專利名稱：麩質(zhì)蛋白單克隆抗體的生產(chǎn)及其細(xì)胞株的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及麩朊蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其用途，屬于食品的生物檢測
技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
據(jù)FA0(1995)報(bào)告，90%以上的食品過敏是由蛋、奶、魚、甲殼類、花生、大豆、堅(jiān)果類及小麥8類常見的過敏食物引起。麩質(zhì)蛋白是谷物特別是小麥的主要過敏原，引起最常見的病癥是乳糜瀉——由于對(duì)麩質(zhì)(面筋)不能耐受所致的慢性小腸吸收不良綜合癥。癥狀有頑固的腹瀉、體重下降、貧血、乏力、手足抽搐等。麩朊是引起乳糜瀉的主要原因。麩質(zhì)蛋白主要存在于麥制品中，如面粉、餅干、飼料、含麥添加劑等，不過市場上有無麩小麥，專為乳糜瀉患者或其他特殊需要，當(dāng)以區(qū)分。 麩朊(gliadin)，也稱醇溶蛋白，不溶于水及無水乙醇，但溶于70X 80X乙醇。麩朊這類蛋白主要存在于植物種子中，如玉米醇溶蛋白、麥醇溶蛋白等，在成熟小麥種子中，醇溶蛋白約占貯藏蛋白總量的40%，是組成面筋的重要蛋白質(zhì)。分為四種亞型，a-，|3-， y-和"-醇溶蛋白，分別占醇溶蛋白總量的25%、30%、30%和15%。
檢測過敏原麥醇溶蛋白的方法有ELISA、放射過敏原吸附實(shí)驗(yàn)、對(duì)流免疫電泳法、組胺釋放試驗(yàn)等。ELISA檢測靈敏度高、特異性和重復(fù)性好，但分析時(shí)間較長、商品化程度低。放射過敏原吸附實(shí)驗(yàn)靈敏度高、準(zhǔn)確性好，但是對(duì)人體血清具有依賴性，而人IgE抗體占血清比重小，抗體特異性也不確定，且特異結(jié)合能力不同，因此難標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì)流免疫電泳法操作簡便、快速，但分辨力低、精確度不及ELISA。組胺釋放試驗(yàn)靈敏度和特異性較高，但靈敏度與食品是否新鮮十分相關(guān)，組胺測定必須在抽血后24h之內(nèi)完成，造成應(yīng)用的局限性。根據(jù)各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，綜合選擇ELISA檢測卵清蛋白。 目前，市面上已有醇溶蛋白檢測試劑盒，但大都是國外生產(chǎn)，價(jià)格高、運(yùn)輸周期長。我們研制的醇溶蛋白ELISA檢測試劑盒，以自制的雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗醇溶蛋白單克隆抗體包板，采用雙抗夾心法，可以定性或定量檢測醇溶蛋白。檢測靈敏度高、特異性好，價(jià)格低于國外，開創(chuàng)了國內(nèi)生產(chǎn)醇溶蛋白檢測試劑盒的先例。
發(fā)明的內(nèi)容 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一株麩朊蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的單克隆抗體。
本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供麩朊蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其
分泌的單克隆抗體在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域的用途。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案麩朊蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，保藏編號(hào)為CCTCC-C200944。 —種由雜交瘤細(xì)胞株CCTCC-C200944分泌的單克隆抗體。 麩朊蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株用于制備Gliadin單克隆抗體的用途。 —種由雜交瘤細(xì)胞株CCTCC- 分泌的單克隆抗體用于制備檢測Gliadin過敏原的試劑的用途。 麩朊蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2D8，于2009年6月17日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC-C200944，建議的分類命名為雜交瘤細(xì)胞。 