專利名稱：rAAV8-HBV1.3病毒用于建立HBV小鼠模型的制作方法
rAAV8-HBV1. 3病毒用于建立HBV小鼠模型本發(fā)明屬于生物技術發(fā)明領域。本發(fā)明具體涉及用rAAV8-HBVl. 3重組病毒載體建立“慢性乙型肝炎小鼠模型”。其中，rAAV8-HBVl. 3是含有HBV(h印atitis B virus，人乙型肝炎病毒，簡稱為“乙肝病毒”)的1.3個拷貝的全長基因組的外殼為AAV8的重組病毒載體。通過對小鼠尾靜脈注射rAAV8-HBVl. 3重組病毒載體構建獲得“慢性乙型肝炎小鼠模型”。背景關于乙型肝炎和HBV 國際病毒命名委員會1986年將如下病毒屬歸類到噬肝DNA 病毒科(侯云德著《分子病毒學》)=HBV(乙型肝炎病毒)、WHV(東方土撥鼠肝炎病毒)、 GSHV(地松鼠肝炎病毒)、DHBV(北京鴨肝炎病毒)、WMHV(長毛猴肝炎病毒)、HHBV(灰蒼鷺乙型肝炎病毒)、SGHV (雪鵝肝炎病毒)。HBV由屬特異性抗原決定簇a(al、a2、a3)和亞型決定簇d/y、w/r、q、g、η、χ、 t (少見)，等組合分成adw、adr、ayw, ayr等常見亞型。其中，亞型決定簇w又分為wl、w2、 w3、w4。各亞型中，Adw和adr亞型最常見，我國也以此2亞型為主；ayw和ayr亞型相對較少，但我國新疆、西藏、內(nèi)蒙以ayw亞型為主。乙型肝炎(h印atitis B,乙型肝炎，簡稱為“乙肝”)是由HBV引起的、以肝臟病變?yōu)橹鞑⒖梢鸲喾N器官損害的人類傳染性疾病。乙肝在已知各型人類病毒性肝炎(甲、乙、 丙、丁、戊型肝炎)中危害最嚴重。全球約有20億人感染過乙型肝炎病毒(HBV)，近3. 5億人終身攜帶HBV，或者罹患慢性乙型肝炎，其中有相當一部分人會發(fā)展成肝硬化或者肝癌。 全球每年約有一百萬人死于HBV引起的疾病。我國是HBV感染高發(fā)區(qū)，在乙肝疫苗大面積應用前，慢性乙肝患者約有3000萬例，每年急性乙肝新發(fā)病例約300萬例。雖已通過大面積接種乙肝疫苗預防HBV感染，但現(xiàn)有乙肝患者及HBSAg攜帶者的防治在今后幾十年內(nèi)仍將是一項艱巨的工作。要解決這個問題，必須進一步研究HBV持續(xù)感染與免疫應答及免疫耐受的分子機制，研發(fā)新的有效治療方法、藥物與疫苗。而病毒感染動物模型是人們了解病毒復制、病毒感染與宿主免疫應答和致病分子機制、研制有效抗病毒藥物和疫苗的不可或缺的工具。而這些工作的深入開展目前在很大程度上都受限于缺乏HBV持續(xù)感染的免疫功能正常的小動物模型。HBV病毒黏附以及病毒DNA轉錄及復制對細胞有嚴格的要求，HBV感染有高度的種屬和組織特異性，除人以外，它只感染黑猩猩和類人猿。HBV病毒不能直接感染小鼠肝臟，因此無法直接用感染性的HBV病毒接種小鼠來制備動物模型，而需要借助于其它手段把HBV 病毒基因組導入到肝臟或用轉基因動物的方法。目前研究所涉及的肝炎動物模型包括DHBV可感染鴨子，此類動物常作為間接乙肝動物模型；樹駒感染HBV模型；人鼠嵌合肝臟小鼠模型；HBV轉基因小鼠模型。上述各種 HBV感染動物模型都存在某些缺陷。目前，缺乏理想的HBV慢性感染的動物模型。HBV轉基因小鼠是目前較為常用的攜帶HBV基因組的小鼠模型，但其HBV蛋白與小鼠自身抗原均處于耐受狀態(tài)，與人HBV無癥狀攜帶者很相似，并且轉基因小鼠的HBV是整合在宿主染色體上的，不形成cccDNA，而cccDNA是前基因組及各種長度RNA的轉錄模板，在 HBV的復制過程中起著非常重要的作用。近年來用腺病毒為載體攜帶HBV基因組制備HBV全基因組或單個基因的細胞或動物模型取得了一定的進展。Sprinzl 等(Sprinzl MF, et al. Transfer of hepatitis Bvirus genome by adenovirus vectors into cultured cells and mice :crossing thespecies barrier. J Virol，2001，75 :5108-5118.)利用 Ad-DHBVl. 3 系統(tǒng)，將 293 細胞包裝好的病毒顆粒以尾靜脈接種小鼠，5d后處死小鼠，8只小鼠中有7只肝臟中用Southern blot檢測出復制型DHBV，用PCR檢測出所有小鼠的血清中有DHBV，都沒有腺病毒DNA。用這些鼠的血清可以感染原代鴨肝細胞，并且和DHBV陽性鴨的血清感染效率相當。說明DHBV也可以通過腺病毒轉移到小鼠肝臟并支持DHBV體內(nèi)復制。然而這種模型不能用作HBV慢性感染研究， 因為腺病毒載體的缺點是腺病毒本身的免疫原性很強，在體內(nèi)很快會被清除。另外腺病毒載體還攜帶了許多腺病毒的其它基因，這些基因在肝臟表達也對肝細胞產(chǎn)生毒性和干擾因素。因此，用腺病毒做載體制備HBV慢性感染的動物模型是有困難的。用高壓水動力注射1. 2-1. 3拷貝HBV基因組質粒DNA成功制備急性HBV模型已經(jīng)有報道，但HBV持續(xù)感染的小鼠模型則不易獲得。2006年Li-Rung Huang等(Huang LR, et al. An immunocompetent mouse model for the tolerance ofhuman chronic hepatitis B virus infection. Proc Natl Acad Sci USA. 2006 Nov21 ； 103 (47) : 17862-7.)用含 1. 2 個 HBV基因組的AAV載體質粒DNA用高壓水動力注射方法經(jīng)尾靜脈注射入成年小鼠體內(nèi)，注射的C57BL/6小鼠全部出現(xiàn)急性HBV感染表現(xiàn)，其中有40%可在血液中持續(xù)檢測到HBSAg， 持續(xù)時間達到6個月以上；在HBSAg陽性小鼠肝臟中檢測到HBV復制中間體、轉錄產(chǎn)物及相關蛋白持續(xù)時間達1年以上；而在Balb/c小鼠上僅能表現(xiàn)為HBV急性感染。這可能首次報道的免疫功能正常的非轉基因小鼠HBV持續(xù)感染模型的成功例子。他們認為質粒上AAV的 ITR對于HBV的持續(xù)表達有重要作用，小鼠的種屬也很重要。然而他們的研究表明在Balb/ c小鼠上僅出現(xiàn)HBV急性感染指標。然而，最近國內(nèi)學者(王文，等.免疫抑制劑地塞米松可明顯延長乙型肝炎病毒抗原在水動力法轉染HBV小鼠模型中的表達.病毒學報.2010^6(1) :20- .)用本研究中用到的pAAV2neo-HBVl. 3質粒DNA尾靜脈注射C57BL/6小鼠卻仍只是獲得了急性乙型肝炎小鼠模型，而沒有重復出LI-Rimg Huang等的結果。在上述研究背景下，本課題和發(fā)明通過制備攜帶1.3拷貝HBV基因組DNA的重組AAV8病毒rAAV8-HBVl. 3，將其經(jīng)尾靜脈注射到具有正常免疫功能的成體小鼠體內(nèi)，利用 AAV8病毒對肝臟感染的高親嗜性特點，將所攜帶的HBV基因組導入肝細胞中，以期制備持續(xù)感染HBV的小動物模型。由于AAV載體基因組兩端的ITR本身是反向互補的，可以形成首尾相接的環(huán)狀結構并滾環(huán)復制而形成染色體外附加子DNA，并且1.3拷貝的HBV基因組的首尾重復序列也有助于形成首尾相接的環(huán)狀結構，這對于形成HBV cccDNA都是有利因素。關于HBV病毒的基因組結構和分子病毒學背景HBV病毒全基因組長約3. 2kb,包括X、Core、S、P基因等。其中，ayw亞型的HBV的基因組DNA全長為3182bps，其它各亞型的HBV病毒全基因組結構相同。HBV病毒全基因組結構參見圖1。完整的HBV病毒毒粒為 Dane顆粒，直徑42nm，由外膜(HBsAg)和核殼(環(huán)狀DNA分子、DNA多聚酶、DNA結合蛋白、 蛋白激酶、HBcAg)組成。慢性乙型肝炎患者的血清中所含HBV的直徑為22nm，為球狀或絲狀空心外膜。存在毒粒時，可發(fā)現(xiàn)與核殼有關的可溶性抗原(HBeAg)。關于AAV載體的背景腺相關病毒(adeno-associated virus, AAV)因在腺病毒制品中發(fā)現(xiàn)而得名。腺伴隨病毒(adeno-associated virus, AAV)是微小病毒科 (parvovirus)成員，其基因組為4682個核苷酸組成的單鏈DNA。AAV是依賴性病毒，需要其它病毒如腺病毒或單純皰疹病毒，或輔助因素提供輔助功能才能復制。在沒有輔助病毒存在時，AAV感染細胞后其基因組將整合到細胞染色體中成為潛伏狀態(tài)，而不產(chǎn)生子代病毒。最早分離到的AAV病毒是血清型2型AAV (AAV2)。AAV2基因組長約4. 71Λ，基因組兩端為長度145bp的“反向末端重復序列”(ITR)，呈回紋-發(fā)卡結構?