專利名稱：：表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞特異性的啟動子和使用其調(diào)節(jié)血管生成的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：和背景本發(fā)明涉及可用于在受試者的特定組織區(qū)域中調(diào)節(jié)血管生成的核酸構(gòu)建體、藥物組合物和方法。更具體地講，本發(fā)明涉及表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動子活性的分離多核苷酸序列及其使用方法，再更具體地講，涉及在內(nèi)皮細(xì)胞中表現(xiàn)出增加的活性和特異性的修飾型前內(nèi)皮素原-1(PPE-1)啟動子以及核酸構(gòu)建體，它們可用于在特定細(xì)胞亞型中激活細(xì)胞毒性，由此使得能治療特征在于異常新血管形成或細(xì)胞生長的疾病，或者可用于誘導(dǎo)新血管生長，由此使得能治療局部缺血疾病。本發(fā)明進(jìn)一步涉及PPE啟動子的修飾，所述修飾增強其響應(yīng)于包括低氧和血管生成在內(nèi)的生理條件的表達(dá)，并涉及新血管生成內(nèi)皮特異性聯(lián)合療法。血管生成指新血管的生長，這是一個主要依賴于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的運動、增殖和管形成的過程。在血管生成期間，內(nèi)皮細(xì)胞從其靜息狀態(tài)擺脫并迅速增殖。盡管尚不知曉負(fù)責(zé)將細(xì)胞轉(zhuǎn)變成血管生成表型的分子機制，但導(dǎo)致形成新血管的事件次序已有充分的文件記載[Hanahan,D.:Science277,48-50,(1997)]。血管生長需要內(nèi)皮萌芽[Risau,W.,Nature386,671-674,(1997)]或套疊[Patan,S.等;Microvasc.Res.51,260-272,(1996)]。在第一條途徑中，可發(fā)生以下順序的事件(a)血管基底(通常是毛細(xì)血管后小靜脈)和間質(zhì)基質(zhì)溶解；(b)內(nèi)皮細(xì)胞向刺激物遷移；(c)尾隨前導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞之后的內(nèi)皮細(xì)胞增殖；(d)在內(nèi)皮索(army)/芽中形成腔(成管)；(e)通過芽的匯合性吻合形成分支和回路，以允許血液流動；(f)周細(xì)胞(即內(nèi)皮周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞)包一皮血管；和(g)在不成熟血管周圍形成基底膜。新血管還可經(jīng)第二條途徑形成將間質(zhì)組織柱插入預(yù)先存在的血管的腔中。這些柱隨后的生長及其穩(wěn)定化導(dǎo)致血管腔分隔和局部血管網(wǎng)絡(luò)重建。血管生成在低氧濃度(局部缺血和腫瘤轉(zhuǎn)移等)條件下發(fā)生，且因此在新血管形成中可能是一個重要的環(huán)境因素。包括促紅細(xì)胞生成素、轉(zhuǎn)鐵蛋白及其受體、大多數(shù)葡萄糖轉(zhuǎn)運和糖酵解途徑基因、LDH、PDGF-BB、內(nèi)皮素-1(ET-1)、VEGF和VEGF受體在內(nèi)的幾種基因的表達(dá)在低氧條件下被低氧誘導(dǎo)型因子(HIF-1)與調(diào)節(jié)這些基因轉(zhuǎn)錄的低氧反應(yīng)元件(HRE)的特異性結(jié)合所誘導(dǎo)。這些基因響應(yīng)低氧條件的表達(dá)，使細(xì)胞能夠在低氧條件下發(fā)揮作用。血管生成過程受到由腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞分泌的血管生成生長因子以及胞外基質(zhì)組合物和內(nèi)皮酶活性的調(diào)節(jié)(Nicosia和Ottinetti,1990,Lab.Invest.,63,115)。在血管生成初期，內(nèi)皮細(xì)胞芽通過預(yù)先存在的血管基底膜中的間隙露出(Nicosia和Ottinetti,1990,參見上文；Schoefl,1963,VirehousArch,Pathol.Anat.337,97-141;Ausprunk和Folkman,1977,Microvasc.Res.14,53-65;Paku和Paweletz,1991,Lab.Invest.63,334-346)。當(dāng)新血管生成時，它們的基底膜經(jīng)歷復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和組成變化，這些變化被認(rèn)為影響血管生成反應(yīng)(Nicosia等，1994,ExpBiology.164,197-206)。A^^成弄病邏夢有多種血管生成因子掌控血管生成過程。據(jù)了解，在病變期間，促血管生成因子和抗血管生成因子之間的精密平衡被破壞，由此引起非自限性的內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮周細(xì)胞增殖。盡管在正常條件下血管生成是高度受調(diào)節(jié)的過程，但許多疾病(特征為"血管生成性疾病")由持續(xù)不受調(diào)節(jié)的血管生成引起。在這樣的病狀中，不受調(diào)節(jié)的血管生成或者可直接引起特定疾病，或者可使現(xiàn)有的病理狀況惡化。例如，眼新血管形成已被指是失明的最主要病因，且是大約20種眼病的病理學(xué)基礎(chǔ)。在某些預(yù)先存在的狀況如關(guān)節(jié)炎中，新形成的毛細(xì)血管侵入關(guān)節(jié)并破壞軟骨。在糖尿病中，在視網(wǎng)膜中形成的新毛細(xì)血管侵入玻璃體液，從而引起出血和失明。直到最近，對在眼新血管形成疾病、關(guān)節(jié)炎、皮膚病和腫瘤中出現(xiàn)的血管生成仍難以在治療上進(jìn)行抑制。不平衡的血管生成以各種病理狀況為典型特征，且通常支持病理狀態(tài)的演進(jìn)。例如，在實體瘤中，血管內(nèi)皮細(xì)胞以快達(dá)正常組織中的那些纟田月包約354咅的速度分裂(Denekamp禾口Hobson,1982Br.J.Cancer46:711-20)。這樣的異常增殖是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移所必需的(Folkman,1986CancerRes.46:467-73)。血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖在慢性炎癥疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮痺和滑膜炎中也是重要的，其中這些細(xì)胞響應(yīng)于在炎癥部位中釋放的生長因子而增殖(Brown和Weiss,1988,Ann.Rheum.Dis.47:881-5)。在動脈粥樣硬化中，血管中內(nèi)皮細(xì)胞的單克隆擴增觸發(fā)動脈粥樣硬化斑塊的形成(Alpem-Elran1989,J.Neurosurg.70:942-5)。此外，在糖尿病性視網(wǎng)膜病中，失明被認(rèn)為是由眼內(nèi)基底膜變化所引起的，目艮內(nèi)基底膜的變化刺激不受控的血管生成和視網(wǎng)膜消耗(West和Kumar,1988,Lancet1:715-6)。內(nèi)皮細(xì)胞還參與移植排斥。在同種異體移植物排斥發(fā)作中，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)促粘附?jīng)Q定簇，其指導(dǎo)白細(xì)胞運輸?shù)揭浦膊课?。?jù)認(rèn)為，白細(xì)胞誘導(dǎo)，正如已知在炎性損害中所發(fā)生的?？?、、'''另一方面，消除的血管生成在疾病發(fā)展例如動脈粥樣硬化誘發(fā)的冠狀動脈阻塞(如心紋痛)、意外損傷或外科手術(shù)后的壞死損害、或胃腸損害如潰瘍中也是一個主要因素。因此，調(diào)節(jié)或改變血管生成過程在限制該過程促成潛在病狀的病理演進(jìn)方面以及提供研究其病因?qū)W的有價值方法方面可具有重要的治療作用。最近，面已取得顯著進(jìn)步。例如，施用在置于成年大鼠腹膜腔中的、膠原蛋白包被基質(zhì)內(nèi)的PFGF蛋白，導(dǎo)致產(chǎn)生充分血管形成并正常灌注的結(jié)構(gòu)(Thompson等，PNAS86:7928-7932,1989)。據(jù)報道，將pFGF蛋白注射到冠狀動脈閉塞期間的成年犬冠狀動脈中，導(dǎo)致心肌功能障礙減輕、心肌梗塞縮小和血管分布增加(Yanagisawa-Miwa等，Science257:1401-1403,1992)。