，部分是由于小腸粘度的降低(Bedford等，1993，ProceedingsoftheIstSymposiumonEnzymesinAnimalNutrition，73-77頁)，借此實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物對(duì)植物營養(yǎng)物利用的改善。因此，改善了所述動(dòng)物的生長(zhǎng)率和/或飼料轉(zhuǎn)化比(即，相對(duì)于重量增加所攝入的飼料重量)。本發(fā)明的多肽還可以用于造紙與紙漿工業(yè)，尤其是在漂白過程中增強(qiáng)經(jīng)漂白的紙漿的亮度，借此減少用于漂白階段的氯的量，并在回收紙工藝中增加紙漿的游離度(freeness)(Eriksson,1990,WoodScienceandTechnology24:79_101；Paice等，1988,Biotechnol.和Bioeng.32:235_239，和Pommier等，1989，TappiJournal187-191)。此夕卜，所述多肽可以用于處理木質(zhì)纖維素漿從而改善其可漂白性(bleachability)。對(duì)木質(zhì)纖維素菜的處理可以，例如，如美國專利5，658，765、W093/08275,WO91/02839和WO92/03608的描述進(jìn)行。本發(fā)明的多肽還可以用于釀造啤酒，特別是改善含有，例如，大麥和/或高粱麥芽的麥芽汁的可濾性(filterability)(W02002/24926)。所述多肽可以以相同方式用作常規(guī)用于釀造的戊聚糖酶，例如，如ViStor等，1993，J.Inst.Brew.99:243_248；和EP227159所描述。此外所述多肽可用于處理釀酒酒糟(brewersspentgrain)，即，來自含有大麥或發(fā)芽大麥(maltedbarley)或其它谷物的啤酒麥芽汁產(chǎn)生的殘余物，以改善所述殘余物作為，例如，動(dòng)物飼料的利用。本發(fā)明的多肽可以用于分離植物細(xì)胞壁材料的組分，特別是谷物組分如小麥組分。特別關(guān)注的是將小麥分離成谷蛋白和淀粉，即，具有可觀商業(yè)利益的組分。所述分離工藝可通過使用本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行，方便地為作為水力旋流(hydroclone)或傾析工藝進(jìn)行的所謂打糊(batter)工藝(或濕磨工藝)。在所述打糊工藝中，起始材料為待進(jìn)行分離的植物材料(如小麥)的稀釋的可泵送的(pumpable)分散液。在小麥分離工藝中，所述分散液通常由小麥粉與水制得。本發(fā)明的多肽還可以用于制備水果或蔬菜汁以增加產(chǎn)量。本發(fā)明的多肽還可以用作用于紡織品的酶法煮煉(scouring)系統(tǒng)的組分。本發(fā)明的多肽還可以與其它酶功能組合用于洗衣洗滌劑應(yīng)用。信號(hào)月太本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含編碼蛋白質(zhì)的基因，其中所述基因與編碼信號(hào)肽的核苷酸序列可操作地連接，所述信號(hào)肽包含SEQIDNO:2的氨基酸1到19或SEQIDNO4的氨基酸1到18，或由SEQIDNO2的氨基酸1到19或SEQIDNO4的氨基酸1到18組成，其中所述基因?qū)τ谒龊塑账嵝蛄惺峭庠吹?。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸1_57或由SEQIDNO:1的核苷酸1-57組成。在另一優(yōu)選的方面，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:3的核苷酸1-54或由SEQIDNO3的核苷酸1_54組成。本發(fā)明還涉及包含這樣的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在適合于產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)這樣的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白質(zhì)。32所述蛋白質(zhì)對(duì)于宿主細(xì)胞可以是天然的或異源的。術(shù)語“蛋白質(zhì)”在本文的意思不是指特定長(zhǎng)度的編碼產(chǎn)物，并因此包括肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語“蛋白質(zhì)”還包括組合以形成編碼產(chǎn)物的兩種以上多肽。所述蛋白質(zhì)還包括雜合多肽，其包含獲得自至少兩種不同的蛋白質(zhì)的部分或全部多肽序列的組合，其中一種或多種(幾種)對(duì)于宿主細(xì)胞可以是異源或天然的。蛋白質(zhì)進(jìn)一步包括上述蛋白質(zhì)和雜合蛋白質(zhì)的天然存在的等位基因變異和工程的變異。蛋白質(zhì)優(yōu)選是激素或其變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分，或報(bào)告蛋白(reporter)。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述蛋白質(zhì)是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶(lyase)、異構(gòu)酶或連接酶。在一個(gè)更加優(yōu)選的方面，所述蛋白質(zhì)是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、另外的脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。基因可以獲得自任何原核、真核或其它來源。通過以下實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述，但不應(yīng)將其理解為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例材料用作緩沖液和底物的化學(xué)品是至少試劑級(jí)的商業(yè)產(chǎn)品。菌株使用土生梭孢霉NRRL8126作為編碼具有木聚糖酶活性的家族10多肽的基因的來源。培養(yǎng)基PDA平板由每升39克馬鈴薯右旋糖瓊脂組成。NNCYP培養(yǎng)基由每升5.OgNH4N03、0.5gMgSO4·7Η20、0·3gCaCl2,2.5g檸檬酸、1.OgBactoP印tone(細(xì)菌用蛋白胨)、5.Og酵母提取物、ImlCOVE痕量金屬溶液和使最終pH為5.4的足量K2HPO4組成。