；蚪M中有兩個大開放閱讀框(ORF)，分別編碼r印和cap基因。AAV-2的全長基因組已克隆至大腸桿菌質粒中。 其中含有2個各145bp長的倒轉末端重復序列anvertedterminal repeat, ITR)。它們是 AAV基因組的復制起點，并與AAV復制、整合或包裝等功能有關。其基因組其余部分可分為 2個功能區(qū)，I^p基因區(qū)和cap基因區(qū)。R印蛋白對于AAV病毒的復制、整合、拯救和包裝都具有重要作用。其中R印78和R印68與ITR種的末端解鏈位點trs (terminal resolution site)和GAGY重復基序(r印eat motif)特異性結合，啟動AAV基因組由單鏈向雙鏈的復制過程。ITR中trs和GAGC重復基序是AAV基因組復制的中心，因此雖然在各種血清型的 AAV病毒中ITR序列都不盡相同，但是都能構成發(fā)卡結構和存在R印結合位點。在AAV2基因組圖譜位置19處有pl9啟動子，分別表達R印52和R印40。Rep52和R印40沒有結合DNA 的功能，而有ATP依賴的DNA解旋酶活性。cap基因編碼AAV病毒的衣殼蛋白VP1、VP2和 VP3。其中，VP3分子量最小，但數(shù)量最多，在成熟的AAV顆粒中VP1、VP2、VP3的比例大致為 1 1 20。VPl是形成有感染性的AAV所必需的；VP2協(xié)助VP3進入細胞核；VP3是組成 AAV顆粒的主要蛋白。AAV病毒載體因為安全性好、感染的宿主范圍廣泛、能穩(wěn)定表達外源基因而成為有應用前景的病毒載體。AAV載體通常是用外源基因的表達單位(包括啟動子、外源基因、 mRNA加尾信號和/或其它調(diào)控元件)替代AAV病毒的r印cap基因，保留兩端的ITR，包裝到AAV病毒顆粒中形成一種“假型病毒”(pseudotyped virus)。產(chǎn)生rAAV病毒的最經(jīng)典方法為將rAAV載體質粒與含有r印-cap基因的輔助質粒導入腺病毒或單純皰疹病毒感染的細胞中。2-3天后從培養(yǎng)上清及病變的細胞中即可收獲到rAAV病毒，同時還含有所用的腺病毒或單純皰疹病毒。腺病毒和單純皰疹病毒都可用熱處理(55°C 30分鐘至2小時)而滅活，但不影響AAV病毒的活性。雖然這種生產(chǎn)rAAV病毒的方法比較簡單，但仍存在許多明顯的缺點。首先，每次制備rAAV病毒時都需要轉染細胞。由于轉染方法自身的限制，轉染及共轉染效率較低，是產(chǎn)生rAAV病毒滴度較低的原因之一。而且，用轉染方法目前還難以大規(guī)模轉導細胞，因此不適應大量生產(chǎn)rAAV病毒的需要。因此，有必要研究一種能用于大量生產(chǎn)rAAV病毒的系統(tǒng)和方法。早期的AAV載體是通過對在2型AAV(AAV2)病毒基因組克隆進行基因操作而實現(xiàn)的。AAV2基因組長度約4. 7kb，由兩端的ITR(145bp)、r印0RF、capORF三部分組成。為了使AAV載體能夠攜帶外源基因及表達元件，往往將兩個ITR之間的rep和capORF除去， 代之以外源基因的表達單位，比如CMV-EGFP-polyA，構建成ITR-CMV-MCS-polyA-ITR的結構。用帶有大腸桿菌復制子及抗生素抗性基因(如ampR，氨芐抗性基因)的質粒骨架攜帶 ITR-CMV-MCS-polyA-ITR 結構即構成 AAV2 載體質粒(MCS，multiple cloning sites 多克隆位點)，比如Mratagene公司商品化的pAAV-MCS質粒。為了便于將AAV載體質粒轉染到細胞中形成穩(wěn)定的“載體細胞株”，而不是每次都將AAV載體質粒用轉染方法導入細胞中，吳小兵等將ITR-CMV-MCS-SV40polyA-ITR結構插入pSV2neo質粒的BamHI切點中，構建成pSNAV載體質粒(中國專利申請?zhí)?9119038. 6，系列通用型腺病毒伴隨病毒載體的構建及用途)。將外源基因克隆到PSNAV或其衍生載體中的啟動子下游，轉染到生產(chǎn)細胞如BHK21或HEK293等細胞中，加G418 400 800ug/ml選擇培養(yǎng)10 15天，即可得到穩(wěn)定攜帶所轉染的AAV載體質粒的G418抗性細胞。同樣，為了省去每次包裝AAV病毒時將兩個復制質粒用轉染方式導入細胞的麻煩，吳小兵等將AAV2的r印-cap基因置于HSVl基因組中，構建成用于簡便而大量生產(chǎn)rAAV 病毒的全功能輔助病毒HSV-rc (中國專利申請?zhí)?8120033. 8)。用HSV_rc感染rAAV病毒載體質粒瞬時轉染的細胞或上述穩(wěn)定攜帶AAV病毒載體質粒的細胞株，就能產(chǎn)生大量有感染性的rAAV毒粒。用這種方法產(chǎn)生的rAAV能將外源基因導入哺乳動物細胞中并表達。(伍志堅，吳小兵等，科學通報。1999，44(5) :506-509。伍志堅，吳小兵等，中國科學C 輯。2001，31(5) :423-430。WU Zhijian, WU Xiaobing, etal. Science in China(Series C). 2002,45(1) :96-104。WU Zhijian, WU Xiaobing, et al. Chinese Science Bulletin。 1999,44(8) :715-718。)這種包裝策略比目前國際上常用的三質?；螂p質粒共轉染細胞法生產(chǎn)AAV病毒的優(yōu)勢在于用“感染方式”替代了“轉染方式”，最大的特點是便于AAV病毒大規(guī)模生產(chǎn)。AAV7 禾口 AAV8 是 Gao 等(Gao GP, et al. Novel adeno—associated viruses fromrhesus monkeys as vectors for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Sep 3 ；99 (18) :11854-9.)從恒河猴的組織中用AAV1-6的保守區(qū)引物PCR方法篩選后再獲取全長的r印-cap ORF而得來的。將AAV2的r印與AAV7或AAV8的cap雜合用于包裝攜帶AAV2 ITR的重組AAV病毒就是我們現(xiàn)在常提到的AAV2/7和AAV2/8載體，也往往簡稱為AAV7和AAV8載體。許多研究證明了 AAV8載體在體內(nèi)表達具有良好的肝嗜性(Gao G, et al. New recombinant serotypes of AAVvectors. Curr Gene Ther. 2005 Jun ；5 (3) 285-97. Davidoff AM, et al. Comparison ofthe ability of adeno-associated viral vectors pseudotyped with serotype 2,5,and 8capsid proteins to mediate efficient transduction of the liver in murine andnonhuman primate models. Mol Ther. 2005 Jun ； 11 (6) :875-88. Wang L, et al. Systematic evaluation of AAV vectors for liver directed gene transfer in murinemodels. Mol Ther. 2010 Jan ； 18 (1) :118_25·)。AAV8載體在體內(nèi)表達具有良好的肝嗜性，我們采用AAV8載體做為導入HBV病毒基因組的載體工具。為此，在我們之前的AAV載體包裝系統(tǒng)的發(fā)明專利的基礎上，我們進一步發(fā)展了具有包裝rAAV2/8病毒的全功能輔助病毒rHSVl-rep2Cap8包裝系統(tǒng)(專利申請?zhí)?00810167070. 0，董小巖、吳小兵等，用于重組AAV2/8病毒載體生產(chǎn)的重組I型單純皰疹病毒及其用途)。使用這個系統(tǒng)可以把將插入了外源基因的pAAV2neo-gene質粒包裝產(chǎn)生含有外源基因表達單元的血清型為8型的重組病毒rAAVS-gene。例如，本發(fā)明所述利用全功能輔助病毒rHSVl-r印2cap8包裝系統(tǒng)將pAAVneo-HBVl. 3包裝制備成重組病毒 rAAV8-HBVl. 3。發(fā)明_既述
