專利名稱：：海藻糖合成酶及其編碼基因與它們的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種海藻糖合成酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：海藻糖由兩個(gè)吡喃環(huán)葡萄糖以1，1-糖苷鍵連結(jié)而成，是一種非還原性二糖。海藻糖有3種光學(xué)異構(gòu)體，其中ae和Pe型在自然界中很少存在，aa型是最常見(jiàn)的海藻糖，aa型海藻糖結(jié)構(gòu)式如式I所示。海藻糖無(wú)色無(wú)嗅，口感略帶甜味，其甜度相當(dāng)于蔗糖的45%。海藻糖的理化性質(zhì)穩(wěn)定，不會(huì)焦糖化，不能使斐林試劑還原，也不能被a-糖苷酶水解，但能被海藻糖酶水解為兩個(gè)葡萄糖分子。海藻糖的制備方法傳統(tǒng)方法有化學(xué)合成法和微生物抽提法，特別是酵母提取法曾經(jīng)是海藻糖的主要商品生產(chǎn)方式。但這些方法產(chǎn)品收率低，制造成本過(guò)高，價(jià)格昂貴，近年來(lái)已經(jīng)逐步被淘汰。海藻糖的生物合成途徑有5種，磷酸化酶法利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)海藻糖，有關(guān)研究在國(guó)內(nèi)外也頗為活躍。荷蘭植物生物技術(shù)公司將編碼大腸桿菌的6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷酸海藻糖酯酶的基因OtsA和OtsB導(dǎo)入甜菜、馬鈴薯基因組中，然后從塊莖中提取海藻糖。其缺點(diǎn)是目前塊莖中海藻糖的含量還不夠高。酶轉(zhuǎn)化法是制備海藻糖的新方法。1990年意大利MDeRosa小組首先發(fā)現(xiàn)了能夠?qū)⒌矸鬯馕镛D(zhuǎn)化為海藻糖的酶，但未申請(qǐng)專利。1994年日本林原生化研究所發(fā)明了用兩種酶，即麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖基海藻糖水解酶(MTHase)，協(xié)同作用，由淀粉直接酶法生產(chǎn)海藻糖。配合其它淀粉水解酶，海藻糖轉(zhuǎn)化率可達(dá)70%。1995年林慮公司實(shí)現(xiàn)了雙酶轉(zhuǎn)化法的工業(yè)化生產(chǎn)，是當(dāng)時(shí)海藻糖生產(chǎn)方法中成本最低的途徑。酶轉(zhuǎn)化法分為兩種雙酶法和單酶法。單酶法是由TreS基因編碼的海藻糖合成酶通過(guò)分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基作用，可把海藻糖轉(zhuǎn)化為麥芽糖TreS麥芽糖^-海藻糖雙酶法首先由MTSase作用于麥芽糊精末端，催化分子內(nèi)的轉(zhuǎn)糖基化，形成麥芽寡糖基海藻糖。然后在MTHase作用下斷裂麥芽寡糖和海藻糖間的a-l，4-糖苷鍵，釋放出海藻糖。編碼麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶的基因分別是TreY和TreZ。TreYTreZ麥芽糊精-麥芽寡糖基海藻糖-海藻糖這兩種酶系在自然界的微生物中廣泛存在，至少有15個(gè)菌屬含有上述單酶或雙酶系，但主要存在于古細(xì)菌、極端環(huán)境微生物中，或是在極端環(huán)境下誘導(dǎo)生成。關(guān)于海藻糖生成和代謝機(jī)制的研究一直是極端微生物(Extremophiles)研究的熱點(diǎn)課題，在Nature,Science等頂級(jí)雜志上常有相關(guān)論文，也有大量研究課題，如近年的歐盟課題QLKl-CT-2000-01376;POCTI/BIO/48333/2002.有大量關(guān)于海藻糖合成酶系的基因工程表達(dá)研究，但海藻糖合成酶基因的編碼特征特殊，在異源生物中不易表達(dá)，或表達(dá)量偏低，因此雖然有大量論文發(fā)表，但很少有依據(jù)基因工程表達(dá)申報(bào)的專利公開(kāi)，據(jù)此推測(cè)相關(guān)技術(shù)尚待研究開(kāi)發(fā)。經(jīng)過(guò)聯(lián)網(wǎng)檢索，關(guān)于海藻糖的酶法轉(zhuǎn)化共檢索到23個(gè)專利。其中林原生化研究所的國(guó)際專利01100417.7是日本生產(chǎn)海藻糖的主要方法。南寧中諾生物工程有限責(zé)任公司申請(qǐng)的中國(guó)專利200410013006.9公開(kāi)的一種海藻糖合成酶，在40L發(fā)酵罐水平上表達(dá)，以27.27%的麥芽糖為底物，轉(zhuǎn)化時(shí)間32h，轉(zhuǎn)化率70%。是目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)海藻糖的主要方法。中國(guó)專利200410013007.3、200410013008.8結(jié)果類似。工業(yè)化生產(chǎn)1995年日本林原Hayashibara公司首先實(shí)現(xiàn)了雙酶法規(guī)?；a(chǎn)海藻糖，大幅降低了生產(chǎn)成本和產(chǎn)品價(jià)格。目前海藻糖生產(chǎn)生產(chǎn)企業(yè)主要有日本林原研究所、美國(guó)Cargill公司、廣西南寧中諾公司。其中廣西南寧中諾公司通過(guò)選用木薯淀粉做原料，優(yōu)化轉(zhuǎn)化工藝，己經(jīng)將海藻糖的價(jià)格降低到25000元/噸。長(zhǎng)期以來(lái)制約海藻糖廣泛應(yīng)用的根本原因是生產(chǎn)成本偏高。由于海藻糖和麥芽糖一樣，都由淀粉二步轉(zhuǎn)化生成麥芽糖由淀粉酶和糖化酶轉(zhuǎn)化，海藻糖由麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶轉(zhuǎn)化，因此一旦海藻糖生產(chǎn)酶的產(chǎn)量、生產(chǎn)成本和效率能夠和麥芽糖生產(chǎn)酶的一樣，海藻糖的價(jià)格就可以和麥芽糖一樣，其的產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)力和市場(chǎng)份額將非常巨大。