我們采用上述雜交瘤細(xì)胞制備了麩朊蛋白單抗。該單抗，可用于通過Elisa和免疫印記的方法檢測樣品中的Gliadin過敏原的含量。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1)染色體穩(wěn)定，分泌IgG2a型抗體；2)分泌抗體效價(jià)高，直接培養(yǎng)上清可達(dá)到l : IO萬；3)小鼠腹水可達(dá)到lmg/mL;效價(jià)可達(dá)到1 : 100萬?？梢杂胮rotein G純化；4)分泌抗體可以用于Elisa和免疫印跡(westernblot)實(shí)驗(yàn)(1 : 1000)。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并非對(duì)本發(fā)明的限定，依照本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此，因此凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作為的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。


圖1為單克隆抗體染色體分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :制備雜交瘤細(xì)胞 材料和來源 抗原麩質(zhì)蛋白(gliadin， Sigma) 動(dòng)物6-8周齡ABLB/c鼠(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所) 骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保存委員會(huì)細(xì)胞庫) 完全和不完全佐劑(SIGMA公司) RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、完全RPMI-1640培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基、HAT培養(yǎng)基(以上試劑均購自Gibico公司)
方法
免疫動(dòng)物 采用攪拌混合法，將等體積的抗原溶液和佐劑均勻混合。 初次免疫每只鼠打4針(腋下腹股溝淋巴結(jié)豐富處)每針0.2mL，用完全福氏佐劑；21天后第二次免疫劑量針數(shù)同上但用不完全福氏佐劑；14天后第三次免疫劑量針數(shù)同上但不加佐劑；10天后加強(qiáng)免疫( 一般為融合前3天)50 ii g im\iv ;三天后取脾采血。 飼養(yǎng)細(xì)胞的分離 未免疫的BALB/c小鼠，摘眼球放血。分離血清作為抗體檢測時(shí)的陰性對(duì)照血清。小鼠拉頸處死后浸泡于75%酒精中5min，于解剖臺(tái)板上固定后剪開腹部皮膚后撕開暴露出腹膜，用酒精棉球反復(fù)搽拭后，小心在腹膜剪開一小口 ，小心用習(xí)慣吹入5mL的不完全培養(yǎng)基，收集腹沖液；后用5mL不完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗，兩次腹沖液合并收于離心管中，1000r/min離心10min，棄上清。加HAT培養(yǎng)至5mL將沉淀的細(xì)胞重懸并混勻，作細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，補(bǔ)加HAT培養(yǎng)基，使細(xì)胞濃度為2X107mL。將細(xì)胞懸液加入到4塊96孔板中，每孔100 y L(約兩滴)，然后置37°C 5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
免疫脾細(xì)胞的制備將免疫的BALB/c小鼠，摘眼球放血。分離血清作為抗體檢測時(shí)的陽性對(duì)照血清。小鼠拉頸處死后浸泡于75X酒精中5min，于解剖臺(tái)板上固定后掀開左側(cè)腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪鑷，在超凈臺(tái)中用無菌手術(shù)剪剪開腹膜，取出脾臟置于已盛有l(wèi)OmL不完全培養(yǎng)基的平皿中，輕輕洗滌，并細(xì)心剝?nèi)ブ車Y(jié)締組織。將脾臟移入另一個(gè)盛有l(wèi)OmL不完全培養(yǎng)基的平皿中，用注射器內(nèi)芯在200目的銅網(wǎng)內(nèi)擠壓研磨脾臟，使脾細(xì)胞浸入平皿中的不完全培養(yǎng)基。用吸管吹打數(shù)次，制成單細(xì)胞懸液。為除去脾細(xì)胞懸液中的大團(tuán)塊，可用100目鋼銅網(wǎng)過濾。收獲脾細(xì)胞懸液，1000r/min離心10min，用不完全培養(yǎng)基離心洗滌1-2次，然后將細(xì)胞重懸于10mL不完全培養(yǎng)基混勻，取上述懸液計(jì)數(shù)。通常每只小鼠可得1 X 108-2.5X 108個(gè)脾細(xì)胞。
