專利名稱：：B型肝炎病毒dna捕捉用探針和探針固定化固相載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及B型肝炎病毒(本發(fā)明說明書中也稱為"HBV")DNA捕捉用探針和固定有所述探針的固相載體。
背景技術(shù)：
：HBV的定量，作為用于觀察HBV感染者的治療效果，以及為了防止通過輸血用血液或移植用器官介導(dǎo)的受者的HBV感染而檢查供體有無感染HBV的手段，是十分重要的。作為定量血清等試樣中的HBV的方法，可以舉出如下方法，例如用磁性顆粒等載體捕捉試樣中的HBV-DNA,通過TaqMan(商標(biāo))法等實(shí)時檢測PCR法定量所捕捉的HBV-DNA的方法。此時優(yōu)選的是，即使是病毒濃度極低的檢測對象，也可以準(zhǔn)確地捕捉HBV-DNA。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種即使是病毒濃度極低的檢測對象，也可以準(zhǔn)確地捕捉HBV-DNA的B型肝炎病毒DNA捕捉用探針和探針固定化固相載體。本發(fā)明的一個方式中所述的B型肝炎病毒DNA捕捉用探針為，含有與選自序列號1~12所示的任一個序列中的連續(xù)的10個以上堿基具有80%以上序列同源性的堿基序列，且為堿基數(shù)15~80的寡核苷酸。本發(fā)明的一個方式中所述的探針固定化固相載體固定有上述B型肝炎病毒DNA捕捉用探針。通過使用上述B型肝炎病毒DNA捕捉用探針，即使在病毒濃度極低的檢測對象中也可以準(zhǔn)確地捕捉HBV-DNA。更具體而言，通過使用固定有上述B型肝炎病毒DNA捕捉用探針的探針固定化固相載體來捕捉HBV-DNA，即使在病毒濃度極低的檢測對象中也可以準(zhǔn)確地捕捉HBV-DNA。l.B型肝炎病毒DNA捕捉用探針本發(fā)明的一個實(shí)施方式中所述的B型肝炎病毒DNA捕捉用探針(以下也稱為"HBV-DNA捕捉用探針，，)含有與選自序列號1~12所示的任一個序列中的連續(xù)的10個以上堿基具有80%以上(優(yōu)選90%以上)的序列同源性的堿基序列，且堿基數(shù)為15~80(優(yōu)選25-45)的寡核苷酸。HBV-DNA捕捉用探針可以使用市售品，也可以通過公知的合成方法合成。探針BA:5'—TCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCT-3'(序列號l)探針BB:5，-CCCC丁GCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAA一3'(序列號2)探針BC:5'—GTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGG—3'(序列號3)探針BD:5'—TATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTT'TATCATATTCCTCT一3'(序列號4)探針BE:5,—CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGA—3'(序列號5)探針BF:5'_CCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCG丁丁TCTCTTGGCTCAGTTTACTAG-3'(序列號6)探針BG:5'_GGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGCTATATGGATGAT—3'(序列號7)探針BH:5'—丁GCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTT—3，(序列號8)探針BI:5'—CTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTG—3'(序列號9)探針BJ:5'—CCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTTGCATGGAGA—3'(序列號IO)探針BK:5'-TGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGC—3'(序列號ll)探針BL5'-GCAGG丁CCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAG—3'(序列號12)通過將HBV-DNA捕捉用探針固定化在例如探針固定化固相載體(例如磁性顆粒)的表面，在包含檢測對象的試樣中使該捕捉用探針與HBV-DNA雜交，在極低濃度下也可以捕捉檢測對象中的HBV-DNA。作為檢出對象的HBV-DNA包含于懷疑含有HBV的某種檢測對象中，例如血清，血漿等體液中。而且，使用HBV-DNA捕捉用探針捕捉到的HBV-DNA可以通過例如實(shí)時檢測PCR法進(jìn)行定量。例如，在含有捕捉到HBV-DNA的磁性顆粒和正向側(cè)引物和反向側(cè)引物和熒光探針(3，末端被供體熒光色素標(biāo)識化且5，末端被受體熒光色素標(biāo)識化的寡核苷酸(TaqMan(商標(biāo))探針))的系統(tǒng)中進(jìn)行PCR反應(yīng)，可以基于獲得的熒光強(qiáng)度測定檢測對象中的B型肝炎病毒DNA量。該實(shí)時檢測PCR法本身是公知的，這種用途的裝置和試劑盒也是市售的，因此使用這種市售的裝置和試劑盒可以進(jìn)行實(shí)時檢測PCR法。2.探針固定化固相載體本發(fā)明的一個實(shí)施方式中所述的探針固定化固相載體固定有上述HBV-DNA捕捉用探針。作為固相載體，可以舉出，例如可以作為色鐠載體、診斷試劑而使用的載體顆粒，例如可以作為DNA芯片、DNA微陣列而使用的芯片(基板)等。本實(shí)施方式中所述的探針固定化固相載體，更優(yōu)選為用于檢測HBV的固相載體(更具體的是在表面固定有HBV-DNA捕捉用探針的磁性顆粒)。