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種海藻糖合成酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的海藻糖合成酶，來(lái)源于金黃節(jié)桿菌"W/^o^c^c^Mce似)名稱為AA-TreS;是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與海藻糖合成酶相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列1由598個(gè)氨基酸殘基組成。所述一個(gè)或數(shù)幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。為了使(a)中的AA-TreS便于純化，可在由序列表中序列l(wèi)所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表l所示的標(biāo)簽。表l標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(b)中的AA-TreS可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的AA-TreS的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。所述海藻糖合成酶(AA-TreS)的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述海藻糖合成酶(AA-TreS)的編碼基因?yàn)槿缦耹)或2)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述海藻糖合成酶的DNA分子；序列表中的序列2由1797個(gè)核苷酸組成。所述嚴(yán)格條件可為在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。含有所述海藻糖合成酶編碼基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述轉(zhuǎn)基因重組菌具體可為含有所述海藻糖合成酶編碼基因的重組大腸桿菌，如含有上述基因的大腸埃希氏菌(^foc/zen'c/n'aco/Z)BL21(DE3)PlysS。所述重組大腸桿菌優(yōu)選為大腸埃希氏菌(^foc/^n'c/^co/z')PlysSaaN-TreS-30a，產(chǎn)生重組海藻糖合成酶。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)海藻糖合成酶的方法。本發(fā)明所提供的表達(dá)海藻糖合成酶的方法，是培養(yǎng)上述含有海藻糖合成酶AA-TreS編碼基因的轉(zhuǎn)基因重組菌，得到海藻糖合成酶。海藻糖合成酶AA-TreS的分子量為68kDa，酶活性的pH范圍為4.58.5，最適pH為6.5;酶活性的溫度范圍為2045。C，最適反應(yīng)溫度為35'C。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種制備海藻糖的方法。本發(fā)明所提供的制備海藻糖的方法，是以麥芽糖為底物，用海藻糖合成酶AA-TreS進(jìn)行催化，得到海藻糖。所述方法中，反應(yīng)溫度可為2045°C，反應(yīng)液的pH可為4.58.5;所述反應(yīng)溫度優(yōu)選為204(TC，尤其優(yōu)選為35。C，所述反應(yīng)液的pH優(yōu)選為5.08.0，尤其優(yōu)選為6.5。所述方法中，反應(yīng)時(shí)間可為410小時(shí)，尤其優(yōu)選為8小時(shí)。本發(fā)明制備海藻糖的方法，海藻糖合成酶催化時(shí)間短、所需底物濃度低，以90mM麥芽糖為底物，催化8小時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)69%。圖1為大腸埃希氏菌(Aco//)PlysSaaN-TreS-30a的PCR鑒定結(jié)果圖圖2為大腸埃希氏菌(￡.co//)PlysSaaN-TreS-30a表達(dá)的本發(fā)明的海藻糖合成酶的SDS-PAGE圖圖3為本發(fā)明的海藻糖合成酶最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果圖圖4為本發(fā)明的海藻糖合成酶最適反應(yīng)溫度檢測(cè)和熱穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果圖圖5為本發(fā)明的海藻糖合成酶隨催化時(shí)間轉(zhuǎn)化率變化測(cè)定結(jié)果圖圖6為本發(fā)明的海藻糖合成酶催化反應(yīng)產(chǎn)物監(jiān)測(cè)TLC分析圖圖7為本發(fā)明海藻糖合成酶制備海藻糖轉(zhuǎn)化效率檢測(cè)結(jié)果圖具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例的主要試劑限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；PfliDNA聚合酶購(gòu)自天為時(shí)代公司；X-Gal購(gòu)自Promega公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海申能博彩公司；Ni-NTAHis'BindResins購(gòu)自德國(guó)Novagen公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000購(gòu)自天根生化科技有限公司；麥芽糖及海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；薄層色譜(TLC)預(yù)制板購(gòu)自Merck公司；糊精購(gòu)自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口分析純?cè)噭?。?shí)施例l、海藻糖合成酶的獲得及其效果驗(yàn)證一、海藻糖合成酶編碼基因的獲得1、金黃節(jié)桿菌C4w/^okcterflw^cwcesATCC13344)基因組DNA的提取將活化的金黃節(jié)桿菌G4w/zTO6fl"erflwmscewc"ATCC13344)(購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)轉(zhuǎn)接至營(yíng)養(yǎng)肉汁液體培養(yǎng)基(含有蛋白胨10g/L，牛肉提取物3g/L，氯化鈉5g/L，pH7.0的培養(yǎng)基)中，30。