NNCYPmod培養(yǎng)基由每升1.OgNaCl,5.OgNH4N03、0.2gMgS04·7Η20、0·2gCaCl2,2.Og檸檬酸、1.Og細(xì)菌用蛋白胨、5.Og酵母提取物、ImlCOVE痕量金屬溶液和使最終pH為5.4的足量K2HPO4組成。COVE痕量金屬溶液由每升0.04gNa2B4O7·10Η20、0·4gCuSO4·5H20、1.2gFeS04·7Η20、0·7gMnSO4·H20,0.8gNa2MoO2·2H20和IOgZnSO4·7H20組成。LB平板由每升IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化鈉和15gBactoAgar(細(xì)菌用瓊脂)組成。MDU2BP培養(yǎng)基由每升45g麥芽糖、IgMgSO4·7Η20、IgNaCl、2gK2HS04、12gKH2PO4,2g尿素和500μ1AMG痕量金屬溶液組成，將pH調(diào)節(jié)至5.0，然后用0.22μm過濾裝置過濾滅菌。AMG痕量金屬溶液由每升14.3gZnSO4·7Η20、2·5gCuSO4·5Η20、0·5gNiCl2·6Η20、13.8gFeSO4·7Η20、8·5gMnSO4·7H20和3g檸檬酸組成。SOC培養(yǎng)基由2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、IOmMNaCl、2.5mMKCl、IOmMMgCl2和IOmMMgSO4組成，通過高壓滅菌進(jìn)行滅菌，然后加入過濾滅菌的葡萄糖至20mM。冷凍培養(yǎng)基由60%SOC培養(yǎng)基和40%甘油組成。2XYT培養(yǎng)基由每升16g胰蛋白胨、IOg酵母提取物、5gNaCl和15g細(xì)菌用瓊脂組成。實(shí)施例1表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)cDNA文庫構(gòu)建將土生梭孢霉NRRL8126在250ml搖瓶中補(bǔ)充有葡萄糖的50mlNNCYPmod培養(yǎng)基中于45°C，200rpm的振蕩下培養(yǎng)24小時(shí)。使用來自24小時(shí)液體培養(yǎng)物的2ml等分試樣接種含有補(bǔ)充20/oSIGMACELL20(SigmaChemicalCo.，St.Louis,MO,USA)的100mlNNCYPmod培養(yǎng)基的500ml燒瓶。將所述培養(yǎng)物在45°C，200rpm的振蕩下溫育3天。通過經(jīng)帶有玻璃纖維預(yù)濾器(Nalgene，Rochester,NY,USA)的漏斗過濾收獲菌絲體，用IOmMTris-HCl-ImMEDTApH8(TE)洗滌2次，并在液氮中快速冷凍。使用下述方法分離總RNA。將土生梭孢霉NRRL8126的冷凍菌絲體在電動(dòng)咖啡研磨機(jī)中研磨。將經(jīng)研磨的材料與20mlFENAZ0L(Ambion，Inc.，Austin，TX，USA)按1Iv/ν在50mlFALCON管中混合。一旦將菌絲體懸浮，就用氯仿提取菌絲體并用酚-氯仿-異戊醇2524lv/v/v混合物提取三次。通過加入1/10體積的3M乙酸鈉pH5.2和1.25倍體積的異丙醇從得到的水相沉淀RNA。通過在4°C以12，OOOxg離心30分鐘來回收沉淀的RNA。最終沉淀用冷的70%乙醇洗滌、風(fēng)干并重懸在500ml用焦碳酸二乙酯處理的水(DEPC水)中。純化的RNA的質(zhì)和量用AGILENT2100Bioanalyzer(AgilentTechnologies,Inc.,PaloAlto,CA,USA)評(píng)定。在POLY(A)PURISTMagneticKit(Ambion,Inc.,Austin,TX,USA)的輔助下按照制造商的說明從360μg總RNA分離聚腺苷酸化的mRNA。為了創(chuàng)建cDNA文庫，采用CL0NEMINERKit(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA,USA)構(gòu)建定向文庫，其不需要使用限制酶克隆，由此降低了嵌合克隆數(shù)和大小偏好。為了確保cDNA的成功合成，以兩種不同的mRNA濃度(2.2和4.4μg多聚(A)+mRNA)平行進(jìn)行了兩個(gè)反應(yīng)。將mRNA樣品與Biotin-attB2_01igo(dt)(生物素-attB2-寡聚(dt))引物(InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA,USA)、1X第一鏈緩沖液(InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA,USA)、2μ10.IM二硫蘇糖醇(DTT)UOmM每種dNTP和水混合以使終體積分別為18和16μ1。將反應(yīng)混合物混合，然后加入2和4μ1的SUPERSCRIPT逆轉(zhuǎn)錄酶(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA，USA)。將反應(yīng)混合物在45°C溫育60分鐘以合成第一互補(bǔ)鏈。對(duì)于第二鏈合成，向每個(gè)第一鏈反應(yīng)加入30μ15Χ第二鏈緩沖液(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA,USA)、3μ1IOmM的每種dNTP、10單位大腸桿菌DNA連接酶(InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA,USA)、40單位大腸桿菌DNA聚合酶I(InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA,USA)和2單位大腸桿菌RNaseH(InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA,USA)，總體積為150μ1。然后將所述混合物在16°C溫育2小時(shí)。2小時(shí)溫育之后，向每個(gè)反應(yīng)加入2μ1Τ4DNA聚合酶(InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA,USA)并在16°C溫育5分鐘以產(chǎn)生平端cDNA。用酚-氯仿-異戊醇25241ν/ν/ν的混合物提取所述cDNA反應(yīng)物并且在20μg糖原、120μ15Μ乙酸銨和660μ1乙醇存在下沉淀。在4°C以12，OOOxg離心30分鐘后，用冷的70%乙醇洗滌cDNA沉淀，真空干燥2-3分鐘，并重懸在18μ1DEPC水中。向每個(gè)重懸的cDNA樣品加入10μ15Χ適應(yīng)緩沖液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)、每種attBl銜接頭(adapter)(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)10μg、7μ10.IMDTT和5單位T4DNA連接酶(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。