一種新型皮膚填充劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)用生物材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新型交聯(lián)透透明質(zhì)酸鈉凝膠的制備 方法，該交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠用于醫(yī)學(xué)填充美容。
【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸鈉是人和動物皮膚、玻璃體、關(guān)節(jié)潤滑液和軟骨組織的重要成分，它由 (1-0 -4) f葡糖醛酸和（1-0 -3) A乙?；被咸请p糖單位重復(fù)連接而成，廣泛使 用在修復(fù)手術(shù)、眼部手術(shù)或作為美容產(chǎn)品填充皺紋。透明質(zhì)酸具有良好的理化性能及生物 相容性。然而，它在體內(nèi)受到透明質(zhì)酸酶的酶解作用而迅速降解，存留時間較短，需要重復(fù) 注射才能達(dá)到療效。交聯(lián)透明質(zhì)酸是透明質(zhì)酸經(jīng)交聯(lián)劑交聯(lián)修飾得到的高分子凝膠，可以 彌補(bǔ)透明質(zhì)酸存留時間短等缺點(diǎn)，同時仍具有良好的生物相容性及效果。
[0003] 經(jīng)過近幾年的快速發(fā)展及其市場整合，如今交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的技術(shù)現(xiàn)狀趨于 平穩(wěn)和雷同，市場中的產(chǎn)品競爭也進(jìn)入了白熱化，僅在中國市場就有4-5家產(chǎn)品并存，但從 交聯(lián)技術(shù)層面來講，類型主要包括兩大類即二乙烯基砜（DVS)和1，4- 丁二醇二縮水甘油醚 (BDDE)作為交聯(lián)劑；同時現(xiàn)有的產(chǎn)品在凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)是都是一致的即交聯(lián)/修飾的位點(diǎn) 均在-OH上；眾所周知上述兩種交聯(lián)劑具有很高的生物毒性或潛在的致癌性，雖然各生產(chǎn) 廠家采取了嚴(yán)格的控制措施確保產(chǎn)品的安全性，但交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠為長期植入體內(nèi)的 三類醫(yī)療器械，因此臨床上也缺乏大樣本的長期跟蹤數(shù)據(jù)來佐證該類產(chǎn)品的生物安全性； 同時由于市場需求的趨勢，如今包括國外生產(chǎn)廠家都在追求更長的體內(nèi)殘留時間，這勢必 提高產(chǎn)品的交聯(lián)/修飾程度，加大交聯(lián)劑的引入量，更加劇了人們對該類產(chǎn)品的擔(dān)憂。
[0004] 因此，在世界范圍內(nèi)選擇無毒或低毒的交聯(lián)劑成交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠領(lǐng)域的必然 趨勢。氨基酸是一類具有雙官能團(tuán)的化合物，是組成蛋白質(zhì)的基本單位，可以被人體吸收利 用，相比其他傳統(tǒng)的化學(xué)交聯(lián)劑來講，其毒性明顯降低(表1)，因此選擇氨基酸及其衍生物 作為交聯(lián)劑制備交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠再生物安全性方面具有較大優(yōu)勢；同時在交聯(lián)的凝膠 的分子結(jié)構(gòu)上也具有顯著區(qū)別于現(xiàn)有產(chǎn)品的獨(dú)特優(yōu)勢，即利用透明質(zhì)酸鈉分子中的羧基與 氨基酸交聯(lián)劑中的氨基形成酰胺鍵從而達(dá)到交聯(lián)的效果，大量的文獻(xiàn)研究結(jié)果表明酰胺鍵 具有的優(yōu)良的熱穩(wěn)定性，這也顯示利用氨基酸作為交聯(lián)劑制備的透明質(zhì)酸鈉凝膠具有潛在 的抗高溫滅菌的特性；眾所周知透明質(zhì)酸鈉在體內(nèi)的降解主要是通過特異性的透明質(zhì)酸酶 來實現(xiàn)的，該過程的特異性識別位點(diǎn)為羧基，而利用氨基酸作為交聯(lián)劑的反應(yīng)位點(diǎn)恰為羧 基，因此利用氨基酸作為交聯(lián)劑制備的凝膠具有顯著區(qū)別于傳統(tǒng)產(chǎn)品的抗酶解性。
[0005] 表1賴氨酸與常用交聯(lián)劑毒性對比分析表

在透明質(zhì)酸鈉分子中引入酰胺鍵常用的方法有1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)-碳二 亞胺（EDC)活化、2-氯-1-甲基吡啶鐺碘化物（CMPI)活化等，但這些方法大都存在著諸多 的弊端，如EDC活化法對PH值的依賴性較強(qiáng)且接枝效率低，不適宜于大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化放大； 而CMPI活化法則存在著存在反應(yīng)活性低、后處理復(fù)雜等弊端。