C搖床210rpm培養(yǎng)24h。取100mL培養(yǎng)液離心收集菌體，力Q9.5mlTE(10mmol/LTris-HCl,lmmol/LEDTA,pH8.0)懸浮沉淀，并加0.5ml10%(質(zhì)量含量)SDS,50u120mg/ml蛋白酶K，混勻，37°C6保溫1小時(shí)；力[]1.5ml5mol/LNaCI，混勻；再加1.5ml10%(質(zhì)量含量)CTAB溶液(用0.7mol/LNaCl溶液配制)，混勻，65"C保溫20分鐘；用等體積酚、氯仿和異戊醇的混合液(酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:l)抽提，5000rpm離心10分鐘,將上清液移至干凈離心管；用等體積氯仿和異戊醇的混合液(氯仿和異戊醇的體積比為24:l)抽提，上清液加1倍體積異丙醇，沉淀DNA;5000rpm離心10min，去上清，70%乙醇漂洗，吸干，溶解于1mLTE或ddH20，一20。C保存。2、PCR擴(kuò)增海藻糖合成酶編碼基因以步驟1提取的金黃節(jié)桿菌CGMCC1.1892的基因組DNA為模板，用引物AaTreSF禾PAaTreSR為進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，上游引物AaTreSF:5，-AGATCTGAGTTTTTCTCCGCAGAACC國(guó)3，(下劃線部分示BglII識(shí)別位點(diǎn))，下游引物AaTreSR:5，-CTCGAGTCATCCTTTGAGGTCAC-3，(下劃線部分示XhoI識(shí)別位點(diǎn))。PCR條件為94。C預(yù)變性4min;然后94。C30sec，50。C30sec，72°C2min，30個(gè)循環(huán)后72"C延伸5min。將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果表明得到的PCR產(chǎn)物大小約為1800bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加A后用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，與pGEM-TVector(購(gòu)自Promega公司)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10(購(gòu)自Invitrogen)，挑取陽(yáng)性克隆。進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列2的DNA序列(X4-7>")，編碼序列表中序列1的海藻糖合成酶AA-TreS。將含有序列表中序列2的DNA序列的重組載體命名為pGEM-AA-TreS。二、海藻糖合成酶AA-TreS的表達(dá)1、制備表達(dá)海藻糖合成酶AA-TreS的重組菌分別用BglII和XhoI雙酶切pGEM-AA-TreS，回收1800bp的^4-7>eS片段，pET-30a(+)，將v4v4-7>"片段插入到pET-30a(+)BglII和XhoI酶切位點(diǎn)之間得到重組載體，將該重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌T叩IO，挑取陽(yáng)性克隆，進(jìn)行PCR測(cè)序鑒定和酶切鑒定，得到含有具有序列表中序列2的DNA序列的AA-TreS片段的重組載體pET-AA-TreS。提取pET-AA-TreS，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)pLysS(購(gòu)自Invitrogen)，步驟如下1)冰上融化-70。C保存的宿主菌BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞。2)加入pET-AA-TreS質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴放置30min。3)將離心管放入預(yù)加溫至42t:的水浴中，靜止放置90s。4)快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻l2min。5)加400nLLB培養(yǎng)基于轉(zhuǎn)化細(xì)胞中。76)37'C輕柔振蕩4560min，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗性標(biāo)記基因。7)將200己轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有卡那霉素(50]Lig/mL)的LB平板上，用無(wú)菌涂布棒輕輕的將菌液涂布均勻。8)將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37'C培養(yǎng)1216h。通過(guò)PCR、測(cè)序鑒定和酶切鑒定，得到含有重組載體pET-AA-TreS的重組菌，將其命名為大腸埃希氏菌(五.co//)PlysSaaN-TreS-30a。其中，大腸埃希氏菌(￡.co/0PlysSaaN-TreS-30a的PCR鑒定結(jié)果如圖1所示，表明得到大小約為1800bp的產(chǎn)物。