專(zhuān)利名稱(chēng)：濃集核酸分子的方法
濃集核酸分子的方法本發(fā)明涉及在表面上濃集試樣的待檢測(cè)核酸分子的方法。核酸診斷學(xué)越來(lái)越多地利用“生物芯片”?！吧镄酒庇脕?lái)例如檢測(cè)不同類(lèi)型和 種類(lèi)的核酸，這些核酸可以是DNA、RNA、cDNA或其他核酸?；谏镄酒姆治龇椒ㄍǔＶ?在檢測(cè)試樣中的特殊核酸。因此，例如可以檢查患者的DNA中是否存在表示疾病遺傳缺陷 的特定序列。同樣可以通過(guò)證實(shí)在患者血樣里存在病原體(如病毒和細(xì)菌(如HIV、HPV, HCV))的DNA或RNA來(lái)檢測(cè)病原體。這些分析方法的優(yōu)勢(shì)是比傳統(tǒng)免疫測(cè)定法的準(zhǔn)確度更 高，因?yàn)橹苯訖z測(cè)了病原體，而不是經(jīng)由制備的與其對(duì)應(yīng)的抗體來(lái)檢測(cè)的。所用生物芯片的最簡(jiǎn)單的形式是基于玻璃基底，在玻璃基底上固定了可以特異性 結(jié)合至待檢測(cè)核酸的捕捉分子(例如寡聚核苷酸)。這些通常由合成方式制備的短核酸片 段就其序列而言至少是與待檢測(cè)核酸的序列部分互補(bǔ)的，這導(dǎo)致高特異性結(jié)合。為了防止 獲得假陽(yáng)性結(jié)果，無(wú)論如何都必須避免除了待檢測(cè)核酸以外的其他核酸發(fā)生結(jié)合。在很多 方法中，通過(guò)熒光方法實(shí)際檢測(cè)核酸，在該熒光方法中，熒光染料連接待檢測(cè)的核酸，例如 通過(guò)生物素-鏈霉抗生素蛋白結(jié)合而連接。在核酸與捕捉分子特異性雜交后，漂洗生物芯 片以除去未結(jié)合的物質(zhì)。結(jié)果，溶液不再包含任何熒光染料。通過(guò)激發(fā)染料，可以通過(guò)使用 CCD照相機(jī)觀測(cè)到熒光，從而可以進(jìn)行檢測(cè)。生物芯片的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是多路檢測(cè)能力。因此，可以在生物芯片的不同位點(diǎn)上固定 靶向不同待檢測(cè)核酸的不同種類(lèi)的捕捉分子。然后，可以通過(guò)空間分辨(space-resolved) 的熒光測(cè)量進(jìn)行檢測(cè)。從而可以在單個(gè)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)多種核酸檢測(cè)。因?yàn)橐延械暮怂峥截悢?shù)通常對(duì)于直接檢測(cè)來(lái)說(shuō)是不足的，所以在檢測(cè)前復(fù)制(擴(kuò) 增)核酸。擴(kuò)增可以例如通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行。PCR是基于在熱穩(wěn)定的DNA聚合 酶的幫助下復(fù)制核酸。這包括使一對(duì)寡聚核苷酸引物(單鏈寡聚核苷酸)接觸待擴(kuò)增的核 酸。選擇引物使得引物結(jié)合在互補(bǔ)鏈上待擴(kuò)增片段的兩端。然后，在延伸期間，引物在沿著 特定靶核酸鏈的3'方向延伸(正向引物和反向引物)。正向引物和反向引物或者也稱(chēng)作 上游引物或下游引物(sense or antisense primers)。以這樣的方式可以對(duì)位于靶核酸 各位點(diǎn)之間的片斷進(jìn)行擴(kuò)增，其中靶核酸與引物是互補(bǔ)的。為了后續(xù)的檢測(cè)反應(yīng)，有利地從 PCR混合物的引物、核酸和其他干擾成分中移出PCR產(chǎn)物。PCR方法包括大量的熱循環(huán)，每個(gè)所述的熱循環(huán)包括三個(gè)步驟首先加熱試樣(例 如至94°C)，從而對(duì)存在于試樣中的雙鏈靶向DNA的各鏈進(jìn)行分離(變性)。接著降低溫 度(例如至45°C 60°C)，從而引物可以連接目前單鏈DNA的互補(bǔ)區(qū)域(退火)。在最后 的步驟中，結(jié)合在單鏈上的引物按照DNA模板鏈的信息使用在溶液中用作結(jié)構(gòu)單元的相應(yīng) 的三磷酸核苷通過(guò)DNA聚合酶在3'方向上進(jìn)行延長(zhǎng)(extend)(延伸(elongation)，例如 在72°C時(shí))。在PCR期間，該循環(huán)典型地進(jìn)行大約15-50次。上述溫度僅作為實(shí)例給出，應(yīng) 該根據(jù)在每個(gè)情況中具體實(shí)施的PCR對(duì)溫度進(jìn)行調(diào)整。因此，可以實(shí)現(xiàn)在非常短的時(shí)間內(nèi)由現(xiàn)有的少量DNA(或通常為核酸)樣品制備大 量的DNA拷貝，其濃度對(duì)于后續(xù)的定性檢測(cè)試樣中的所述DNA或核酸是充足的。例如，20個(gè) PCR循環(huán)(典型地需要20 40分鐘)理論上生成初始應(yīng)用的核酸數(shù)量的22°倍，即IO6倍。
5同時(shí)，PCR可以使用能被檢測(cè)的標(biāo)記物，其結(jié)合入所得PCR產(chǎn)物。因此，通過(guò)使用例如生物 素標(biāo)記的PCR引物或三磷酸核苷，從而可以得到合成的生物素化的PCR產(chǎn)物。在PCR產(chǎn)物 連接了固定的捕捉分子后，結(jié)果是，生物素同樣也固定在相應(yīng)位點(diǎn)的生物芯片上。在進(jìn)一步 的步驟中，鏈霉抗生素蛋白結(jié)合的熒光染料接著可以與所述的生物素結(jié)合，這使得能夠檢 測(cè)核酸或它的PCR產(chǎn)物。其他的檢測(cè)系統(tǒng)，例如基于電化學(xué)檢測(cè)的檢測(cè)系統(tǒng)，可以用作除了 熒光染料的備選方案?；谏镄酒臋z測(cè)方法的重點(diǎn)是雜交，即，待檢測(cè)核酸(該術(shù)語(yǔ)在本文中與從 核酸制備的PCR產(chǎn)物同義)的結(jié)合。核酸檢測(cè)的靈敏度取決于雜交效率。一般通過(guò)生物芯 片對(duì)核酸進(jìn)行溫育以發(fā)生雜交。雜交可以通過(guò)選擇合適的溫度和緩沖媒介得以改善。同 樣重要的是，將核酸移動(dòng)至生物芯片的表面，該表面被能夠發(fā)生雜交的捕捉分子所占據(jù)。 因此如果核酸的移動(dòng)僅是由熱擴(kuò)散引起就不是最理想的。所以，例如當(dāng)25聚體(25mer) 寡聚核苷酸的速率常數(shù)僅為約8Xl(T8cm2/s時(shí)(“Observation of hybridization and dehybridization of Thiol-tethered DNA using two-color surface ρlasmon resonance spectroscopy" Peterlinz et al. (1997)，J.Am. Chem. Soc. 119 3401-3402)，結(jié)果是，在 16 個(gè)小時(shí)的雜交時(shí)間內(nèi)僅有0. 096cm的平均遷移。因此，假設(shè)表面的尺寸為4cm2，單獨(dú)的被動(dòng) 擴(kuò)散使得只有約1.5%的試樣核酸可與固定在生物芯片上的捕捉分子進(jìn)行雜交。很多有效 的方法可以增加雜交效率。ia Jlfc, C. F. Erdmann ^ ^t "Electric field directed nucleic acid hybridization on microchips", Nucleic Acids Research (1997) 25，4907-4914 中公開(kāi)了 施加電場(chǎng)以電泳方式將核酸移動(dòng)至生物芯片的方法。