[0006] 鑒于上述方法的不足，本發(fā)明采用嗎啉衍生物作為偶聯(lián)試劑進(jìn)行制備交聯(lián)透明質(zhì) 酸鈉凝膠（以下簡稱DMTMM法)。DMTMM是目前較為理想的生成酰胺鍵的方法之一，其具有如 下幾個優(yōu)勢：1.反應(yīng)活性高，單一氨基酸的接枝率可達(dá)到70%以上；2.反應(yīng)溫和，低溫和 室溫下即可反應(yīng)；3.對PH的依賴性弱，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；4.副反應(yīng)少，未參加反應(yīng)的嗎啉 衍生物不與透明質(zhì)酸鈉反應(yīng)，且易于去除，有利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。
[0007] 本發(fā)明利用DMTMM法，采用人體內(nèi)的必需氨基酸中的堿性氨基酸-賴氨酸和精氨 酸及其衍生物作為交聯(lián)劑制備交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠從根本上避免了 DVS、BDDE等毒性較大 的交聯(lián)試劑的使用，保證的透明質(zhì)酸鈉衍生物的安全性，同時賦予了凝膠以獨(dú)特的物理特 性即熱穩(wěn)定性和抗透明質(zhì)酸酶解性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)： 1.采用人體內(nèi)的必需氨基酸中的堿性氨基酸-賴氨酸及其衍生物作為交聯(lián)劑，上述交 聯(lián)劑具有無毒特性同時具有獨(dú)特的生物學(xué)活性。
[0009] 2.制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠是通過酰胺鍵將透明質(zhì)酸鈉分子交聯(lián)成三維立體 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，區(qū)別于傳統(tǒng)DVS和BDDE交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。
[0010] 3.利用DMTMM法制備交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠，該反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少且易于規(guī) ?；a(chǎn)。
[0011] 4.利用本發(fā)明制備的交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠封閉體內(nèi)透明質(zhì)酸酶的識別位點(diǎn)，延長 殘留時間。
[0012]
【附圖說明】： 圖1樣品透明質(zhì)酸鈉酶降解率對比圖。
【具體實施方式】
[0013] 現(xiàn)結(jié)合實施例，以賴氨酸為例對本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實施不僅限于此。
[0014] 實施例一 將賴氨酸〇. 〇914g溶解于15mL水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為4,稱取lg透明質(zhì)酸鈉干粉，攪 拌均勻后，放4°C過夜。第二天稱取DMTMM 0. 6918g用5mL水完全溶解后加入凝膠中，待完 全攪拌均勻后，4°C下反應(yīng)3天。
[0015] 將反應(yīng)好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每lh更換透析液1次并稱重，直到 凝膠質(zhì)量到50g后終止透析，將該凝膠粉碎制粒后，得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。
[0016] 實施例二 將賴氨酸〇. 〇914g溶解于15mL水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為6,稱取lg透明質(zhì)酸鈉干粉，攪 拌均勻后，放4°C過夜。第二天稱取DMTMM 0. 6918g用5mL水完全溶解后加入凝膠中，待完 全攪拌均勻后，4°C下反應(yīng)3天。
[0017] 將反應(yīng)好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每lh更換透析液1次并稱重，直到 凝膠質(zhì)量到50g后終止透析，將該凝膠粉碎制粒后，得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。
[0018] 實施例三 將賴氨酸〇. 〇914g溶解于15mL水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為6. 5,稱取lg透明質(zhì)酸鈉干粉， 攪拌均勻后，放4°C過夜。第二天稱取DMTMM 0. 6918g用5mL水完全溶解后加入凝膠中，待 完全攪拌均勻后，4°C下反應(yīng)3天。
[0019] 將反應(yīng)好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每lh更換透析液1次并稱重，直到 凝膠質(zhì)量到50g后終止透析，將該凝膠粉碎制粒后，得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。
[0020] 實施例四 將賴氨酸〇. 〇914g溶解于15mL水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為7,稱取lg透明質(zhì)酸鈉干粉，攪 拌均勻后，放4°C過夜。第二天稱取DMTMM 0. 6918g用5mL水完全溶解后加入凝膠中，待完 全攪拌均勻后，4°C下反應(yīng)3天。