將連接反應(yīng)在16°C溫育過夜。通過在ImlSEPHACRYLS-500HR樹脂(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ,USA)中進(jìn)行的大小排阻層析去除過量的銜接頭。按照CLONEMINERKit的說明書收集柱級(jí)分，并且用AGILENT2100Bioanalyzer分析級(jí)分3-14以確定attBl銜接頭開始洗脫的級(jí)分。該分析顯示銜接頭大約在級(jí)分10或11開始洗脫。對(duì)于第一文庫，匯集了級(jí)分6-11，而對(duì)于第二文庫，匯集了級(jí)分4-11。按照GATEWAYSystem規(guī)程(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA,USA)使用BPCL0NASE(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA，USA)作為重組酶通過同源DNA重組進(jìn)行cDNA的克隆。每個(gè)BPCL0NASE重組反應(yīng)含有約70ng側(cè)翼為attB的cDNA、250ngpD0NR222、2μ15ΧBPCL0NASE緩沖液、2μ1TE禾口3μ1BPCL0NASE。所有試劑獲得自Invitrogen，Carlsbad,CA,USA。將重組反應(yīng)在25°C溫育過夜。然后將熱失活的BP重組反應(yīng)分成6個(gè)等分試樣，并且電穿孔入ELECTR0MAX大腸桿菌DH10B電感受態(tài)細(xì)胞(InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA,USA)，所述電穿孔使用GENEPULSER(Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)和以下參數(shù)電壓2.OkV；電阻200Ω；和電容25yF。將電穿孔的細(xì)胞重懸在ImlSOC培養(yǎng)基中并在37°C、200rpm恒定振蕩下溫育60分鐘。在溫育期之后，匯集轉(zhuǎn)化的細(xì)胞并與冷凍培養(yǎng)基按11混合。取200μ1等分試樣用于文庫滴定(librarytitration)，然后將剩余的每種文庫分裝至1.8ml冷凍小瓶(ffheatonScienceProducts,Millville,NJ,USA)中并在_80°C冷凍儲(chǔ)藏。制備每種文庫的四個(gè)系列稀釋物1/100，1/1000，1/104和1/105。對(duì)于每種稀釋物，將100μ1鋪板到150mm補(bǔ)充有50μg/ml卡那霉素的LB平板上并在37°C溫育過夜。計(jì)數(shù)每種稀釋物平板上的菌落數(shù)并用于計(jì)算每種文庫中的轉(zhuǎn)化體總數(shù)。第一文庫含有約540萬獨(dú)立克隆，而第二文庫含有約900萬獨(dú)立克隆。實(shí)施例2=CDNA克隆的模板制備和核苷酸測(cè)序?qū)碜詫?shí)施例1中所述的兩個(gè)文庫的等分試樣混合并鋪板在補(bǔ)充有50μg/ml卡那霉素的25x25cmLB平板上。在QPixRobot(GenetixInc.,Boston,MA,USA)的輔助下將單獨(dú)的菌落排列在96孔板上，所述96孔板含有100μ1補(bǔ)充有50μg/ml卡那霉素的LB。針對(duì)總共4320個(gè)獨(dú)立的克隆獲得了45個(gè)96孔板。將這些平板在37°C、200rpm振蕩下溫育過夜。溫育之后，向每孔加入100μ1無菌的50%甘油。借助96針工具(Boekel，F(xiàn)easterville,PA,USA)將轉(zhuǎn)化體復(fù)制到次級(jí)深皿96孔微量培養(yǎng)板中(AdvancedGeneticTechnologiesCorporation,Gaithersburg,MD,USA),其中每孑L含有Iml補(bǔ)充有50μg/ml卡那霉素的MAGNIFICENTBROTH(MacConne11Research,SanDiego，CA，USA)。將原始微量滴定板冷凍儲(chǔ)藏在_80°C。將次級(jí)深皿板在旋轉(zhuǎn)搖床上以300rpm劇烈搖動(dòng)在37°C溫育過夜。為了避免濺出和交叉污染，也為了允許充分的通氣，將每個(gè)次級(jí)培養(yǎng)板用聚丙烯墊(AdvancedGeneticTechnologiesCorporation,Gaithersburg,MD,USA)禾口塑料微量滴定皿蓋覆蓋。用Robot-Smart384(MWGBiotechInc.，HighPoint,NC,USA)和MONTAGEPlasmidMiniprepKit(Millipore,Billerica,MA,USA)制備質(zhì)粒DNA。測(cè)序反應(yīng)使用BIGDYE(AppliedBiosystems,Inc.，F(xiàn)osterCity,CA,USA)終止子化學(xué)(Giesecke等，1992，JournalofVirologyMethods38:47_60)和如下M13Forward(正向)(-20)測(cè)序引物進(jìn)行5，-GTAAAACGACGGCCAG-3，(SEQIDNO:5)。所述測(cè)序反應(yīng)以384孔形式用Robot-Smart384進(jìn)行。終止子的去除用MULTISCREENSeq384SequencingClean-upKit(測(cè)序清除試劑盒)(Millipore，Billerica,MA,USA)進(jìn)行。反應(yīng)含有6μ1質(zhì)粒DNA和4μ1測(cè)序用主混合物(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)，所述混合物含有1μ15Χ測(cè)序緩沖液(Millipore，Billerica,MA,USA)、1μBIGDYE終止子(AppliedBiosystems,Inc.，F(xiàn)osterCity，CA，USA)、1.6皮摩爾M13正向引物和Ιμ水。單輪DNA測(cè)序(single-passDNAsequencing)用ABIPRISM自動(dòng)DNA測(cè)序儀3700型(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)進(jìn)行。實(shí)施例3:cDNA克隆的DNA序列數(shù)據(jù)分析堿基判定(basecalling)、質(zhì)量賦值(qualityvalueassignment)和載體修整(vectortrimming)借助PHRED/PHRAP軟件(UniversityofWashington,Seattle,WA,USA)進(jìn)行。