圖1中，泳道1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，泳道2為PCR產(chǎn)物。按照上述的方法將pET-30a(+)轉(zhuǎn)入BL21(DE3)pLysS得到重組菌BL21(DE3)pLysS-30a作為對(duì)照。2、重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)與海藻酸合成酶的純化挑取大腸埃希氏菌(Eco//)PlysSaaN-TreS-30a單菌落接種到含卡那霉素50wg/mL和氯霉素34ug/mL的LB液體培養(yǎng)基，在37。C振蕩12小時(shí)。按照1%(體積比)的接種量轉(zhuǎn)接至30mL上述含卡那霉素50ug/mL和氯霉素34pg/mL的LB液體培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)，加IPTG至終濃度0.4mmol/L，25°C誘導(dǎo)培養(yǎng)6h后，離心收集菌體。用100mmol/LpH7.5的磷酸緩沖液重懸菌體，超聲破碎(功率300W,工作時(shí)間2秒，間歇時(shí)間8秒，總時(shí)間2.0分鐘)，4°C12000rpm離心lmin后，取上清液。上清液采用Ni-NTAHis'BindResins(購(gòu)自Novagen)純化，回收得到純化的海藻糖合成酶AA-TreS酶液，取純化的樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。以BL21(DE3)pLysS-30a全蛋白作為對(duì)照，BL21(DE3)pLysS-30a的細(xì)胞破碎全蛋白的獲得方法為挑取大腸埃希氏菌(￡.co//)PlysSaaN-TreS-30a單菌落接種到含卡那霉素50ug/mL和氯霉素34ug/mL的LB液體培養(yǎng)基，在37"C振蕩12小時(shí)。按照1%(體積比)的接種量轉(zhuǎn)接至30mL上述含卡那霉素50ng/mL和氯霉素34wg/mL的LB液體培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)，加IPTG至終濃度0.4mmol/L，25。C誘導(dǎo)培養(yǎng)6h后，離心收集菌體。用100mmol/LpH7.5的磷酸緩沖液重懸菌體，超聲破碎(功率300W,工作時(shí)間2秒，間歇時(shí)間8秒，總時(shí)間2.0分鐘)，4°C12000rpm離心lmin后，取上清液。結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明在68kDa處出現(xiàn)了較明顯的單一條帶，與理論'分子量基本符合(圖2)。圖2中，泳道1為低分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為Ni-NTAHis.BindResins(Novagen)純化后的重組海藻酸合成酶，泳道3為純化前PlysSaaN-TreS-30a細(xì)胞破碎上清液蛋白，泳道4為BL21(DE3)pLysS-30a的細(xì)胞破碎全蛋白。對(duì)上述發(fā)酵得到的海藻糖合成酶AA-TreS進(jìn)行酶活力測(cè)定，具體方法如下所述取lOO^iL純化的海藻糖合成酶AA-TreS酶液，用100mmol/LpH6.5的磷酸緩沖液稀釋至500pL，加麥芽糖至終濃度為90mM，35。C反應(yīng)20min,100。C煮沸5min終止反應(yīng)，12000rpm離心5min，取上清，稀釋1000倍用離子色譜法檢測(cè)產(chǎn)物中海藻糖的含量。離子色譜為DIONEX2500(戴安(DIONEX)公司)，柱子CarboPacPA-2(戴安(DIONEX)公司)，流動(dòng)相體積比為70:30的100nmol/LNaOH和500nmol/LNaAC，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10^L。根據(jù)標(biāo)樣及待測(cè)樣品的峰面積計(jì)算出待測(cè)樣品中海藻糖的含量。酶活力單位的定義在35"C，pH6.5條件下，l分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化lumol麥芽糖成為海藻糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。同時(shí)以相同條件培養(yǎng)BL21(DE3)pLysS-30a作為對(duì)照，結(jié)果表明BL21(DE3)pLysS-30a的菌體破碎上清液無(wú)海藻糖合成酶活性。酶活力測(cè)定結(jié)果表明酶比活力為1.525U/mg。3、大腸埃希氏菌(Aco/OPlysSaaN-TreS-30a表達(dá)的海藻糖合成酶的性質(zhì)分析1)海藻糖合成酶AA-TreS最適pH的測(cè)定分別配制pH4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0的100mmol/LKH2P04-K2HP04緩沖液。分別取100ul步驟2純化的海藻糖合成酶AA-TreS酶液，分別用100mmol/L上述pH值的磷酸緩沖液稀釋至500nl，按照步驟2的測(cè)定方法測(cè)定酶活力，35"C振蕩反應(yīng)30min，沸水浴5min終止反應(yīng)。用步驟2所述離子色譜法檢測(cè)產(chǎn)物中海藻糖的含量。根據(jù)1^樣及待測(cè)樣品的峰面積計(jì)算出待測(cè)樣品中海藻糖的含量，計(jì)算公式如下樣品濃度Hf品峰面積+標(biāo)樣峰面積X標(biāo)樣濃度X進(jìn)樣稀釋倍數(shù)；轉(zhuǎn)化率=產(chǎn)物海藻糖含量+底物麥芽糖含量xiooy。。以轉(zhuǎn)化率最高的條件的相對(duì)酶活力為100%，其余條件的相對(duì)酶活力為其轉(zhuǎn)化率與最高轉(zhuǎn)化率的比值，即得到pH對(duì)海藻糖合成酶AA-TreS酶活力的影響曲線。