業(yè)已才艮道在心肌局部缺血動物;漢型中使用(3FGF蛋白獲得了相似結(jié)果(Harada等，JClinInvest94:623-630,1994,Unger等，AmJPhysiol266:H1588-H1595,1994)。然而，對于長期功能性血管的大量形成，需要重復(fù)或長期遞送上述蛋白因子，從而限制了它們在臨床情形中的應(yīng)用。此外，除與血管生成調(diào)節(jié)因子生產(chǎn)相關(guān)的高成本之外，這些因子的有效遞送需要使用待置入冠狀動脈內(nèi)的導(dǎo)管，從而進(jìn)一步增加了治療的費用和難度。因此，所有抗血管生成治療的基本目標(biāo)都是使增殖微血管的病灶回復(fù)到其正常靜息狀態(tài)，并阻止其再生長[Cancer:Principles&PracticeofOncology,第五版，VincentT.DeVita,Jr.,SamuelHellman,StevenA.Rosenberg編輯，Lippincott-RavenPublishers,Philadelphia.(1997)]。同樣,促血管生成治療不僅涉及恢復(fù)所需要的血管生成因子，而且涉及重建它們之間的正確平衡(Dor等，AnnNYAcadSci2003;995:208-16)(關(guān)于促血管生成治療和抗血管生成治療的詳盡綜述參見Zhang等，ActaBiochandBiophysCinica,2003:35:873-880，和Mariani等，MedGenMed2003,5:22;和Folkman,Semin.One2002,29:15-18)。鑒于抗血管生成治療可延緩腫瘤生長演進(jìn)(例如視網(wǎng)膜病、良性的和惡性的血管生成性腫瘤)，其是強有力的臨床方法。一般來說，每一種由不受控毛細(xì)血管生長引起的疾病，如糖尿病性視網(wǎng)膜病、牛皮癬、關(guān)節(jié)炎、血管瘤、肺瘤生長和轉(zhuǎn)移，都是抗血管生長治療的標(biāo)靶。例如，超過臨床上潛伏大小(例如幾mm勺的實體瘤的進(jìn)行性生長需要連續(xù)的新血管生成，即已知為胂瘤血管生成的過程。肺瘤生長和轉(zhuǎn)移是血管生成依賴性的。肺瘤必須連續(xù)地刺激新毛細(xì)血管的生長，以遞送營養(yǎng)和氧供腫瘤自身生長。因此，抗血管生成腫瘤治療的基礎(chǔ)在于阻止帛最近，已^發(fā)出過多抗血管生成劑來治療惡性疾病，其中口一些已處于臨床試驗中(關(guān)于綜述，參見Herbst等(2002)Semin.Oncol.29:66-77,和Mariani等，MedGenMed2003;5:22)。研究的大部分腫瘤抗血管生成治療標(biāo)靶是在人中調(diào)節(jié)血管生成的主導(dǎo)過程，即血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與其受體(VEGFR)的相互作用。調(diào)節(jié)VEGFR的促血管生成作用的試劑包括(i)針對VEGF蛋白本身或其受體的抗體(例如rhuMAbVEGF,阿瓦斯丁(Avastin));(ii)針對VEGFR酪氨酸激酶的小分子化合物(例如，ZD6474和SU5416);(iii)耙向VEGFR的核酶。其它新的血管生成抑制劑包括具有獨特的抗腫瘤和抗血管生成特性的雌二醇的天然代謝物2-曱氧雌二醇(2-ME2),以及分別為纖溶酶原和膠原蛋白XVIII的蛋白酶剪切片段的制管張素和內(nèi)皮抑制素。盡管在臨床前模型中有前景，但迄今為止在臨床試驗測試的所有抗血管生成劑的全身施用都顯示出有限的成功率和相當(dāng)大的毒性，包括血小板減少癥、白細(xì)胞減少和咯血。這些結(jié)果提示，目前的肺瘤抗血管生成劑作為晚期惡性腫瘤療法的用途可能有限。O'Reilly等已經(jīng)表明，在抗血管生成治療開始至抗肺瘤作用出現(xiàn)之間的潛伏期可能導(dǎo)致在對治療起反應(yīng)之前的初期胂瘤演進(jìn)[O'ReillyS等，(1998)ProcAmSocClinOncoll7:217a]。而且，最近的研究提示，毛細(xì)血管床之間的血管生成調(diào)節(jié)可能不同，從而提示抗血管生成治療可能需要基于器官/組織特異性來最優(yōu)化[Arap等(1998)Science279:377-380]。有趣的是，當(dāng)對冠狀動脈病患者的心肌局部缺血實施針對平滑肌細(xì)胞增殖的抗血管生成療法(例如肝素、肝素-肽治療)時，獲得的效果也不理想[Liu等，Circulation,79:1374-1387(1989);Goldman等，Atherosclerosis,65:215-225(1987);Wolinsky等，JACC,15(2):475-481(1990)]。與利用這些試劑治療心血管疾病有關(guān)的各種限制包括(i)對心血管疾病患者產(chǎn)生不可耐受的風(fēng)險水平的全身毒性；(ii)妨礙外科手術(shù)后的血管傷口愈合；(iii)可能損害周圍的內(nèi)皮和/或其它中間平滑肌細(xì)胞。因此，這些以及其它與全身施用抗血管生成因子相關(guān)的固有障礙(即基于所需體外不穩(wěn)定性和高劑量的制造限制；和歸咎于次最佳效應(yīng)的單次快速靜脈施用的峰動力學(xué))限制了血管生成因子在新血管形成相關(guān)疾病治療中的有效使用。^/f辨癥#成治#在原發(fā)性腫瘤以及轉(zhuǎn)移中的腫瘤細(xì)胞增殖由于營養(yǎng)供應(yīng)受限導(dǎo)致凋亡速率增加而被抵消。只要發(fā)生"血管生成轉(zhuǎn)變，，和營養(yǎng)供應(yīng)對肺瘤大小足夠，休眠的原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性胂瘤就開始發(fā)展成轉(zhuǎn)移。血管生成轉(zhuǎn)變可經(jīng)幾種機制發(fā)生1.通過癌基因上調(diào)促血管生成基因，例如VEGF和bFGF,或下調(diào)血管抑制物(angio-suppressor),例^口血小一反反應(yīng)蛋白。2.通過腫瘤相關(guān)的低氧條件活化低氧誘導(dǎo)型因子-1(HIF-1)。3.腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤床成纖維細(xì)胞的促血管生成蛋白分泌。4.骨髓內(nèi)皮先祖(progenitor)運輸入腫瘤。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>.血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)成纖維細(xì)胞生長因子1(FGF1)*成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)*血'J、板衍生生長因子(PDGF)，促血管生成素2*.促血管生成素1**轉(zhuǎn)化生長因子-P*(TGF-P).月中瘤壞死因子-o^(TNF-oc)*白細(xì)胞介素-8(IL-8)血小板衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(PD-ECGF)'肝細(xì)胞生長因子(HGF)*劑量依賴性**弱血管生成活化劑P53血小板反應(yīng)蛋白-l**血小板反應(yīng)蛋白-2*組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)，制管張素，內(nèi)皮抑制素*抗血管生成抗凝血酶III.血管生成抑制性C-X-C趨化因子(PF4、IP-IO、MIG)色素內(nèi)皮衍生因子(PEDF).白細(xì)胞介素-12(IL-12)'干擾素(INF)-a(3y血管生成的活化劑和抑制劑(參見上文的表1)之間的相對平衡對將腫瘤保持在靜息狀態(tài)是重要的。降低抑制劑水平或增加活化劑水平改變了平tf,且導(dǎo)致胂瘤血管生成和腫瘤生長。當(dāng)腫瘤組織距最近血管的厚度超過150-200jum時，向肺瘤組織的氧擴散是不夠的。所以，根據(jù)定義，超過這些尺寸的所有腫瘤已經(jīng)打開血管生成。腫瘤細(xì)胞增殖率與血管供應(yīng)無關(guān)。但是，血管生成轉(zhuǎn)變一發(fā)生，凋亡速率就降低達(dá)1/3-1/4(24)。而且，營養(yǎng)供應(yīng)和分解代謝物釋放并不是血管生成性血管對肺瘤凋亡減退的唯一影響因素。微血管系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞還分泌進(jìn)一步抑制肺瘤細(xì)胞凋亡的抗凋亡因子、促分裂原和存活因子，例如b-FGF、HB-EGF、IL-6、G國CSF、IGF誦1和PDGF。腫瘤細(xì)胞由于高突變率而在遺傳上不穩(wěn)定，這為它們提供了超越天然細(xì)胞的優(yōu)勢。例如，p53基因中的突變抑制凋亡率。而且，促血管生成或血管生成抑制劑控制的癌基因改變(例如ras癌基因)可誘導(dǎo)血管生成轉(zhuǎn)變。