與僅通過(guò)熱移動(dòng)核酸相比，將核酸濃 集在生物芯片的表面附近使得雜交明顯快得多。另外，通過(guò)翻轉(zhuǎn)電勢(shì)可以從生物芯片的表 面除去未雜交的核酸。所述方法要求電極用保護(hù)層特別制備，從而阻止電極反應(yīng)中的自由 基和 PH 變化破壞濃集的核酸。M. J. Heller 等人在“An Active Microelectronics Device for Multiplex DNA Analysis，，，IEEE Engineering in Medicine and Biology(1996) March/April, 100-104中公開(kāi)了一個(gè)對(duì)比方法。生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)診斷學(xué)中的很多方法利用了磁性材料、聚合物載體材料(特別是 聚合物顆粒)來(lái)方便細(xì)胞、蛋白質(zhì)和核酸的移動(dòng)。與傳統(tǒng)的分離方法相比，使用磁性載體 材料的優(yōu)勢(shì)在于裝載的載體材料可以在磁場(chǎng)力的幫助下容易且快速地從試樣的其他成分 中除去?；诰垡蚁┐嫉拇胖樾位蚯驙罹酆衔镱w粒已被證實(shí)對(duì)于所述分離方法是特別合適 的，上述顆粒的粒徑分布狹窄，在小于IOym的范圍內(nèi)(W0 97104862)。已知的還有，特殊的生物材料、特別是核酸和蛋白質(zhì)只有通過(guò)更多的努力才可以 從它們的自然環(huán)境中分離出來(lái)。這尤其是由于以下事實(shí)必須利用機(jī)械的、化學(xué)的和生物的 溶胞方法從細(xì)胞核或細(xì)胞膜或細(xì)胞器中分離出核酸和蛋白質(zhì)。此外，相應(yīng)的生物試樣通常 進(jìn)一步包括會(huì)削弱分離作用的固體和/或溶解組分例如其他的蛋白質(zhì)和細(xì)胞骨架的成分。 另外的一個(gè)難點(diǎn)是，很多時(shí)候在待研究的生物試樣中只存濃度很小的核酸或蛋白質(zhì)。但是，為了能夠利用使用磁性顆粒的優(yōu)勢(shì)從生物試樣中分離出核酸，已經(jīng)特別建 議在具有基本無(wú)孔的玻璃表面的磁性顆粒的幫助下分離核酸(W096141811)。為了實(shí)現(xiàn)所需 的功效，所述顆粒必須有特定的組成(composition)，也就是說(shuō)，它們的玻璃表面必須有特 定的組成。此外制備這些顆粒需要相對(duì)復(fù)雜的工藝以實(shí)現(xiàn)必要的玻璃表面的燒結(jié)。
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已知的診斷方法，例如核酸和蛋白質(zhì)診斷，通常需要大量人工操作以得到分析結(jié) 果。這尤其要求將待檢測(cè)成分與試樣的其余部分中分離。已知的分離方法的實(shí)例是過(guò)濾、 離心、色譜和提取。所有這些方法都為化學(xué)和物理分離方法，通常不適用于從試樣序列特異 性分離DNA或蛋白質(zhì)。例如，使用表面官能化的、從而能夠結(jié)合DNA或蛋白質(zhì)的樹(shù)脂。靶分 子通過(guò)以下方式純化與樹(shù)脂的固相結(jié)合，接著進(jìn)行大量的洗滌步驟，然后在合適的緩沖條 件下將靶分子從固相中分離出來(lái)。靶分子必須被緊密結(jié)合，而試樣的污染成分溶解在不同 的液相中。在各種洗滌程序之后，靶分子然后必須從固相中再次分離出來(lái)，例如通過(guò)改變液 相而分離。反復(fù)改變液相首先就材料而言是非常昂貴的，其次產(chǎn)品產(chǎn)量因?yàn)槊總€(gè)附加的方 法步驟而有所波動(dòng)，這使得定量校準(zhǔn)很難進(jìn)行。具體來(lái)說(shuō)，在整合的分析方法中，例如在芯 片上的實(shí)驗(yàn)室(lab-on-a-chip)系統(tǒng)中基本上自動(dòng)地制備和分析試樣，這樣一來(lái)，檢查單 個(gè)方法步驟經(jīng)常是不可能的，結(jié)果是在各個(gè)方法步驟中的偏差彼此放大并且會(huì)導(dǎo)致分析結(jié) 果的偏差很大。通過(guò)所述的載體顆粒，也稱(chēng)為磁珠(magnetic bead)，可以對(duì)單個(gè)步驟進(jìn)行簡(jiǎn)化或 甚至完全自動(dòng)化。所述磁珠設(shè)有親和性配體或其他表面改性措施，從而所述磁珠適于從溶 液中將特定的生物分子如DNA結(jié)合至其表面上。純化方法通常包括向試管中的待分離試樣 中加入磁珠的懸浮液。在數(shù)分鐘的使親和性配體與所需生物分子結(jié)合的溫育時(shí)間之后，施 加磁場(chǎng)，由此通過(guò)將顆粒積聚在試管壁上而移去顆粒。棄去上清液，然后至少洗滌顆粒一 次。為了這個(gè)目的，首先撤去磁場(chǎng)，將顆粒懸浮在新鮮的緩沖溶液中，該緩沖溶液主要包含 阻止生物分子從載體材料分離的離液序列高的鹽。然后通過(guò)再次施加磁場(chǎng)使磁珠沉積在容 器壁上。這樣就有可能在多個(gè)洗滌步驟后，通過(guò)低鹽緩沖溶液將分子洗出至(與粗提取物 相比而言的)無(wú)干擾成分的溶液中，其中低鹽緩沖溶液將結(jié)合的生物分子從磁珠除去。磁 珠再次沉積在容器壁上，使得生物分子留在上清液溶液中。該方法的缺點(diǎn)是在各情況下都 需要大量的液體，對(duì)于每個(gè)單個(gè)的方法步驟都需要數(shù)百微升范圍的液體。已知對(duì)于真核細(xì)胞或原核細(xì)胞或病毒通過(guò)例如與熒光標(biāo)記物或磁珠偶聯(lián)的特異 性抗體進(jìn)行分離。這種抗體通常是單克隆的，并且指向特異性結(jié)合位點(diǎn)，例如指向細(xì)胞或病 毒的相應(yīng)抗原的表面受體分子。通過(guò)將抗體偶聯(lián)至特異性結(jié)合位點(diǎn)對(duì)所需細(xì)胞或病毒進(jìn)行 標(biāo)記，并且例如通過(guò)FACS或永磁體進(jìn)行分選(sort)。分選方法首先可以以“正選擇”的方 式進(jìn)行，涉及進(jìn)一步處理標(biāo)記的細(xì)胞或者病毒。其次，可以進(jìn)行“負(fù)選擇”，涉及移去標(biāo)記的 細(xì)胞以及進(jìn)一步處理剩余的細(xì)胞。兩個(gè)方法都可以使得細(xì)胞或者病毒被量化，并且，作為結(jié) 果，可以對(duì)所述進(jìn)一步處理所需的試劑量進(jìn)行計(jì)算。DE 101 11 520 B4公開(kāi)了在磁性顆粒的幫助下純化生物分子的方法，所述的方法 尤其可以以基本自動(dòng)化的方式純化較少量的液體。該方法描述了具有磁性顆粒的懸浮液通 過(guò)被強(qiáng)磁場(chǎng)穿過(guò)的管道。通過(guò)設(shè)置合適的直徑、流動(dòng)速度和磁場(chǎng)強(qiáng)度，磁性顆粒在通過(guò)管道 時(shí)沉積到管壁上。通過(guò)清空管道棄去上清液，或者將上清液收集在容器中。然后可以用洗 液漂洗捕獲的顆粒。在洗滌程序中，磁性顆?？梢员Ａ粼诠艿乐谢蛘咴俅螒腋』虺练e。通 過(guò)用合適的緩沖液進(jìn)行漂洗將生物分子從懸浮液的磁性顆粒分離。這里的管道應(yīng)當(dāng)涉及成 還可以處理少于50 μ L的少量液體。所描述的方法特別適用于純化DNA或RNA。在這種方 法的結(jié)束時(shí)，溶液中得到的DNA或者RNA可以自動(dòng)引入相應(yīng)的分析系統(tǒng)中?？梢杂靡埔簷C(jī) 器人實(shí)現(xiàn)自動(dòng)操作。如果通過(guò)序列特異性雜交來(lái)檢測(cè)DNA，則建議額外使管道流經(jīng)加熱元件
