本發(fā)明涉及生物檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及用于人類ROS1融合基因的核酸、試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
：肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。從組織病理學(xué)上可以分為小細(xì)胞肺癌(Smallcelllungcancer，SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(Non-smallcelllungcancer，NSCLC)兩大類，其中NSCLC包括鱗癌、腺癌、腺鱗癌、大細(xì)胞癌、類癌等，NSCLC約占肺癌總病例的85％。在發(fā)達(dá)國家肺癌患者的5年生存率可以達(dá)到20％左右，而我國肺癌患者的5年生存率僅為13％，而約70％的NSCLC在確診時(shí)己處于晚期。其主要原因是大多數(shù)肺癌由于缺乏高靈敏的基因突變檢測和確診技術(shù)，以及與之相配的科學(xué)治療方案，從而使患者錯(cuò)失了治療的最佳時(shí)機(jī)。據(jù)我國衛(wèi)生部的統(tǒng)計(jì)，肺癌相關(guān)死亡率居惡性腫瘤總死亡率的首位。手術(shù)、放療和化療一直是NSCLC的主要治療方法。手術(shù)治療是NSCLC最佳治療方法，但當(dāng)NSCLC被發(fā)現(xiàn)時(shí)，僅20～30％的病例有手術(shù)指征，且術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率仍高達(dá)50％以上。其主要治療方法化療的療效也并不讓人滿意。隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，肺癌的分子靶向治療因其特異性高，毒副作用低，日益成為臨床醫(yī)生首選治療方式。近年來，隨著對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制及其生物學(xué)行為研究的不斷深入，肺癌的分子靶向治療領(lǐng)域成為研究熱點(diǎn)。活性氧基團(tuán)基因1(ReactiveOxygenSpecies1，ROS1)是胰島素受體家族的一種跨膜酪氨酸激酶，與禽流感肉瘤病毒UR2的v-ros序列具有同源性，因此被命名為ROS基因。ROS1基因編碼一種受體酪氨酸激酶，當(dāng)與CD74、EZR、SLC34A2等基因發(fā)生融合后，會(huì)持續(xù)激活ROS1酪氨酸激酶區(qū)及下游PI3K/AKT、JAK/STAT、RAS/MAPK等信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。ROS1融合基因是NSCLC中最新發(fā)現(xiàn)的分子靶標(biāo)，其融合基因具有生物學(xué)活性。就目前的研究而言，20～30％的NSCLC患者存在ROSl的高表達(dá)，作為最新發(fā)現(xiàn)的肺癌驅(qū)動(dòng)基因，對(duì)臨床實(shí)踐具有非常重要的指導(dǎo)意義。臨床實(shí)踐證明，小分子酪氨酸激酶抑制劑克唑替尼(Crizotinib)對(duì)于ROS1融合陽性的NSCLC患者有顯著療效，檢測ROS1融合基因可篩選出對(duì)ROS1融合基因突變靶向藥物受益的患者。臨床上檢測ROS1融合基因突變的檢測方法主要為直接測序法和熒光原位雜交(FISH)法。然而，直接測序的靈敏度低，檢測靈敏度只有20-30％，易出現(xiàn)假陰性；檢測操作復(fù)雜，效率低，通常要1-2天才可出檢測結(jié)果；而FISH法檢測特異性差，靈敏度低，檢測時(shí)間長。此外，F(xiàn)ISH檢測需要昂貴的專用儀器設(shè)備，試劑成本較高，操作復(fù)雜，使臨床檢測廣泛使用受到了限制。FISH檢測要求檢測樣本保存時(shí)間不宜過長，采用保存時(shí)間長的樣本進(jìn)行檢測會(huì)導(dǎo)致假陰性的發(fā)生，影響了檢測的準(zhǔn)確性。因而，直接測序法和熒光原位雜交(FISH)法無法滿足臨床檢測實(shí)際的需求，臨床迫切需要開發(fā)一種快速融合基因突變檢測的方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)融合基因突變進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地檢測。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為克服以上現(xiàn)有檢測人類ROS1融合基因方法的不足，本發(fā)明的目的是提供用于檢測人類ROS1融合基因的核酸組。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于檢測人類ROS1融合基因的試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：用于檢測人類ROS1融合基因的核酸組，該核酸組包括以下S01～S12的12種ROS1融合基因變體類型的檢測引物對(duì)的一組或多組：S01：CD74:ROS1(C6:R32)的檢測引物對(duì)：核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNO.2所示；S02：SDC4:ROS1(S2:R32)的檢測引物對(duì)：核苷酸序列如SEQIDNo.4和SEQIDNO.2所示；S03：SDC4:ROS1(S4:R32)的檢測引物對(duì)：核苷酸序列如SEQIDNo.5和SEQIDNO.2所示；S04：SLC34A2:ROS1(S4:R32)的檢測引物對(duì)：核苷酸序列如SEQIDNo.6和SEQIDNO.