但是，高突變率不是癌癥遺傳不穩(wěn)定性的唯一機制。有證據(jù)表明胂瘤細(xì)胞吞噬"凋亡體"，從而導(dǎo)致非整倍性和遺傳不穩(wěn)定性的進(jìn)一步增加。總而言之，癌癥依賴于血管生成。由于遺傳不穩(wěn)定性，癌癥可配合促血管生成細(xì)胞因子平衡，該平衡抑制其凋亡率并可實現(xiàn)轉(zhuǎn)移接種。人脈管系統(tǒng)包含一兆(trillion)以上的內(nèi)皮細(xì)胞。正常靜息內(nèi)皮細(xì)胞的壽命超過1000天。盡管參與腫瘤發(fā)展的血管生成內(nèi)皮細(xì)胞迅速增殖，但它們因其基因組穩(wěn)定性、及由此產(chǎn)生的最小的藥物抗性和發(fā)展出突變克隆的低可能性而與肺瘤細(xì)胞不同。而且，因為腫瘤發(fā)展的限速因素是血管生成，所以針對血管生成性內(nèi)皮細(xì)胞的治療能產(chǎn)生高效治療模式。實際上，幾種抗血管生成物質(zhì)可用作全身治療的潛在候選物。但是，由于這些試劑是蛋白，且其施用因此有賴于頻繁的靜脈內(nèi)施用，其應(yīng)用提出了嚴(yán)重的生產(chǎn)和保持難題。遞送抗血管生成基因為持續(xù)的蛋白分泌提供了潛在的解決方法。隨著調(diào)節(jié)血管生成過程的新基因的鑒定，人們一直試圖采用體基因治療來突破這些限制。雖然投入了很大的努力致力于開發(fā)癌癥、心血管和外周血管疾病的基因治療方法，但有效且特異性的基因遞送仍存在很大障礙[關(guān)于綜述參見FeldmanAL.(2000)Cancer89(6):1181-94]。通常使用重組病毒載體作為穿梭載體、利用目標(biāo)基因進(jìn)行基因治療的主要限制因素是將目標(biāo)基因特異性地導(dǎo)向靶組織的能力?？朔@些限制的努力包括使用綴合至細(xì)胞毒性基因的組織特異性啟動子。例如，Jagger等已描述了處于內(nèi)皮特異性啟動子控制下表達(dá)的細(xì)胞毒性基因耙向內(nèi)皮細(xì)胞，他們利用KDR或E-選沖奪蛋白啟動子以在內(nèi)皮細(xì)胞中特異性地表達(dá)TNFot[JaggarRT.等HumGeneTher(1997)8(18):2239-47]。Ozaki等用von-Willebrand因子(vWF)啟動子將單純皰滲病毒胸苷激酶(HSV-tk)遞送到HUVEC[HumGeneTher(1996)7(13》1483-90]。但是，這些啟動子僅僅顯示出微弱的活性，并且不允許高水平表達(dá)。[Proc.Natl.Acad.Sci.(1995)92:7567-571]分離出可賦予組織特異性體內(nèi)表達(dá)的人vonWillebrand因子基因的5'和3'調(diào)節(jié)序列。然而，這些序列僅可介導(dǎo)一種不均一形式的報告轉(zhuǎn)基因表達(dá)。在轉(zhuǎn)基因小鼠中處于vonWillebrand調(diào)節(jié)元件調(diào)節(jié)之下的細(xì)菌LacZ報告基因揭示出在卵黃嚢和成體腦中的內(nèi)皮細(xì)胞亞群中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。然而，在脾、肺、肝、腎、心臟、睪丸和主動脈的血管床中以及在血栓調(diào)節(jié)蛋白基因座中沒有檢測到表達(dá)。KorhonenJ等[Blood(1995)96:1828-35]分離出促進(jìn)轉(zhuǎn)基因在小鼠胚胎的整個血管系統(tǒng)中均勻表達(dá)的人和小鼠TIE基因啟動子。然而，在成體中的表達(dá)局限于肺和腎的血管，而在心臟、腦和肝中沒有檢測到表達(dá)。SchlaegerM等獲得了相似的結(jié)果，他們分離出TIE-2啟動子的1.2kb5'側(cè)翼區(qū)，并且表明轉(zhuǎn)基因表達(dá)限于胚胎小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞[SchlaegerTM等，(1995)Development121:1089-1098]。因此，這些序列中沒有一個在所有發(fā)育階段或成年動物的所有內(nèi)皮細(xì)胞中均一地起作用。此外，這些序列中的一些序列并不局限于內(nèi)皮。由Kong和Crystal提出了一種替代方法，該方法包括抗血管生成因子的腫瘤特異性表達(dá)。然而，迄今為止，盡管在臨床前模型中一些合成的抗血管生成劑與毒性相關(guān)，但重組體形式的內(nèi)源抗血管生成劑的毒性還沒有被證實[Kong和Crystal(1998)J.Natl.CancerInst.90:273-76]。制管張素也已被用作可能的抗血管生成劑(Folkman等，Cell1997Jan24;88(2):277-85),^a由于腫瘤中涉及血管生成調(diào)節(jié)的因子過多，所以單獨的制管張素治療應(yīng)非常難以奏效。迄今為止，有前景的臨床實驗已表明，像Avastin⑧或Bay-43906的抗血管生成治療可通過限制腫瘤周圍血管的新生長而減慢轉(zhuǎn)移進(jìn)展。但是，在其中需要顯著的抗血管生成作用來破壞大部分或全部現(xiàn)有血管生成性血管并誘導(dǎo)腫瘤壞死的癌癥病理學(xué)中，抑制新血管生成和/或部分地石皮壞它們可能不足夠。廣尸尸五-/)^動子Masaki等在1988年發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮素(ET)由ET-1、ET-2和ET-3這3個基因組成。內(nèi)皮素-1(ET-1)為21個氨基酸的肽，首先被描述為有效的血管收縮劑和平滑肌細(xì)胞促分裂原，由內(nèi)皮細(xì)胞合成。ET-1在血管內(nèi)皮中表達(dá)，盡管在其它細(xì)胞如平滑肌細(xì)胞、呼吸道和胃腸上皮、神經(jīng)元和腎小球系膜細(xì)胞中也有一些表達(dá)。其表達(dá)在各種病理生理狀況下被誘導(dǎo)，例如^氐氧、心血管疾病、炎癥、哮喘、糖尿病和癌癥。內(nèi)皮素-l觸發(fā)血管生成因子如VEGF和PDGF的生產(chǎn)并與其相互作用，且因此在血管生成過程中起作用。Hu等鑒別出位于內(nèi)皮素-l啟動子反義鏈上的低氧反應(yīng)元件(HRE)。該元件是低氧誘導(dǎo)型因子-1結(jié)合位點，是低氧正調(diào)節(jié)(人、大鼠和鼠基因的)內(nèi)皮素-l啟動子所必需的。低氧是有效信號，誘導(dǎo)幾種基因表達(dá)，包括促紅細(xì)胞生成素(Epo)、VEGF和各種糖酵解酶。核心序列(8個堿基對)在響應(yīng)于低氧條件的所有基因中都是保守的，且側(cè)翼區(qū)與其它基因不同。ET-1^氐氧反應(yīng)元件位于GATA-2和AP-1結(jié)合位點之間。Bu等在鼠PPE-l啟動子(mET-l)中鑒別出復(fù)雜的調(diào)節(jié)區(qū)，其似乎賦予內(nèi)皮細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄活性，并結(jié)合局限于內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白或蛋白復(fù)合物。該區(qū)域稱為內(nèi)皮特異性正轉(zhuǎn)錄元件，由位于鼠PPE-l啟動子的-364bp至-320bp之間的至少3個功能元件組成。全部3個元件都是完整活性所必需的。當(dāng)將一個或三個拷貝構(gòu)建入最小mET-l啟動子中時，內(nèi)皮細(xì)胞中的體外報告基因表達(dá)相比于無元件的最小啟動子增加至2-10倍。美國專利5,747,340講述了鼠PPE-1啟動子及其部分的應(yīng)用。然而，該專利既沒有暗示也沒有證明內(nèi)皮特異性增強子可用于增加用PPE啟動子實現(xiàn)的表達(dá)水平而同時保留內(nèi)皮特異性。此外，該專利也沒有講述在低氧條件下PPE-1啟動子被誘導(dǎo)至較高的轉(zhuǎn)錄水平。差^措導(dǎo)^躇#秀治^TGDE尸7V.-該策略也稱為"自殺基因治療"。其包括將惰性前藥在癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚约?xì)胞毒性試劑。在GDEPT中最廣泛使用的兩種基因是偶聯(lián)更昔洛韋(GCV)施用的單純皰滲病毒胸苷激酶(HSV-TK)和偶聯(lián)5-氟胞嘧啶(5FC)施用的大腸桿菌(E.coli)胞嘧啶脫氨酶(CD)。HSV-TK/GCV系統(tǒng)已經(jīng)歷了廣泛的臨床前評價以及臨床實驗。迄今為止，HSV-TK/GCV系統(tǒng)已表現(xiàn)出不顯著的副作用，例如發(fā)熱、GCV全身毒性、骨髓抑制和輕至中度肝毒性。HSV-TK/GCV系統(tǒng)首先由Kmiselburd等在1976年描述。