7從而實(shí)現(xiàn)DNA雙鏈的變性。然而，為了使用這種方法分析DNA，還必須通過(guò)未描述的方法步 驟從試樣里提取所述DNA。磁珠不僅適用于純化試樣也可以用于其他的目的。因此，US2004/0219066 Al描 述了可以分選各種顆粒的裝置。所述顆粒與具有不同磁矩的不同磁珠結(jié)合。由于磁珠的磁 矩不同，在反應(yīng)容器中產(chǎn)生的磁場(chǎng)梯度將磁珠移動(dòng)至不同的收集盒中。因此不同的顆?？?以通過(guò)不同設(shè)計(jì)的磁珠進(jìn)行區(qū)分。WO 00/47983描述了一種電化學(xué)生物傳感器，其中磁珠經(jīng)由親和性配體連接至試 樣的各成分。酶與試樣的結(jié)合成分進(jìn)行偶聯(lián)，并且添加的酶底物被所述酶分解(cleave)。 所述的酶底物生成了可以進(jìn)行氧化還原循環(huán)過(guò)程的分子?？梢赃@種方式對(duì)試樣的特定成分 進(jìn)行檢測(cè)。另外，已知使用順磁性的磁珠用于檢測(cè)DNA。這里，與待檢測(cè)的DNA互補(bǔ)的捕捉分 子位于磁致伸縮傳感器上。如果研究的試樣包含待檢測(cè)的DNA，在所述的待檢測(cè)DNA和捕捉 分子之間則發(fā)生雜交。雜交的DNA已經(jīng)標(biāo)記有或標(biāo)記了生物素，其中鏈霉抗生素蛋白涂覆 的磁珠偶聯(lián)至該生物素。生物素標(biāo)記物通常通過(guò)上游PCR(upstream PCR)利用生物素標(biāo)記 的引物或者核苷酸引入至待檢測(cè)的DNA中。在與順磁珠偶聯(lián)后，通過(guò)應(yīng)用磁場(chǎng)磁化順磁珠， 并且通過(guò)磁阻傳感器測(cè)量它們的雜散場(chǎng)(stray field)。這間接引起對(duì)試樣中的DNA的定 量檢測(cè)。DE 41 27 657和WO 97104862中關(guān)于載體材料制備方法的公開(kāi)內(nèi)容引入本文作 為參考，它們公開(kāi)了制備磁性聚乙烯醇載體材料的方法，該載體材料優(yōu)選為珠狀顆粒設(shè)計(jì)。 根據(jù)所披露的方法，可以制備粒徑分布非常狹窄且粒徑為1 4 μ m的磁性顆粒，其特別用 于分離懸浮液中的生物物質(zhì)以及用于診斷醫(yī)學(xué)。聚乙烯醇顆粒是通過(guò)向油包水乳狀液的油相中添加特定乳化劑混合物而制備的。 作為添加劑加入油相中的合適乳化劑有環(huán)氧丙烷_(kāi)環(huán)氧乙烷嵌段共聚物、失水山梨糖醇脂 肪酸酯、季戊四醇脂肪酸酯和檸檬酸的混合復(fù)合酯、聚乙二醇_蓖麻油衍生物、蓖麻油衍生 物的嵌段共聚物、聚乙二醇、改性聚酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯-聚環(huán) 氧丙烷_(kāi)乙二胺嵌段共聚物、聚甘油基衍生物、聚氧乙烯醇衍生物、烷基苯基聚乙二醇衍生 物、多羥基脂肪酸-聚乙二醇嵌段共聚物、聚乙二醇醚衍生物。這類(lèi)物質(zhì)已知特別以商品 名 Pluronic 、Synperonic 、Tetronic 、Triton 、Arlacel 、Span 、Tween 、Bri jOR、 ReneX0R、Hyperme 、Lameform 、Dehymuls 或Eumulgin 銷(xiāo)售。為了得到均勻的珠形聚合物顆粒并優(yōu)選其粒徑為0. 5 ΙΟμπι，向油相中添加至 少由2種、優(yōu)選3-4種所述表面活性劑組成的混合物。優(yōu)選的是混合親脂性乳化劑成分和 至少一種具有半親水性特性的乳化劑，即，半親水性特性的乳化劑在水和油中都是可溶的。 符合后一種特性的乳化劑實(shí)例有環(huán)氧乙烷作為主要部分的環(huán)氧乙烷_(kāi)環(huán)氧丙烷嵌段共聚 物衍生物、聚乙二醇十六烷基醚、短鏈聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙二醇或短鏈?zhǔn)?水山梨糖醇脂肪酸酯。油相中乳化劑的濃度通常是2 6體積％，優(yōu)選3. 5 5. 0體積％。 就聚合物液滴的細(xì)度和狹窄粒徑分布而言，包含至少兩種親脂性成分和一種版親水性乳化 劑的乳化劑混合物是有利的。半親水性乳化劑的濃度通常為15-30體積％ (基于乳化劑總 量)。除了顆粒細(xì)度外，所述顆粒顯示珠樣形狀。除了用于油相的乳化劑之外，可溶于聚合物水相中的特殊的表面活性劑也是有利于改善乳化的質(zhì)量，尤其是低分子量的聚乙烯醇溶液(Mowiol，Clariant GmbH, Frankfurt am Main, DE)。此外，通過(guò)添加離子型乳化劑成功地將以固體形式添加的磁性膠體細(xì)微分 散。也可以用作二元混合物的乳化劑的例子如下血清白蛋白、凝膠、脂肪族的磺酸衍生物 和芳香族的磺酸衍生物、聚乙二醇、聚N-乙烯吡咯烷酮或乙酸丁酸纖維素。使用的乳化劑 的量通常為0.01 2重量％ (基于聚合物相)，離子乳化劑的濃度總是0.01 0.05重 量％。熟練技術(shù)人員對(duì)于攪拌速度、兩相的濃度和粘性對(duì)粒徑的影響是熟悉的。為了得到 優(yōu)選的0. 5 10 μ m的粒徑，需要每分鐘1500 2000轉(zhuǎn)的攪拌速度，使用傳統(tǒng)的雙螺旋槳 葉片攪拌機(jī)。原則上，可以使用這些具有合適的粒徑和通常具有50 400高斯的磁飽和的鐵磁 膠體或超順磁膠體作為磁性顆粒，在該方法中將該磁性顆粒包封入聚乙烯醇基質(zhì)中。磁性 顆粒要滿足的另一個(gè)要求是在包含聚乙烯醇的聚合物水相中的可分散性。在有機(jī)相中進(jìn)行 后續(xù)乳化時(shí)，同時(shí)在聚合物液滴中包含磁性膠體。合適的磁性膠體優(yōu)選是粒徑為10 200nm的磁石。這種物質(zhì)可以是市購(gòu)的，例 如，商品名為Bayferrox或Ferrofluidics。因?yàn)橹苽溥@種膠體通常是現(xiàn)有技術(shù)，也可以通 過(guò)已公開(kāi)的方法制備磁性顆粒，例如在Shinkai et al.，Biocatalysis，Vol. 5，1991，61，或 Kondo et al.，Appl. Microbiol. Biotechnol.，Vol. 41，1994，99 中所描述的方法。對(duì)于由于 制備過(guò)程已經(jīng)是含水膠體的膠體而言，膠體在聚合物相中的濃度通常為4 14體積％ (在 各情況中，基于該聚合物相)，并且對(duì)于固態(tài)物質(zhì)而言為0. 3 2體積％。制備包括將磁性 膠體與聚合物相直接混合。為了保證顆粒的細(xì)微分散和均勻分布，通過(guò)高轉(zhuǎn)數(shù)的分散工具 (Ultra-Turrax)以及后續(xù)的超聲處理對(duì)含水分散體進(jìn)行快速混合是有利的。用于制備磁性 顆粒所需的聚合物相通常包含2. 5 10重量％的聚乙烯醇溶液。對(duì)于熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，然后可以通過(guò)本身已知的方法如過(guò)濾和洗滌從懸浮液中 得到磁性聚乙烯醇載體材料。已知的官能化方法包括在載體材料表面上配置親和性配體。這通常需要在所述表 面上粘附化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)，親和性配體然后與附上的化學(xué)反應(yīng)組結(jié)合。