2所示；S05：SDC4:ROS1(S4:R34)的檢測引物對(duì)：核苷酸序列如SEQIDNo.7和SEQIDNO.8所示；S06：CD74:ROS1(C6:R34)的檢測引物對(duì)：核苷酸序列如SEQIDNo.10和SEQIDNO.8所示；S07：EZR:ROS1(E10:R34)的檢測引物對(duì)：核苷酸序列如SEQIDNo.11和SEQIDNO.8所示；S08：SLC34A2:ROS1(S4:R34)的檢測引物對(duì)：核苷酸序列如SEQIDNo.12和SEQIDNO.8所示；S09：TPM3:ROS1(T8:R35)的檢測引物對(duì)：核苷酸序列如SEQIDNo.13和SEQIDNO.14所示；S10：LRIG3:ROS1(L16:R35)的檢測引物對(duì)：核苷酸序列如SEQIDNo.16和SEQIDNO.14所示；S11：GOPC:ROS1(G8:R35)的檢測引物對(duì)：核苷酸序列如SEQIDNo.17和SEQIDNO.14所示；S12：GOPC:ROS1(G4:R36)的檢測引物對(duì)：核苷酸序列如SEQIDNo.18和SEQIDNO.19所示。如上所述核酸組，還包括用于熒光RT-PCR檢測時(shí)，各基因相應(yīng)的如下檢測探針：S01：CD74:ROS1(C6:R32)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；S02：SDC4:ROS1(S2:R32)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；S03：SDC4:ROS1(S4:R32)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；S04：SLC34A2:ROS1(S4:R32)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；S05：SDC4:ROS1(S4:R34)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；S06：CD74:ROS1(C6:R34)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；S07：EZR:ROS1(E10:R34)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；S08：SLC34A2:ROS1(S4:R34)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；S09：TPM3:ROS1(T8:R35)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.15所示；S10：LRIG3:ROS1(L16:R35)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.15所示；S11：GOPC:ROS1(G8:R35)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.15所示；S12：GOPC:ROS1(G4:R36)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.20所示，上述檢測探針的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。如上所述核酸組，還包括用于每組基因檢測的內(nèi)部質(zhì)控，所述內(nèi)部質(zhì)控包括質(zhì)控引物對(duì)和質(zhì)控探針，所述質(zhì)控引物對(duì)的核苷酸序列如SEQIDNo.21和SEQIDNo.22所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQIDNo.23所示，所述質(zhì)控探針的5’端標(biāo)記有不同于所述檢測探針的熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。如上所述核酸組，還包括S01～S12的12種ROS1融合基因變體類型中的一組或多組如下的陽性對(duì)照品：S01：CD74:ROS1(C6:R32)的陽性對(duì)照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.24所示；S02：SDC4:ROS1(S2:R32)的陽性對(duì)照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.25所示；S03：SDC4:ROS1(S4:R32)的陽性對(duì)照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.26所示；S04：SLC34A2:ROS1(S4:R32)的陽性對(duì)照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.27所示；S05：SDC4:ROS1(S4:R34)的陽性對(duì)照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.28所示；S06：CD74:ROS1(C6:R34)的陽性對(duì)照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.29所示；S07：EZR:ROS1(E10:R34)的陽性對(duì)照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.30所示；S08：SLC34A2:ROS1(S4:R34)的陽性對(duì)照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.31所示；S09：TPM3:ROS1(T8:R35)的陽性對(duì)照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.32所示；S10：LRIG3:ROS1(L16:R35)的陽性對(duì)照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.33所示；S11：GOPC:ROS1(G8:R35)的陽性對(duì)照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.34所示；S12：GOPC:ROS1(G4:R36)的陽性對(duì)照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.35所示。