EST的聚類分析用TranscriptAssemblerv.2.6.2.(Paracel,Inc.,Pasadena,CA,USA)進(jìn)行。EST聚類(clustering)分析表明存在395個(gè)獨(dú)立的簇。對(duì)裝配的EST序列針對(duì)PIR和其他數(shù)據(jù)庫的序列同源性分析用Blastx程序(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-410)在32節(jié)點(diǎn)Linux簇(Paracel,Inc.，Pasadena,CA,USA)上使用BLOSUM62矩陣(Henikoff，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915-10919)進(jìn)行。從這些看，246個(gè)在不同的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫對(duì)已知的基因具有命中，而149個(gè)對(duì)這些數(shù)據(jù)庫沒有顯著的命中。在這246個(gè)基因中，13個(gè)針對(duì)糖基水解酶基因的經(jīng)充分表征的同源物具有命中。實(shí)施例4編碼土生梭孢霉家族10木聚糖酶(GH10A和GH10B)的cDNA克隆的鑒定編碼土生梭孢霉家族10木聚糖酶(GH10A)的cDNA克隆最初是通過與來自雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)(GenP印t登錄號(hào)060206)的木聚糖酶的序列同源性鑒定的。編碼另一個(gè)土生梭孢霉家族10木聚糖酶(GH10B)的另一個(gè)cDNA克隆起初通過與來自灰腐質(zhì)霉的木聚糖酶的序列同源性(GenP印t登錄號(hào)BAA19220)來鑒定。在此初始鑒定之后，從其原始冷凍貯存平板取回定名為Tterl0D9(GH10A)和Tter23Dl(GH10B)的克隆并劃線接種到補(bǔ)充有50μg/ml卡那霉素的LB平板上。將所述平板在37°C溫育過夜并使用來自每個(gè)平板的單菌落接種3ml補(bǔ)充有150μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基。將所述液體培養(yǎng)物在37°c溫育過夜并且用BIOROBOT9600(QIAGEN，INC.，Valencia,CA,USA)從兩者制備質(zhì)粒DNA。用BIGDYE終止子化學(xué)如上所述再次測(cè)序來自克隆TterlOD9和Tter23Dl的質(zhì)粒DNA，其中使用M13正向引物和M13反向引物及下文所示的多聚T引物來測(cè)序該克隆的3’端。5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3‘(SEQIDNO6)其中V=G、A、C且N=G、A、C、T36用Interproscan程序(Zdobnov禾口ApweiIer，2001，Bioinformatics17:847_8)分析推導(dǎo)的克隆10D9的氨基酸序列，該分析顯示所述氨基酸序列含有糖基水解酶家族10的序列特征(sequencesignature)。這種稱為Pfam:PF00331的序列特征存在于自起始氨基酸甲硫氨酸起的28個(gè)氨基酸，確認(rèn)了克隆TterlOD9編碼家族10糖基水解酶。對(duì)克隆23D1的推導(dǎo)的氨基酸序列的分析顯示該蛋白質(zhì)也含有糖基水解酶家族10的特征Pfam:PF00331。這種特征序列存在于自起始氨基酸甲硫氨酸起18個(gè)氨基酸，確認(rèn)了克隆Tter23Dl編碼家族10糖基水解酶。TterlOD9的cDNA序列(SEQIDNO1)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO2)示于圖1。該cDNA克隆編碼369個(gè)氨基酸的多肽。全長(zhǎng)編碼區(qū)的％G+C含量為66.3%，并且成熟蛋白編碼區(qū)(SEQIDNO:1的核苷酸58-1107)的％G+C含量為66.5%。使用SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，ProteinEngineering10:1-6)，預(yù)測(cè)了19個(gè)殘基的信號(hào)肽。預(yù)測(cè)的成熟蛋白含有350個(gè)氨基酸，具有39.IkDa的分子量。使用ClustalW方法(Higgins，1989，見上)，用VectorNTIAdvance10.3軟件(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的AlignX模塊和blosum62mt2評(píng)分矩陣，以及下列多種比對(duì)參數(shù)確定了氨基酸序列的比較性配對(duì)全局比對(duì)K-元組大小1；最佳對(duì)角線5；窗口大小5；缺口罰分5；缺口開放罰分10；缺口延伸罰分0.1。該比對(duì)顯示土生梭孢霉GHlOA基因的推導(dǎo)的氨基酸序列與來自嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)木聚糖酶序列(GeneSeqP:AAW23541；WO97/27292)推導(dǎo)的氨基酸序列共享77%同一性。Tter23Dl的cDNA序列(SEQIDNO3)和推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO4)示于圖2。該cDNA克隆編碼414個(gè)氨基酸的多肽。全長(zhǎng)編碼區(qū)的％G+C含量為66.7%，并且成熟蛋白編碼區(qū)(SEQIDNO:3的核苷酸55-1242)的％G+C含量為66.8%。使用SignalP軟件程序(Nielsen等，1997，見上)，預(yù)測(cè)了18個(gè)殘基的信號(hào)肽。預(yù)測(cè)的成熟蛋白含有396個(gè)氨基酸，具有42.5kDa的分子量。使用ClustalW方法(Higgins，1989，見上)，用VectorNTIAdvance10.3軟件(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的AlignX模塊和blosum62mt2評(píng)分矩陣，以及下列多種比對(duì)參數(shù)確定了氨基酸序列的比較性配對(duì)全局比對(duì)K-元組大小1；最佳對(duì)角線5；窗口大小5；缺口罰分5；缺口開放罰分10；缺口延伸罰分0.1。該比對(duì)顯示土生梭孢霉GHlOB基因的推導(dǎo)的氨基酸序列與來自棘孢曲霉的木聚糖酶II序列(GeneSeqP:AAR63790；WO94/21785)推導(dǎo)的氨基酸序列共享54%同一性。