骨髓瘤細(xì)胞系 骨髓瘤細(xì)胞生長快通常以l : IO傳代，(37t:，5XC02孵箱，用含15XFBS的完全RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibico公司)，融合前，使大多數(shù)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞形態(tài)均一，細(xì)胞匯合度適中(大約10-80% )，收獲骨髓瘤細(xì)胞，1000r/min離心10min，用不完全培養(yǎng)基離心洗滌1-2次，然后將細(xì)胞重懸于10mL不完全培養(yǎng)基混勻，取上述懸液計(jì)數(shù)。
細(xì)胞融合 將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP/0按4 : l混合于一支50mL離心管中，補(bǔ)加不完全培養(yǎng)基至30mL。充分混勻；1000r/min離心5-10min，將上清盡量吸凈；在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻；用lmL吸管在30秒內(nèi)加預(yù)熱至37。C的50% PEG(pH = 8. 0) lmL，沿管壁邊加邊輕輕滴加；然后立即在60秒內(nèi)將細(xì)胞全部吸入吸管中，靜止30秒，然后在30秒內(nèi)將細(xì)胞吹入離心管中，用吸管在5min內(nèi)加30mL預(yù)熱至37°C的不完全培養(yǎng)基；1000r/min離心10min，棄去上清后加入40mLHAT培養(yǎng)液；分裝96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；7-10天后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基；(第14天后可用普通完全培養(yǎng)基)；經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時(shí)吸出上清供抗體檢測?？贵w檢測的方法為Elisa法，以骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陰性對(duì)照，以免疫鼠血清作為陽性血清，進(jìn)行Elisa常規(guī)操作。
克隆培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞 植被待克隆的雜交瘤細(xì)胞懸液，用含15%血清的HT培養(yǎng)基稀釋至每毫升含2. 5、15和50個(gè)細(xì)胞3種不同的稀釋度；按每毫升加入5X 104_1 X 105細(xì)胞比例，在上述雜交瘤細(xì)胞懸液中分別加入鋪好飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板中；每種雜交瘤細(xì)胞分裝96孔板一塊，每個(gè)稀釋度32孔，每孔量為0. lmL，每孔雜交瘤細(xì)胞數(shù)分別為O. 5、3和10 ;37°C、7. 5% C02濕潤培養(yǎng)7-10天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可檢測抗體；早倒置顯微鏡下觀察，標(biāo)出只有單個(gè)克隆生長孔，去上清作抗體檢測；取康圖檢測陽性孔德細(xì)胞夸大培養(yǎng)，并凍存。
選擇Elisa陽性值高的克隆，細(xì)胞活力強(qiáng)底面積覆蓋> 1/4放大到24孔板當(dāng)細(xì)胞量大于1/2底面積進(jìn)行亞克隆化，選取10-15個(gè)克隆亞克隆2-3個(gè)，亞克隆化后14天選取細(xì)胞狀態(tài)良好的測定Elisa對(duì)其陽性值高的在進(jìn)行擴(kuò)增選取5-10個(gè)亞克隆2-3個(gè)；同法再進(jìn)行亞克隆，共三次，20代。
雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng) 用10%的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，371:、5%0)2，隔一天換一次液；細(xì)胞大而透亮，大小均一為佳。 實(shí)施例2 :Elisa法篩選雜交瘤細(xì)胞
主要試劑
包被液碳酸鹽緩沖液pH = 9. 6， NaHC03 2. 93g ;加蒸餾水至lOOOrnL。沖洗液和稀釋液:T :PBST pH = 7. 4 :NaCl 8. 0g ;KH2P04 0. 2g ;NaHP04 12H202. 9g ;