這些基團(tuán)可以是例 如甲苯磺酰基、羥基、醛或羧基、氨基、硫醇或環(huán)氧基團(tuán)。通?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)未經(jīng)涂覆的單分散 的超順磁性顆粒進(jìn)行處理得以提供這些化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)，從而向顆粒提供帶有這些官能團(tuán) 的聚合物的表面層，所述聚合物為提供羥基的纖維衍生物或含聚乙二醇的聚氨酯、提供羧 基的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物或共聚物、或提供氨基的氨基烷基化聚合物。US4654267 公開(kāi)了大量表面涂層(coating)。DE 100 13 995 Al公開(kāi)基于聚乙烯醇的磁性載體材料，其表面的至少部分是硅烷 化的，并且在合適時(shí)該材料配備有與生物分子偶聯(lián)的親和性配體。所描述的載體材料可以 設(shè)計(jì)成過(guò)濾器、膜或顆粒。優(yōu)選賦予磁性載體材料以珠狀或球狀顆粒，所述顆粒的粒徑優(yōu)選 為0. 2 50 μ m，特別優(yōu)選0. 5 5 μ m。除了優(yōu)選的珠狀和球形的顆粒設(shè)計(jì)以外，它們的粒 徑分布應(yīng)該在盡可能小的范圍內(nèi)。優(yōu)選通過(guò)使聚乙烯醇載體材料和有機(jī)硅烷化合物進(jìn)行反 應(yīng)來(lái)制備顆粒形式的載體材料。然后使硅烷化的顆粒與親和性配體進(jìn)行反應(yīng)。原則上可以進(jìn)行偶聯(lián)的親和性配體是在親和色譜法中使用的任何配體。這些配體 的實(shí)例有蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G、蛋白質(zhì)L、鏈霉抗生素蛋白、生物素、肝磷脂、抗體、血清白蛋 白、凝膠、賴(lài)氨酸、伴刀豆球蛋白A、低聚糖、寡聚核苷酸、多聚核苷酸、結(jié)合蛋白質(zhì)的金屬離子、外源凝集素、適體或酶。使用這些親和基質(zhì)實(shí)施的特殊的分段分離(fractionation)是 一般現(xiàn)有技術(shù)。所述磁珠的優(yōu)勢(shì)也可用于在生物芯片上濃集核酸，如US 2002/0166764A1所記載 的。其中所描述的設(shè)備包括安置在腔體內(nèi)的生物芯片。調(diào)節(jié)通過(guò)腔體的液體流。在腔體外 面，存在可以使腔體內(nèi)的磁珠移動(dòng)到生物芯片表面的磁場(chǎng)發(fā)生器。核酸在進(jìn)入腔體前與磁 珠特異性連接。所述連接通過(guò)磁珠上的寡聚核苷酸提供。磁珠并因此核酸也在容器內(nèi)通過(guò) 磁場(chǎng)發(fā)生器移動(dòng)至生物芯片的表面并且保持在那里。在磁珠上的核酸的存在通過(guò)氧化還原 循環(huán)過(guò)程檢測(cè)。所述方法不能多路進(jìn)行，因?yàn)榇胖椴荒苋缭谖㈥嚵兄幸粯佣ㄎ恢羻蝹€(gè)位點(diǎn)。 磁珠非特定性地保持在生物芯片表面的附近。WO 98/4584公開(kāi)了一種檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法(免疫測(cè)定)，該方法也利用了磁珠。能 偶聯(lián)至靶結(jié)合分子的捕捉分子固定在磁珠上。靶結(jié)合分子轉(zhuǎn)而與待檢測(cè)蛋白質(zhì)連接。在蛋 白質(zhì)、靶結(jié)合分子、捕捉分子和磁珠的復(fù)合物形成以后，可以通過(guò)磁力將復(fù)合物與試樣的其 余部分分離。在“溫和”條件下(未詳細(xì)說(shuō)明)，捕捉分子和靶結(jié)合分子之間的鍵可以溶解， 且靶結(jié)合分子不失去其結(jié)合能力。之后移動(dòng)除去上面仍具有捕捉分子的磁珠。蛋白質(zhì)通過(guò) 固定在表面上的抗體而結(jié)合，并且因此類(lèi)似地得到固定。檢測(cè)分子如熒光染料結(jié)合至靶結(jié) 合分子用于檢測(cè)。從而可以檢測(cè)試樣中的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的目的是提供在生物芯片上濃集核酸的改進(jìn)方法。所述目的通過(guò)具有權(quán)利要求1、8和21的方法步驟的方法實(shí)現(xiàn)。權(quán)利要求1建議一種在表面上濃集試樣的待檢測(cè)核酸分子的方法，其中特異性結(jié) 合捕捉探針的捕捉分子固定在所述表面上。該方法包括以下步驟-提供載體材料，所述載體材料具有捕捉探針，并且能夠特異性連接至核酸分子以 生成包括所述載體材料和所述核酸分子的復(fù)合物，-溫育載體材料和試樣，并且形成復(fù)合物，-將復(fù)合物移動(dòng)至表面上，和-至少一部分的所述復(fù)合物通過(guò)捕捉探針與捕捉分子結(jié)合。這種方法具有如下的優(yōu)勢(shì)，使用捕捉探針并使其與生物芯片表面上固定的捕捉分 子連接，使得磁珠有效地連接至捕捉分子。結(jié)果是，待檢測(cè)的核酸在表面附近固定，并且可 以通過(guò)已知方法檢測(cè)。另外，該生物芯片不是特定用于核酸的，因此可以普遍被使用。特 異性?xún)H由載體材料的設(shè)計(jì)而引起，該載體材料首先包括獨(dú)立于試樣的捕捉探針用于選擇性 (一般意義上的選擇性(可尋址性))連接至表面，其次能夠特異性結(jié)合至待檢測(cè)核酸。因 此，可以在試樣制備中將待檢測(cè)核酸與適當(dāng)設(shè)計(jì)的載體材料混合，并通過(guò)生物芯片對(duì)其進(jìn) 行溫育。生物芯片本身總是可以相同方式大規(guī)模生產(chǎn)，且無(wú)需修飾就可用于各種核酸的任 何檢測(cè)。核酸一般形成載體材料的活性部分(其結(jié)合至固定在芯片表面的捕捉分子)，靶分 子-特異性部分可以包括核酸、蛋白質(zhì)或適體。可以以簡(jiǎn)單的方式平行進(jìn)行所述方法，這就是說(shuō)，所述方法是可以多路進(jìn)行的。這 要求多種類(lèi)型的具有各種捕捉探針的載體材料，捕捉探針在各情況下可連接至不同的待檢 測(cè)的核酸從而得到不同的復(fù)合物。所述不同的核酸因此可以通過(guò)捕捉分子被捕獲在生物芯 片的不同位點(diǎn)處，其中捕捉分子固定在生物芯片上的不同位點(diǎn)處并且指向所述的不同捕捉 探針。已知的檢測(cè)過(guò)程使得能以空間分辨的方式檢測(cè)核酸。