[0021] 將反應(yīng)好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每lh更換透析液1次并稱重，直到 凝膠質(zhì)量到50g后終止透析，將該凝膠粉碎制粒后，得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。
[0022] 實施例五 將賴氨酸〇. 〇914g溶解于15mL水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為7. 4,稱取lg透明質(zhì)酸鈉干粉， 攪拌均勻后，放4°C過夜。第二天稱取DMTMM 0. 6918g用5mL水完全溶解后加入凝膠中，待 完全攪拌均勻后，4°C下反應(yīng)3天。
[0023] 將反應(yīng)好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每lh更換透析液1次并稱重，直到 凝膠質(zhì)量到50g后終止透析，將該凝膠粉碎制粒后，得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。
[0024] 實施例六 將賴氨酸〇. 1828g溶解于15mL水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為7. 4,稱取lg透明質(zhì)酸鈉干粉， 攪拌均勻后，放4°C過夜。第二天稱取DMTMM 0. 6918g用5mL水完全溶解后加入凝膠中，待 完全攪拌均勻后，4°C下反應(yīng)3天。
[0025] 將反應(yīng)好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每lh更換透析液1次并稱重，直到 凝膠質(zhì)量到50g后終止透析，將該凝膠粉碎制粒后，得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。
[0026] 實施例七 將賴氨酸〇. 〇731g溶解于15mL水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為7. 4,稱取0. 8g透明質(zhì)酸鈉干 粉，攪拌均勻后，放4°C過夜。第二天稱取DMTMM 0. 5534g用5mL水完全溶解后加入凝膠中， 待完全攪拌均勻后，4°C下反應(yīng)3天。
[0027] 將反應(yīng)好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每lh更換透析液1次并稱重，直到 凝膠質(zhì)量到40g后終止透析，將該凝膠粉碎制粒后，得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。
[0028] 實施例八 將賴氨酸〇. 〇731g溶解于15mL水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為7. 4,稱取0. 8g透明質(zhì)酸鈉干 粉，攪拌均勻后，放4°C過夜。第二天稱取DMTMMO. 2767g用5mL水完全溶解后加入凝膠中， 待完全攪拌均勻后，4°C下反應(yīng)3天。
[0029] 將反應(yīng)好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每lh更換透析液1次并稱重，直到 凝膠質(zhì)量到40g后終止透析，將該凝膠粉碎制粒后，得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。
[0030] 實施例九 將賴氨酸〇. 1462g溶解于15mL水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.4,稱取0.8g透明質(zhì)酸鈉干 粉，攪拌均勻后，放4°C過夜。第二天稱取DMTMM 0. 5534g用5mL水完全溶解后加入凝膠中， 待完全攪拌均勻后，4°C下反應(yīng)3天。
[0031] 將反應(yīng)好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每lh更換透析液1次并稱重，直到 凝膠質(zhì)量到40g后終止透析，將該凝膠粉碎制粒后，得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。
[0032] 實施例十 將賴氨酸〇. 1462g溶解于15mL水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.4,稱取0.8g透明質(zhì)酸鈉干 粉，攪拌均勻后，放4°C過夜。第二天稱取DMTMM 0. 2767g用5mL水完全溶解后加入凝膠中， 待完全攪拌均勻后，4°C下反應(yīng)3天。
[0033] 將反應(yīng)好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每lh更換透析液1次并稱重，直到 凝膠質(zhì)量到40g后終止透析，將該凝膠粉碎制粒后，得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。
[0034] 實施例^-一 將賴氨酸乙酯二鹽酸鹽〇. 309g溶解于15mL水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7. 4,稱取lg 透明質(zhì)酸鈉干粉，攪拌均勻后，放4°C過夜。第二天稱取DMTMM 0. 6918g用5mL水完全溶解 后加入凝膠中，待完全攪拌均勻后，4°C下反應(yīng)3天。