一旦確認(rèn)了克隆TterlOD9和Tter23Dl的同一性，將來自每個(gè)克隆的定名為pTterl0A(圖3)和pTterl0B(圖4)的質(zhì)粒DNA的0.5μ1等分試樣分別轉(zhuǎn)移至大腸桿菌Τ0Ρ10細(xì)胞(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA,USA)的小瓶中，輕輕混合，并在冰上溫育10分鐘。然后將細(xì)胞在42°C熱休克30秒并再次在冰上溫育2分鐘。將細(xì)胞重懸在250μ1SOC培養(yǎng)基中，并在37°C、以200rpm恒定振蕩溫育60分鐘。溫育期之后，將兩份30μ1等分試樣鋪板在補(bǔ)充有50μg/ml卡那霉素的LB平板上并在37°C溫育過夜。次日，從每個(gè)轉(zhuǎn)化物挑取單菌落并劃線接種到3個(gè)1.8ml冷凍小瓶中，所述冷凍小瓶含有約1.5ml補(bǔ)充有50μg/ml卡那霉素的LB瓊脂糖。將小瓶用PETRISEAL(DiversifiedBiotech,BostonMA,USA)密封，并作為NRRLB-50079和NRRLB-50080保藏在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection),北區(qū)石if究中心(NorthernRegionalResearchCenter),Peoria,IL，USA，保藏日期為2007年11月30日。生物材料的保藏依據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款，下述的生物材料已經(jīng)保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心(亦稱農(nóng)業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心)(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection),北區(qū)石if究中心(NorthernRegionalResearchCenter)，1815UniversityStreet,Peoria,Illinois，61604，并給予下述的登錄號(hào)保藏物登錄號(hào)保藏日期大腸桿菌pTterlOANRRLB-500792007年11月30日大腸桿菌pTterlOBNRRLB-500802007年11月30日所述菌株于下述條件下保藏確保在本專利申請(qǐng)未決期間，由外國專利法律決定授權(quán)的人能夠獲得所述培養(yǎng)物。所述保藏物為所保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。在提交了題述申請(qǐng)的副本或其后續(xù)文本的國家，依據(jù)該外國專利法律的要求，可以獲得所述保藏物。然而，應(yīng)當(dāng)理解，保藏物的獲得并不構(gòu)成對(duì)實(shí)施題述發(fā)明的許可，實(shí)施題述發(fā)明是對(duì)政府行為所授予的專利權(quán)的侵犯。通過下述編號(hào)的段落進(jìn)一步描述本發(fā)明[1]一種具有木聚糖酶活性的分離的多肽，其選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO:4的成熟多肽具有至少60%同一性或與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少80%同一性的氨基酸序列；(b)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中-高嚴(yán)緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或在至少高嚴(yán)緊條件下與以下雜交(iv)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ν)包含SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(vi)(iv)或(ν)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。(c)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性和與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少80%同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO2或SEQIDNO4的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。[2]段落1的多肽，其包含與SEQIDNO4的成熟多肽具有至少60%同一性的氨基酸序列。[3]段落2的多肽，其包含與SEQIDNO4的成熟多肽具有至少65%同一性的氨基酸序列。[4]段落3的多肽，其包含與SEQIDNO4的成熟多肽具有至少70%同一性的氨基酸序列。[5]段落4的多肽，其包含與SEQIDNO4的成熟多肽具有至少80%同一性的氨基酸序列。[6]段落5的多肽，其包含與SEQIDNO4的成熟多肽具有至少85%同一性的氨基酸序列。[7]段落6的多肽，其包含與SEQIDNO4的成熟多肽具有至少90%同一性的氨38基酸序列。[8]段落7的多肽，其包含與SEQIDNO4的成熟多肽具有至少95%同一性的氨基酸序列。[9]段落8的多肽，其包含與SEQIDNO4的成熟多肽具有至少97%同一性的氨基酸序列。[10]段落1的多肽，其包含SEQIDNO2的成熟多肽具有至少80%同一性的氨基酸序列。[11]段落10的多肽，其包含SEQ基酸序列。[12]段落11的多肽，其包含SEQ基酸序列。[13]段落12的多肽，其包含SEQ基酸序列。[14]段落13的多肽，其包含SEQ基酸序列。[15]段落1的多肽，其包含SEQIDNO:2或SEQIDNO4的氨基酸序列或其具有木聚糖酶的片段，或由SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列或其具有木聚糖酶的片段組成。[16]段落15的多肽，其包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列，或由SEQIDNO:2或SEQIDNO4的氨基酸序列組成。[17]段落15的多肽，其包含SEQIDNO2或SEQIDNO4的成熟多肽，或由SEQIDNO2或SEQIDNO4的成熟多肽組成。