一種用于檢測人類ROS1融合基因的試劑盒，該試劑盒包括如上所述的核酸組。如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，該試劑盒用于熒光RT-PCR檢測，其中，所述熒光基團(tuán)為FAM、JOE、CY3、HEX、VIC中任意一種，所述淬滅基團(tuán)為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，該試劑盒用于熒光RT-PCR檢測，試劑盒內(nèi)包括：不同基因類型的檢測試劑：每一個(gè)ROS1融合基因變體的檢測引物和檢測探針在一個(gè)反應(yīng)體系中，該基因類型的反應(yīng)體系中還含有質(zhì)控引物對(duì)和質(zhì)控探針，以及PCR緩沖液，構(gòu)成一管該基因類型的檢測試劑；一管含反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶的酶試劑；有陽性對(duì)照品的，還有一管陽性對(duì)照品混合液，陽性對(duì)照混合液內(nèi)含與該試劑盒內(nèi)所有檢測引物基因類型相應(yīng)的該種ROS1融合基因類型的陽性對(duì)照品。其中，PCR緩沖液含buffer、dNTPs、Mg2+等，可以直接購買市售商品，也可以自行配制，為現(xiàn)有技術(shù)已知內(nèi)容。如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，試劑盒中包括全部12種ROS1融合基因類型的檢測引物對(duì)和檢測探針，每種基因類型的檢測引物和探針，連同質(zhì)控引物對(duì)和質(zhì)控探針以及PCR緩沖液獨(dú)立包裝在一管內(nèi)。本發(fā)明還提供了以上任一所述的用于檢測人類ROS1融合基因的試劑盒，用于熒光RT-PCR檢測，其中所述各基因的檢測探針的5’端標(biāo)記FAM，所述質(zhì)控探針的5’端標(biāo)記JOE，，使用方法是將待檢樣品提取RNA，加入到各種ROS1融合基因類型的檢測反應(yīng)體系中，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，收集反應(yīng)信號(hào)，JOE信號(hào)應(yīng)達(dá)到設(shè)定閾值Ct值小于26，檢測結(jié)果有效，否則實(shí)驗(yàn)失敗，應(yīng)重新檢測；檢測JOE信號(hào)滿足Ct值小于26后，進(jìn)行下列判斷：每種檢測體系中FAM信號(hào)Ct值＞30或無Ct值，表明該樣本陰性不存在ROS1融合基因；其中某種檢測體系中FAM信號(hào)Ct值≤30，表明該待檢樣品中含有該種類型的ROS1融合基因。優(yōu)選地，上述使用方法中，熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃反應(yīng)5min，1個(gè)循環(huán)；95℃反應(yīng)5min，1個(gè)循環(huán)；95℃反應(yīng)30s，58℃反應(yīng)45s，共10個(gè)循環(huán)；95℃反應(yīng)15s，58℃反應(yīng)45s，共35個(gè)循環(huán)，在58℃時(shí)收集信號(hào)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：(1)檢測融合類型多：可以檢測出多種ROS1融合基因，見表1。(2)明確融合類型：一種融合類型對(duì)應(yīng)一個(gè)反應(yīng)孔，使樣本檢測出來的融合類型很明確，見表4。(3)適用于多種樣本類型：本技術(shù)對(duì)標(biāo)本RNA獲取質(zhì)量要求低，無論是新鮮組織還是石蠟組織，血清，血漿都能獲得理想的檢測效果。(4)操作簡單，檢測時(shí)間短：目前市場產(chǎn)品和技術(shù)都是兩步PCR，第一步反轉(zhuǎn)錄把RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，第二步開管把cDNA加入到PCR反應(yīng)條。但本試劑盒只需要一次加樣直接加入提取好的樣本RNA即可，反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增在封閉的同一管反應(yīng)體系中進(jìn)行，這樣不但降低了污染幾率，而且降低了結(jié)果出現(xiàn)偏差的幾率。一次檢測只需90分鐘完成。(5)特異性好：用本試劑盒檢測A549細(xì)胞系提取RNA，檢測ALK融合基因，檢測RET融合基因，檢測結(jié)果均為陰性。(6)靈敏度高：經(jīng)分析靈敏度，驗(yàn)證1～10copyDNA基因組均可檢出。(7)結(jié)果判讀明確直觀：直接看擴(kuò)增曲線和Ct值就可判斷結(jié)果?？傊景l(fā)明涉及的人類ROS1融合基因檢測試劑盒適用于臨床多種樣本類型選擇，具有檢測種類多，靈敏度高，實(shí)驗(yàn)操作簡單，周期短，安全無毒，成本低等顯著優(yōu)點(diǎn)。