HBV病毒不能直接感染小鼠肝臟，因此無法直接用感染性的HBV病毒接種小鼠來制備動物模型，而需要借助于其它手段把HBV病毒基因組導入到肝臟或用轉基因動物的方法。本發(fā)明的技術特征是將攜帶了多拷貝HBV基因組DNA的重組AAV病毒用于制作小鼠模型。通過我們的研究，我們能夠確定該重組AAV病毒是具有相對專一感染小鼠肝臟組織細胞的能力的、血清型為8型的AAV (重組AAV8病毒)，或者是具有相對專一感染小鼠肝臟組織細胞能力的其它嵌合型的AAV病毒。在本研究中，我們采用HBV基因組DNA的拷貝數(shù)為1. 3個拷貝。當HBV基因組DNA的拷貝數(shù)大于1時，就會存在HBV基因組DNA同源臂，此同源臂會發(fā)生同源重組，因而最終獲得完整的HBV基因組。鑒于此簡單而符合邏輯的理論，我們認為，HBV基因組DNA的拷貝數(shù)大于1的HBV基因組DNA片段都可以被用于實現(xiàn)本發(fā)明的目的。所建立的HBV小鼠模型可以是慢性乙型肝炎模型、持續(xù)HBV病毒復制、攜帶模型。本發(fā)明所述的建立的HBV小鼠模型動物為C57BL/6小鼠和/或Balb/c小鼠。本發(fā)明所述的重組AAV病毒是通過小鼠尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)而感染了小鼠的肝臟組織細胞從而造成了 HBV小鼠模型。重組AAV病毒所包裝的HBV的亞型為ayw亞型或adw、adr、ayr 亞型。發(fā)明詳述眾所周知，HBV病毒不能直接感染小鼠肝臟，因此無法直接用具有感染性的HBV病毒接種小鼠來制備動物模型，而需要借助于其它手段把HBV病毒基因組導入到肝臟或用轉基因動物的方法。HBV轉基因小鼠是目前較為常用的攜帶HBV基因組的小鼠模型，但是轉基因小鼠的HBV是整合在宿主染色體上的，在所有的HBV轉基因小鼠都不能檢測到細胞內(nèi) cccDNA,因此其應用也有局限性。本研究利用AAV8病毒的嗜肝性特點，將所攜帶的1. 3拷貝的HBV基因組導入肝細胞。由于AAV載體基因組兩端的ITR本身是反向互補的，可以形成首尾相接的環(huán)狀結構并滾環(huán)復制而形成染色體外附加子DNA ；并且1. 3拷貝的HBV基因組的首尾重復序列也有助于形成首尾相接的環(huán)狀結構，這對于形成環(huán)化的而非整合的HBV DNA都是有利因素。 在本發(fā)明中，我們將來自于ayw或adw、adr、ayr亞型的HBV的基因組DNA通過分子克隆操作，獲得1. 3個拷貝或者大于1的多拷貝的HBV的基因組DNA片段，如拷貝數(shù)為 1. 1 1.4。然后，將此HBV基因組DNA片段插入到pAAV2ne0質粒的多克隆位點，并去除原質粒上的CMV啟動子，獲得攜帶了多拷貝HBV基因組DNA的重組質粒如pAAVneo-HBVl. 3。之后，我們采用吳小兵等發(fā)明的AAV的病毒包裝生產(chǎn)策略(中國專利申請?zhí)?8120033. 8 ’伍志堅，吳小兵等，科學通報。1999,44(5) :506-509.伍志堅，吳小兵等，中國科學C輯。2001， 31(5) :423-430。WU Zhijian, WU Xiaobing, et al. Science in China(Series C). 2002， 45(1) :96-104offUZhijian,ffU Xiaobing,et al. Chinese Science Bulletin。1999，44(8) 715-718。)和具有包裝rAAV2/8病毒的全功能輔助病毒rHSVl_r印2cap8 (董小巖、吳小兵等的發(fā)明用于重組AAV2/8病毒載體生產(chǎn)的重組I型單純皰疹病毒及其用途。專利申請?zhí)?00810167070. 0)將pAAVneo-HBVl. 3包裝制備成重組病毒rAAV8_HBVl. 3。然后，我們用攜帶了多拷貝HBV基因組DNA的重組AAV病毒如rAAV8-HBVl. 3通過小鼠尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)而感染了小鼠的肝臟組織細胞從而造成了 HBV小鼠模型。
本發(fā)明技術上之所以能夠成功，是建立在1)AAV8被發(fā)現(xiàn)具有高度的肝臟組織細胞親嗜性；2) 1. 1 1. 4拷貝(如1. 3拷貝)的HBV基因組長度對于AAV載體的允許包裝容量是合適的；幻多拷貝的HBV基因組DNA片段的兩端存在同源臂；4)這個同源臂在細胞內(nèi)可以成功地發(fā)生同源重組；5)同源重組的結果是產(chǎn)生環(huán)化的HBV基因組；6)環(huán)化的HBV 基因組能夠自主復制和裝配HBV病毒顆粒。腺相關病毒(adeno-associated virus, AAV)載體具有安全性好(本身不致病)、 持續(xù)存在和表達、免疫原性低等特點而被廣泛用于基因治療、載體疫苗和其它基因轉移研究。AAV載體基因組中去除了所有病毒編碼基因，只有兩端的ITR元件(非編碼序列)，進入細胞后不表達任何病毒自身基因，因此不會引起針對病毒基因產(chǎn)物的免疫反應，這也是 AAV病毒載體介導外源基因能在免疫功能正常的小鼠體內(nèi)長期表達而不被免疫清除的主要原因之一。AAV載體有多種血清型，至今至少有11個血清型被公認。其中AAV8被發(fā)現(xiàn)具有高度的肝細胞親嗜性，并且，AAV8對肝臟的轉染不像AAV2那樣有“飽和限制”?！帮柡拖拗啤?的意思是，當使用用AAV2注射小鼠，即使用高劑量甚至更高劑量，肝細胞轉染效率最高也只能達到10%，這就表現(xiàn)為“飽和限制”。每只小鼠用高劑量如7. 2X10el2vg的AAV8進行尾靜脈或門脈注射，幾乎100%的肝細胞可被轉染并持續(xù)表達外源基因達1年以上。1.3拷貝的HBV基因組長度不足4. 31Λ，這個容量對于AAV載體是合適的。理論上，在不超過AAV病毒包裝的最長基因4. 5kb的前提下，HBV基因組長度越長，其HBV基因組DNA片段的兩端的同源臂就越長，其在細胞內(nèi)發(fā)生同源重組的成功率就越高。當多拷貝 HBV基因組長度為4. 51Λ時，其拷貝數(shù)為1.4。故本發(fā)明案例所使用的HBV基因組的拷貝數(shù)理論上可以為1. 1 1.4。本研究的實施例3中，我們用3只C57BL/6小鼠尾靜脈注射rAAV8_HBVl. 3后，在血液中持續(xù)檢測到HBSAg、HBeAg，說明該病毒攜帶的HBV病毒基因在體內(nèi)獲得了表達；10周處死動物，用普通PCR方法檢測3只C57BL/6小鼠肝臟DNA中的HBV S基因片段都為陽性， HBV熒光定量PCR也證明肝組織中HBV DNA含量較高；肝臟的免疫組化結果顯示3只實驗組小鼠至少HBc抗原都是明確陽性的，這些結果說明rAAV8-HBVl. 3成功將HBV1. 3轉至肝細胞內(nèi)并表達了 HBV抗原。由于rAAV8-HBVl. 3在基因組結構上的特征是僅含有AAV2的2 個ITR和1. 3拷貝的HBV基因組，不帶有任何其它外源基因和元件。因此，HBSAg、HBeAg的表達應該是由HBV自身的基因元件調(diào)控的。AAV8導入的HBV DNA是否在肝臟發(fā)生了復制及其復制的方式是本研究關注的重點。rAAV8-HBVl. 3中攜帶的基因組是單鏈線性的，我們希望知道它進入肝細胞后是整合到染色體中，還是在染色體外形成了環(huán)狀DNA，如果是環(huán)狀的或至少有環(huán)化的DNA產(chǎn)生，那是按AAV方式復制而來的還是按HBV方式復制來的？這是一個十分有趣的問題，也是一個本研究中至關重要的科學問題。圖8顯示了我們區(qū)分這兩種假想的復制方式的思路在1. 3 拷貝HBV DNA的非重復區(qū)兩末端設計的一對特異性引物，以實驗組小鼠肝臟組織DNA為模板向兩外側進行PCR。我們預測，如果HBV DNA是整合在細胞的染色體基因組里的，那么這對引物將導致兩條擴增鏈向外延伸不能相遇，因而無法擴增出特異性片段；如果HBV DNA 是環(huán)化的，則可能有兩種擴增結果一種是擴增出一個1009bps的片段，剛好是1. 3拷貝 HBVDNA上的一個重復區(qū)長度，說明DNA復制是按HBV病毒方式進行的；另一種可能是擴出 2183bps的片段，是2個重復區(qū)長度加上一個的雙D序列ITR長度，說明DNA復制是按AAV病毒方式進行的。我們的實驗結果顯示擴增出來的片段長度是1009bps，說明DNA復制是按照HBV病毒方式進行DNA復制的。結果見圖9。10周處死動物時，將所獲得的小鼠血清使用全自動生化儀進行肝功能檢測，檢測結果顯示3只C57BL/6小鼠的ALT指標均稍高于正常值的上限，分別為87、83、88U/L，提示肝臟有輕度損傷。小鼠的ALT指標正常值為< 80U/L。在本研究的實施例5中，我們用3只C57BL/6小鼠與4只Balb/c小鼠注射 rAAV8-HBVl. 3，以進一步比較在不同品系的小鼠中使用rAAV8_HBVl. 3對產(chǎn)生慢性乙型肝炎小鼠模型是否存在差異。本研究的結果表明，C57BL/6與Balb/c小鼠間是存在著一定差異。在HBSAg表達水平上，3只C57BL/6小鼠的個體差異大一些，但均為陽性，3只Balb/c 小鼠均為陽性；HBeAg表達水平上，3只C57BL/6小鼠和3只Balb/c小鼠在7d后均能檢測到血中HBeAg表達，并且比較穩(wěn)定地持續(xù)在較高水平，一直到100天時均為陽性。HBSAb、 HBeAb和HBcAb的檢測各時間點1 16倍稀釋血漿中，檢測結果均小于臨界值，均判定為陰性。本案所提供的實驗數(shù)據(jù)說明用rAAV8-HBVl. 3重組病毒載體經(jīng)小鼠尾靜脈注射 C57BL/6與Balb/c小鼠成功地建立了“慢性乙型肝炎小鼠模型”，小鼠肝臟內(nèi)可以持續(xù)檢查到HBV病毒的復制，該小鼠同時也是乙型肝炎病毒長期攜帶模型。