[18]段落1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少中-高嚴(yán)緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[19]段落18的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴(yán)緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[20]段落1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少高嚴(yán)緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[21]段落1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性的核苷酸序列。[22]段落21的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列具有至少65%同一性的核苷酸序列。[23]段落22的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列具有至少70%同一性的核苷酸序列。[24]段落23的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列具有至少80%同一性的核苷酸序列。IDNO2的成熟多肽具有至少85%同一性的氨IDNO2的成熟多肽具有至少90%同一性的氨IDNO2的成熟多肽具有至少95%同一性的氨IDNO2的成熟多肽具有至少97%同一性的氨[25]段落24的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列具有至少85%同一性的核苷酸序列。[26]段落25的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。[27]段落26的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列具有至少95%同一性的核苷酸序列。[28]段落27的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列具有至少97%同一性的核苷酸序列。[29]段落1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列具有至少80%同一性的核苷酸序列。[30]段落29的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少85%同一性的核苷酸序列。[31]段落30的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。[32]段落31的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列具有至少95%同一性的核苷酸序列。[33]段32的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少97%同一性的核苷酸序列。[34]段落1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDN0:1或SEQIDNO:3的核苷酸序列或其編碼具有木聚糖酶活性的片段的亞序列，或由SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的核苷酸序列或其編碼具有木聚糖酶活性的片段的亞序列組成。[35]段落34的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO1或SEQIDNO3的核苷酸序列，或由SEQIDNO1或SEQIDNO3的核苷酸序列組成。[36]段落34的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO1或SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列，或由SEQIDNO1或SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列組成。[37]段落1的多肽，其中所述多肽為SEQIDNO:2或SEQIDNO4的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。[38]段落1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含于質(zhì)粒PTterlOA或質(zhì)SpTterlOB中，所述質(zhì)粒pTterlOA包含于大腸桿菌NRRLB-50079中，所述質(zhì)粒pTterlOB包含于大腸桿菌NRRLB-50080中。[39]段落1-38任一所述的多肽，其中所述成熟多肽為SEQIDNO2的氨基酸20到369或SEQIDNO4的氨基酸19到414。[40]段落1-39任一所述的多肽，其中所述成熟多肽編碼序列為SEQIDNO1的核苷酸58到1107或SEQIDNO3的核苷酸55到1242。[41]分離的多核苷酸，其包含編碼段落1-40任一所述的多肽的核苷酸序列。[42]段落41的分離多核苷酸，其在SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列中包含至少一個(gè)突變，其中所述突變核苷酸序列分別編碼SEQIDNO:2或SEQIDNO4的成熟多肽。[43]核酸構(gòu)建體，其包含段落41或42的多核苷酸，所述多核苷酸可操作連接于一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列，其在表達(dá)宿主中指導(dǎo)該多肽的產(chǎn)生。[44]重組表達(dá)載體，其包含段落43的核酸構(gòu)建體。[45]重組宿主細(xì)胞，其包含段落43的核酸構(gòu)建體。[46]產(chǎn)生段落1-40任一所述多肽的方法，包括(a)在有益于該多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，其以其野生型形式產(chǎn)生該多肽；和(b)回收所得多肽。[47]產(chǎn)生段落1-40任一所述多肽的方法，包括(a)在有益于該多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體包含編碼該多肽的核苷酸序列；和(b)回收所得多肽。[48]產(chǎn)生親本細(xì)胞突變體的方法，包括破壞或缺失編碼段落1-40任一所述多肽的核苷酸序列，其導(dǎo)致所述突變體與所述親本細(xì)胞相比產(chǎn)生較少的該多肽。[49]突變體細(xì)胞，由段落48的方法產(chǎn)生。[50]段落49的突變體細(xì)胞，進(jìn)一步包含編碼天然或異源蛋白質(zhì)的基因。[51]產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)段落50的突變體細(xì)胞；和(b)回收該蛋白質(zhì)。