附圖說明圖1為本發(fā)明試劑盒檢測含ROS1融合基因的非小細(xì)胞肺腺癌FFPE樣本RNA擴(kuò)增曲線圖。圖2為本發(fā)明試劑盒檢測S1體系靈敏度的擴(kuò)增曲線圖。圖3為本發(fā)明試劑盒檢測S2體系靈敏度的擴(kuò)增曲線圖。圖4為本發(fā)明試劑盒檢測S3體系靈敏度的擴(kuò)增曲線圖。圖5為本發(fā)明試劑盒檢測S4體系靈敏度的擴(kuò)增曲線圖。圖6為本發(fā)明試劑盒檢測S5體系靈敏度的擴(kuò)增曲線圖。圖7為本發(fā)明試劑盒檢測S6體系靈敏度的擴(kuò)增曲線圖。圖8為本發(fā)明試劑盒檢測S7體系靈敏度的擴(kuò)增曲線圖。圖9為本發(fā)明試劑盒檢測S8體系靈敏度的擴(kuò)增曲線圖。圖10為本發(fā)明試劑盒檢測S9體系靈敏度的擴(kuò)增曲線圖。圖11為本發(fā)明試劑盒檢測S10體系靈敏度的擴(kuò)增曲線圖。圖12為本發(fā)明試劑盒檢測S11體系靈敏度的擴(kuò)增曲線圖。圖13為本發(fā)明試劑盒檢測S12體系靈敏度的擴(kuò)增曲線圖。圖14為本發(fā)明試劑盒檢測不含ROS1融合基因的A549細(xì)胞系RNA模板擴(kuò)增曲線圖。圖15為本發(fā)明試劑盒檢測含有ALK融合基因定的擴(kuò)增曲線圖。圖16為本發(fā)明試劑盒檢測含有RET融合基因模板的擴(kuò)增曲線圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，并非對(duì)本發(fā)明的限定，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，本發(fā)明提供的核苷酸序列的互補(bǔ)序列也可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，如無特殊說明，所用試劑為常規(guī)試劑，因此凡依照本公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1引物、探針、驗(yàn)證模板設(shè)計(jì)本發(fā)明是針對(duì)人類ROS1融合基因12組不同融合基因類型來設(shè)計(jì)檢測引物，本發(fā)明設(shè)計(jì)的檢測引物用于普通PCR可擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的融合基因類型的特異性產(chǎn)物，并設(shè)計(jì)檢測探針用于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的檢測，具體融合基因的類型見表1.表1本發(fā)明可檢測融合基因的類型通過對(duì)檢測引物對(duì)、檢測探針的篩選和體系的優(yōu)化，最終確定的各基因的檢測引物對(duì)和檢測探針及可以作為陽性對(duì)照品的各基因?qū)?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列如下，其中檢測引物對(duì)及探針的核苷酸序列見表2，ROS1融合基因外顯子拼接序列，即陽性對(duì)照品的序列見表3。S01：ROS1融合基因變體：CD74:ROS1(C6:R32)的檢測引物對(duì)：上游引物(SEQIDNO.1)，下游引物(SEQIDNO.2)、檢測探針(SEQIDNO.3)；其陽性對(duì)照品(含SEQIDNO.24)；S02：ROS1融合基因變體：SDC4:ROS1(S2:R32)的檢測引物對(duì)：上游引物(SEQIDNO.4)，下游引物(SEQIDNO.2)；檢測探針(SEQIDNO.3)、其陽性對(duì)照品(SEQIDNO.25)；S03：ROS1融合基因變體：SDC4:ROS1(S4:R32)的檢測引物對(duì)：上游引物(SEQIDNO.5)，下游引物(SEQIDNO.2)；檢測探針：(SEQIDNO.3),其陽性對(duì)照品(SEQIDNO.26)；S04：ROS1融合基因變體：SLC34A2:ROS1(S4:R32)的檢測引物對(duì)：上游引物(SEQIDNO.6)，下游引物(SEQIDNO.2)；檢測探針(SEQIDNO.3)，其陽性對(duì)照品(SEQIDNO.27)；S05：ROS1融合基因變體：SDC4:ROS1(S4:R34)的檢測引物對(duì)：上游引物(SEQIDNO.7)，下游引物(SEQIDNO.8)，檢測探針(SEQIDNO.9)，其陽性對(duì)照品(SEQIDNO.28)；S06：ROS1融合基因變體：CD74:ROS1(C6:R34)的檢測引物對(duì)：上游引物(SEQIDNO.10)，下游引物(SEQIDNO.8)，檢測探針(SEQIDNO.9)，其陽性對(duì)照品(SEQIDNO.29)；S07：ROS1融合基因變體：EZR:ROS1(E10:R34)的檢測引物對(duì)：上游引物(SEQIDNO.11)，下游引物(SEQIDNO.8)，檢測探針(SEQIDNO.9)，其陽性對(duì)照品(SEQIDNO.30)；S08：ROS1融合基因變體：SLC34A2:ROS1(S4:R34)的檢測引物對(duì)：上游引物(SEQIDNO.12)，下游引物(SEQIDNO.8)，檢測探針(SEQIDNO.9)，其陽性對(duì)照品(SEQIDNO.31)；S09：ROS1融合基因變體：TPM3:ROS1(T8:R35)的檢測引物對(duì)：上游引物(SEQIDNO.13)，下游引物(SEQIDNO.14)，檢測探針(SEQIDNO.15)，其陽性對(duì)照品(SEQIDNO.32)；S10：ROS1融合基因變體：LRIG3:ROS1(L16:R35)的檢測引物對(duì)：上游引物(SEQIDNO.16)，下游引物(SEQIDNO.14)，檢測探針(SEQIDNO.15)，其陽性對(duì)照品(SEQIDNO.33)；S11：ROS1融合基因變體：GOPC:ROS1(G8:R35)的檢測引物對(duì)：上游引物(SEQIDNO.17)，下游引物(SEQIDNO.14)，檢測探針(SEQIDNO.15)，其陽性對(duì)照品(SEQIDNO.34)；S12：ROS1融合基因變體：GOPC:ROS1(G4:R36)的檢測引物對(duì)：上游引物(SEQIDNO.18)，下游引物(SEQIDNO.19)，檢測探針(SEQIDNO.20)，其陽性對(duì)照品(SEQIDNO.35)。