分別取lml步驟2純化的海藻糖合成酶液，分別用100mmol/L上述pH值的磷酸緩沖液稀釋至5ml，35'C溫育20min后，用氫氧化鉀或磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值到6.5，按照步驟2的測(cè)定方法測(cè)定剩余的酶活力，35'C振蕩反應(yīng)30min，沸水浴5min終止反應(yīng)。用步驟2所述離子色譜法檢測(cè)產(chǎn)物中海藻糖的含量。根據(jù)標(biāo)樣及待測(cè)樣品的峰面積計(jì)算出待測(cè)樣品中海藻糖的含量，計(jì)算公式如下樣品濃度=樣品峰面積+標(biāo)樣峰面積X標(biāo)樣濃度X進(jìn)樣稀釋倍數(shù)；轉(zhuǎn)化率=產(chǎn)物海藻糖含量+底物麥芽糖含量X100M。以轉(zhuǎn)化率最高的條件的相對(duì)酶活力為100%，其余條件的相對(duì)酶活力為其轉(zhuǎn)化率與最高轉(zhuǎn)化率的比值，即得到海藻糖合成酶AA-TreS的pH穩(wěn)定性的曲線。9結(jié)果如圖3所示，"畫"是pH對(duì)海藻糖合成酶AA-TreS酶活力的影響曲線，"▲"是海藻糖合成酶AA-TreS的pH穩(wěn)定性的曲線。結(jié)果表明，海藻糖合成酶AA-TreS酶活性的pH范圍為4.58.5，特別是在pH6.5，海藻糖合成酶AA-TreS對(duì)底物有60%左右的轉(zhuǎn)化率，說(shuō)明海藻糖合成酶AA-TreS在中性及偏酸條件下具有較高的活性，最適pH為6.5。pH穩(wěn)定性的曲線結(jié)果表明，海藻糖合成酶AA-TreS在pH5.57.5范圍內(nèi)酶活力保持高度穩(wěn)定。2)海藻糖合成酶AA-TreS最適溫度的測(cè)定溫度對(duì)重組酶合成酶活的影響主要表現(xiàn)在兩方面一方面當(dāng)溫度升高時(shí)，反應(yīng)速度加快；另一方面隨著溫度的升高，由于酶是蛋白質(zhì)，酶逐漸變性而失活，從而引起酶反應(yīng)速度的下降。酶反應(yīng)所表現(xiàn)的最適溫度是這兩種因素綜合影響的結(jié)果。根據(jù)反應(yīng)的時(shí)間，可合理的選擇反應(yīng)的溫度。氨基酸序列分析顯示，海藻糖合成酶基因中含有a-淀粉酶的多個(gè)保守序列，較高的溫度可能導(dǎo)致a-淀粉酶活力升高，把部分底物水解為葡萄糖，從而降低了海藻糖的轉(zhuǎn)化率。分別取100u1步驟2純化的海藻糖合成酶AA-TreS酶液，按照步驟2的方法，分別在20°C，25°C，30°C，35°C，40°C，50°C，6(TC振蕩反應(yīng)30min，沸水浴5min終止反應(yīng)。用離子色譜法檢測(cè)產(chǎn)物中海藻糖的含量。根據(jù)標(biāo)樣及待測(cè)樣品的峰面積計(jì)算出待測(cè)樣品中海藻糖的含量，計(jì)算公式如下樣品濃度=樣品峰面積+標(biāo)樣峰面積X標(biāo)樣濃度X進(jìn)樣稀釋倍數(shù)；轉(zhuǎn)化率=產(chǎn)物海藻糖含量+底物麥芽糖含量X100%。以轉(zhuǎn)化率最高的條件的相對(duì)酶活力為100%，其余條件的相對(duì)酶活力為其轉(zhuǎn)化率與最高轉(zhuǎn)化率的比值，即獲得溫度對(duì)海藻糖合成酶AA-TreS酶活力的影響曲線。分別取100lU步驟2純化的海藻糖合成酶AA-TreS酶液，分別在20°C，25°C,3(TC，35°C，40°C，50°C，60。C條件下溫育20min，然后立即調(diào)節(jié)溫度至35°C，按照步驟2的方法，振蕩反應(yīng)30min，沸水浴5min終止反應(yīng)。用離子色譜法檢測(cè)產(chǎn)物中海藻糖的含量。根據(jù)標(biāo)樣及待測(cè)樣品的峰面積計(jì)算出待測(cè)樣品中海藻糖的含量，計(jì)算公式如下樣品濃度Hf品峰面積+標(biāo)樣峰面積X標(biāo)樣濃度X進(jìn)樣稀釋倍數(shù)；轉(zhuǎn)化率-產(chǎn)物海藻糖含量+底物麥芽糖含量X100%。以轉(zhuǎn)化率最高的條件的相對(duì)酶活力為100%，其余條件的相對(duì)酶活力為其轉(zhuǎn)化率與最高轉(zhuǎn)化率的比值，即獲得海藻糖合成酶AA-TreS的溫度穩(wěn)定性的曲線。結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明海藻糖合成酶AA-TreS酶活性的溫度范圍為2045°C，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，酶活力迅速下降，最適反應(yīng)溫度為35°C(圖4)。溫度穩(wěn)定性曲線結(jié)果表明，海藻糖合成酶AA-TreS在204(TC溫度范圍內(nèi)酶活力保持高度穩(wěn)定。圖4中，"■"是溫度對(duì)海藻糖合成酶AA-TreS酶活力的影響曲線，"▲"是海藻糖合成酶AA-TreS的溫度穩(wěn)定性的曲線。103)金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響分別配制100mM的CuS。4、MgCl2、CaCl2、MnCl2、Tris、SDS、EDTA溶液。分別取lOOul步驟2純化的海藻糖合成酶AA-TreS酶液，按照步驟2的方法，再加入上述溶液至終濃度1mM或5mM，35°C，pH6.5振蕩反應(yīng)30min，沸水浴5min終止反應(yīng)。以僅含酶液和麥芽糖溶液的混合液作為對(duì)照組。用上述離子色譜法檢測(cè)產(chǎn)物中海藻糖的含量。根據(jù)標(biāo)樣及待測(cè)樣品的峰面積計(jì)算出待測(cè)樣品中海藻糖的含量，計(jì)算公式如下樣品濃度Hf品峰面積+標(biāo)樣峰面積X標(biāo)樣濃度X進(jìn)樣稀釋倍數(shù)；轉(zhuǎn)化率=產(chǎn)物海藻糖含量+底物麥芽糖含量乂100%。不同離子濃度下測(cè)定的轉(zhuǎn)化率除以對(duì)照組的轉(zhuǎn)化率即為相對(duì)轉(zhuǎn)化率。