用含HSV-TK的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或用含HSV-TK的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞對包括阿昔洛韋、更昔洛韋(GCV)、伐昔洛韋和泛昔洛韋在內(nèi)的藥物超家族正變得敏感起來。鳥苷類似物GCV在基因療法的配置中是最有效的藥物。HSV-TK陽性細(xì)胞產(chǎn)生病毒TK，其將GCV磷酸化成單磷酸GCV(GCV-MP)的效力為人TK的3個數(shù)量級高。GCV-MP隨后由天然胸苷激酶磷酸化為二磷酸GCV,且最后磷酸化為三磷酸GCV(GCV-TP)。GCV-TP是有效的DNA聚合酶抑制劑，其通過摻入新生鏈導(dǎo)致DNA合成終止，從而終止DNA延伸并最終引起細(xì)胞死亡。因為GCV主要影響HSV-TK陽性細(xì)胞，所以其副作用最小且罕有，且主要包括血小板減少癥、嗜中性白細(xì)胞減少癥和中毒性腎損害。而且，因為GCV毒性基于DNA合成，所以其主要影響增殖細(xì)胞。HSV-TK/GCV系統(tǒng)近來已廣泛用于癌基因治療的臨床實驗。不過，結(jié)果令人失望，主要受限于體內(nèi)低轉(zhuǎn)導(dǎo)百分率。近期研究已表征了HSV-TK/GCV細(xì)胞的細(xì)胞毒性機制。他們揭示細(xì)胞周期由于G2-MDNA損傷檢查點的活化而停滯于S晚期或G2期。發(fā)現(xiàn)這些事件導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞死亡以及與細(xì)力包死亡相關(guān)的旁^見者效應(yīng)。極度的細(xì)胞增大在施用HSV-TK/GCV系統(tǒng)的細(xì)胞中是公知的形態(tài)學(xué)變化。這些形態(tài)學(xué)變化歸因于特異性細(xì)胞骨架重排。應(yīng)激肌動蛋白纖維和粗中間絲網(wǎng)出現(xiàn)在細(xì)胞周期停滯之后。HSV-TK/GCV系統(tǒng)使用稱為"旁觀者效應(yīng)"的放大潛力。旁觀者效應(yīng)代表了HSV-TK陽性細(xì)胞借助其誘導(dǎo)HSV-TK陰性細(xì)胞殺傷的現(xiàn)象。f麂,妓^:旁觀者效應(yīng)首先由Moolten等描述，他們發(fā)現(xiàn)HSV-TK陽性細(xì)胞和HSV-TK陰性細(xì)胞分別為1:9的混合物在加入GCV之后導(dǎo)致完全的細(xì)胞殺傷。業(yè)已描述了旁觀者效應(yīng)的幾種特征1.發(fā)現(xiàn)旁觀者效應(yīng)高度依賴于細(xì)胞-細(xì)胞接觸。2.其程度在不同細(xì)胞類型中不同。3.其不限于同質(zhì)細(xì)胞類型，也不限于不同細(xì)胞類型的混合物。4.發(fā)現(xiàn)較高水平的HSV-TK表達(dá)與較高的旁觀者效應(yīng)相關(guān)聯(lián)。Culver等首先在體內(nèi)才莫型中證實了旁觀者效應(yīng)。他們證實當(dāng)以不同比率植入HSV-TK陽性腫瘤細(xì)胞時腫瘤消退。與體外模型不同，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞-細(xì)胞接觸是體內(nèi)旁觀者效應(yīng)必需的。Kianmanesh等通過在不同的肝葉中植入其中僅有一些為HSV-TK陽性的肺瘤細(xì)胞證實了遠(yuǎn)距離旁觀者效應(yīng)。HSV-TK陽性和陰性病灶都消退。還在不同來源的細(xì)胞之間體內(nèi)證實了旁觀者效應(yīng)?？偠灾?dāng)在基因遞送系統(tǒng)中實施時，HSV-TK及其旁觀者效應(yīng)利于肺瘤抑制的有效手段。但是，迄今為止，臨床研究僅證實了有限的結(jié)果。因此，對于獲得高度特異性的、可靠的血管生成特異性啟動子和核酸構(gòu)建體，從而在受試者的特定組織區(qū)域中提供有效調(diào)節(jié)血管生成的新方法，同時避免毒性副作用和表征現(xiàn)有技術(shù)抗血管生成方法的有限成功，存在著廣泛認(rèn)可的需求，并且將是高度有利的。發(fā)明概述按照本發(fā)明的一個方面，提供含順式調(diào)節(jié)元件的分離多核苷酸，所述順式調(diào)節(jié)元件包含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列，所述分離的多核苷酸能夠在真核細(xì)胞中指導(dǎo)在轉(zhuǎn)錄上與其連接的多核普酸序列的轉(zhuǎn)錄。還提供含該分離多核普酸的核酸構(gòu)建體、含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的細(xì)胞以及接種了所述細(xì)胞的支架。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，提供還含有處于順式調(diào)節(jié)元件的調(diào)節(jié)控制之下的核酸序列的核酸構(gòu)建體。所述核酸序列還可編碼血管生成調(diào)節(jié)物。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，所述核酸序列選自VEGF、p55、促血管生成素-1、bFGF和PDGF-BB。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，所述支架由合成聚合物、細(xì)胞粘附分子或胞外基質(zhì)蛋白組成。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，合成聚合物選自聚乙二醇(PEG)、羥基磷灰石(HA)、聚乙醇酸(PGA)、用編織聚-l-交酯加固的s-己內(nèi)酯和1-乳酸[KN-PCLA]、織物(WV-PCLA)、互連多孔羥基磷灰石《丐陶瓷(IP-CHA)、聚D,L-乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)、不飽和聚酯(丙二醇-富馬酸)共聚物(PPF)、交酯-乙交酯共聚物(PLAGA)、聚羥基鏈烷酸酯(PHA)、聚-4-羥基丁酸酯(P4HB)和聚磷腈。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，細(xì)胞粘附分子選自整聯(lián)蛋白、細(xì)胞間粘附分子(ICAM)l、N-CAM、4丐粘著蛋白、生腱蛋白、gicerin和神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白2(ninjurm2)。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，胞外基質(zhì)蛋白選自血纖蛋白原、膠原蛋白、纖連蛋白、波形蛋白、微管相關(guān)蛋白1D、神經(jīng)突增生因子(NOF)、細(xì)菌纖維素(BC)、層粘連蛋白和明膠。按照本發(fā)明的再一方面，提供在真核細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)核酸序列的方法，該方法通過向受試者施用包含目標(biāo)核酸序列的核酸構(gòu)建體實施，所述目標(biāo)核酸序列處于順式調(diào)節(jié)元件轉(zhuǎn)錄控制之下，所述順式調(diào)節(jié)元件含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列。按照本發(fā)明的又一方面，提供在組織中調(diào)節(jié)血管生成的方法，該方法通過在所述組織中表達(dá)核酸構(gòu)建體實施，所述核酸構(gòu)建體包含(a)內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動子；(b)至少一個拷貝的SEQIDNO:5所示的低氧反應(yīng)元件；和(c)編碼血管生成調(diào)節(jié)物的核酸序列，所述核酸序列處于所述啟動子和所述低氧反應(yīng)元件調(diào)節(jié)控制之下。按照本發(fā)明的另一方面，提供在組織中調(diào)節(jié)血管生成的方法，所述方法通過在所述組織中表達(dá)核酸構(gòu)建體實施，所述核酸構(gòu)建體含編碼血管生成調(diào)節(jié)物的核酸序列，所述核酸序列處于順式調(diào)節(jié)元件調(diào)節(jié)控制之下，所述順式調(diào)節(jié)元件含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列，由此在所述組織中調(diào)節(jié)血管生成。按照所述優(yōu)選實施方案中的其它特征，施用通過選自以下的方法實施全身性體內(nèi)施用、先體外后體內(nèi)(avm)施用由受試者機體取出的細(xì)胞并將細(xì)月包隨后再導(dǎo)入受試者體內(nèi)；以及局部體內(nèi)施用。按照所述優(yōu)選實施方案中的其它特征，所述組織是天然組織或工程化組織。