[52]段落41或42所述的分離的多核苷酸，其通過如下獲得(a)在至少中-高嚴(yán)緊度的條件下將DNA群體與下述雜交(i)SEQIDNO:3的成熟多肽編碼序列；(ii)包含SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[53]段落52的分離多核苷酸，其通過如下獲得(a)在至少高嚴(yán)緊度的條件下將DNA群體與下述雜交(i)SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列；(ii)包含SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。[54]段落52或53所述的分離的多核苷酸，其中所述成熟多肽編碼序列為SEQIDNO3的核苷酸55到1242。[55]段落41或42所述的分離多核苷酸，其通過如下獲得(a)在至少高嚴(yán)緊度的條件下將DNA群體與下述雜交(i)SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列；(ii)包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有木聚糖酶活性的多肽。[56]段落55的分離的多核苷酸，其中所述成熟多肽編碼序列為SEQIDNO1的核苷酸58到1107。[57]產(chǎn)生包含突變體核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述突變體核苷酸序列編碼具有木聚糖酶活性的多肽，該方法包括(a)將至少一個(gè)突變導(dǎo)入SEQIDNO:1或SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列中，其中所述突變體核苷酸序列分別編碼包含SEQIDNO2或SEQIDNO:4的成熟多肽或由所述成熟多肽組成的多肽；和(b)回收包含所述突變體核苷酸序列的多核苷酸。[58]通過段落57的方法產(chǎn)生的突變體多核苷酸。[59]產(chǎn)生多肽的方法，包括(a)在有益于所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)包含編碼所述多肽的段落58的突變體多核苷酸的細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。[60]產(chǎn)生段落1-40任一所述多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，其包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。[61]轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其用編碼段落1-40任一所述的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化。[62]一種雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含段落41或42的多核苷酸的亞序列，其中所述dsRNA任選地為siRNA或miRNA分子。[63]段落62的雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其在長(zhǎng)度上為約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多雙鏈體核苷酸。[64]在細(xì)胞中抑制具有木聚糖酶活性的多肽表達(dá)的方法，其包括對(duì)所述細(xì)胞施用或在細(xì)胞中表達(dá)雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含段落41或42的多核苷酸的亞序列。[65]段落64的方法，其中所述dsRNA在長(zhǎng)度上為約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多雙鏈體核苷酸。[66]核酸構(gòu)建體，其包含可操作連接于編碼信號(hào)肽的核苷酸序列的編碼蛋白質(zhì)的基因，所述信號(hào)肽包含SEQIDNO2的氨基酸1到19或SEQIDNO4的氨基酸1到18，或由SEQIDNO2的氨基酸1到19或SEQIDNO4的氨基酸1到18組成，其中所述基因?qū)λ龊塑账嵝蛄袨橥庠吹?。[67]重組表達(dá)載體，其包含段落66的核酸構(gòu)建體。[68]重組宿主細(xì)胞，其包含段落66的核酸構(gòu)建體。[69]產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)段落68所述的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所得蛋白質(zhì)。[70]降解含有木聚糖的材料的方法，其包括用段落1-40任一所述的具有木聚糖酶活性的多肽處理所述含有木聚糖的材料。[71]段落70的方法，進(jìn)一步包含用木聚糖降解酶處理所述含有木聚糖的材料。[72]段落71的方法，其中所述木聚糖降解酶選自下組乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶及其組合。[73]段落70-72任一所述的方法，其中所述含有木聚糖的材料為動(dòng)物飼料。[74]段落70-72任一所述的方法，其中所述含有木聚糖的材料為Kraft漿。[75]段落70任一所述的方法，其中所述含有木聚糖的材料為纖維素生物質(zhì)或木質(zhì)纖維素生物質(zhì)。在本文中描述和要求保護(hù)的發(fā)明在范圍上并不受限于本文公開的特定方面的范圍，因?yàn)檫@些方面意欲作為本發(fā)明數(shù)個(gè)方面的說明。任何等同的方面意欲在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，從前述的描述中，除本文所顯示和描述的那些之外，本發(fā)明的多種修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。這樣的修改亦意欲落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在沖突的情況下，以包括定義的本公開為準(zhǔn)。權(quán)利要求一種分離的多肽，其具有木聚糖酶活性，選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO4的成熟多肽具有至少60％同一性或與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少80％同一性的氨基酸序列；(b)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中高嚴(yán)緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或在至少高嚴(yán)緊條件下與以下雜交(iv)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(v)包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(vi)(iv)或(v)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。