圖IHBV基因結構圖以ayw型的HBV的基因結構圖為例，示意HBV基因結構。該圖引用自侯云德著的 《分子病毒學》。圖2 HBV在肝細胞內(nèi)繁殖HBV在肝細胞內(nèi)繁殖和生活周期的示意圖。該圖引用自侯云德著的《分子病毒學》。圖3 pAAV2neo_HBVl. 3質粒結構示意圖為pAAV2neo-HBVl. 3質粒結構的示意圖，圖中所示為AAV的兩個ITR之間的 HBV1. 3的各基因的編碼和相對位置。HBV的各基因包括X、S、P、Core基因，超過1個完整的HBV基因組的多出來部分的基因主要是X基因和Core的5’端的一部分、P的3’端的一部分。圖4轉染細胞上清HBSAg和HBeAg檢測體外培養(yǎng)的3種細胞株，分別用質粒pAAV2ne0-HBVl. 3的DNA轉化細胞和 rAAV2-HBVl. 3病毒感染細胞，之后，檢測細胞培養(yǎng)上清液中HBSiVg和HBeAg的水平。圖中可見，HEK293和H印G2這2種細胞，不論是病毒感染還是轉染，7 檢測細胞上清時，HBSAg和 HBeAg仍均為陰性，只有Huh7/質粒DNA轉化的上清的HBSAg和HBeAg為明確陽性，Huh7/ 病毒感染的也是陰性HBSAg和HBeAg。參見實施例2。圖5小鼠血漿中HBSAg及HBeAg的檢測結果為C57 BL/6小鼠尾靜脈注射rAAV8_l. 3HBV后各時間點的小鼠血漿中HBSAg及 HBeAg的檢測結果。結果顯示，1周后開始在血液中檢測到HBSAg和HBeAg的表達，并持續(xù)至10周均為陽性。其中HBSAg的表達水平經(jīng)歷了一個上升-下降-再上升的過程，其中， 第4周為最低，稍高于陽性的臨界值，從第6周開始到第10周，HBSAg的表達水平很高，為強陽性。而HBeAg表達水平則比較持續(xù)穩(wěn)定，有不特別顯著的上升-下降-再上升的過程， 但沒有特別低的情況，到第10周時也明顯較之前水平高些。參見實施例3。
圖6小鼠肝臟HBV DNA的S基因的普通PCR的電泳結果圖中所示，M為BM2000 (Takara)Marker ；泳道1為No. 1小鼠肝臟DNA ；泳道2為 No. 2小鼠肝臟DNA ；泳道3為No. 3小鼠肝臟DNA ；PC為陽性對照(PositiveControl) ；NC為陰性對照(Negative Control)。圖7用熒光定量PCR法檢測C57 BL/6小鼠尾靜脈注射rAAV8_l. 3HBV后，處死小鼠后獲得的肝臟及血清中的HBV DNA的Q-PCR水平其中，左上圖為No. 1 3號小鼠的肝臟HBV DNA Q-PCR ；右上圖為No. 1 3號小鼠的血清HBV DNA Q-PCR ；左下圖為用陽性對照品所做的標準曲線；右下圖為左上圖和右上圖的原始實驗數(shù)據(jù)。圖8小鼠肝臟內(nèi)的HBV DNA的復制方式的設計圖rAAV8-HBVl. 3導入到小鼠肝臟后，HBV DNA的復制方式如果是按AAV病毒復制方式復制則見左下圖，如果是按HBV病毒方式復制則見右下圖。圖9 HBV DNA在肝臟內(nèi)的復制方式的檢測圖中，M為BL15000 Marker ；泳道1 3為No. 1小鼠的基因組DNA的不同上樣量， 分別為0. 1、0. 5、IuL ；泳道4 6為No. 2小鼠的基因組DNA的不同上樣量，分別為0. 1、0. 5、 IuL ；泳道7 9為No. 3小鼠的基因組DNA的不同上樣量，分別為0. 1,0. 5、luL ；泳道10為陰性對照；泳道11為陽性對照(pTHBV DNA)。圖 10 Balb/c 與 C57BL/6 小鼠注射 rAAV8_HBVl. 3 后 HBSAg、HBeAg 的比較其中，左上圖為No. 1 3號Balb/c小鼠的HBsAg的檢測結果；左下圖為No. 1 3號Balb/c小鼠的HBeAg的檢測結果；右上圖為No. 1 3號及陰性對照C57BL/6小鼠的 HBsAg的檢測結果；右下圖為No. 1 3號及陰性對照C57BL/6小鼠的HBeAg的檢測結果；圖11小鼠血細胞中HBV DNA檢測(注射后19天)其中，圖A =PCR擴增小鼠全血細胞DNA中HBV DNA后擴增HBV S基因的300bp DNA 片段的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中，泳道1 -4 :PCR products from Balb/cmice Nol，2，3，4， 泳道 5 :marker DL2000 (TAKARA)，泳道 6 為 pAAMneo-HBVl. 3DNA,做為陽性對照，泳道 7 為陰性對照，泳道 8 11 :PCR products from C57BL/6mice Nol，2，3，4。圖 B:將圖 A 的 PCR 產(chǎn)物電泳后的凝膠轉膜做Southern雜交所獲得的結果的照片，它是以地高辛標記的HBV S 基因片段為探針。其泳道順序與圖A相同。圖12小鼠肝臟病理分析其中，A、B、C分別為3只小鼠(No. UNo. 2,No. 3)的肝臟經(jīng)福爾馬林固定、蠟包埋、切片、HE染色、脫色、封片后鏡檢有代表性的所見。D為正常肝對照。圖13肝臟HBV抗原的免疫組化結果其中，A、B、C分別為3只小鼠(No. 1、No. 2、 No. 3)的肝臟HBSAg組化結果；D、E、F分別為3只小鼠(No. UNo. 2,No. 3)的肝臟HBCAg組化結果；G為正常小鼠肝臟的HBSAg組化；H為正常小鼠肝臟的HBCAg組化。圖14 Balb/c小鼠體內(nèi)Fluc基因表達分布(44dpi)圖15 C57BL/6小鼠體內(nèi)Fluc基因表達分布(22dpi)圖16 Balb/c小鼠外周血中Gluc的RLU值的動態(tài)監(jiān)測
圖17 C57BL/6小鼠外周血中Gluc的RLU值的動態(tài)監(jiān)測以下實施例對本發(fā)明的rAAV8-HBVl. 3病毒用于建立HBV小鼠模型的技術作了詳細說明，但并不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。實施例1 質粒 pAAV2neo-HBVl. 3 及重組病毒 rAAV2_HBVl. 3 和 rAAV8_HBVl. 3重組質粒pAAVaieo-HBVl. 3含有1. 3個拷貝的HBV基因組DNA，是將HBV DNA的1. 3 拷貝的基因片段插入到pAAV2ne0質粒的多克隆位點中構建成的，其中，去除了 pAAV2ne0質粒的CMV啟動子，構建過程見所發(fā)表的文章(王文，孫世惠，曾道炳，趙光宇，于虹，郭彥，譚文杰，盧實春，周育森。免疫抑制劑地塞米松可明顯延長乙型肝炎病毒抗原在水動力法轉染 HBV小鼠模型中的表達。病毒學報。2010，26(1) :2016)。詳細構建過程:p HBV21質粒(含兩個拷貝全長HBV基因組基因，ayw亞型，GenBank :AB^709011)DNA經(jīng)Nsi I酶切Klenow Fragment補平后EcoR I酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收21 Ikb小片段(HBV21)，ρ HBV21質粒 DNA經(jīng)EcoR I/B gl II雙酶切瓊脂糖凝膠電泳回收2101Λ小片段(HBV22)，pAAV2ne0載體經(jīng)Bio I酶切Klenow Fragment補平后B amH I酶切瓊脂糖凝膠電泳回收610大片段與 HBV21及HBV22連接，轉化ToplO感受態(tài)細胞，篩選獲得包含113個拷貝HBV基因組的陽性克隆PAAV2HBV113，分別經(jīng)EcoR I及B amH I酶切及序列測定鑒定。所攜帶的HBV基因組為ayw亞型。重組質粒pAAV2ne0-HBVl. 3是用于包裝 rAAV8-HBVl. 3和rAAV2_HBVl. 3重組病毒的。pAAV2neo_HBVl. 3的質粒結構示意圖見圖3。