作為在磁性顆粒上將HBV-DNA捕捉用探針固定化的方法，可以舉出，例如使3，末端被氨基修飾的HBV-DNA捕捉用探針與含有羧基的磁性顆粒反應(yīng)的方法，使3，末端被生物素化的HBV-DNA捕捉用探針與抗生物素蛋白化磁性顆粒反應(yīng)的方法。3.實(shí)施例以下，基于實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明。不過，本發(fā)明并不限于下述實(shí)施例。3.1具有HBV-DNA捕捉用探針的磁性顆粒的制作3.1.1.HBV畫DNA捕捉用探針作為HBV-DNA捕捉用探針，使用上述序列號1~12所示的序列BA~BL。3.1.2.HBV-DNA捕捉用探針向磁性顆粒的固定化性顆粒反應(yīng)的方法、和使3，末端被生物素化的HBV-DNA捕捉用探針與抗生物素蛋白化磁性顆粒反應(yīng)的方法這兩種方法，制作固定有HBV-DNA捕捉用探針的磁性顆粒。(a)通過使3，末端被氨基修飾的HBV-DNA捕捉用探針與含有羧基的磁性顆粒反應(yīng)，HBV-DNA捕捉用探針向磁性顆粒固定化將含有羧基的磁性顆粒(Magnosphere(商標(biāo))M300/Carboxyl(JSR林式會社制))lwt。/。分散液500jul取至管中，通過磁力架進(jìn)行磁力分離，除去上清。用0.0001N鹽酸清洗3次后，分散于500jil的0.0001N鹽酸中，加入5n1的3'末端被氨基化的HBV-DNA捕捉用探針(探針BA)IOOjnM溶液、和0.25mgEDC(l-乙基-3-(3-二曱基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽)，在設(shè)定于10X:的恒溫槽中攪拌15小時。然后，通過磁力架進(jìn)行磁力分離，除去上清。用含有0.5mMEDTA和l細(xì)NaCl的5mMtris-HCl(pH7.4)清洗3次后，分散于50n1的5mMtris-HCl緩沖液中，獲得了通過酰胺鍵結(jié)合有HBV-DNA捕捉用探針(探針BA)的探針固定化磁性顆粒(am-BA)的分散液(10%重量)。而且，用同樣的方法獲得了通過酰胺鍵結(jié)合有HBV-DNA捕捉用探針(探針BB,BC，BD,BE，BF，BG，BH，BI，BJ，BK，BL)的探針固定化磁性顆粒(am-BB,am-BC,am-BD，am-BE，am-BF，am-BG,am國BH,am-BI,am—BJ,am國BK，am畫BL)o(b)通過使3，末端被生物素化的HBV-DNA捕捉用探針與抗生物素蛋白化磁性顆粒反應(yīng)，HBV-DNA捕捉用探針向磁性顆粒的固定化將生物素化磁性顆粒(Magnosphere(商標(biāo))M300/Streptavidin(JSR林式會社制))lwtYo分散液500ji1取至管中，通過磁力架進(jìn)行磁力分離，除去上清。用含有0.5mMEDTA和l.OMNaCl的5mMTris-HCl(pH7.4)清洗3次后，分散于500ji1的含有0.5mMEDTA和l.OMNaCl的5mMTris-HCl(pH7.4)中，加入5nl的3，末端被生物素化的HBV-DNA捕捉用探針(探針BA)100juM溶液，室溫下攪拌30分鐘。然后，通過磁力架進(jìn)行磁力分離，除去上清。用含有0.5mMEDTA和l.OMNaCl的5mMtris-HCl(pH7.4)清洗3次后，分散于50p1的5mMtris-HCl緩沖液中，獲得了通過生物素-抗生物素蛋白結(jié)合而結(jié)合了HBV-DNA捕捉用探針(探針BA)的磁性顆粒(bi-BA)分散液(lO%重量)。而且，用同樣的方法獲得了通過生物素-抗生物素蛋白結(jié)合而分別結(jié)合了探針BB、BC、BD、BE、BF、BG、BH、BI、BJ、BK、BL的探針固定化磁性顆粒(bi-BB、bi-BC、bi-BD、bi誦BE、bi畫BF、bi誦BG、bi-BH、bi-BI、bi-BJ、bi-BK、bi-BL)。3.2.通過HBV-DNA捕捉用探針固定化磁性顆粒進(jìn)行的HBV-DNA的提取和檢測3.2.1.HBV國DNA的提取用上述工序制備的HBV-DNA捕捉用探針固定化磁性顆粒，從人血漿中提取HBV-DNA。用正常的人血漿稀釋含有濃度已知的HBV的人血漿的檢測對象，制備出IO倍階的稀釋系列。從各0.1ml的這些稀釋的血漿中提取HBV-DNA。首先，將O.lml血漿取至管中，加入380nl檢測對象稀釋液(1%N-月桂酰肌氨酸鈉，10mMEDTA，200mMNaCl，2%2-琉基乙醇，200mMTris-HCl(pH7.5))和5n1的10%葡聚糖T2000(Amersham公司制)進(jìn)行攪拌后，于55"C靜置30分鐘。接著，加入250jul的8M胍基鹽酸鹽進(jìn)行攪拌后，于55匸靜置15分鐘。然后,于95匸靜置10分鐘后冷卻到室溫。然后，加入10jul具有上述工序中制備的HBV-DNA捕捉用探針的磁性顆粒分散液(IO重量％)，于室溫下攪拌10分鐘后，通過磁力架進(jìn)行磁力分離除去液體。然后，用0.01%tritonX-100和含有0.1MNaCl的10mMtris-HCl(pH7.5)溶液清洗顆粒1次后，分散于40jul的無脫氧核糖核酸酶的水中，獲得了含有HBV-DNA的磁性顆粒分散液。以該磁性顆粒分散液作為模板，直接進(jìn)行實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)處理。3.2.2.通過實(shí)時檢測PCR進(jìn)行的擴(kuò)增和檢測每一個反應(yīng)管中制備下表l所示的反應(yīng)液，加入40pl含有上述提取的HBV-DNA的磁性顆粒分散液，進(jìn)行實(shí)時檢測PCR。