KC1 0. 2g ;Tween 0. 5mL加蒸餾水至lOOOmL。 封閉液1% BSA(lg/100mL購置SIGMA公司)4.顯色液TMB，每lmLTMB加入3 ii L 2mg/mL的抗氧化劑NaS203. 5H20 A液0. 2M Na2HP04 (28 . 4g/L) 25. 7mL 0. 1M擰檬酸(19. 2g/L) 24. 3mL H202 0. 1 % ;加蒸餾水50mL B液TMB3. 90g 檸檬酸10. 52g EDTA 1. 86g 甘油2000mL DMSO 300mL，加熱熔解后加蒸餾水至lOOOOmL. 5.終止液(2M H2S04):蒸餾水178. 3mL，逐滴加入濃硫酸(98% )21. 7mL。
方法 包板濃度5 ii g/孔，4t:過夜，甩板洗滌3-6次，拍干；
封閉1% BSA每孔100iiL，37。C，1小時(shí); —抗取每孔培養(yǎng)上清100iiL加入酶標(biāo)板中，37。C l小時(shí)，洗板3次，2min/次，拍干。 二抗加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG稀釋比是l : 3000(SIGMA公司)，每孔100iiL，37°C 1小時(shí)，洗板3次，2min/次，拍干。 顯色先加A液50 ii L/孔；再加B液50 ii L/孔。避光15min。
終止50 ii L/孔2M H2S04
波長450nm記錄分析。
三.結(jié)果 在融合后用Elisa左效價(jià)測試融合后大約11天左右新生的雜交瘤細(xì)胞達(dá)底面積的1/10-1/4，在培養(yǎng)上清中可以檢測到。 細(xì)胞株的選擇需要考慮上清中的抗體的量受多因素的影響、雜交瘤細(xì)胞的數(shù)量、雜交瘤細(xì)胞的分泌抗體的能力、雜交瘤細(xì)胞的生長狀態(tài)、殘余脾細(xì)胞、上清液的量等等因素。因此細(xì)胞株的選擇不能單看效價(jià)值得高低，要綜合各方面因素來選擇。本實(shí)驗(yàn)選擇2D8細(xì)胞株擴(kuò)增與凍存，并于2009年6月17日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC-C200944，建議的分類命名為雜交瘤細(xì)胞。
實(shí)施例3 :動(dòng)物體內(nèi)制備單克隆抗體
材料和來源 小鼠成年BALB/c小鼠，年齡> 15周，(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所)
腹腔處理前體重分別是1號(hào)30. Og， 2號(hào)29. lg
用液體石蠟處理后體重分別是31. 2g， 2號(hào)30. 6g
細(xì)胞株CCTCC-C200944。 培養(yǎng)基選擇10%的胎牛血清完全培養(yǎng)基，(Glbico)
方法 選擇生長狀態(tài)好的SP2/0細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，細(xì)胞生長密度不宜過大，最好不超
底面積的80%。大約每只小鼠需8瓶(25cm培養(yǎng)瓶)細(xì)胞，每瓶約含5X 106細(xì)胞。 腹腔處理小鼠腹腔內(nèi)注射高壓過的液體石蠟每只0. 7mL，處理后10天至2個(gè)月
都可用。 注射細(xì)胞收集對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，離心洗滌1-2次重懸浮生理鹽水中，調(diào)整好濃度(濃度為1 X 107-2X 107mL)，每只老鼠腹腔內(nèi)注射0. 8mL。 接種后觀察接種后第l-5天，兩只小鼠無明顯不適，體重略微增加(分別鄭家0. 7g和0. 8g)從第6天開始腹部明顯膨隆，體重1天之內(nèi)徒增0. 9g和1. lg。之后必須在一周內(nèi)老鼠體重下降時(shí)抽取腹水(3-5mL)，腹水3000rpm5min室溫離心收集細(xì)胞注入腹腔已處理好的老鼠體內(nèi)可以加快產(chǎn)生腹水的時(shí)間，約在注射后第3天可見腹部膨隆。
腹水的處理3000rpm室溫離心收集細(xì)胞，在4t: 12000r/min， 15min除去上層油質(zhì)和下層細(xì)胞成分和其它的沉淀物，收集上清，測定抗體效價(jià)，分裝，_701:凍存?zhèn)溆茫騼龈杀４?。?jīng)測定，小鼠腹水可達(dá)到0.6-lmg/mL;效價(jià)可達(dá)到1 : 360萬。