質粒pTHBV為攜帶了首尾相連的、2個拷貝的HBV基因組DNA的質粒，來自于國家疾病預防控制中心病毒病預防控制所本實驗室，所攜帶的HBV基因組為ayw亞型。重組病毒rAAV2-HBVl. 3 和 rAAV8_HBVl. 3 是使用 pAAV2neo_HBVl. 3 包裝的重組 AAV病毒載體，其AAV的外殼的血清型分別為2型和8型。采用吳小兵、董小巖等發(fā)明(ZL 99119039. 4，可用于大規(guī)模生產(chǎn)的重組腺病毒伴隨病毒生產(chǎn)方法及用途；200810167070. 0， 用于重組AAV2/8病毒載體生產(chǎn)的重組I型單純皰疹病毒及其用途；ZL 99123723. 4，一種快速高效分離和純化重組腺病毒相關病毒的方法和用途)的AAV的病毒包裝生產(chǎn)策略制備 rAAV2-HBVl. 3 和 rAAV8_HBVl. 3實施例2用AAV-HBV1. 3重組病毒及pAAV2neo-HBVl. 3質粒進行體外細胞實驗重組AAV-HBV1. 3病毒感染細胞及HBSAg和HBeAg檢測實驗培養(yǎng)細胞株Huh7、H印G2、HEK293于96孔板中，其中Huh7和H印G2為肝來源的細胞，HEK293為非肝臟來源的細胞。細胞培養(yǎng)液為10% FBS/DMEM，細胞接種量為1 2X10e4cells/200ul培養(yǎng)液/孔，每種細胞加2行9列。5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h加入病毒。分別加入rAAV2-HBVl. 3和rAAV8_HBVl. 3到細胞培養(yǎng)板上，病毒的滴度為 lX10ellvg/mL·每種病毒在孔板上加“行3 X列3”孔，即每行中相同病毒有4個復孔，其中1列不加病毒。rAAV2-HBVl. 3病毒的使用量為1 X 10e8vg/well，rAAV8-HBVl. 3病毒的使用量為2X 10e9Vg/well。5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)Mh，到48h時取上清50ul用 ELISA方法(萬泰)測定HBSAg和HBeAg的表達和分泌的水平。結果顯示rAAV2-HBVl. 3和rAAV8_HBVl. 3病毒感染肝來源或非肝來源的3種細胞均為陰性，考慮到AAV8對體外培養(yǎng)的細胞一般都不敏感，而AAV2應該敏感，但也是陰性，所以再用其生產(chǎn)所用的質粒做這3種細胞。
質粒pAAMneo-HBVl. 3轉染細胞及HBSAg和HBeAg檢測實驗接種三種細胞Huh7，H印G2，HEK293至M孔板孔中，接種密度為1 2X10e4cells/200ul培養(yǎng)液/孔。細胞培養(yǎng)液為10% FBS/DMEM。在細胞密度至50%時進行質粒轉染。分別轉染pAAV2neo-HBVl. 3 DNA到上述3種細胞，質粒DNA的使用量為0. 8ug/ 孔,用 lipofectamine2000 轉染，使用量為 2uL/ 孔。用 pAAV2neo-CMV_EGFP 質粒 DNA 作對照，同時監(jiān)測轉染效率。轉染后24h、4 i及72h取上清50ul測定HBSiVg和HBeAg。實驗中觀察至Ij pAAV2neo-HBVl. 3 DNA轉染24h和48h時的3種細胞上清中均未檢測到HBSAg和HBeAg陽性(Huh7、H印G2、HEK293的EGFP轉染效率分別約為80%,5%,95% ) 換液，800uL培養(yǎng)液 /孔。轉染后7 再次檢測，結果只有Huh7上清HBSAg和HBeAg為明確陽性，HEK293細胞和H印G2細胞上清仍均為陰性。檢測結果見圖4。結果提示1. 3拷貝的HBV DNA直接轉染肝來源的細胞株Huh7能夠表達HBSAg和HBeAg ；HepG2未檢測到HBSAg和HBeAg的表達可能是由于其轉染效率太低所致；HEK293細胞的轉染效率雖然很高(95% )，卻沒有檢測到 HBSAg和HBeAg的表達，可能是因為1. 3拷貝的HBV DNA的表達在非肝來源的細胞中受到限制。圖4為轉染細胞上清HBSAg和HBeAg檢測。檢測方法參照萬泰公司的HBSAg和HBeAg 的ELISA檢測試劑盒使用說明書。HBSAg和HBeAg的Cut-off值(臨界值)的判定臨界值=陰性對照孔OD均值X2. 1。陰性對照孔OD均值低于0. 05者按0. 05計算。實施例3 C57 BL/6小鼠尾靜脈注射rAAV8_l. 3HBV的HBV的指標檢測動物實驗使用C57 BL/6小鼠共4只，雄性，4 6周齡。采取小鼠尾靜脈注射給藥方法，4只小鼠以病毒注射量做為變量進行分組，分別為No. 1組200ul，病毒的使用量為2X IOellvg/只，1只；No. 2組與No. 3組:400ul，病毒的使用量為4X IOellvg/只，各1 只；No. 4組陰性對照(不注射病毒)，1只。所使用病毒為rAAV8-l. 3HBV，共約Iml純化濃縮的病毒，批號為T2010011001C，滴度為lX10el2vg/ml。檢測按預先設計的時間點進行尾靜脈采血。采血量為50ul全血，加150ul PBS 稀釋，離心取上清，用HBV ELISA檢測試劑盒(萬泰)按照使用說明書檢測了 4只小鼠在1、 2、3、4、5、6、10 周的血菜中 HBSAg、HBeAg、HBSAb、HBeAb、HBcAb 的水平。結果顯示，1周后開始在血液中檢測到HBSAg和HBeAg的表達，并持續(xù)至10周均為陽性。其中HBSAg的表達水平經(jīng)歷了一個上升-下降-再上升的過程，其中，第4周為最低，稍高于陽性的臨界值，從第6周開始到第10周，HBSAg的表達水平很高，為強陽性。而 HBeAg表達水平則比較持續(xù)穩(wěn)定，有不特別顯著的上升-下降-再上升的過程，但沒有特別低的情況，到第10周時也明顯較之前水平高些。結果見圖5。同時，用ELISA試劑盒檢測各時間點血漿(1 16倍稀釋)中HBSAb, HBeAb和HBcAb,結果均為陰性。肝臟病理第10周處死動物后，所取的所有重要臟器中，肝臟病理切片檢查分析結果見圖 12。圖中，A、B、C分別為3只小鼠(No. 1、No. 2、No. 3)的肝臟經(jīng)福爾馬林固定、蠟包埋、切片、HE染色、脫色、封片后鏡檢有代表性的所見。D為正常肝對照。圖中所示，A、B、C肝臟均無明顯肝細胞損傷、淋巴細胞浸潤、炎性反應，但似乎存在肝小葉邊界不清析，肝細胞輕微腫脹。肝臟HBV抗原的免疫組化
所用的檢測HBc的一抗為兔抗HBcAg的單抗，二抗為HRP標記的羊抗兔抗體；檢測 HBS的一抗為HBSAb陽性的人血清，二抗為HRP標記的抗人IgG的抗體。免疫組化結果3只注射了 rAAV8-HBVl. 3 病毒的 C57BL/6 小鼠(No. UNo. 2,No. 3) 肝臟切片的HBcAg免疫組化結果均為陽性，正常對照小鼠為陰性。這3只小鼠的肝臟切片的HBSiVg的免疫組化結果也均為陽性，正常對照小鼠為陰性。有代表性的照片結果見圖13。 其中，A、B、C分別為3只小鼠(No. 1、No. 2、No. 3)的肝臟HBSAg的組化結果，為陽性；D、E、 F分別為3只小鼠(No. 1、No. 2、No. 3)的肝臟HBCAg的組化結果，為陽性；G為正常小鼠肝臟的HBSAg組化結果，H為正常小鼠肝臟的HBCAg組化結果，均為陰性。10周處死動物時，將所獲得的小鼠血清使用全自動生化儀進行肝功能檢測，檢測結果顯示3只C57BL/6小鼠的ALT指標均稍高于正常值的上限，分別為87、83、88U/L，提示肝臟有輕度損傷。小鼠的ALT指標正常值為< 80U/L。用普通PCR法檢測小鼠肝臟及血清中的HBVDNA的S基因片段設計一對特異引物P3、P4，所要擴增的目的片段為HBV S基因的一部分，長度約為 300bpsο P3 5' -ATGGAGAACATCACATCAGG-3‘P4 5 ‘-ATAGTCCAGAAGAACCAACA-3‘PCR的反應模板為3只注射了病毒的小鼠的肝組織基因組DNA和血清中的HBV病毒顆粒的DNA，做為PCR模板。PCR模板的提取方法肝組織基因組DNA為PCR模板使用TaKaRa公司的基因組DNA提取試劑盒，分別提取3只注射病毒的小鼠的肝組織基因組DNA，做為PCR模板。血清中的HBV病毒顆粒的 DNA為PCR模板使用深圳匹基生物的HBV PCR熒光定量檢測試劑盒的提取試劑來提取的， 提取了 3只小鼠的血清中(HBV病毒顆粒)的DNA做為普通PCR模板。PCR反應體系10XPCR Buffer4dNTP (2. 5mM)D. D. W5' primer (IOmM)pyrobest DNA 多聚酶(5U/y 1)模板 DNATotal Volume
5 μ 1 4μ 1
38. 65 μ 1
1 μ 1 3' primer (IOmM)1 μ 1