結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明，1mM的Ci^+和SDS對(duì)酶有強(qiáng)烈抑制，當(dāng)濃度增大到5mM時(shí)，上述試劑對(duì)酶都有抑制作用。表-2.金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)海藻糖合成酶AA-TreS酶活力的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>4)海藻糖合成酶AA-TreS隨催化時(shí)間轉(zhuǎn)化率變化測(cè)定分別取100n1步驟2純化的海藻糖合成酶AA-TreS酶液，按照步驟2的方法，35。C振蕩反應(yīng)，分另lJ在Oh，0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，10h取樣，沸7乂浴5min終止反應(yīng)。用上述離子色譜法檢測(cè)產(chǎn)物中海藻糖的含量。以10h時(shí)的轉(zhuǎn)化率(轉(zhuǎn)化率=(產(chǎn)物海藻糖含量+底物麥芽糖含量)X100%)為100%基準(zhǔn)，其他值與其相比得出相對(duì)轉(zhuǎn)化率。結(jié)果如圖5所示，可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化率逐漸提高，在O-lh轉(zhuǎn)化率呈線性快速增長(zhǎng)，隨后開(kāi)始減緩，在8h以后反應(yīng)趨于平衡。5)重組酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的TLC分析將步驟2純化的海藻糖合成酶AA-TreS酶液與麥芽糖溶液(麥芽糖終質(zhì)量百分離心10min去除不溶物，取上清，用超純水稀釋10倍后點(diǎn)樣，上樣量liU，進(jìn)行薄層色譜檢測(cè)。薄層色譜(TLC)預(yù)制板購(gòu)自Merck公司，展層劑(正丁醇吡啶水=4:5:1)，顯色劑(98%硫酸甲醇-l:4)，105。C顯色8min。以BL21(DE3)pLysS(pET-30a)的胞質(zhì)上清液為對(duì)照，結(jié)果如圖6所示，泳道l是海藻糖合成酶AA-TreS酶液與麥芽糖的反應(yīng)產(chǎn)物；泳道2是(BL21(DE3)pLysS(pET-30a)的胞質(zhì)上清液與麥芽糖反應(yīng)產(chǎn)物；泳道3和4分別是麥芽糖和海藻糖的標(biāo)樣；結(jié)果表明該海藻糖合成酶AA-TreS能將底物麥芽糖轉(zhuǎn)化成海藻糖，而對(duì)照組(BL21(DE3)pLysS(pET-30a)的胞質(zhì)上清液)沒(méi)有生成海藻糖的能力。實(shí)施例2、大腸埃希氏菌(￡.co//)PlysSaaN-TreS-30a表達(dá)的海藻糖合成酶制備海藻糖取0.5ml實(shí)施例1中步驟二的步驟2純化的海藻糖合成酶AA-TreS酶液，用100mmol/LpH6.5的磷酸緩沖液稀釋至50(HiL，加入麥芽糖至終濃度為90mM，35°C振蕩反應(yīng)8h，沸水浴5min終止反應(yīng)。用離子色譜測(cè)定樣品中海藻糖的含量。離子色譜的測(cè)定方法如下離心收集反應(yīng)液上清液，用100mmol/LpH7.0的磷酸緩沖液稀釋1000倍進(jìn)樣。離子色譜為DIONEX2500，柱子CarboPacPA-IOO，流動(dòng)相體積比為70:30的100nmol/LNaOH和500nmol/LNaAC，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10uL。已知標(biāo)樣濃度，根據(jù)標(biāo)樣及待測(cè)樣品的峰面積計(jì)算出待測(cè)樣品中海藻糖的含量，計(jì)算公式為樣品濃度=(樣品峰面積+標(biāo)樣峰面積)x標(biāo)樣濃度x進(jìn)樣稀釋倍數(shù)。轉(zhuǎn)化率=(產(chǎn)物海藻糖含量+底物麥芽糖含量)X100%。結(jié)果如圖7所示，標(biāo)準(zhǔn)樣品中海藻糖的出峰時(shí)間是1.4min，葡萄糖的出峰時(shí)間是2.lmin，麥芽糖的出峰時(shí)間是4.6min。樣品圖中第一個(gè)峰是海藻糖(T)，第序列表<160〉2<210〉1<211〉598〈212>PRT<400〉1MetSerPheSerProGinAsnProSerGinTyrPheThrProLysAsn1ThrArgLysAsnTyr65Gin5PheGluLeuAsnAlaProGly20AlaValPheTyrGluVal3540AspGlySerGlyAs口PheLeu25LeuGly50LeuGlySerGlyGinTrpLeuSerProLeuValLeuAspGluAlaHisThr145TyrThr130GlyHis115SerGlu100AlaArg85PheGly70AspAsp55Val10GinHisAspProValArgAlaPhe45AspAspGlyArgGlyValThrlieAspProTyrGlyGinAspAlaGinHisAsp150liePro135PheArg120TrpSer105ValHis30Ala15TrpTyrAspAlaHisGlyCysLeuGlyGlyTyrAsp90AspliePheGinTyrValTrpliePheValArg165ThrPheAspProlieArgArgGinAsp170PhePheLeulie60TrpLeu75lieAlaPheLyslieAspGluSer140SerAsp155ThrGluLysLeuAspProProPheAspArgLeu125ArgTyrLeu110ProThr95ValPhe80SerAlaLeuAsnLysAspProThrAspGluGluSerLys160TrpAsn175TrpHisArgPhePheSer13180AspLeuAsnPheHisGinPro195ValValArgPhe185AsnProLysValTyrAsp210AspAlalieProGlu200LeuAspGinGlyAla225AsnLeuProAlaTrp215LeuPheGluGlu190lieGluAlaLeu205