純化方法將Hitrip protein G安裝到蛋白純化儀上，流速為速度lmL/min，先用lOmL去離子水平衡，再用50mL平衡緩沖液(50m M Tris-Cl， pH = 8. 0)平衡親和柱，取硫酸氨沉淀后的腹水用上樣環(huán)上樣5mL，再用平衡緩沖液平衡至基線跑平，再用10mL的洗脫液(0. 1M甘氨酸pH二 5.0)洗脫，；收集穿過峰和洗脫峰，洗脫峰用中和液(1M Tris-Cl pH=8. 0)迅速將洗脫液的pH調(diào)至7. 2左右。對(duì)收集到的各管進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析純度及濃度差異，選擇濃度和純度高的。用超濾管濃縮，10000rpm，4t:，20min。(抗體的保存添加終濃度為0. 1%疊氮鈉和1%的BSA于_701:長期保存。)
實(shí)施例4 :體外法獲得單克隆抗體 —、選擇經(jīng)過三次亞克隆化的2D8細(xì)胞株進(jìn)行體外培養(yǎng)，首先用含10%完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。2D8細(xì)胞株生長活躍，能夠耐受此過程，但需每日換液，穩(wěn)定培養(yǎng)5代后液氮凍存。 二 .純化利用蛋白G親和層析法。將Hitrip protein G安裝到蛋白純化儀上，流速為速度lmL/min，先用10mL去離子水平衡，再用50mL平衡緩沖液(50mM Tris_Cl，pH =8. 0)平衡親和柱，取硫酸氨沉淀后的腹水用上樣環(huán)上樣5mL，再用平衡緩沖液平衡至基線跑平，再用10mL的洗脫液(0. 1M甘氨酸pH二 5.0)洗脫，；收集穿過峰和洗脫峰，洗脫峰用中和液(1M Tris-Cl pH = 8. 0)迅速將洗脫液的pH調(diào)至7. 2左右。對(duì)收集到的各管進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析純度及濃度差異，選擇濃度和純度高的。用超濾管濃縮，10000rpm，4°C ， 20min。(抗體的保存添加終濃度為0. 1 %疊氮鈉和1 %的BSA于-7(TC長期保存。)
實(shí)施例6 :抗體特性的鑒定
雜交瘤細(xì)胞的染色體分析
方法 在加秋水仙素前48-36h將雜交瘤細(xì)胞傳代。在培養(yǎng)瓶中加入秋水仙素(100 y g/mL，除菌，_201:保存)，使最終濃度為0. l-0.4yg/mL(若改用秋水仙胺則最終濃度為0. 02-0. 05ii g/mL);繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)，然后吹打細(xì)胞，移入離心管中，1000r/min 10min，棄上清。加入已預(yù)熱到37t:的0.075mol/L KCL溶液5mL，將沉淀細(xì)胞懸浮并混勻，37。C水域15-20min。向懸液中加入新配制的固定液(甲醇與冰醋酸3 : 1混合)lmL，混勻，然后 1000r/minlOmin，棄去上清液本步驟的目的是將細(xì)胞表面輕微固定，可防止固定后細(xì)胞粘 連成團(tuán)款。加入固定液5mL，將細(xì)胞懸浮并混勻，室溫靜止20-30min，然后1000r/minlOmin， 棄去上清液；重復(fù)作操作一次；其后加5mL固定液，將細(xì)胞懸浮并混勻，封上管口，置4t:過 夜。取出離心管，1000r/min 5min，輕輕吸取上清液，根據(jù)細(xì)胞壓積多少而留下0. 5-lmL固 定液，將細(xì)胞懸浮并混均后，吸取細(xì)胞懸液1-2滴，滴在剛從冰水中取出的載波片上，用口 吹散，并在火焰上通過數(shù)次，使細(xì)胞平鋪于載波片上自然干燥。用新配制的10^Giemsa染 液染色10-20min，然后用自來水吸取染液，自然干燥。 鏡檢選擇染色體分散好，無重疊，無失散的細(xì)胞驚醒觀察分析。每份標(biāo)本應(yīng)計(jì)數(shù) 100個(gè)完整的中期核細(xì)胞，并注意觀察是否有標(biāo)志染色體。
結(jié)果染色體穩(wěn)定，見圖1 。
實(shí)施例7 :單抗免疫球蛋白重鏈和輕鏈類型的鑒定
— 材料 1.包被液碳酸鹽緩沖液pH = 9. 6， Na2C03 1. 59g ;NaHC03 2. 93g ;甲蒸餾水至 lOOOmL. 2.沖洗液和稀釋液:T :PBST pH = 7. 4 :NaCl 8. Og ;KH2P04 0. 2g ;NaHP0412H20 2. 9g ;KCl 0. 2g ;Tween 0. 5mL加蒸餾水至lOOOmL。