表2相關(guān)引物探針序列編號(hào)序列(5＇-3＇)SEQIDNO.1TGTTTGAAATGAGCAGGCACTSEQIDNO.2CATTATCTTCAGCTTTCTCCCACTGSEQIDNO.3TTTGGGAATGCCTGGTTSEQIDNO.4GGCAGGAATCTGATGACTTSEQIDNO.5AGAGAATCTCACCCGTTGAAGAGSEQIDNO.6GGATATTCTTAGTAGCGCCTTCCSEQIDNO.7GTTTGAAATGAGCAGGCACTSEQIDNO.8CAAAGGTCAGTGGGATTGTAACASEQIDNO.9CCAGAAATATTCCAACTATSEQIDNO.10GACAGGCGGTGGATCAGATAASEQIDNO.11ACTGTGCAGGGCAGCAACASEQIDNO.12GGATATTCTTAGTAGCGCCTTCCSEQIDNO.13TAGTTATTTGTCATCTCAGGGAACGSEQIDNO.14GTATTGCATAGCAGGCATTAGCCSEQIDNO.15CCTACTCCGGCTGCCASEQIDNO.16TTGAGGCTCAGGCGGAGAASEQIDNO.17CTTGATGAGTTAGAAGGAGGTGGTASEQIDNO.18GAATGAAGCCCTTCGTAGACATASEQIDNO.19CTTCATACACTTCTCCAAAGGCTCSEQIDNO.20CCGAGGGAAGGCAGGSEQIDNO.21ACCGAGCGCGGCTACAGSEQIDNO.22CTTAATGTCACGCACGATTTCCSEQIDNO.23ACCACCACGGCCGAG表3ROS1融合基因外顯子拼接進(jìn)一步，為了對(duì)上述各組基因檢測時(shí)，對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和實(shí)驗(yàn)操作過程進(jìn)行質(zhì)控，同時(shí)檢測樣本的質(zhì)量，避免漏檢，本發(fā)明選用根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的人類ACTB基因設(shè)計(jì)的內(nèi)部控制引物和內(nèi)控探針，并對(duì)內(nèi)控的上下游引物進(jìn)行篩選，使非模版體系(NTC)不起線，樣本起線正常，并且要求設(shè)計(jì)的質(zhì)控引物、質(zhì)控探針、及質(zhì)控?cái)U(kuò)增產(chǎn)物均不會(huì)與上述基因的檢測引物對(duì)、檢測探針及擴(kuò)增產(chǎn)物有交叉反應(yīng)。通過內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對(duì)、質(zhì)控探針的篩選和體系優(yōu)化，建立了實(shí)時(shí)熒光PCR內(nèi)部質(zhì)控檢測體系，其中，質(zhì)控引物對(duì)(SEQIDNO.21～22)、質(zhì)控探針(SEQIDNO.23)最后確定的核苷酸序列如表1中所示。作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，其擴(kuò)增序列的大小為60bp，將擴(kuò)增序列作為內(nèi)部質(zhì)控陽性對(duì)照物，即包含如SEQIDNo.36所示序列，作為驗(yàn)證是否漏檢的質(zhì)控陽性對(duì)照。實(shí)施例2：用于檢測人類ROS1融合基因的試劑盒用于檢測人類ROS1融合基因的試劑盒包括有實(shí)施例1中的檢測12種不同的ROS1融合基因變體類型的檢測引物對(duì)，可用于普通PCR擴(kuò)增，來檢測相對(duì)應(yīng)的ROS1融合基因變體。優(yōu)選地，在上述試劑盒的基礎(chǔ)上，用于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測時(shí)，添加有各基因檢測探針，檢測探針的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，可用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR來檢測相應(yīng)的ROS1融合基因變體。檢測效率高，耗時(shí)短，不用跑電泳就可以獲得檢測結(jié)果。其中，熒光基團(tuán)為FAM、JOE、CY3、HEX、VIC中任意一種，所述淬滅基團(tuán)為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。為了便于PCR反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)體系的配置，試劑盒還配有其他的反應(yīng)試劑如PCR緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、DEPC水等。在實(shí)際操作中，反應(yīng)體系需要一一配置，本發(fā)明中提供一種配置好反應(yīng)體系的試劑盒，該試劑盒用于人類ROS1融合基因的檢測試劑盒，含12個(gè)PCR反應(yīng)體系(兩條6聯(lián)條PCR管)，用來檢測待檢樣本ROS1融合基因變體的情況。試劑盒內(nèi)還有一管酶試劑(含有RT酶、TaqDNA酶)，試劑盒內(nèi)PCR反應(yīng)體系組成及檢測ROS1融合類型見表4。