在本發(fā)明的有利實(shí)施方式中，未結(jié)合的復(fù)合物從表面移去，然后再移回到表面。接 著，將至少另一部分的復(fù)合物結(jié)合至捕捉分子。這里強(qiáng)調(diào)的問(wèn)題是具有固定核酸的載體材 料由于通過(guò)磁場(chǎng)移動(dòng)而均勻地分布在生物芯片的表面上。因此，特別是在多路方法中，在生 物芯片上未找到任何捕捉分子形式的固定配偶體的測(cè)量位置(點(diǎn))處的核酸可以重新分 布。與生物芯片的整個(gè)表面相比，測(cè)量點(diǎn)的尺寸通常是小的。通過(guò)多次重復(fù)方法步驟，雜交 效率可以得到提高，因?yàn)樯形措s交的復(fù)合物再被移動(dòng)到表面并且在此部分結(jié)合。在該方法的一個(gè)有利形式中，載體材料具有這樣的載體材料表面在該表面上固 定了捕捉探針和結(jié)合核酸分子的轉(zhuǎn)移分子。這種載體材料可以通過(guò)之前描述的方法容易地 制造。所選核酸僅對(duì)每種載體材料的高度特異性結(jié)合提供了高度的誤差可信度。在該方法的一個(gè)有利形式中，捕捉分子、捕捉探針和轉(zhuǎn)移分子是核酸。以這種途 徑，可以簡(jiǎn)單的方式生成該方法所要求的高度特異性結(jié)合事件。權(quán)利要求8提供了本發(fā)明問(wèn)題的另一解決方案。權(quán)利要求8要求保護(hù)在表面上濃 集試樣的待檢測(cè)核酸分子的方法，其中特異性結(jié)合核酸分子的捕捉分子固定在該表面上， 該方法包括以下步驟-提供載體材料，所述載體材料能夠特異性連接至待檢測(cè)的核酸分子以生成包括 所述載體材料和所述核酸分子的復(fù)合物，-溫育載體材料和試樣，并且形成復(fù)合物，-將復(fù)合物移動(dòng)至表面，-從載體材料分離核酸分子，和-至少一部分的核酸分子與捕捉分子結(jié)合。該方法的特別優(yōu)點(diǎn)為所述部分的核酸分子高效率地結(jié)合至表面，這是因?yàn)閷?fù) 合物移動(dòng)至表面上引起了它們的濃集。此外，與權(quán)利要求1中所述的方法相比，可以省卻額 外的捕捉探針。然而，上述相對(duì)于已知方法的優(yōu)點(diǎn)是一致的。在這個(gè)實(shí)施方式中，檢測(cè)方法 的特異性由于捕捉分子固定在表面上而在于生物芯片本身。在該方法的一個(gè)有利實(shí)施方式中，待檢測(cè)的核酸分子從載體材料分離，并且載體 材料從表面上除去。這可以防止載體材料對(duì)后續(xù)方法步驟如核酸檢測(cè)的可能影響。這里， 核酸本身保持固定至生物芯片表面上的捕捉分子。在該方法的一個(gè)有利實(shí)施方式中，載體材料是磁珠的形式，該磁珠的表面具有轉(zhuǎn) 移分子用于結(jié)合核酸。芯片結(jié)合的捕捉分子和轉(zhuǎn)移分子還可以是核酸的形式。在有利的實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括以下步驟-在各情況中，捕捉分子包括與待檢測(cè)核酸分子的核酸序列部分互補(bǔ)的核酸序列，-在各情況中，轉(zhuǎn)移分子包括與待檢測(cè)核酸分子的核酸序列部分互補(bǔ)的核酸序列，-與待檢測(cè)核酸分子互補(bǔ)的捕捉分子和轉(zhuǎn)移分子的核酸序列是按照以下方式選擇 的核酸分子_轉(zhuǎn)移分子雜化物的解鏈溫度低于核酸分子_捕捉分子雜化物的解鏈溫度。捕捉分子和轉(zhuǎn)移分子的這個(gè)實(shí)施方式提供了簡(jiǎn)單地分離復(fù)合物的可能性。部分互 補(bǔ)的核酸序列通常是連續(xù)的。通過(guò)互補(bǔ)核酸序列的長(zhǎng)度這種簡(jiǎn)單的方式實(shí)現(xiàn)雜化物的不同 解鏈溫度。這確保了當(dāng)轉(zhuǎn)移分子和核酸間的連接頭(linkage)溶解時(shí)，核酸分子和捕捉分 子間的連接頭保持完整，并且核酸分子仍然是固定的。因此，載體材料可以這種簡(jiǎn)單的方式 除去。一般來(lái)說(shuō)，可以利用改變嚴(yán)緊條件進(jìn)行分離。因此例如可以通過(guò)改變鹽濃度或甲酰胺含量改變嚴(yán)緊條件。因此，該方法的一個(gè)有利實(shí)施方式包括在低于核酸分子_轉(zhuǎn)移分子雜化物的解鏈 (變性)溫度的嚴(yán)緊條件下進(jìn)行溫育。該復(fù)合物在低于核酸分子-轉(zhuǎn)移分子雜化物的解鏈 溫度的嚴(yán)緊條件下移動(dòng)至表面上。該方法的一個(gè)有利實(shí)施方式包括在低于核酸分子_轉(zhuǎn)移分子雜化物的解鏈溫度 的第一溫度時(shí)進(jìn)行溫育。在低于核酸分子-轉(zhuǎn)移分子雜化物的解鏈溫度的第二溫度時(shí)將復(fù) 合物移動(dòng)至表面上。在復(fù)合物結(jié)合至捕捉分子后，將溫度提高溫度至第三溫度，該第三溫度 介于核酸分子_轉(zhuǎn)移分子雜化物的解鏈溫度和核酸分子_捕捉分子雜化物的解鏈溫度之 間。這確保在核酸和捕捉分子之間的連接頭保持完整，而在核酸分子和轉(zhuǎn)移分子之間的連 接頭被剪切。所描述的方法和有利的方案可以容易地平行進(jìn)行。只需要用各種捕捉分子裝配 生物芯片的不同位點(diǎn)，這些捕捉分子與待檢測(cè)核酸是部分互補(bǔ)的。還需要提供具有不同轉(zhuǎn) 移分子的各種載體材料，然后轉(zhuǎn)移分子將轉(zhuǎn)移所述各種核酸運(yùn)輸至表面。取決于待檢測(cè)的 核酸，還可以使用相同種類(lèi)的磁珠，所有這些磁珠都能結(jié)合任一待檢測(cè)的核酸。這是有可能 的，是因?yàn)楣潭ㄖ辽镄酒谋砻嬗捎谖挥诖颂幍牟蹲椒肿佣哂懈叨忍禺愋浴?quán)利要求21提供了本發(fā)明目的的另一解決方案。所述權(quán)利要求要求保護(hù)在表面 上濃集試樣的不同待檢測(cè)核酸分子的方法，其中特異性結(jié)合所述核酸分子的捕捉分子分組 固定在表面上的不同位點(diǎn)處，該方法包括以下步驟-提供載體材料，該載體材料能夠特異性連接至待檢測(cè)的核酸分子以生成包括所 述載體材料和所述核酸分子的復(fù)合物，-溫育載體材料和試樣，并且形成復(fù)合物，-將復(fù)合物移動(dòng)至表面，-從載體材料分離核酸分子，和-至少一部分的核酸分子與捕捉分子結(jié)合。這個(gè)多路方法可以特別容易地得以實(shí)現(xiàn)，這是因?yàn)橹灰笠环N類(lèi)型的具有結(jié)合不 同核酸性能的載體材料。另外可以實(shí)施同樣的如上所述的此方法的有利方案。本方法的其他優(yōu)點(diǎn)和改進(jìn)從下文描述的實(shí)施例中得出，并且基于附圖進(jìn)行解釋。


圖1 10描述雜交過(guò)程的各種方法步驟，和圖11 13描述可供選擇的雜交過(guò)程的不同方法步驟。以下描述的示例性實(shí)施方式涉及濃集DNA分子的方法。原則上可以以同一方式應(yīng) 用于任何核酸。對(duì)于可以通過(guò)所描述方法得到特異性結(jié)合配偶體的其他生物分子，同樣也 可以濃集。通過(guò)列舉數(shù)個(gè)或僅一個(gè)核酸樣品的實(shí)施例對(duì)所述的方法進(jìn)行描述。通常使用大 量的樣品以便于隨后可以對(duì)核酸進(jìn)行檢測(cè)。圖1示意描述了磁珠1，磁珠1具有三種不同的寡聚核苷酸3a，3b，3c作為轉(zhuǎn)移分 子。同樣描述了兩種不同的待檢測(cè)DNA分子5a和5b。寡聚核苷酸3a和3b具有對(duì)于DNA 分子5a和5b部分互補(bǔ)的序列。在各情況中DNA分子5a和5b具有生物素分子7。圖1的情況表示本方法的溫育階段的開(kāi)始。在溫育階段之前，DNA分子5a和5b已經(jīng)被從例如患者的血樣中分離、純化和合適 時(shí)通過(guò)已知方法擴(kuò)增。然而也可以通過(guò)下文的方法本身進(jìn)行分離和純化。事先可能只要求 必要的溶胞過(guò)程以使DNA分子5a和5b從相應(yīng)的細(xì)胞或病毒中釋放。在圖2中，磁珠1與DNA分子5a和5b的溫育已經(jīng)完成。DNA分子5a和5b分別結(jié) 合至寡聚核苷酸3a和3b，并且因此固定在磁珠1上。DNA分子5a與寡聚核苷酸3a的結(jié)合 通過(guò)兩根連接線象征性地表示。所述連接線表示DNA分子5a與寡聚核苷酸3a的互補(bǔ)核酸 序列的重疊。DNA分子5b與寡聚核苷酸3b的結(jié)合以類(lèi)似的方式表示。圖3示意描述了生物芯片101的表面。