0. 25 μ 1
0. 1 μ 1 50 μ 1
將加好的反應體系按下列反應條件進行PCR擴增95°C，5min ；94°C,30sec ；55°C, 30sec，72°C，2min ；35 個循環(huán)后，72°C，7min ；4°C，5min 終止。3 只小鼠的序號為 No. 1、No. 2、No. 3。PCR 后樣品與 DNA MarkerDL2000 (TaKaRa)、 陽性對照、陰性對照等一起用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，Genefinder染料染色，凝膠成像儀照相分析。結果顯示3只小鼠的肝組織的基因組DNA均為陽性結果，均能檢測出 HBV S基因目標條帶，結果見圖6。而以所提取的小鼠血清中的HBV病毒顆粒的DNA為模板進行PCR檢測HBV S基因， 結果顯示3只小鼠血清的普通PCR電泳結果均為陰性，提示血清中HBV的病毒顆粒數(shù)及其DNA的拷貝數(shù)可能比較低，無法用普通PCR檢測出HBV S基因目標條帶。因此，設計熒光定量PCR方法再次對樣品進行檢測，同時以小鼠的肝組織的基因組DNA做對照進行熒光定量PCR檢測。熒光定量PCR法檢測C57 BL/6小鼠肝臟及血清中HBV DNAHBV PCR熒光定量檢測試劑盒用的是深圳匹基生物公司的，按照使用說明書檢測肝組織及血清中的HBV DNA。結果顯示3只小鼠(No. UNo. 2、No. 3)血清中的HBV DNA分別為4208. 22,3592. 13,2463. 50IU/ml血清，肝臟基因組DNA所檢測出的HBV DNA分別為 7996305、5582148、2538361IU/g肝組織。肝臟與血液均檢出HBV的DNA，兩者數(shù)值上相差分別為1900、1554、1030倍。結果與預期基本一致，血清中的HBV DNA水平較低，因此用普通 PCR無法檢測出HBV S基因目標條帶。實驗數(shù)據(jù)詳見圖7。實施例4肝臟內(nèi)HBV DNA的復制方式本實驗在1. 3拷貝的HBV的非重復區(qū)設計了一對特異性PCR引物Pl和P2， 以肝臟組織基因組DNA為模板進行PCR擴增，通過擴增產(chǎn)物的大小來判斷在重組病毒 rAAV8-HBVl. 3導入到小鼠肝臟后，HBV DNA的復制是按AAV病毒復制方式還是按HBV病毒方式。本實驗的設計思路是特異性引物Pl和P2設計在1. 3拷貝的HBV非重復區(qū)，即在重復區(qū)域之外，這兩條引物方向相反，朝向重復區(qū)域延伸。如果HBV DNA的復制是按AAV病毒復制方式進行的，PCR就應該能獲得理論上有218:3bps的片段，該片段為2個重復區(qū)域 (1009X2 = 2018bps)加上1個AAV的復制出的ITR(165bps)；如果HBV DNA的復制是按 HBV病毒方式進行的，則該片段理論上有1009bps，即僅有1個重復區(qū)域的長度。設計思路如圖8所示。特異性PCR引物為Pl :5，-TTGTGGGTCTTTTGGGTTTT-3，P2 5 ’ -CTGAGGCGGTATCTAGAAGA-3，反應體系10XPCR Buffer5μ 14dNTP(2. 5mM)4μ 1D. D. W38. 65 μ 15' primer (IOmM)1 μ 13' primer (IOmM)1 μ 1pyrobest DNA 多聚酶0. 25 μ 1(5U/y 1)模板DNA0. 1 μ 1Total Volume50 μ 1將加好的反應體系按下列反應條件進行PCR擴增95°C，5min ；94°C,30sec ；55°C, 30sec，72°C，2min ；35 個循環(huán)后，72°C，7min ；4°C，5min 終止。PCR擴增的產(chǎn)物與DNA Marker DL2000 (TaKaRa)、陽性對照、陰性對照等一起用 0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，Genefinder染料染色，凝膠成像儀照相分析。以3只小鼠的肝組織的基因組DNA為模板，所設計的PCR特異引物為PCR引物，PCR 后上樣跑瓊脂糖凝膠電泳，以PTHBV質粒為陽性對照。實驗結果見圖9。結果顯示，3只小鼠(No. UNo. 2、Νο· 3)的肝組織的基因組DNA PCR都獲得了 1009bps的片段，陽性對照和陰性對照分別獲得各自的正確結果。這個結果提示，小鼠肝臟中至少是確切存在HBV病毒的復制方式。由于AAV ITR的這個結構在PCR時比較困難，所以目前尚不能排除與此同時是否還存在AAV ITR介導的復制方式，這個還需要其它實驗驗證或排除。實施例5 C57BL/6 與 Balb/c 小鼠注射 rAAV8_HBVl. 3 比較實驗動物為C57 BL/6小鼠4只與Balb/c小鼠4只，共7只，雄性，4 6周齡。其中，1只C57 BL/6小鼠(C57 BL/6 No. 4小鼠)做為陰性對照(不注射病毒)，其余7只小鼠采用尾靜脈注射方法給藥，6只小鼠的病毒注射量相同200ul/只(lXlOellvg/只)。在操作中，Balb/c No. 4小鼠尾靜脈注射病毒時打漏了，只打進去IOOul病毒，所以在檢測時仍然檢測它，但不計入組內(nèi)。注射的病毒為rAAV8-l. 3HBV，共約Iml純化濃縮的病毒，批號T2010021401C，滴度 5X10ellvg/ml。檢測方法按預先設計的時間點進行尾靜脈采血。采血量為50ul全血，加 150ulPBS 稀釋，離心，取上清，用于 HBSAg、HBeAg、HBSAb、HBeAb、HBcAb 的 ELISA 檢測(使用萬泰公司HBV ELISA檢測試劑盒)；血細胞沉淀用于提取全基因組DNA (使用TAKARA公司的全基因組DNA提取試劑盒)，參照產(chǎn)品使用說明書進行。PCR模板的制備方法、PCR引物設計、PCR反應體系、條件與實施例3中所述相同，擴增目標片段為HBV S基因的一段300bp DNA片段。用HBV PCR熒光定量檢測試劑盒(國藥準字S20020033，深圳匹基生物)，按照使用說明書檢測肝組織及血清中的HBV DNA。結果顯示，3只C57BL/6小鼠和3只Balb/c小鼠在7d后均能檢測到血中HBeAg 表達，并且比較穩(wěn)定地持續(xù)在較高水平(高于萬泰公司ELISA試劑盒中的陽性對照)，一直到第95天仍為陽性；而HBSAg的表達則有比較大的波動，3只Balb/c小鼠在7d達到一個 HBSAg表達高峰，隨后逐漸下降至陰性；3只C57BL/6小鼠的HBSAg表達水平的小鼠個體差異更大一些。結果見圖10 (A、B、C、D)。檢測各時間點1 16倍稀釋血漿中HBSAb、HBeAb 和HBcAb，檢測結果均小于臨界值，均判定為陰性。從2種小鼠的HBeAg持續(xù)表達結果來看， HBSAg的表達水平下降至陰性應該不是轉染了 rAAV8-HBVl. 3病毒的細胞被免疫清除的結果，推測有可能是HBV S基因的表達沉默造成的。結合第一批動物實驗的結果規(guī)律來看，隨時間延伸，第二批小鼠的HBSAg也有可能重新上升。小鼠血細胞中HBV DNA檢測(19dpi)Balb/c和C57BL/6小鼠各3只共6個全血細胞的DNA樣品。為注射后第19d的。 Balb/c小鼠No. 1、2、3及C57BL/6小鼠No. 1、2、3。經(jīng)全血細胞樣品的DNA提取、PCR擴增小鼠全血細胞DNA中HBV S基因的一段300bp DNA片段，之后，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，照相后使用半干轉印儀進行轉膜，所用膜為正電荷尼龍膜，以地高辛標記的HBV S基因片段做為探針進行Southern雜交，并完成顯色和照相。PCR產(chǎn)物電泳圖(圖11A)和Southern雜交圖(圖11B)結果一致，可見Balb/c小鼠No. 1、2、3及C57BL/6小鼠No. 2均擴增出HBV S基因特異的條帶，C57BL/6小鼠No. 1、3 未擴出陽性；Southern雜交證實了 PCR產(chǎn)物的特異性。結果見圖11A、11B。實施例6 AAV8載體在小鼠體內(nèi)的分布和表達特點本實施例在實驗中是處于實施例2之后及在實施例3之前進行的。因其內(nèi)容較多，且本案的核心內(nèi)容是乙肝病毒的小鼠模型，因此，本實施例相對于實施例3、4、5的重要性低一些，故放在最后的實施例里。特此說明。且此實施例的過程和結果對于實施例3、4、 5的設計和實施均有意義。我們在研究中發(fā)現(xiàn)AAV8載體在體外對于多種細胞的轉染效率都很低。然而許多文獻報道AAV8載體在體內(nèi)具有良好的嗜肝性和表達效率。