(c)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO3的成熟多肽編碼序列具有至少60％同一性或與SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；和(d)SEQIDNO2或SEQIDNO4的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的變體。2.權(quán)利要求1的多肽，其包含SEQIDNO2或SEQIDNO4的氨基酸序列或其具有木聚糖酶活性的片段，或由SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列或其具有木聚糖酶活性的片段組成。3.權(quán)利要求1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDNO:1或SEQIDNO3的核苷酸序列或其編碼具有木聚糖酶活性的片段的亞序列，或由SEQIDNO1或SEQIDNO3的核苷酸序列或其編碼具有木聚糖酶活性的片段的亞序列組成。4.權(quán)利要求1的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含于質(zhì)粒PTterlOA或質(zhì)粒pTterlOB中，所述質(zhì)粒pTterlOA包含于大腸桿菌NRRLB-50079中，所述質(zhì)粒pTterlOB包含于大腸桿菌NRRLB-50080中。5.分離的多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的多肽的核苷酸序列。6.核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求5的多核苷酸，所述多核苷酸可操作連接于一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列，該調(diào)控序列在表達(dá)宿主中指導(dǎo)該多肽的產(chǎn)生。7.重組宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求6的核酸構(gòu)建體。8.產(chǎn)生權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述多肽的方法，包括(a)在有益于該多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，其以其野生型形式產(chǎn)生該多肽；和(b)回收所述多肽。9.產(chǎn)生權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述多肽的方法，包括(a)在有益于該多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)包含核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體包含編碼該多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。10.產(chǎn)生親本細(xì)胞突變體的方法，包括破壞或缺失編碼權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述多肽的核苷酸序列，其導(dǎo)致所述突變體與所述親本細(xì)胞相比產(chǎn)生較少的該多肽。11.通過權(quán)利要求10的方法產(chǎn)生的突變體細(xì)胞。12.產(chǎn)生權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)包含編碼所述多肽的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。13.轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其用編碼權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化。14.雙鏈抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含權(quán)利要求5的多核苷酸的亞序列，其中所述dsRNA任選地為siRNA或miRNA分子。15.在細(xì)胞中抑制具有木聚糖酶活性的多肽表達(dá)的方法，其包括對(duì)所述細(xì)胞施用所述雙鏈RNA(dsRNA)分子或在所述細(xì)胞中表達(dá)所述雙鏈RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含權(quán)利要求5的多核苷酸的亞序列。16.核酸構(gòu)建體，其包含編碼蛋白質(zhì)的基因，所述基因可操作連接于編碼信號(hào)肽的核苷酸序列，所述信號(hào)肽包含SEQIDNO2的氨基酸1到19或SEQIDNO4的氨基酸1到18，或由SEQIDNO2的氨基酸1到19或SEQIDNO4的氨基酸1到18組成，其中所述基因?qū)λ龊塑账嵝蛄袨橥庠吹摹?7.重組宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求16的核酸構(gòu)建體。18.產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求17所述的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所得蛋白質(zhì)。19.降解含有木聚糖的材料的方法，其包括用權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的具有木聚糖酶活性的多肽處理所述含有木聚糖的材料。20.權(quán)利要求19的方法，進(jìn)一步包括用木聚糖降解酶處理所述含有木聚糖的材料。全文摘要本發(fā)明涉及具有木聚糖酶活性的分離的多肽和編碼該多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。文檔編號(hào)C12N1/15GK101932704SQ200880126053公開日2010年12月29日申請(qǐng)日期2008年12月3日優(yōu)先權(quán)日2007年12月5日發(fā)明者邁克爾·雷伊,阿爾弗雷多·洛佩茲德利昂申請(qǐng)人:諾維信公司