生物芯片101包括三個(gè)傳感區(qū)域103a，103b 和103c，傳感區(qū)域的裝配是用于檢測(cè)各種DNA分子。設(shè)置了磁場(chǎng)發(fā)生器105 (這里僅示意性 表示)。其可以設(shè)計(jì)成，例如可移動(dòng)的永磁體或線圈。生物芯片101位于溶液填充的反應(yīng)腔 (未顯示)中。所述溶液包括經(jīng)溫育的磁珠1，其濃度C1 = Ii1ZiV1，其中Ii1是磁珠1的數(shù)目， V1是溶液的體積。圖4描述了在通過(guò)磁場(chǎng)發(fā)生器105施加磁場(chǎng)后的生物芯片101。磁珠1通過(guò)磁場(chǎng) 已經(jīng)移動(dòng)至生物芯片101的表面，并且在那里以C2 = H1A2的濃度存在，其中V2是目前磁珠 1濃集在生物芯片101上方的體積。因?yàn)閂2 << V1，所以濃度C2高于C1。因此磁珠1已經(jīng) 濃集在生物芯片101的表面附近。圖5描述了在傳感區(qū)域103a的表面201上的情形的部分。在傳感區(qū)域103a上固 定捕捉分子寡聚核苷酸203。以寡聚核苷酸3a為例，它們指向DNA分子5a，雖然指向不同 的序列。如同寡聚核苷酸3a，寡聚核苷酸203具有與DNA分子5a互補(bǔ)的序列。然而這個(gè)序 列比DNA分子5a和寡聚核苷酸3a的互補(bǔ)序列更長(zhǎng)。在溫度T1時(shí)，用傳感區(qū)域103a的表 面201溫育與磁珠1結(jié)合的DNA分子5a，T1低于DNA分子5a和寡聚核苷酸3a的雜化物的 解鏈溫度。因此，該雜化物將在此溫度T1時(shí)保持穩(wěn)定。因?yàn)榛パa(bǔ)序列的長(zhǎng)度不同，所以DNA 分子5a在溫度T1時(shí)趨向于與寡聚核苷酸203形成雜化物。因此，形成的雜化物的解鏈溫 度高于DNA分子5a和寡聚核苷酸3a的雜化物的解鏈溫度。圖6分別描述在磁珠1和DNA分子(5a，5b)的復(fù)合物分裂后傳感區(qū)域103a的表 面201的情況。復(fù)合物的分裂已經(jīng)通過(guò)將溫度提高至溫度T2來(lái)實(shí)現(xiàn)。所選溫度T2高于DNA分子 5a和5b與寡聚核苷酸3a和3b的各自的雜化物的解鏈溫度。將溫度提高至溫度T2導(dǎo)致雜 化物解鏈，從而固定了寡聚核苷酸3a的磁珠1從DNA分子5a中溶解出來(lái)。將溫度提高至溫度T2同樣溶解了 DNA分子5b和寡聚核苷酸3b的雜化物，結(jié)果是 DNA分子5b再次從磁珠1獨(dú)立并釋放至溶液中。溫度T2低于DNA分子5a和寡聚核苷酸203的雜化物的解鏈溫度，并且因此所述 雜化物在所選溫度T2時(shí)是穩(wěn)定的。圖7描述了在DNA分子5a和寡聚核苷酸203雜交以后 的表面201。寡聚核苷酸203與DNA分子5a的連接通過(guò)四根連接線象征性地表示。同樣固 定在磁珠1上的DNA分子5b在傳感區(qū)域103a的表面201上的寡聚核苷酸203中找不到任 何的配偶體，導(dǎo)致在這種情況中未發(fā)生連接。如果同樣要檢測(cè)DNA分子5b，相應(yīng)的寡聚核苷酸必須固定在分開(kāi)的感應(yīng)區(qū)域上(例如在感應(yīng)區(qū)域103b上)，然后DNA分子5b可以在這里通過(guò)固定在那里的寡聚核苷酸的 互補(bǔ)序列進(jìn)行結(jié)合。相應(yīng)地，DNA分子5a在感應(yīng)區(qū)域103b中找不到配偶體。在關(guān)閉磁場(chǎng)以后，磁珠1將再次釋放至溶液中，以至于感應(yīng)區(qū)域103a的表面201 不再由磁珠1占據(jù)。這相應(yīng)于圖3中的情況，除了先前已雜交的DNA分子5a。因此排除了 對(duì)隨后的DNA分子5a的檢測(cè)反應(yīng)的干擾。可以設(shè)想，在生物芯片101的整個(gè)表面上的磁珠1的隨機(jī)均勻的分布沒(méi)有成功地 在傳感區(qū)域103a的表面201上固定充足的DNA分子5a的樣品。相應(yīng)于均勻的分布，在打 開(kāi)磁場(chǎng)以后具有DNA分子5a的磁珠1均勻分布在表面上。圖7通過(guò)如下事實(shí)證實(shí)了，在這 里，DNA分子5b位于傳感區(qū)域103a的上方而不是如最終想要的位于傳感區(qū)域103b上。相 應(yīng)地，具有DNA分子5a的其他拷貝的磁珠1將在生物芯片的其他傳感區(qū)域的表面上存在或 者在傳感區(qū)域的表面之間存在。通過(guò)重復(fù)如上所述的方法步驟，DNA分子5a的其他樣品可 以移動(dòng)至傳感區(qū)域103a的表面201上。在溫度T2及磁場(chǎng)關(guān)閉時(shí)，磁珠和還沒(méi)有固定在傳 感區(qū)域上的DNA分子5a和5b再次釋放至體積為V1的溶液中。通過(guò)將溫度再次降低至上 述的低于DNA分子5a和寡聚核苷酸3a的雜化物的解鏈溫度T1,溶液中游離的DNA分子5a 和5b再次固定在磁珠1上。這個(gè)方法是有效的，因?yàn)橐烟砑痈邼舛鹊拇胖?，因此獲得足量 的DNA分子5a和5b的雜交配偶體。DNA分子5a和5b在短時(shí)間內(nèi)找到雜交配偶體的概率 是足夠高的。再次打開(kāi)磁場(chǎng)將磁珠1再次移動(dòng)至生物芯片的表面上，其中磁珠1上具有再 次固定的DNA分子5a和5b，此時(shí)，磁珠1在明顯更小的體積V2中濃集，這基本上相應(yīng)圖4 中的情況。圖8描述了這個(gè)情況。在之前的過(guò)程中已經(jīng)移動(dòng)至傳感區(qū)域103a的表面201的 DNA分子5a仍然與其中一個(gè)寡聚核苷酸203連接且因此固定在表面201上。在磁珠1上， 與DNA分子5a —致的DNA分子5a'現(xiàn)在再次與寡聚核苷酸3a結(jié)合，并且現(xiàn)在能和另一個(gè) 寡聚核苷酸203雜交。如在第一個(gè)過(guò)程循環(huán)中，這個(gè)方法是有效的，因?yàn)镈NA分子5a'在表 面201附近濃集。在DNA分子5a'與寡聚核苷酸203雜交以后，溫度再一次地提高到高于DNA分子 5a‘與寡聚核苷酸3a的雜化物的解鏈溫度的溫度T2,結(jié)果，磁珠從DNA分子5a'上分離。 這在圖9中顯示。所描述的方法可以重復(fù)任意次使得在相應(yīng)的傳感器表面上有效地實(shí)施 DNA分子5a和5b的濃集。同樣地，在圖5的情況中，還可以在DNA分子5a從磁珠1分離以前使DNA分子5a 與寡聚核苷酸203進(jìn)行雜交。這在圖10中描述。將提高溫度至溫度T2,從而得到如圖7中 的相同情況。DNA分子5a和寡聚核苷酸3a的雜化物解鏈，而DNA分子5a和寡聚核苷酸203 的雜化物是穩(wěn)定的。相應(yīng)的方法具有以下步驟-至少一部分的核酸分子與捕捉分子結(jié)合，-提供載體材料，該載體材料可以特異性連接至待檢測(cè)核酸分子以生成包括所述 載體材料和所述核酸分子的復(fù)合物，-溫育載體材料和試樣，形成復(fù)合物，-將復(fù)合物移動(dòng)至表面上，和-至少一部分的復(fù)合物與捕捉分子結(jié)合?；趫D1 10描述的方法使用了磁珠1，其在各情況中在表面上具有不同的寡聚核苷酸(3a，3b，3c)。這樣的優(yōu)勢(shì)為只要使用一種磁珠1，仍然可以實(shí)施多路過(guò)程。在可 選的示例性實(shí)施方式中，可以在各情況中在磁珠1上固定一種寡聚核苷酸3a，3b或3c用于 僅一個(gè)結(jié)合配偶體(DNA分子5a或5b)，從而生成不同種類(lèi)的磁珠1。如果僅有一種待檢測(cè) DNA分子，這是首先要求的。