[0035] 將反應(yīng)好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每lh更換透析液1次并稱重，直到 凝膠質(zhì)量到50g后終止透析，將該凝膠粉碎制粒后，得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。
[0036] 實施例十二 將賴氨酸一鹽酸鹽〇. 1142g溶解于15mL水中，用等摩爾的氫氧化鈉將鹽酸中和后，再 用鹽酸調(diào)節(jié)pH為7.4,稱取lg透明質(zhì)酸鈉干粉，攪拌均勻后，放4°C過夜。第二天稱取DMTMM 0. 6918g用5mL水完全溶解后加入凝膠中，待完全攪拌均勻后，4°C下反應(yīng)3天。
[0037] 將反應(yīng)好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每lh更換透析液1次并稱重，直到 凝膠質(zhì)量到50g后終止透析，將該凝膠粉碎制粒后，得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。
[0038] 實施例十三 稱取lg透明質(zhì)酸鈉干粉，用15mL水溶解均勻后，放4°C過夜。第二天稱取DMTMM 0. 6918g用5mL水完全溶解后加入凝膠中，待完全攪拌均勻后，4°C下反應(yīng)3天。
[0039] 將反應(yīng)好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每lh更換透析液1次并稱重，直到 凝膠質(zhì)量到50g后終止透析，將該凝膠粉碎制粒后，得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。
[0040] 實施例十四 由實施例五、七、十一、十二、十三得到的樣品經(jīng)蒸汽滅菌，（12rC、20min)后。取凝 膠0. 32g，加入透明質(zhì)酸酶液8ml (240UI);同樣取對照樣品0. 32g，加入透明質(zhì)酸酶液8ml (240UI)，37°C水浴48h，離心取上清液測定糖醛酸含量，繪制降解曲線，并與市售瑞藍(lán)、潤 百顏產(chǎn)品相比較。所得產(chǎn)品48h的酶降率在60%以下，顯著低于目前市場上的主流交聯(lián)產(chǎn) 品。
【主權(quán)項】
1. 一種新型皮膚填充劑的制備方法，其主要特征為以透明質(zhì)酸鈉為原料，采用 4-(4, 6-二甲氧基三嗪-2-基）-4-甲基嗎啉鹽酸鹽（DMTMM)作為縮合劑，選擇適量的天然 氨基酸及其衍生物作為交聯(lián)劑，控制透明質(zhì)酸鈉的起始濃度、縮合劑的加入量、反應(yīng)溫度、 PH值以及反應(yīng)時間，反應(yīng)結(jié)束后，將凝膠切成小塊放入磷酸緩沖液中進(jìn)行透析，然后經(jīng)過制 粒和滅菌工藝得到交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠。2. 權(quán)利要求1所述的交聯(lián)劑是指天然氨基酸及其衍生物，包括L-賴氨酸、L-賴氨酸一 鹽酸鹽、L-賴氨酸二鹽酸鹽、L-賴氨酸乙酯二鹽酸鹽、L-精氨酸、L-精氨酸一鹽酸鹽、L-精 氨酸二鹽酸鹽，優(yōu)先選擇L-賴氨酸和L-精氨酸。3. 權(quán)利要求1所述的適量交聯(lián)劑時指交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸鈉的比例為1/10~2/l(mol/ mol )〇4. 權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸鈉起始反應(yīng)濃度為2~10% (m/m%)。5. 權(quán)利要求1所述的縮合劑加入量與透明質(zhì)酸鈉的比例為1/10~2/1 (mol/mol)。6. 權(quán)利要求1所述的反應(yīng)的溫度范圍為4~50°C。7. 權(quán)利要求1所述的反應(yīng)的時間范圍為4~120h。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新型皮膚填充劑的制備方法，該方法采用低毒的氨基酸及其衍生物作為交聯(lián)劑制備交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠；充分發(fā)揮了DMTMM法固有的反應(yīng)活性高、條件溫和以及處理簡便等優(yōu)勢，選擇人體必需氨基酸中的堿性氨基酸-賴氨酸和精氨酸或衍生物作為交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸鈉分子的羧基端發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，繼而部分封閉了體內(nèi)透明質(zhì)酸酶的識別位點(diǎn)，延緩了酶的識別和降解，最終提高了體內(nèi)的殘留時間，為開發(fā)安全、長效的透明質(zhì)酸鈉類注射美容填充劑提供了一種新的技術(shù)，具有較好的市場開發(fā)前景。
【IPC分類】C08J3/24, C08L5/08, C08K5/357, C08K5/17, C08J3/075, A61L27/60, A61L27/20, A61L27/52
【公開號】CN105713211
【申請?zhí)枴緾N201410715492
【發(fā)明人】魏長征, 宋瑞瑞, 奚宏偉, 蔣麗霞
【申請人】上海其勝生物制劑有限公司