按照所述優(yōu)選實施方案中的其它特征，所述核酸序列編碼促血管生成因子，且調(diào)節(jié)血管生成為上調(diào)血管生成。按照所述優(yōu)選實施方案中的其它特征，所述核酸序列編碼血管生成抑制劑，且調(diào)節(jié)血管生成為下調(diào)血管生成。按照本發(fā)明的再一方面，提供核酸構(gòu)建體，其包含(a)編碼嵌合多肽的第一多核苦酸區(qū)，所述嵌合多肽包含與細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域融合的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(b)笫二多核普酸區(qū)，其編碼能夠在特定組織或細(xì)胞中指導(dǎo)所述嵌合多肽表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件。選擇所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使其能與存在于特定組織或細(xì)胞中的配體結(jié)合，而所述配體與配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活化所述細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域。還提供用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的真核細(xì)胞。按照所述優(yōu)選實施方案中的其它特征，所述順式調(diào)節(jié)元件是選自以PPE-l-3x啟動子、TIE-1啟動子、TIE-2啟動子、內(nèi)皮糖蛋白啟動子、vonWillerband啟動子、KDR/flk-l啟動子、FLT-1啟動子、Egr-l啟動子、ICAM-1啟動子、VCAM-1啟動子、PECAM-1啟動子和主動"永羧肽酶樣蛋白(ACLP)啟動子。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞表面受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞表面受體可選自受體酪氨酸激酶、受體絲氨酸激酶、受體蘇氨酸激酶、細(xì)胞粘附分子和磷酸酶受體。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，所述細(xì)胞毒性分子選自Fas、TNFR和TRAIL。按照本發(fā)明的另一方面，提供在受試者組織中下調(diào)血管生成的方法，該方法通過給所述受試者施用核酸構(gòu)建體實施，所述核酸構(gòu)建體設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞亞群中產(chǎn)生細(xì)胞毒性。所述核酸構(gòu)建體包含(a)編碼嵌合多肽的第一多核普酸區(qū)，所述嵌合多肽包含與細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域融合的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(b)第二多核苷酸區(qū)，其編碼在血管生成細(xì)胞亞群中指導(dǎo)所述嵌合多肽表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件。選擇所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使其能與存在于或提供給血管生成細(xì)胞亞群的配體結(jié)合，且所述配體與配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活化所述細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域，由此下調(diào)所述組織中的血管生成。按照本發(fā)明的再一方面，提供在受試者組織中下調(diào)血管生成的方法，該方法如下實施(a)在受試者的組織中表達(dá)i更計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞亞群中產(chǎn)生細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含(i)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區(qū)，所述嵌合多肽包含與細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域融合的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中選擇所述效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域，從其編;馬在血管生成細(xì)胞亞群"中^旨導(dǎo)所口述嵌合多肽表達(dá)的順式作用調(diào)節(jié)元件；和(b)給所述受試者施用配體，由此在所述組織中下調(diào)血管生成。按照本發(fā)明的又一方面，提供在受試者組織中下調(diào)血管生成的藥物組合物，所述藥物組合物包含作為活性成分的核酸構(gòu)建體和藥學(xué)上可接受的載體，所述核酸構(gòu)建體設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞亞群中產(chǎn)生細(xì)胞毒性。所述核酸構(gòu)建體包含(a)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區(qū)，所述嵌合多肽包含與細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域融合的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(b)第二多核普酸區(qū)，其編碼在血管生成細(xì)胞亞群中指導(dǎo)所述嵌合多肽表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件，其中選擇能夠結(jié)合存在于特定組織或細(xì)胞中之配體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以使所述配體與所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活化細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域。按照本發(fā)明的再一方面，提供治療與過度新血管形成相關(guān)的疾病或狀況的方法。該方法通過施用治療有效量的核酸構(gòu)建體實施，所述核酸構(gòu)建體設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞亞群中產(chǎn)生細(xì)胞毒性，所述核酸構(gòu)建體包含(i)編碼嵌合多肽的第一多核苦酸區(qū)，所述嵌合多肽包含與細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域融合的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(ii)第二多核苷酸區(qū)，其編碼在血管生成細(xì)胞亞群中指導(dǎo)所述嵌合多肽表達(dá)的順式作用調(diào)節(jié)元件；且其中選擇能夠結(jié)合存在于或提供給血管生成細(xì)胞亞群的配胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域，由此在所述組織中下調(diào)血管生成，并治療與過度新血管形成相關(guān)的疾病或狀況。還提供在受試者中治療肺瘤的方法，該方法通過施用治療有效量的核酸構(gòu)建體實施，所述核酸構(gòu)建體設(shè)計并構(gòu)建用于在腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞毒性。按照本發(fā)明的另一方面，提供治療與局部缺血相關(guān)的疾病或狀況的方法，該方法通過施用治療有效量的核酸構(gòu)建體實施，所述核酸構(gòu)建體設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞亞群中產(chǎn)生血管生成，由此在所述組織中上調(diào)血管生成，且治療與局部缺血相關(guān)的疾病或狀況。所述核酸構(gòu)建體包含(i)編碼促血管生成因子的笫一多核苷酸區(qū)；和(ii)第二多核苷酸區(qū)，其編碼在血管生成細(xì)胞亞群中指導(dǎo)促血管生成因子的表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，與局部缺血相關(guān)的疾病或狀況選自傷口愈合、缺血性中風(fēng)(ischemicstroke)、缺血性心臟病和胃腸損害。