反應(yīng)液的纟且成PCR等級的蒸餾水32.2nl10x緩沖液10plMgCl2(25mM)10ju1dATP(10mM)1ji1dGTP(10mM)1|J1dCTP(10mM)1ji1dTTP(10mM)1ji1正向側(cè)引物(100iaM)lpl反向側(cè)引物(100jiM)lHlTaqMan(商標(biāo))探針(25pM)0.4n1FastStartTaqDNA聚合酶(5U/p1)0.4ji1ROXReferenceDye(Invitrogen公司制)1|i1總計(jì)60|il正向側(cè)引物、反向側(cè)引物和TaqMan(商標(biāo))探針使用具有特表2005-505289記載的下述序列。正向側(cè)引物的序列5'—ATCTTATCAACACTTCCGGA—3'(序列號13)反向側(cè)引物的序列5'—AGATTGAGATCTTCTGCGAC—3'(序列號14)TaqMan(商標(biāo))探4十的序列5，一[FAM]AGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCT[TAMRA]—3'(序列號15)FastStartTaqDNA聚合酶和10x緩沖液4吏用FastStartTaqDNA聚合酶(Rochediagnostic公司制)所附的試劑。將反應(yīng)管置于實(shí)時檢測PCR裝置Prism7700(商品名，AppliedBiosystems公司)，在以下條件下進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。初期活性化步驟95匸15分鐘PCR變性95t:15秒PCR延伸60"C60秒重復(fù)進(jìn)行50個這樣的PCR循環(huán)。到達(dá)50個循環(huán)時，將熒光強(qiáng)度以指數(shù)函數(shù)性增加的判斷為陽性，不增加的判斷為陰性。使用各磁性顆粒獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于下表l。根據(jù)表1可知，具有上述HBV-DNA捕捉用探針的磁性顆?？梢詮暮兄辽?0個/0.1ml血漿的病毒的試樣中捕捉B型肝炎病毒。表l使用HBV-DM固定化磁性顆粒的HBV-DM的分離和檢測結(jié)果(陽性檢測對象數(shù)/試驗(yàn)檢測對象數(shù))<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>序列表<110>JSR株式會社<120>B型肝炎病毒DNA捕捉用探針和探針同定化固相載體<130>IP0817294<160>15<210>1<211>39<212>DNA<213>人工序列<■>1tcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttct39<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>2cccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaa40<210>3<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>3gtctagactcgtggtggacttctctcaattttctagggg39<210>4<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>4tatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctct40<210>5<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>5catcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctgga42<210>6<211>47<212>DNA<213>人工序列<400>6cctatgggagtgggcctcagtccgtttctcttggctcagtttactag47<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>7ggctttcccccactgtttggctttcagctatatggatgat40<210>8<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>8tgccaagtgtttgctgacgcaacccccactggctggggctt41<210>9<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula><210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14agattgagatcttctgcgac20<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>15aggtcccctagaagaagaactccct2權(quán)利要求1.一種B型肝炎病毒DNA捕捉用探針，其特征在于，含有與選自序列號1～12所示的任一個序列中的連續(xù)的10個以上堿基具有80％以上序列同源性的堿基序列，且為堿基數(shù)15～80的寡核苷酸。2.—種探針固定化固相載體，其特征在于，固定有權(quán)利要求l所述的B型肝炎病毒DNA捕捉用探針。全文摘要提供了一種即使是病毒濃度極少的檢測對象也可以準(zhǔn)確地捕捉HBV-DNA的B型肝炎病毒DNA捕捉用探針和探針固定化固相載體。B型肝炎病毒DNA捕捉用探針含有與選自序列號1～12所示的任一個序列中的連續(xù)的10個以上堿基具有80％以上序列同源性的堿基序列，且為堿基數(shù)15～80的寡核苷酸。文檔編號C12N15/09GK101519699SQ200910005388公開日2009年9月2日申請日期2009年2月24日優(yōu)先權(quán)日2008年2月26日發(fā)明者上野勝,村田充弘,片寄聰,福田哲夫,范可君申請人:Jsr株式會社