然而，同樣地，該方法可以通過(guò)添加不同種類(lèi)的磁珠1平行進(jìn) 行，在各情況中在磁珠1的表面上具有寡聚核苷酸3a、3b或3c中的一種。因此可以例如儲(chǔ) 備許多不同種類(lèi)的磁珠1，其在各情況中涂覆一種寡聚核苷酸3a、3b或3c，并且依照待檢測(cè) DNA分子5a或5b混合磁珠1成反應(yīng)混合物。圖11描述本發(fā)明的可選的實(shí)施方式。其中描述了兩種磁珠，501a和501b，它們?cè)?各情況中攜帶寡聚核苷酸3a和3b中的一種。寡聚核苷酸3a指向溶液中的DNA分子5a。 寡聚核苷酸3b指向溶液中沒(méi)有的DNA分子。此外，寡聚核苷酸503a和503b進(jìn)一步固定在 磁珠501a和501b的表面上。圖13舉例說(shuō)明寡聚核苷酸503a和503b的作用。圖12描述在磁珠501a和501b已經(jīng)與含有DNA分子5a的溶液溫育后的情況。DNA 分子5a和寡聚核苷酸3a的雜化物已經(jīng)形成。由于缺乏相應(yīng)的寡聚核苷酸的結(jié)合配偶體， 在磁珠501b上沒(méi)有發(fā)生雜交。磁珠501a和501b隨后通過(guò)磁場(chǎng)移動(dòng)至生物芯片的表面，并保持在那里。這在圖 13中描述。生物芯片505包括兩個(gè)傳感區(qū)域，507a和507b。寡聚核苷酸509a固定在傳感 區(qū)域507a上，寡聚核苷酸509a具有與寡聚核苷酸503a部分互補(bǔ)的核酸序列。相應(yīng)地，寡 聚核苷酸509b固定在傳感區(qū)域507b上，寡聚核苷酸509b具有與寡聚核苷酸503b部分互 補(bǔ)的核苷酸序列。以與上述方法類(lèi)似的方式，濃集磁珠501a和501b從而濃集寡聚核苷酸 503a和503b，這支持所述寡聚核苷酸503a和503b與寡聚核苷酸509a和509b在傳感區(qū)域 507a和507b上進(jìn)行雜交。在充足的溫育周期以后，關(guān)閉磁場(chǎng)從而從表面移去未固定的磁 珠501a和501b。作為結(jié)果，標(biāo)記的DNA分子5a僅通過(guò)傳感區(qū)域507a上方的寡聚核苷酸 503a和509a的雜化物的固定而結(jié)合。因此排除了僅通過(guò)傳感區(qū)域507b上方的磁場(chǎng)進(jìn)行固 定。然后可以通過(guò)已知的檢測(cè)方法對(duì)DNA分子5a經(jīng)由傳感區(qū)域507a位點(diǎn)的標(biāo)記物511進(jìn) 行檢測(cè)。經(jīng)由DNA分子5a特異性結(jié)合至磁珠501a上的寡聚核苷酸3a以及其經(jīng)由寡聚核 苷酸503a與傳感區(qū)域507a處的寡聚核苷酸509a的雜交，使得DNA分子5a分配至傳感區(qū) 域507a是明確的。這要求除去傳感表面上的未固定的磁珠501a和501b的樣品。因?yàn)樘?供的試樣不包含寡聚核苷酸3b的結(jié)合配偶體，在傳感區(qū)域507b處將檢測(cè)不到DNA分子，因 此測(cè)定相應(yīng)地為陰性的。以與上述示例性實(shí)施方式類(lèi)似的方式，該方法還可以循環(huán)重復(fù)，從而使更多種類(lèi) 的磁珠501a接近傳感器表面507a并且固定在那里。這有利于增加濃集的效率，特別是如 果只存在少量拷貝的DNA分子5a。所描述的方法可以普遍地使用，因?yàn)榫痛龣z測(cè)的DNA分子而言，磁珠501a和501b 的固定是非特異性的。僅通過(guò)形成磁珠501a和501b和固定其上的寡聚核苷酸3a和3b實(shí) 現(xiàn)檢測(cè)的特異性。相應(yīng)的具有不同感應(yīng)區(qū)域507a和507b的生物芯片505因此適合用于檢 測(cè)任何種類(lèi)的DNA分子。檢測(cè)僅要求不同設(shè)計(jì)的、能結(jié)合待檢測(cè)分子的磁珠。所描述的示例性實(shí)施例只記載了檢測(cè)DNA分子的實(shí)施例。然而它們可以以類(lèi)似的 方式用于任何核酸分子或其他能特異性結(jié)合的分子。因此，可以固定指向試樣中存在的蛋 白質(zhì)的抗體，用于在所述方法的磁珠上進(jìn)行檢測(cè)。磁珠可以相應(yīng)地在這里任選地通過(guò)蛋白質(zhì)本身固定(示例性實(shí)施方式1)或通過(guò)其他的具有抗體的蛋白質(zhì)或甚至核酸固定(示例 性實(shí)施方式2)。
權(quán)利要求
在表面(201)上濃集試樣的待檢測(cè)核酸分子的方法，其中特異性結(jié)合捕捉探針的捕捉分子固定在所述表面(201)上，所述方法包括以下步驟 提供載體材料，所述載體材料具有捕捉探針，并且能夠特異性連接至所述核酸分子以生成包括所述載體材料和所述核酸分子的復(fù)合物， 溫育載體材料和試樣，并且形成復(fù)合物， 將復(fù)合物移動(dòng)至表面(201)上，和 至少一部分的所述復(fù)合物通過(guò)捕捉探針與捕捉分子結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括以下步驟 _從所述的表面(201)移去未結(jié)合的復(fù)合物，_再次將未結(jié)合的復(fù)合物移動(dòng)至所述的表面(201)，和 -至少另一部分的復(fù)合物與所述的捕捉分子結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，多次進(jìn)行移去、再次移動(dòng)和結(jié)合的各步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述載體材料具有這樣的載體材料 表面在該表面上固定了捕捉探針和結(jié)合核酸分子的轉(zhuǎn)移分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述捕捉分子、捕捉探針和轉(zhuǎn)移分 子是核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述載體材料包括磁珠(501a， 501b)。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過(guò)施加磁場(chǎng)移動(dòng)磁珠(501a， 501b)。
8.在表面(201)上濃集試樣的待檢測(cè)核酸分子的方法，其中特異性結(jié)合所述核酸分子 的捕捉分子固定在所述表面(201)上，所述方法包括以下步驟_提供載體材料，所述載體材料能夠特異性連接至待檢測(cè)的核酸分子以生成包括所述 載體材料和所述核酸分子的復(fù)合物，-溫育載體材料和試樣，并且形成復(fù)合物， -將復(fù)合物移動(dòng)至表面(201)， -從載體材料分離核酸分子，和 -至少一部分的核酸分子與捕捉分子結(jié)合。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述載體材料包括這樣的載體材料表面在該表 面上固定了轉(zhuǎn)移分子，所述轉(zhuǎn)移分子能夠結(jié)合核酸分子。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述捕捉分子和轉(zhuǎn)移分子是核酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求8 10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，從表面(201)移去載體材料。