AspGlyPheArgThr245ProTyr230HisThrPheLeulie220GlyThrAsnAspSerAsnTyrProGlyArgVal260ProHisGluValValGluTyr275AlaPheHisPheAsp235GinAspLeuArgArg250lieAlaGluAlalie265GlyThrGluGluHisMet290AspPhe280lieMetProArgArg305GlulieProGinLysAlaLysLysPro295AlaProlielieGluThr310315AlaGinTrpGlyThrPheLeu300LeuGly325GluMetValProGluLeuThrLeu340AlaProAspProGlyArgTrpTyr355LeuAlaProLeuAla345MetArgAlaAsnArg370AsnAlaLeuLeuArg360AspAsnSerArglie385GlyAspGlulieLeu375SerLeuProGlylie365GluLeu390MetGlyAspAsnGlyMetGlyAspAsnlie405410ProMetGinTrpAsnProAspArgAsnCysGlu240MetVal255GinProAsn270AlaProGluCys285TyrTyrAlaLeuAsnArgLeuArgAsnThr330GluGluArgAlaSer380ProPheLeuThrPro320HisAsp335AlaMetLeu350GlylieArglieGluLeuSer395TrpLeuAspAspTyrTyr400ArgAsp415GlyPheAlaValArgThrProMetGinTrpAsnProAspArgAsnAla420425430SerSerAlaAspProGlyGinLeuTyrLeuProVallieGinSerLeu14435440445VslTyr450GlySer465HisProAsnTyrSerMetAlaAsnValGluAlaGluAlaAlaHisSer455460ThrArgGinlieLeuSerValArgLysAsn475480HislieGluAlaAspHisLeuLeuArgTrp470LeuValPheGly485AlaGluValValLeu500AlaGluThrlieArgGlyGlyPheTyrValArgGlyGluAsp515AlaProVal530ArgAspliePhe545HisLeuThrValAlaLysLeuLysGlyAsp535GinLeu520lieArgSerAlaPhe580ValValThrSerLysGly595Met565SerAsnProSerGlu505CysArg490LeuAsp495HisValGly550LeuGlySerHisSer585Ser570ProTyrThrGinAla590Arg575lieGluProAlaGlyAsn510PheAsnLeuSerGinHis525ProGluPheAlaGlyArgGlyLeu540ProPheProAlaValGlyAsp555PheTyrTrpLeuAsnGly560ValPro<210>2〈211〉1797〈212〉DNA<213>金黃節(jié)桿菌(^4rt/zTO6a"erawmscera)〈400>2atgagtttttctccgcagaaccccagccagtacttcactccgaagaacaccttcgagttg60aacgccccaggtctccagcatgatccgcactggtaccgcaaggcagtcttctatgaggta120ctggtgcgggcctttgcggatgccaacggggacggttccggcgacttccacggcttgatc180gacaaactggattatctccagtggctgggcgttgactgcctgtggctgccgccgttcttc240cagtccccgtttcggcaccagtgatcattgcgg犯ggacctaccaggacgattcgccggcaatccgaagggatggcttccaatctgccggcccggccgggggcactgaggtactacgcctgaaattcccag，tggtgcatgcgggccagagatcgagcggggatggiaacccatgcagttatcttccgggctgcgcactcatccggtgtgcgtacgttctgc'gttttcaggccggggcccacttgaccgtccaatcccttgcgcgatggtcagtgatttaccttccgttccacgggacccgcggatcatagttcttctgtcattgaggcgtgctgacgcCC3CgC3C3Ctgatcattgcaagcccccgatgcgggaccaagggggcac3cggccgaagaacataggtattgatcaatgctcggcatgggggaacccggatcatccagtccaggttcgcttcggtttggggggagttgccacctttcccatgcgcgatattgatgctgggcgtcgccttacggttacgacca^cggttgga_a_cc8caccttacggcgatttttgttgacgcaccgtttctctctacgaccattccttaccttcctgcagcgaggccaacatgccacatggaaggccgctgtgggggaccgcgtgccgcctcgacgccgggctgctgctgcgacaacatcccgtaatgcatctggtttacgctgcgctggcggcttccgctgccggcaacgcaccccgtgtttcggcggccagccacagctactcaggcgatcgcggactgtggccgaggtcggaccagcttctatgtgtaccgaggaatttcagtcaccgttgtgaggtttgttcgaaggaccttcgcacagccaccgcgccttccattcccattattgttcctgcgcaatgctcggctttggcgccgctccttgccggtggcttgatgggcttctccaaactac3gca_acccggcagacacattgaagcacgaagggggcggcaaaaccagcctttccttctattggcattcccgtgg3t3CgtC3gtcccacgcacgacccgtggttggagcgatacccaa_ctggacagcctgaccttctggctggaaggacggcacgg3tggtgg3atgaagtggttccccatcatagaccctgcgacca_tgacga_ggtacgcccctgctggst肌gcagtcctttaccgcgatgcgcgctgatcctggccaatgttcctgagcgtcggaccatga6ia_g3Cgccg3tggacattcccggcggtcggtgcgggtccgtgacctccaaactggacgagcggcgtccggccsggaatcatgatgagaaggttcgatcccgaactttgagccaggggatccaactgcgagctcgaattacggagtacttcgcccaggctggaacacgccggctgacgctgggacccgcggctcccgttcccctgtactaccgttcgaacagggccagctttgaggccgagtcgcaagaacggtggtgctcgaccatcctgggagtttgcgcgacaacggtctcagcatttaggatga300360420480540600660720780840■9601020108011401200126013201380144015001560162016801740179權(quán)利要求1、一種海藻糖合成酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQID№.1的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQID№.1氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有海藻糖合成酶相關(guān)功能的由SEQID№1衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述的海藻糖合成酶的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述海藻糖合成酶的編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDW2:2的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQIDW:l蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與1)或2)所述的DNA序列雜交的核苷酸序列。4、含有權(quán)利要求2或3所述的海藻糖合成酶編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因重組菌。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為將權(quán)利要求2或3所述的海藻糖合成酶編碼基因插入到大腸桿菌表達(dá)載體中得到的表達(dá)海藻糖合成酶的重組表達(dá)載體；所述大腸桿菌表達(dá)載體優(yōu)選為pET30a載體。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因重組菌，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因重組菌是將權(quán)利要求4或5所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中，篩選得到表達(dá)海藻糖合成酶的轉(zhuǎn)基因重組菌；所述大腸桿菌優(yōu)選為大腸桿菌BL21(DE3)pLysS。。7、權(quán)利要求2或3所述的海藻糖合成酶編碼基因在表達(dá)海藻糖合成酶中的應(yīng)用。8、權(quán)利要求1所述的海藻糖合成酶及其編碼基因在制備海藻糖中的應(yīng)用。9、一種表達(dá)海藻糖合成酶的方法，是培養(yǎng)權(quán)利要求4或6所述的轉(zhuǎn)基因重組菌得到海藻糖合成酶。10、一種制備海藻糖的方法，是以麥芽糖為底物，用權(quán)利要求1所述的海藻糖合成酶進(jìn)行催化反應(yīng)，得到海藻糖；所述反應(yīng)溫度優(yōu)選為2045'C，最優(yōu)選為2040°C，反應(yīng)液的pH優(yōu)選為4.58.5，最優(yōu)選為5.08.0，特別優(yōu)選為6.5;所述反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為410小時(shí)，最優(yōu)選為8小時(shí)。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種海藻糖合成酶及其編碼基因與應(yīng)用。該海藻糖合成酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQID№.1的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQID№.1氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有海藻糖合成酶相關(guān)功能的由SEQID№1衍生的蛋白質(zhì)。以麥芽糖為底物，用該海藻糖合成酶蛋白進(jìn)行催化，可得到海藻糖，并且該催化反應(yīng)具有催化時(shí)間短、所需底物濃度低，以90mM麥芽糖為底物，催化8小時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)69％的優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)C12N5/10GK101519652SQ200910007259公開(kāi)日2009年9月2日申請(qǐng)日期2009年2月17日優(yōu)先權(quán)日2009年1月22日發(fā)明者丁宏標(biāo),吳秀麗申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所