按照本發(fā)明的再一方面，提供在受試者的組織中下調(diào)血管生成的方法，該方法如下實施(a)在所述組織中表達(dá)設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞中的細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含(i)編碼自殺基因的第一多核苷酸區(qū)；和(ii)第二多核苷酸區(qū)，其編碼能夠在血管生成細(xì)胞中指導(dǎo)所述自殺基因表達(dá)的順式作用調(diào)節(jié)元件；和(b)給所述受試者施用治療量的前藥，所述量在前藥被自殺基因轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘曰衔飼r足以造成所述組織的細(xì)月包凋亡，由此在所述組織中下調(diào)血管生成。按照本發(fā)明的又一方面，提供在受試者的組織中下調(diào)血管生成的藥物組合物，所述藥物組合物包含作為活性成分的核酸構(gòu)建體和藥學(xué)上可接受的載體，所述核酸構(gòu)建體設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞毒性。所述核酸構(gòu)建體包含(a)編碼自殺基因的第一多核苷酸區(qū)，所述自殺基因能夠?qū)⑶八庌D(zhuǎn)變?yōu)槎拘曰衔?；?b)第二多核苷酸區(qū)，其編碼能夠在血管生成細(xì)胞中指導(dǎo)所述自殺基因表達(dá)的順式作用調(diào)節(jié)元件。按照本發(fā)明的另一方面，提供核酸構(gòu)建體，其包含(a)編碼自殺基因的第一多核苷酸區(qū)，所述自殺基因能夠?qū)⑶八庌D(zhuǎn)變?yōu)槎拘曰衔?；?b)第二多核苦酸區(qū)，其編碼能夠在血管生成細(xì)胞中指導(dǎo)所述自殺基因表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件。還提供用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的真核細(xì)胞。按照本發(fā)明的再一方面，提供在受試者組織中下調(diào)血管生成的方法，該方法通過給受試者施用核酸構(gòu)建體實施，所述核酸構(gòu)建體設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞毒性。所述核酸構(gòu)建體包含(a)編碼自殺基因的第一多核苷酸區(qū)；和(b)第二多核苷酸區(qū)，其編碼能夠在血管生成細(xì)胞中指導(dǎo)所述自殺基因表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件，其中選擇能夠?qū)⑶八庌D(zhuǎn)變?yōu)槟軌蛞鸺?xì)胞毒性作用的毒性化合物的自殺基因，由此下調(diào)所述組織中的血管生成。按照本發(fā)明的又另一方面，提供治療與過度新血管形成相關(guān)的疾病或狀況的方法，該方法通過施用治療有效量的本發(fā)明核酸構(gòu)建體實施，所述核酸構(gòu)建體設(shè)計并構(gòu)建用于血管生成細(xì)胞中的細(xì)胞毒性，由此在所述組織中下調(diào)血管生成，并治療與過度新血管形成相關(guān)的疾病或狀況。按照本發(fā)明的另一方面，提供治療受試者中的腫瘤的方法，該方法通過施用治療有效量的核酸構(gòu)建體實施，所述核酸構(gòu)建體i殳計并構(gòu)建用于在肺瘤細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞毒性，所述核酸構(gòu)建體包含(i)編碼自殺基因的第一多核苷酸區(qū)；和(ii)編碼能夠在肺瘤細(xì)胞中指導(dǎo)所述自殺基因表達(dá)的順式作用調(diào)節(jié)元件的第二多核苷酸區(qū)，其中選擇能夠?qū)⑶八庌D(zhuǎn)變?yōu)槟軌蛟谀[瘤細(xì)胞中引起細(xì)胞毒性作用的毒性化合物的自殺基因。按照本發(fā)明的另一方面，提供產(chǎn)品，其包含包裝材料、本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建體和至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述內(nèi)皮特異性啟動子的活性，其中所述包裝材料包括標(biāo)簽或包裝插頁，它們指示所述核酸構(gòu)建體和所述血管生成調(diào)節(jié)劑用于治療受試者中血管生成有關(guān)的疾病或狀況。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，所述自殺基因選自單純皰滲病毒胸苷激酶、水痘帶狀皰滲病毒胸苷激酶和細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，所述前藥選自更昔洛韋、阿昔洛韋、1-5-碘尿嘧啶FIAU、5-氟胞嘧咬、6-甲氧基嘌呤阿糖胞苷及其衍生物。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，所述自殺基因是單純皰滲病毒胸苷激酶，且所述前藥是更昔洛韋、阿昔洛韋、FIAU或其衍生物。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，所述自殺基因是細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶，且所述前藥是5-氟胞嘧啶或其衍生物。按照所述優(yōu)選實施方案的其他特征，所述自殺基因是水痘帶狀皰滲病毒胸普基因，且所述前藥是6-曱氧基噤呤阿糖胞苷或其衍生物。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，所述方法還包括以聯(lián)合形式給受試者施用至少一種額外治療模式，選定的額外治療模式能夠以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述細(xì)胞毒性。所述至少一種額外治療模式可選自化學(xué)療法、放射療法、光線療法和光動力療法、外科手術(shù)、營養(yǎng)療法、切除療法、聯(lián)合的放射療法和化學(xué)療法、臂療法(brachiotherapy)、質(zhì)子射束療法、免疫療法、細(xì)胞療法和質(zhì)子射束放射外科手術(shù)療法。按照下述本發(fā)明優(yōu)選實施方案的其它特征，所述核酸序列包含含順式調(diào)節(jié)元件的分離多核苷酸，所述順式調(diào)節(jié)元件包含共價連接至至少部分SEQIDNO.'16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列，所述分離多核普酸能夠在真核細(xì)胞中指導(dǎo)在轉(zhuǎn)錄上與其連接的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。在所述順式調(diào)節(jié)元件中，至少部分SEQIDNO:15所示序列可位于至少部分SEQIDNO:16所示序列的上游，或者至少部分SEQIDNO:16所示序列可位于至少部分SEQIDNO:15所示序列的上游。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，所述順式調(diào)節(jié)元件還包含至少一個拷貝的SEQIDNO:6所示序列，或至少兩個拷貝的SEQIDNO:6。至少兩個拷貝的SEQIDNCh6可為連續(xù)的。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，至少部分SEQIDNO:15所示序列經(jīng)接頭多核苷酸序列共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列。接頭多核苷酸序列可為啟動子和/或增強子元件。按照所述優(yōu)選實施方案中的其它特征，所述分離多核苷酸包含至少一個拷貝的SEQIDNO:l所示序列。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，所述分離多核苷酸還包含低氧反應(yīng)元件，所述低氧反應(yīng)元件優(yōu)選包含至少一個拷貝的SEQIDNO:5所示序列。按照所迷優(yōu)選實施方案的其它特征，所述順式調(diào)節(jié)元件如SEQIDNO:7所示。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，所述核酸構(gòu)建體還包含條件復(fù)制型腺病毒。