我們構建了一種重組病毒 rAAV8-CAG-Gluc-2A-Fluc，它的表達單元里含有一個由TaV 2A介導的雙螢光素酶共表達基因Gluc-2A-Fluc作為報告基因，用CAG作為啟動子。我們用該病毒研究AAV8載體在小鼠體內(nèi)的分布和表達特點。這為AAV8載體用于肝臟疾病的研究和基因治療打基礎。具體實驗過程、方法、結果如下。本部分研究對Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠等2種不同種系的小鼠進行了實驗。病毒為rAAV8-CAG-Gluc-2A-Fluc，采用的注射方式為尾靜脈注射和肌肉注射，注射劑量分不同的劑量。注射病毒后分別觀察小鼠體內(nèi)報告基因Gluc-2A-Fluc中Fluc和Gluc的表達和分布情況。1.小鼠注射病毒rAAV8-CAG-Gluc-2A_Fluc的實驗方法病毒rAAV8-CAG-Gluc-2A-Fluc；病毒滴度1 X 10el2vg/ml ；Balb/c小鼠，雄性，5只，4_6周齡；注射方式尾靜脈注射(No. 1、No. 2)及肌肉注射(No. 3、No. 4)；注射劑量No. 1 :4X 10ellvg/400uL/ 只；No. 2 :2X 10ellvg/200uL/ 只； No. 3 :0. 5X10ellvg/50uL/ 只；No. 4 :0. 5X 10ellvg/50uL/ 只；No. 5 不注射，做陰性對照。C57BL/6，雄性，6只，2-3周齡；注射方式尾靜脈注射(No. 1-6)；注射劑量分為2 組，組1為高劑量組X 3只，為No. 1-3，病毒注射劑量為IX lOellvg/lOOuL/只；組2為低劑量組X 3只，為No. 1-3，病毒注射劑量為lXlOelOvg/lOOuL/只(用PBS稀釋至IOOuL)； 未設陰性對照。2.小鼠體內(nèi)Fluc基因表達分布實驗通過活體成像分析研究觀察Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠體內(nèi)Fluc基因表達分布，Balb/c小鼠的觀察時間為注射后第44天(44dpi)，C57BL/6小鼠的觀察時間為注射后第22天?；铙w成像方法先注射Fluc酶作用底物D-luciferin 150mg/kg ；5min后腹腔注射戊巴比妥鈉75mg/kg ；15 30min使用小動物活體成像儀檢測和照相。C57BL/6小鼠和Balb/c小鼠分別在注射后第22d和第44d進行小鼠的活體成像分析，以獲得Fluc在C57BL/6小鼠和Balb/c小鼠體內(nèi)的表達和分布情況。各組的實驗數(shù)據(jù)和結果如下。Balb/c小鼠實驗數(shù)據(jù)陰性對照小鼠未見熒光，結果為陰性。4只注射了 rAAV8-CAG-Gluc-2A-Fluc重組病毒的Balb/c小鼠均有明確的Fluc表達活性，表現(xiàn)為注射底物D-Iuciferin后動物身體局部組織器官產(chǎn)生可被活體成像分析設備捕捉及記錄的熒光，熒光強度和總量可被積分和定量，所產(chǎn)生的熒光相對集中聚集。當將活體成像分析設備分析軟件的敏感度調(diào)高時，可見產(chǎn)生熒光的主要組織器官周邊也有較大面積的、彌漫的、較弱的熒光。結果見圖14。其中，尾靜脈注射(No. 1、No. 2)的熒光主要集中在肝臟(圖14A)，且有劑量和熒光強度的正相關性，即熒光強度No. 1 > No. 2，調(diào)高敏感度后， No. 1的熒光彌漫到整個軀干及頭頸部，No. 2的熒光彌漫在軀干局部小區(qū)域(圖14C)。肌肉注射(No. 3、No. 4)的熒光主要集中在所注射的肌肉組織(圖14B)，兩只小鼠的注射劑量相同但熒光強度有差異，No. 3 > No. 4，可能源于操作時注射打漏了導致劑量誤差，調(diào)高敏感度后，No. 3和No. 4的熒光彌漫在與肌肉注射部位的同側軀干(圖14D)。結果表明 rAAV8-CAG-Gluc-2A-Fluc重組病毒能在Balb/c小鼠體內(nèi)工作。AAV8能夠有效感染Balb/ c小鼠的肝臟和肌肉。經(jīng)尾靜脈注射的rAAV8重組病毒絕大多數(shù)都富集在小鼠的肝臟。采用肌肉注射rAAV8重組病毒則主要集中感染所注射的肌肉組織。CAG啟動子能在Balb/c小鼠的肝臟和肌肉組織細胞很好地工作，可以獲得目的基因的長期穩(wěn)定的表達，可以避免CMV 啟動子甲基化而導致基因表達沉默的缺點。經(jīng)尾靜脈注射的rAAV8重組病毒在的肝臟的 Gluc表達存在明確的量效正相關關系。C57BL/6小鼠的實驗數(shù)據(jù)如下高劑量組3只和低劑量組1只一共4只注射了重組病毒的C57BL/6小鼠，其肝臟部位局部均有明確的熒光，但熒光強度存在高低不一致、動物的實驗數(shù)據(jù)個體差異較大。因目前所做實驗的動物的例數(shù)太少，對于這種結果是由于操作誤差還是由于C57BL/6小鼠的遺傳均一性稍差的原因導致的無法下結論。陰性對照小鼠未見熒光，為陰性。取其中兩只C57BL/6小鼠的照片結果如圖15所示。實驗過程中，因 C57BL/6小鼠體重過輕，未能掌握好麻醉劑量，造成低劑量組小鼠在第Ild和21d先后麻醉死了 2只。剩余的1只低劑量組小鼠因被用于肝臟勻漿的采集于第46d被處死了。結果表明rAAV8-CAG-Gluc-2A-Fluc重組病毒能在C57BL/6小鼠體內(nèi)工作。經(jīng)尾靜脈注射的AAV8 能夠有效感染C57BL/6小鼠的肝臟，且重組病毒的表達絕大多數(shù)都富集在小鼠的肝臟。CAG 啟動子能在C57BL/6小鼠的肝臟組織細胞很好地工作，可以獲得目的基因的長期穩(wěn)定的表達，而不易因啟動子甲基化而導致基因表達沉默。3.小鼠外周血中Gluc表達水平的動態(tài)監(jiān)測在特定的時間點，對小鼠進行切尾采血，每只小鼠每次采血2. 5uL進行Gluc檢測。具體步驟以微量加樣槍取2. 5uL全血，加入到預置入了 50ul Gluc酶作用底物 coelenterazine (PBS液10倍稀釋)的EP管中。閉合EP管蓋后輕彈3次，用發(fā)光檢測儀檢測Gluc (積10s) RLU值。Gluc的表達活性，表現(xiàn)為Gluc作用其底物coelenterazine后產(chǎn)生可被發(fā)光檢測儀記錄熒光，RLU值可被定量，該指標敏感性和特異性均好。Balb/c小鼠外周血中Gluc表達水平的動態(tài)監(jiān)測本實驗在第5、8、12、15、19、 沈、29、33、38、43、50、59、68、77、84d，對上述Balb/c小鼠進行切尾采血，每只小鼠每次采血 2. 5uL用發(fā)光檢測儀進行Gluc檢測。實驗中，將底物coelenterazine用PBS液稀釋10倍使用，檢測Gluc測積IOs的RLU值(relativelight unit，相對光單位)。結果如圖16。實驗數(shù)據(jù)顯示陰性對照鼠No. 5在持續(xù)84天的特定時間點的Gluc動態(tài)監(jiān)測過程中，RLU值一直處于< 1000RLU的背景水平。本實驗因此人為地初步設定< 1000RLU為Gluc 的背景臨界線，更準確的Gluc陰性臨界值需要更多的實驗數(shù)據(jù)總結得出。注射了 rAAV8重組病毒的4只Balb/c小鼠，第一次數(shù)據(jù)Gluc水平(5d)除No. 3處于背景臨界線以下，其余 3只均在背景臨界線以上，且之后4只小鼠的RLU值一直全部在背景臨界線以上，為陽性結果，且表現(xiàn)為逐步穩(wěn)定上升的趨勢，并于第26d達到最高峰值，于第43d為最低，之后平穩(wěn)回升，保持相對的穩(wěn)定狀態(tài)。其中，尾靜脈注射組的RLU值處于IX 10e4 5RLU之間，肌肉注射組的RLU值處于2X 10e3 IXlOe 4RLU之間。另外，RLU值與病毒注射劑量之間存在明顯的量效正相關關系，表現(xiàn)為No. 1 > No. 2 >> No. 3和No. 4 ；在肌肉注射組No. 3和No. 4里，它們的病毒的注射劑量相同，但No. 4 > No. 3，這與其在Fluc的表現(xiàn)正好相反。因數(shù)據(jù)量太少，無法解釋其原因。結果表明rAAV8-CAG-Gluc-2A-Fluc重組病毒在采用尾靜脈注射和肌肉注射方式均可在Balb/c小鼠內(nèi)獲得可被檢測到的明確的Gluc表達，Gluc的RLU 值與病毒的注射劑量正相關。在已經(jīng)監(jiān)測的84d(近3個月)里，RLU值能保持相對穩(wěn)定。C57BL/6小鼠外周血中Gluc表達水平的動態(tài)監(jiān)測本實驗在第3、7、11、16、21、 ^、37、46、55、62d，對上述C57BL/6小鼠進行切尾采血，每只小鼠每次采血2. 