3.封閉液1% BSA(Biochrom AG公司)4.顯色液TMB，每lmLTMB加入3 ii L 2mg/mL的抗氧化劑NaS203. 5H20 A液0. 2M Na2HP04 (28 . 4g/L) 25. 7mL 0. 1M擰檬酸(19. 2g/L) 24. 3mL H202 0. 1 % ;加蒸餾水50mL B液TMB3. 90g 擰檬酸IO. 52g EDTA 1.86g 甘油2000mL DMSO 300mL，加熱熔解后加蒸餾水至lOOOOmL. 5.終止液(2M H2S04):蒸餾水178. 3mL，逐滴加入濃硫酸(98% )21. 7mL。 二方法( — ) 1.包板濃度50 ii g/mL， 4。C過夜，甩板洗滌3_6次，拍干； 2.封閉1% BSA(Biochrom AG公司)于37。C，封閉1小時(shí)； 3. 一抗取每孔培養(yǎng)上清100iiL加入酶標(biāo)板中，37。C l小時(shí)，洗板3次，2min/次，拍干。 4.抗體亞型無HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體亞型稀釋比是1 : 6000 (SIGMA公司)， 37°C 1小時(shí)，洗板3次，2min/次，拍干。 4. 二抗HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG稀釋比是l : 3000 (SIGMA公司)，37°C l小時(shí)，洗 板3次，2min/次，拍干。 5.顯色先加A液50/孔；再加B液50/孔，37t: 10min。
6.終止50 ii L/孔2M H2S04 7.波長450nm記錄分析。 1.結(jié)果單克隆抗體為IgG2a型抗體。 (二)抗體特異性檢測 1.方法采用常規(guī)的WesternBlot印跡方法(免疫印跡法)測定抗體純度，一抗 為Gliadin單抗(腹水純化后的)，二抗為羊抗鼠IgG/HRP (中杉金橋生物技術(shù)有限公司)， ECL試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司) 2.結(jié)果與LRP16多抗結(jié)果比較特異性強(qiáng)，幾乎沒有特異性反應(yīng)性帶形成。(三)抗體效價(jià)測定 1.方法常規(guī)ELISA法 2.試劑同ELISA法篩選雜交瘤細(xì)胞 3.結(jié)果指甲培養(yǎng)的上清可達(dá)到1 : 20萬；小鼠腹水可達(dá)到0. 6-lmg/mL ;效價(jià)可
達(dá)到i : ioo萬至i : 360萬。 上述LRP16單抗適合于westernblot與免疫組化研究使用，結(jié)果顯示該抗體特異 性高，背景干凈。
權(quán)利要求
麩朊蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株CCTCC-C200944一種由雜交瘤細(xì)胞株CCTCC-C200944分泌的單克隆抗體。麩朊蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株用于制備Gliadin單克隆抗體的用途。麩朊蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株用于制備檢測Gliadin過敏原的試劑的用途。一種由雜交瘤細(xì)胞株CCTCC-C200944分泌的單克隆抗體用于制備檢測Gliadin過敏原的試劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種麩朊蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其用途，屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域。麩朊蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株CCTCC-C200944。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1)染色體穩(wěn)定，分泌IgG2a型抗體；2)分泌抗體效價(jià)高，直接培養(yǎng)的上清可達(dá)到1∶10萬；3)小鼠腹水中抗體含量可達(dá)到1mg/mL；效價(jià)可達(dá)到1∶100萬，可以用protein G純化；4)分泌抗體可以用于免疫印跡(westernblot)實(shí)驗(yàn)(1∶1000)。
文檔編號(hào)C12P21/08GK101698832SQ200910017430
公開日2010年4月28日 申請(qǐng)日期2009年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月30日
發(fā)明者林超, 梁成珠, 秦倩茹, 趙明, 陳穎, 高宏偉 申請(qǐng)人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心;中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院;青島寶麥德生物醫(yī)藥科技有限公司