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，所述順式調(diào)節(jié)元件是選自以下的內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動子或內(nèi)皮周細(xì)胞特異性啟動子PPE-1啟動子、PPE-l-3x啟動子、TIE-l啟動子、TIE-2啟動子、內(nèi)皮糖蛋白啟動子、vonWillerband啟動子、KDR/flk-1啟動子、FLT-1啟動子、Egr-1啟動子、ICAM-1啟動子、VCAM-1啟動子、PECAM-1啟動子和主動脈羧肽酶樣蛋白(ACLP)啟動子。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，所述方法另外包含給所述組織或所述受試者施用至少一種選擇的能增加腺病毒的拷貝數(shù)和/或增強血管生成調(diào)節(jié)物的表達(dá)的化合物。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，其它化合物是皮質(zhì)類固醇和/或N-乙酰半胱氨酸。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，所迷方法另外包含給所述組織或所述受試者施用至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強順式調(diào)節(jié)元件或內(nèi)皮特異性啟動子的活性。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，所述至少一種血管生成調(diào)節(jié)劑是內(nèi)皮素受體拮抗劑。所述內(nèi)皮受體拮抗劑可以是雙重A-形式和B-形式內(nèi)皮素受體拮抗劑，或B-形式特異性的拮抗劑。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，B-形式特異性的內(nèi)皮素受體拮抗劑選自A192,621;BQ788;Res701-1和Ro46-8443。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，所述內(nèi)皮受體拮抗劑是除波生坦以外的內(nèi)皮素受體拮抗劑。應(yīng)當(dāng)理解，包含順式調(diào)節(jié)元件、本發(fā)明的分離多核普酸的核酸構(gòu)建體可以用于生產(chǎn)藥物，所述藥物用于治療與內(nèi)皮細(xì)胞中過度或不足的血管生成有關(guān)的多種病癥、疾病和狀況，例如肺瘤、轉(zhuǎn)移疾病和局部缺血性疾病。按照所述優(yōu)選實施方案的其它特征，所述藥物與選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑聯(lián)合應(yīng)用，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強順式調(diào)節(jié)元件或內(nèi)皮特異性啟動子的活性，和/或與選擇的至少一種化合物聯(lián)合應(yīng)用，該化合物能增加腺病毒的拷貝數(shù)和/或增強血管生成調(diào)節(jié)物的表達(dá)。本發(fā)明通過提供含具有新增強子元件的順式調(diào)節(jié)元件的分離多核苷酸序列及其使用方法，成功解決了目前已知配置的缺點。新增強子元件可用于制備核酸構(gòu)建體和藥物組合物，它們用于組織特異性地調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)以及通過基因療法用于治療多種病癥、疾病和狀況。具體地說，本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件、分離多核苷酸和藥物組合物可連同選定的轉(zhuǎn)基因一起在內(nèi)皮細(xì)胞中用于特異性地上調(diào)和/或下調(diào)血管生成，由此治療腫瘤、轉(zhuǎn)移疾病和局部缺血性疾病。附圖簡述本文僅作為實例參考附圖描述本發(fā)明?，F(xiàn)在具體地參考附圖的細(xì)節(jié)，要著重強調(diào)的是，所顯示的詳細(xì)資料僅僅作為實例以及用于說明性地論述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，并且提供這些詳細(xì)資料是為了提供被認(rèn)為對本發(fā)明的原理和概念方面最有用和最容易理解的描述。在這方面，并未試圖以比基本上理解本發(fā)明所必需的更為詳細(xì)的方式來顯示本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，連同附圖的說明使本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見如何實際上實施本發(fā)明的幾種形式。在附圖中圖la-b是由TNFR1胞外區(qū)和Fas的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)構(gòu)建并克隆到pcDNA3質(zhì)粒(a)中或腺病毒載體(b)中的Fas嵌合體基因的示意圖。圖2a-b說明促凋亡基因-Fas嵌合體和TNFRl的凋亡活性。圖2a—說明用pcDNA-3-TNFRl(下圖)或者對照空載體(上圖)和編碼GFP的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)。圖2b—說明用pcDNA-3-Fas-c(下圖)或者對照空載體(上圖)和編碼GFP的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞。利用熒光顯微鏡術(shù)顯現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，且從形態(tài)學(xué)上確定凋亡活性。圖3a-f是用促凋亡基因轉(zhuǎn)染的BAEC細(xì)胞的電子顯微鏡術(shù)圖像。轉(zhuǎn)染后24小時，將BAEC細(xì)胞在2.5。/。戊二醛中固定并進(jìn)行加工。顯示的是處于凋亡過程連續(xù)階段的細(xì)胞。圖5a表示AdPPE-Fas-c的PCR分析。泳道1-2—用包含PPE-1啟動子和Fas-c基因的引物獲得的PCR產(chǎn)物。泳道3-4—用Fas-c引物獲得的PCR產(chǎn)物。泳道5-6—在無模板DNA的情況下獲得的PCR產(chǎn)物。圖5b是AdPPE-Fas-c轉(zhuǎn)染的BAEC細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡分析。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，且用針對TNFR1胞外部分的多克隆抗體探測。泳道l-2—pcDNA3-Fas-cBAEC轉(zhuǎn)染細(xì)胞(陽性對照)。泳道3-4—用指示MOI的AdPPE-Fas-c病毒轉(zhuǎn)染的BAEC細(xì)胞。泳道5—非轉(zhuǎn)染細(xì)胞。泳道6-7—用指示MOI的AdPPE-Luc轉(zhuǎn)染的BAEC細(xì)月包。圖6a-d是說明Fas-嵌合體超表達(dá)對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用的顯微照片。用下述物質(zhì)轉(zhuǎn)染BAEC細(xì)胞Ad-PPE-l-3x-Fas-嵌合體(圖6a);Ad-PPE-l-3x-螢光素酶(圖6b);Ad-PPE-l-3x-Fas-嵌合體和Ad-PPEl-3x-GFP(圖6c);Ad-PPE-l-3x-安光素酶和Ad-PPE-l曙3x畫GFP,各為MOIIOOO(圖6d)。顯微照片是在感染后72小時拍攝的，xl0放大。圖7是說明Ad-PPE-l-3x-Fas-嵌合體對內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡特異性作用的直方圖。在用Ad-PPE-l-!3x-Fas-嵌合體或?qū)φ?螢光素酶)病毒感染后72小時通過結(jié)晶紫染色，定量內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC、HUVEC)和非內(nèi)皮細(xì)胞(正常皮膚成纖維細(xì)胞-NSF)的生存力。圖8顯示施用TNFot對Fas-嵌合體介導(dǎo)的凋亡的劑量反應(yīng)作用。用Ad-PPE-l-3x-Fas-c感染BAEC。感染后48小時，向生長培養(yǎng)基中(以指示的劑量)添加TNF。24小時后通過結(jié)晶紫測定確定生存力。圖9a-e是說明由TNFot配體和Fas-c受體的協(xié)同作用介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞特異性凋亡的顯微照片。