表4ROS1融合基因熒光PCR檢測試劑盒組成其中，RT酶為逆轉(zhuǎn)錄酶，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；TaqDNA酶為DNA聚合酶；buffer為反應(yīng)緩沖液；檢測探針為TaqMan-MGB探針，5’端可標(biāo)記FAM、JOE、CY3、HEX、VIC中任意一種，3’端可標(biāo)記MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。對(duì)樣品進(jìn)行檢測時(shí)，為避免漏檢，如避免有的反應(yīng)體系中未加檢測樣本的情況出現(xiàn)，在每個(gè)檢測體系中均設(shè)置有內(nèi)部質(zhì)控，即將質(zhì)控引物對(duì)和質(zhì)控探針都加入上述各檢測體系中，其質(zhì)控引物對(duì)和質(zhì)控探針具體序列如實(shí)施例1中所述。應(yīng)當(dāng)注意的是檢測探針與質(zhì)控探針熒光基團(tuán)標(biāo)記為不同檢測模式的熒光基團(tuán)。實(shí)施例3實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法擴(kuò)增臨床樣本RNA1.臨床樣本RNA的提取本實(shí)施例是從同濟(jì)醫(yī)院獲得的4例非小細(xì)胞肺腺癌患者的石蠟包埋組織切片中提取RNA，并對(duì)其進(jìn)行定量，作為檢測模板。采用Qiagen公司的Cat.NO.73504QIAamp石蠟包埋組織提取試劑盒，具體詳見該說明書，最后將將提取的RNA用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量，并稀釋RNA濃度到1ng/μL。2.運(yùn)用實(shí)施例2中表4所述的試劑盒進(jìn)行檢測，其中，檢測探針的5’端標(biāo)記為熒光基團(tuán)為FAM，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)為MGB質(zhì)控探針的5’端標(biāo)記為JOE，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)BHQ1，檢測步驟如下：(1)首先取6支離心管(PCR級(jí)，需自備)在管蓋分別標(biāo)記樣本1、樣本2、樣本3、樣本4、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照；其次對(duì)相應(yīng)6支離心管分別加入65μL(2ng/μL)待檢測樣本、陽性對(duì)照(STD)及非模板對(duì)照NTC(超純水)至管底；最后再向6支離心管各自加入酶試劑(含RT酶和TaqDNA聚合酶)6.5μL；蓋緊離心管蓋后輕微震蕩，離心，置于冰上，待用。(2)取PCR反應(yīng)條，確定好管號(hào)后輕輕打開PCR反應(yīng)條管蓋，，將步驟(1)混勻的待用液分別加到相對(duì)應(yīng)的PCR孔中，5.5μL/孔。蓋緊PCR反應(yīng)條管蓋，混勻離心，確保試劑全在PCR反應(yīng)管的管底。(3)把離心好的PCR反應(yīng)條放于熒光定量PCR儀中，其中，PCR反應(yīng)體系為：(4)設(shè)定反應(yīng)程序如下：第一階段：45℃反應(yīng)5min；第二階段：95℃5min；第三階段：95℃30s，58℃45s，10個(gè)循環(huán)；第四階段：95℃反應(yīng)15s，58℃反應(yīng)45s，35個(gè)循環(huán)；第四階段：35個(gè)循環(huán)時(shí)，58℃45s收集FAM和JOE信號(hào)。本發(fā)明通過各反應(yīng)體系檢測的FAM和JOE的熒光強(qiáng)度來判斷檢測結(jié)果；JOE是內(nèi)控信號(hào)，用于檢測是否漏加樣本及判定樣本質(zhì)量，JOE信號(hào)應(yīng)達(dá)到設(shè)定閾值(CT值＜26)；FAM是檢測信號(hào)，用于檢測是否存在ROS1融合基因位點(diǎn)；在內(nèi)控信號(hào)達(dá)到要求后，以FAM信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值所需的循環(huán)次數(shù)Ct值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，若12孔PCR管的FAM信號(hào)通道的Ct值＞30或無Ct證明樣本陰性不存在融合類型，若12孔PCR管的FAM信號(hào)通道的任何一孔有擴(kuò)增曲線且Ct值＜30則證明樣本陽性存在融合類型，哪一孔有擴(kuò)增曲線就判定次樣本為對(duì)應(yīng)哪種ROS1融合類型。具體判定見表5。表5：試劑盒結(jié)果判定參考值經(jīng)過陽性對(duì)照品驗(yàn)證后，樣本陰陽性的檢測結(jié)果完全準(zhǔn)確，其中，樣本3含ROS1融合基因的非小細(xì)胞肺腺癌FFPE樣本RNA擴(kuò)增曲線圖，見圖1。實(shí)施例4本發(fā)明試劑盒靈敏度和特異性檢測1.靈敏度檢測將實(shí)施例2的試劑盒中的陽性對(duì)照品進(jìn)行稀釋，加入上述12種各基因檢測的反應(yīng)體系中，使在每個(gè)反應(yīng)體系中，分別含有濃度為1000拷貝/反應(yīng)、100拷貝/反應(yīng)、10拷貝/反應(yīng)、1拷貝/反應(yīng)的陽性對(duì)照品，進(jìn)行實(shí)施例3中的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增，各個(gè)反應(yīng)體系的靈敏度擴(kuò)增圖見圖2～圖13，由擴(kuò)增圖可看出，本發(fā)明的試劑盒可以準(zhǔn)確檢出低至1～10copyDNA基因的基因組DNA。