5uL用發(fā)光檢測儀進行Gluc檢測。實驗中，將底物coelenterazine用PBS液稀釋10倍使用，檢測Gluc 測積IOs的RLU值。在檢測Fluc的活體成像數(shù)據(jù)采集實驗過程中，麻醉造成低劑量組小鼠在第Ild和21d先后死了 2只。低劑量組小鼠因Gluc的RLU值變化趨勢與高劑量組基本相似，剩余的1只低劑量組小鼠因而被用于肝臟勻漿的采集于第46d被處死了。本實驗全部為C57BL/6小鼠尾靜脈注射，rAAV8-CAG-Gluc-2A-Fluc重組病毒注射劑量有高劑量組 (1 X IOellvg/只)和低劑量組(1 X IOelOvg/只)。實驗數(shù)據(jù)顯示從第3d開始一直到62d， 高劑量組3只小鼠一直全部在背景臨界線以上，為陽性結果，且表現(xiàn)為快速上升的趨勢，并于第Ild達到最高峰值，之后快速下降，于第16d為最低，之后平穩(wěn)回升，保持相對的穩(wěn)定狀態(tài)，RLU值處于lX10e4 RLU左右(圖17A)。低劑量組3只小鼠，在第3d時全部在背景臨界線以下，之后快速上升，于第Ild達到最高峰值，然后快速下降，于第16d為最低，相對平穩(wěn)，在背景臨界線以上，保持相對的穩(wěn)定狀態(tài)，RLU值處于1 X 10e3 4RLU左右，為陽性結果 (圖17B)。從數(shù)據(jù)中觀察到，Gluc的RLU值與病毒注射劑量之間存在明顯的量效正相關關系。這與Balb/c小鼠外周血中RLU值數(shù)據(jù)相似，只是C57BL/6小鼠Gluc的RLU值變化起伏很快。結果如圖17。結果表明C57BL/6小鼠經(jīng)尾靜脈注射rAAV8-CAG-Gluc-2A-Fluc重組病毒，注射后第3d外周血中即能檢測到Gluc的表達，RLU值相對持續(xù)穩(wěn)定。Gluc的RLU 值與病毒注射劑量之間存在明顯的量效正相關關系。我們用一種CAG啟動子作用下的雙螢光素酶共表達基因G1UC-2A-F1UC，研究尾靜脈注射或肌肉注射，研究了 AAV8載體在小鼠體內(nèi)的分布和表達特點。雙螢光素酶共表達基因Gluc-2A-Fluc為我們課題組先前構建并用水動力法研究了其體內(nèi)表達特性 ]。該雙螢光素酶作為報告基因的優(yōu)點在于，能同時高效表達分泌型的Gluc (Gaussia Luciferase)和非分泌型的Fluc (firefly luciferase)。在體外研究中，利用Gluc高效分泌到細胞外的特性，可以在不裂解細胞的情況下直接在細胞培養(yǎng)上清中靈敏地檢測其表達，便于對同一孔細胞進行連續(xù)監(jiān)測；在體內(nèi)研究中，可以通過檢測血液中Gluc活性來實時監(jiān)測其體內(nèi)表達情況。Fluc則能用于活體成像中準確定位基因表達部位。之所以選擇CAG而不是CMV啟動子，是因為我們在以前研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AAV載體用CMV啟動子時在肝臟表達很低或檢測不到表達。這種現(xiàn)象可能是由于CMV啟動子的甲基
化所致[83’84]。本研究證明用Gluc作為報告基因來檢測AAV8載體介導的體內(nèi)表達水平和持續(xù)時間是一個簡單、可靠的好方法。由于每次檢測需要的血量很少(2. 5uL全血)，而且也不需要去除樣品中的血細胞，因此可以在很密集的時間點采集數(shù)據(jù)而不需要殺死動物。本研究以Gluc-2A-Fluc為報告基因，CAG為啟動子，制備了高滴度的重組病毒rAAV8-CAG-Gluc-2A-Fluc，使用這種重組病毒對Balb/c和C57BL/6小鼠采用尾靜脈注射和肌肉注射進行了動物活體成像研究，結果顯示，兩種小鼠均能有效感染rAAV8-CAG-Gluc-2A-Fluc?；铙w成像檢測Fluc表達觀察體內(nèi)分布，rAAV8病毒載體小鼠尾靜脈注射主要在肝臟表達分布，但其它部位尤其是肌肉也有較弱的顯影，肌肉注射則主要在肌肉部位表達，但肝臟也有較弱的顯影。提示我們在應用時可以利用AAV8靜脈注射時的肝嗜性，同時也要注意其對其它臟器的轉染帶來的影響。rAAV8病毒載體尾靜脈注射小鼠，注射后3 4d即可在外周血中檢測到Gluc表達，并且表達時間持久。尾靜脈微量采血 (2. 5uL/次)可以靈敏監(jiān)測Gluc表達。Gluc表達的RLU值存在病毒劑量正相關性。名詞解釋l、pAAV2neo質粒是一種攜帶了 AAV2病毒ITR的質粒DNA。所述的AAV載體質粒一般由AAV2 ITR、啟動子、目的基因或阻斷序列、ployA、AAV2 ITR以及Ε. coli質粒骨架組成。質粒骨架上攜帶了 neo基因的表達單位。2、ITR :inverted terminal r印eat，倒轉末端重復，是AAV病毒基因組的反向末端重復序列。翻譯習慣上，inverted翻譯成倒轉或反向都可以。3、Dl和D2 :AAV2病毒ITR中的部分序列。4, CMV promoter 人巨細胞病毒的啟動子。5、CAG promoter 由雞β -actin啟動子序列和人巨細胞病毒的早期增強子序列組成的啟動子。6, BGH polyA 牛生長激素基因的加尾信號序列。7、SV40 late Poly(A)Signal :SV40病毒晚期蛋白表達的加尾信號序列。8、Neo 新霉素抗性基因。9、ampR:氨芐青霉素抗性基因。10、AAV 病毒adeno-associated virus,腺病毒相關病毒。IUMCS 多克隆位點，用于編碼蛋白基因的插入。12, EGFP 為增強型綠色熒光蛋白基因，常用報告基因。13, Gluc 為Gaussia螢光素酶基因，為常用報告基因。14、HBV1.3 :1.3個拷貝的冊￥01印3衍衍8 B virus，人乙型肝炎病毒，簡稱為“乙
肝病毒”)全長基因組。15、rAAV8-HBVl. 3 含有HBV(h印atitis B virus，人乙型肝炎病毒，簡稱為“乙肝病毒”)的1. 3個拷貝的全長基因組的外殼為AAV8的重組病毒載體。16、HBV cccDNA 乙肝病毒共價閉合環(huán)狀DNA，是乙肝病毒前基因組RNA復制的原始合成模板，是乙肝病毒持續(xù)感染的關鍵因素。17、dpi 注射后第天。18、RLU值相對光單位。
權利要求
1.本發(fā)明所述的rAAV8-HBVl.3病毒用于建立HBV小鼠模型技術，其技術特征是將攜帶了多拷貝HBV基因組DNA的重組AAV病毒用于制作小鼠模型。
2.依據(jù)權利要求1，該重組AAV病毒為血清型為8型的AAV8重組AAV病毒，它具有相對專一感染小鼠肝臟組織細胞的能力。
3.依據(jù)權利要求1，該重組AAV病毒為具有相對專一感染小鼠肝臟組織細胞能力的其它嵌合型的AAV病毒。
4.依據(jù)權利要求1，HBV基因組DNA的拷貝數(shù)為大于1的多拷貝。
5.依據(jù)權利要求1，HBV基因組DNA的拷貝數(shù)為1.3個拷貝。
6.依據(jù)權利要求1，所述的建立的HBV小鼠模型為慢性乙型肝炎模型。
7.依據(jù)權利要求1，所述的建立的HBV小鼠模型為持續(xù)HBV病毒復制、攜帶模型。
8.依據(jù)權利要求1，所述的rAAV8-HBV1.3病毒是通過小鼠尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)而感染了小鼠的肝臟組織細胞從而造成了 HBV小鼠模型。
9.依據(jù)權利要求1，該重組AAV病毒所包裝的HBV的亞型為ayw、adw、adr、ayr亞型。
全文摘要
一種rAAV8－HBV1.3病毒用于建立HBV小鼠模型。本發(fā)明將攜帶了多拷貝HBV基因組DNA的重組AAV病毒用于制作小鼠慢性乙型肝炎模型。所使用的HBV小鼠模型動物為免疫系統(tǒng)正常的C57BL/6小鼠和/或Balb/c小鼠。將重組AAV病毒通過小鼠尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，重組AAV病毒可感染小鼠的肝臟組織細胞，重組AAV病毒所攜帶的HBV基因組DNA自主復制產(chǎn)生子代HBV，后者與機體免疫系統(tǒng)共同作用造成了小鼠慢性乙型肝炎模型。重組AAV病毒所包裝的HBV的亞型為ayw亞型或adw、adr、ayr亞型。
文檔編號C12N15/51GK102311974SQ20101021679
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月5日 優(yōu)先權日2010年7月5日
發(fā)明者吳小兵, 董哲岳, 董小巖, 譚文杰 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所, 北京五加和分子醫(yī)學研究所有限公司