12.根據(jù)權(quán)利要求8 11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過(guò)改變嚴(yán)緊條件分離載體材料。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，通過(guò)提高溫度改變嚴(yán)緊條件。
14.根據(jù)權(quán)利要求8 13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，-在各情況中，捕捉分子包括與待檢測(cè)核酸分子的核酸序列部分連續(xù)互補(bǔ)的核酸序列， -在各情況中，轉(zhuǎn)移分子包括與待檢測(cè)核酸分子的核酸序列部分連續(xù)互補(bǔ)的核酸序列， -與待檢測(cè)核酸分子互補(bǔ)的捕捉分子和轉(zhuǎn)移分子的核酸序列是按照以下方式選擇的核酸分子_轉(zhuǎn)移分子雜化物的解鏈溫度低于核酸分子_捕捉分子雜化物的解鏈溫度。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，-在低于核酸分子_轉(zhuǎn)移分子雜化物的解鏈溫度的第一溫度時(shí)進(jìn)行溫育， -在低于核酸分子_轉(zhuǎn)移分子雜化物的解鏈溫度的第二溫度時(shí)將復(fù)合物移動(dòng)至表面 (201)上。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過(guò)將溫度提高至第三溫度從載 體材料分離核酸分子，所述第三溫度介于核酸分子-轉(zhuǎn)移分子雜化物的解鏈溫度和核酸分 子_捕捉分子雜化物的解鏈溫度之間。
17.根據(jù)權(quán)利要求8 16中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括以下步驟 -從表面(201)移去未結(jié)合的復(fù)合物，_再次將未結(jié)合的復(fù)合物移動(dòng)至表面(201)， -從載體材料分離核酸分子，和 -至少另一部分的核酸分子與捕捉分子結(jié)合。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，多次進(jìn)行移去、再次移動(dòng)、分離和結(jié)合的各步馬聚ο
19.根據(jù)權(quán)利要求8 18中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述的載體材料包括裝配有寡聚 核苷酸(3a, 3b)的磁珠(I)0
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，通過(guò)施加磁場(chǎng)移動(dòng)磁珠(1)。
21.在表面(201)上濃集試樣的不同待檢測(cè)核酸分子的方法，其中特異性結(jié)合所述核 酸分子的捕捉分子分組固定在表面(201)上的不同位點(diǎn)處，所述方法包括以下步驟_提供載體材料，所述載體材料能夠特異性連接至待檢測(cè)核酸分子以生成包括所述載 體材料和所述核酸分子的復(fù)合物，-溫育載體材料和試樣，并且形成復(fù)合物， -將復(fù)合物移動(dòng)至表面(201)， -從載體材料分離核酸分子，和 -至少一部分的核酸分子與捕捉分子結(jié)合。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述載體材料具有這樣的載體材料表面在該 表面上固定了結(jié)合不同核酸分子的不同轉(zhuǎn)移分子。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述捕捉分子和轉(zhuǎn)移分子是核酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求21 23中任一項(xiàng)所述的方法，其中，從表面(201)移去載體材料。
25.根據(jù)權(quán)利要求21 24中任一項(xiàng)所述的方法，其中，通過(guò)改變嚴(yán)緊條件分離載體材料。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，通過(guò)提高溫度改變嚴(yán)緊條件。
27.根據(jù)權(quán)利要求21 26中任一項(xiàng)所述的方法，其中-在各情況中，不同的捕捉分子包括與待檢測(cè)的特定核酸分子的特定核酸序列部分互 補(bǔ)的核酸序列，-在各情況中，不同的轉(zhuǎn)移分子包括與待檢測(cè)的特定核酸分子的特定核酸序列部分互 補(bǔ)的核酸序列，-在各情況中，與待檢測(cè)的核酸分子互補(bǔ)的捕捉分子和轉(zhuǎn)移分子的核酸序列是按照以下方式選擇的核酸分子_轉(zhuǎn)移分子雜化物的解鏈溫度低于核酸分子_捕捉分子雜化物的 解鏈溫度。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中-在低于核酸分子_轉(zhuǎn)移分子雜化物的解鏈溫度的第一溫度時(shí)進(jìn)行溫育， -在低于核酸分子-轉(zhuǎn)移分子雜化物的解鏈溫度的第二溫度時(shí)將復(fù)合物移動(dòng)至表面 (201)上。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28任一項(xiàng)所述的方法，其中，在復(fù)合物與捕捉分子結(jié)合以后，將 溫度提高至第三溫度，所述第三溫度介于核酸分子_轉(zhuǎn)移分子雜化物的解鏈溫度和核酸分 子_捕捉分子雜化物的解鏈溫度之間。
30.根據(jù)權(quán)利要求21 29中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括以下步驟 -從表面(201)移去未結(jié)合的復(fù)合物，_再次將未結(jié)合的復(fù)合物移動(dòng)至表面(201)，和 -至少另一部分的復(fù)合物與捕捉分子結(jié)合。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，多次進(jìn)行移去、再次移動(dòng)和結(jié)合的各步驟。
32.根據(jù)權(quán)利要求21 31中任一項(xiàng)所述的方法，所述的載體材料包括裝配有寡聚核苷 酸的磁珠⑴。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，通過(guò)應(yīng)用磁場(chǎng)移動(dòng)磁珠(1)。
全文摘要
本發(fā)明提供在表面上濃集試樣的待檢測(cè)核酸分子的方法，其中特異性結(jié)合捕捉探針的捕捉分子固定在所述表面上，該方法包括以下步驟提供載體材料，該載體材料具有捕捉探針，并且能夠特異性連接至所述核酸分子以生成包括所述載體材料和所述核酸分子的復(fù)合物，溫育載體材料和試樣，并且形成復(fù)合物，將復(fù)合物移動(dòng)至表面上，和至少一部分的所述復(fù)合物通過(guò)捕捉探針與捕捉分子結(jié)合。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101932730SQ200880126122
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2008年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月3日
發(fā)明者彼得·波利卡, 曼弗雷德·斯坦?jié)蔂? 沃爾特·岡布雷赫特 申請(qǐng)人:西門(mén)子公司