2.特異性檢測運(yùn)用實(shí)施例2制備的試劑盒對(duì)由同濟(jì)醫(yī)院提供的不含ROS1融合基因的A549細(xì)胞系RNA、含有ALK融合基因和RET融合基因的樣本為模板，進(jìn)行實(shí)施例3中的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢測，擴(kuò)增曲線：其中不含ROS1融合基因的A549細(xì)胞系RNA的檢測結(jié)果如圖14，顯示只有JOE有曲線，F(xiàn)AM信號(hào)通道無曲線；含有ALK融合基因?yàn)槟０宓臋z測結(jié)果見圖15，顯示只有JOE有曲線，F(xiàn)AM信號(hào)通道無曲線；其中含有RET融合基因?yàn)槟０宓臋z測結(jié)果見圖16，顯示只有JOE有曲線，F(xiàn)AM信號(hào)通道無曲線。說明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物對(duì)與檢測探針具有較強(qiáng)的特異性。特異性強(qiáng)，與其它非目的基因沒有非特異性擴(kuò)增。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明做其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>武漢海吉力生物科技有限公司<120>用于檢測人類ROS1融合基因的核酸、試劑盒及方法<130><160>36<170>PatentInversion3.5<210>1<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>1tgtttgaaatgagcaggcact21<210>2<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>2cattatcttcagctttctcccactg25<210>3<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>3tttgggaatgcctggtt17<210>4<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>4ggcaggaatctgatgactt19<210>5<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>5agagaatctcacccgttgaagag23<210>6<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>6ggatattcttagtagcgccttcc23<210>7<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>7gtttgaaatgagcaggcact20<210>8<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>8caaaggtcagtgggattgtaaca23<210>9<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>9ccagaaatattccaactat19<210>10<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>10gacaggcggtggatcagataa21<210>11<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>11actgtgcagggcagcaaca19<210>12<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>12ggatattcttagtagcgccttcc23<210>13<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>13tagttatttgtcatctcagggaacg25<210>14<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>14gtattgcatagcaggcattagcc23<210>15<211>16<212>DNA<213>人工合成<400>15cctactccggctgcca16<210>16<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>16ttgaggctcaggcggagaa19<210>17<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>17cttgatgagttagaaggaggtggta25<210>18<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>18gaatgaagcccttcgtagacata23<210>19<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>19cttcatacacttctccaaaggctc24<210>20<211>15<212>DNA<213>人工合成<400>20ccgagggaaggcagg15<210>21<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>21accgagcgcggctacag17<210>22<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>22cttaatgtcacgcacgatttcc22<210>23<211>15<212>DNA<213>人工合成<400>23accaccacggccgag15<210>24<211>141<212>DNA<213>人工合成<400>24tgtttgaaatgagcaggcactccttggagcaaaagcccactgacgctccaccgaaagctg60gagtcccaaataaaccaggcattcccaaattactagaagggagtaaaaattcaatacagt120gggagaaagctgaagataatg141<210>25<211>129<212>DNA<213>人工合成<400>25ggcaggaatctgatgactttgagctgtctggctctggagatctggctggagtcccaaata60aaccaggcattcccaaattactagaagggagtaaaaattcaatacagtgggagaaagctg120aagataatg129<210>26<211>189<212>DNA<213>人工合成<400>26agagaatctcacccgttgaagagagtgaggatgtgtccaacaaggtgtcaatgtccagca60ctgtgcagggcagcaacatctttgagagaacggaggtcctggcagctggagtcccaaata120aaccaggcattcccaaattactagaagggagtaaaaattcaatacagtgggagaaagctg180aagataatg189<210>27<211>119<212>DNA<213>人工合成<400>27ggatattcttagtagcgccttccagctggttggagctggagtcccaaataaaccaggcat60tcccaaattactagaagggagtaaaaattcaatacagtgggagaaagctgaagataatg119<210>28<211>130<212>DNA<213>人工合成<400>28actgtgcagggcagcaacatctttgagagaacggaggtcctggcagatgatttttggata60ccagaaacaagtttcatacttactattatagttggaatatttctggttgttacaatccca120ctgacctttg130<210>29<211>141<212>DNA<213>人工合成<400>29tgtttgaaatgagcaggcactccttggagcaaaagcccactgacgctccaccgaaagatg60atttttggataccagaaacaagtttcatacttactattatagttggaatatttctggttg120ttacaatcccactgacctttg141<210>30<211>122<212>DNA<213>人工合成<400>30gacaggcggtggatcagataaagagccaggagcagctgatgatttttggataccagaaac60aagtttcatacttactattatagttggaatatttctggttgttacaatcccactgacctt120tg122<210>31<211>119<212>DNA<213>人工合成<400>31ggatattcttagtagcgccttccagctggttggagatgatttttggataccagaaacaag60tttcatacttactattatagttggaatatttctggttgttacaatcccactgacctttg119<210>32<211>155<212>DNA<213>人工合成<400>32ttgaggctcaggcggagaagtctggcatagaagattaaagaatcaaaaaagtgccaagga60aggggtgacagtgcttataaacgaagacaaagagttggctgagctgcgaggtctggcagc120cggagtaggcctggctaatgcctgctatgcaatac155<210>33<211>266<212>DNA<213>人工合成<400>33tagttatttgtcatctcagggaacgttagctgacaggcaggatgggtacgtgtcttcaga60aagtggaagccaccaccagtttgtcacatcttcaggtgctggatttttcttaccacaaca120tgacagtagtgtctggcatagaagattaaagaatcaaaaaagtgccaaggaaggggtgac180agtgcttataaacgaagacaaagagttggctgagctgcgaggtctggcagccggagtagg240cctggctaatgcctgctatgcaatac266<210>34<211>211<212>DNA<213>人工合成<400>34cttgatgagttagaaggaggtggtaaccctggtgctagttgcaaagacacaagtggggaa60atcaaagtattacaagtctggcatagaagattaaagaatcaaaaaagtgccaaggaaggg120gtgacagtgcttataaacgaagacaaagagttggctgagctgcgaggtctggcagccgga180gtaggcctggctaatgcctgctatgcaatac211<210>35<211>203<212>DNA<213>人工合成<400>35gaatgaagcccttcgtagacatatagctgttctccaggctgaagtatatggggcgagact60agctgccaagtacttggataaggaactggcaggaagtactcttccaacccaagaggagat120tgaaaatcttcctgccttccctcgggaaaaactgactctgcgtctcttgctgggaagtgg180agcctttggagaagtgtatgaag203<210>36<211>60<212>DNA<213>人工合成<400>36accgagcgcggctacagcttcaccaccacggccgagcgggaaatcgtgcgtgacattaag60當(dāng)前第1頁1 2 3