所指示的細(xì)胞在存在或不存在TNFa(10ng/ml)的情況于Ad-PPE-l-3x-Fas-c感染后48小時下溫育；結(jié)晶紫染色在感染后72小時進(jìn)行。圖10a是說明Ad-CMV-Fas-c對內(nèi)皮細(xì)胞的TNFa依賴性凋亡作用的劑量反應(yīng)曲線。用指示MOI的Ad-CMV-Fas-嵌合體感染的BAEC細(xì)胞的生存力在與TNFa溫育后確定。圖10b-d表示TNFa配體和Ad-CMV-Fas-嵌合體對非內(nèi)皮細(xì)胞NSF的凋亡作用。圖10b—經(jīng)對照病毒感染的NSF。圖10c—經(jīng)Ad-CMV-Fas-嵌合體感染的NSF。圖10d—經(jīng)Ad-CMV-Fas-嵌合體感染并與TNF(10ng/ml)溫育的NSF。圖lla-c說明Ad-PPE-l-3x-Fas-c的體內(nèi)抗胂瘤作用。當(dāng)腫癌可觸知時，用Ad-PPE-l-3x-Fas-c、Ad-CMV-Fas-嵌合體、對照病毒或鹽水靜脈內(nèi)注射接種有B16黑素瘤細(xì)胞的小鼠。圖lla—在治療時間段期間測量的腫瘤面積。圖llb—治療時間段結(jié)束時的腫瘤重量。圖llc一圖示Ad-PPE-l-3x-Fas-c治療小鼠和對照小鼠中的腫瘤狀態(tài)。圖12是直方圖，說明使用B2B細(xì)胞系(表達(dá)內(nèi)皮素的支氣管細(xì)胞系)作為對照時本發(fā)明的增強子元件對牛內(nèi)皮細(xì)胞系和人內(nèi)皮細(xì)胞系中的螢光素酶表達(dá)的作用。圖13是直方圖，說明腺病毒載體中的本發(fā)明啟動子對各種細(xì)胞系中的螢光素酶表達(dá)的內(nèi)皮特異性。圖14A-B是顯微照片，表明了在BAEC細(xì)胞系中由本發(fā)明的Ad5PPE-l-3X(14A)和Ad5CMV(14B)對照構(gòu)建體控制的GFP表達(dá)。圖15是在內(nèi)皮細(xì)月包和非內(nèi)皮細(xì)月包中由pACPPE-l-3Xp55、pACPPE-l-3X螢光素酶和pCCMVp55誘導(dǎo)的凋亡百分比的直方圖。圖16是直方圖，說明將本發(fā)明的增強子元件導(dǎo)入啟動子構(gòu)建體中對低氧應(yīng)答的作用。圖17是直方圖，說明將本發(fā)明的增強子元件導(dǎo)入腺病毒載體構(gòu)建體的啟動子中對低氧應(yīng)答的作用。圖18是直方圖，說明將本發(fā)明的增強子元件導(dǎo)入啟動子中對表達(dá)內(nèi)皮素的牛和人內(nèi)皮細(xì)胞系中的表達(dá)水平的作用。圖19是直方圖，說明在注射含有內(nèi)皮啟動子(PPE-1)或?qū)φ?CMV)啟動子的腺病毒構(gòu)建體后在各種器官中觀察到的報告基因的表達(dá)水平。圖20A-B是兩張顯微照片，說明Ad5CMVGFP構(gòu)建體(圖20A)和Ad5PPE-l-GFP構(gòu)建體(圖20B)在注射所述構(gòu)建體的小鼠肝組織中的細(xì)胞表達(dá)。圖21是直方圖，說明將本發(fā)明的增強子元件導(dǎo)入啟動子中對內(nèi)皮細(xì)胞系和非內(nèi)皮細(xì)胞系中的表達(dá)水平的作用。圖22是直方圖，說明將本發(fā)明的增強子元件導(dǎo)入啟動子中對內(nèi)皮細(xì)胞系和非內(nèi)皮細(xì)胞系中的表達(dá)水平的作用。圖23A-C是顯微照片，分別說明Ad5PPE-l-3XGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞、Ad5PPE-lGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和Ad5CMVGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的GFP表達(dá)。圖24A-B說明了分別用moi-l的Ad5PPE-l-3XGFP和Ad5CMVGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的SMC中的GFP表達(dá)。圖25A-B顯示在HeLa細(xì)胞中進(jìn)行的與圖24A-B的實驗相似的實驗的結(jié)果。圖26A-B顯示在HepG2細(xì)胞中進(jìn)行的與圖24A-B的實-瞼相似的實驗的結(jié)果。圖27A-B顯示在NSF細(xì)胞中進(jìn)行的與圖24A-B的實驗相似的實驗的結(jié)果。圖28A-B是顯樣吏照片，說明在分別注射Ad5PPE-lGFP構(gòu)建體和Ad5PPE-l-3XGFP構(gòu)建體的小鼠血管內(nèi)襯的內(nèi)皮細(xì)胞中的GFP表達(dá)。圖29A-C是顯微照片，說明得自經(jīng)注射的小鼠腎組織的結(jié)果。注射Ad5CMVGFP的小鼠(圖29A);注射Ad5PPE-lGFP的小鼠(圖29B;在血管壁中可見略高的GFP表達(dá)；箭標(biāo)所指)和注射Ad5PPE-l-3XGFP的小鼠(圖29C)。圖30A-C說明在脾組織切片上進(jìn)行的、與圖29A-C中描繪的實驗相似的實馬全。圖31A-D說明注射鹽水的對照小鼠(圖31A)、注射Ad5CMVGFP的小鼠(圖31B)、注射Ad5PPE-lGFP的小鼠(圖31C)和注射Ad5PPE-l-3XGFP的小鼠(圖31D)的轉(zhuǎn)移肺中的GFP表達(dá)?？笴d31免疫染色(圖31C'-31D')證實在每種轉(zhuǎn)移組織中GFP表達(dá)和CD31表達(dá)共定位。圖32是直方圖，說明用含有鼠PPE-1啟動子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BAEC中的螢光素酶活性(光單位/pg蛋白)在轉(zhuǎn)染細(xì)胞于低氧條件下溫育時明顯更高。圖33是與圖32相同的直方圖，不同的只是4吏用Ad5PPE-lLuc和Ad5CMVLuc。圖34是與圖33相同的直方圖，說明在不同細(xì)胞系中的低氧效應(yīng)。圖35是直方圖，說明本發(fā)明的3X序列對BAEC細(xì)胞中PPE-1低氧應(yīng)答的作用。細(xì)胞用Ad5PPE-lLuc和Ad5PPE-l-3Xluc轉(zhuǎn)導(dǎo)。圖36是直方圖，顯示在股動脈結(jié)扎后PPE-l-Luc轉(zhuǎn)基因小鼠各種組織中的螢光素酶表達(dá)水平。圖37A-B是結(jié)合本發(fā)明使用的構(gòu)建體的質(zhì)粒圖譜。圖38A-F說明Ad5PPE-l-3XVEGF和Ad5CMVVEGF對小鼠局部缺血肢體的血液灌注和血管生成的作用。圖38A-D是結(jié)扎后21天捕獲的各種治療組小鼠局部缺血肢體的代表性超聲(US)血管造影灌注圖像。黃色信號代表強灌注。該圖像的右側(cè)代表肢體遠(yuǎn)端。圖38A—Ad5PPE-l-3XVEGF治療小鼠；圖38B—Ad5CMVVEGF治療小鼠；圖38C—對照，鹽水治療小鼠；圖38D—對照，正常肢體。圖38E-F是直方圖，說明各種治療組US圖像的平均信號強度(圖38E);根據(jù)各種治療組中CD31+細(xì)胞數(shù)目/mm2測量的平均毛細(xì)血管密度(圖38F)。圖39是直方圖，說明在用Ad5PPE-lLuc(空心條)和Ad5CMVLuc(黑色條)轉(zhuǎn)導(dǎo)的增殖和靜息牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)中的螢光素酶活性。圖40是直方圖，說明用Ad5PPE-lLuc轉(zhuǎn)導(dǎo)的BAEC在正常增殖期間、靜息狀態(tài)和加入VEGF后的快速增殖期間的螢光素酶活性。圖41A-B是直方圖，說明在正常注射Ad5PPE-lLuc和Ad5CMVLuc的C57BL/6小鼠主動脈(圖41A)和肝(圖41B)中的螢光素酶活性(光單位/pg蛋白)。注射后1天0=13)、5天(11=34)、14天(11=32)、30天(n=20)和90天(n-ll)測定活性。圖42A-B是直方圖，說明在正常注射的BALB/C小鼠中注射Ad5PPE-lLuc(空心條)或Ad5CMVLuc(黑色條)后5天(圖42A)和14天(圖42B)(每個時間點均為n=10)檢測的相對營光素酶活性(光單位/iug蛋白)。活性以每只動物全身螢光素酶表達(dá)的百分比表示。圖43是描繪由ApoE缺陷型小鼠解剖的主動脈通過蘇丹(Sudan)-IV著色的現(xiàn)有技術(shù)圖像。胸主動脈含有較少的著紅色的動脈粥樣硬化病變，而腹區(qū)包含許多著紅色的動脈粥樣硬化病變。(摘自ImagingofAorticatheroscleroticlesionsby125I-HDLand125I-BSA.A.Shaish等，Pathobiology2001;69:225-29)。圖44是直方圖，說明給ApoE缺陷型小鼠全身注射Ad5PPE-1Luc(空心條；n=12)或Ad5CMVLuc(黑色條；n=12)后5天檢測的絕對螢光素酶活性(光單位/pg蛋白)。從腹主動脈觀測的螢光素酶活性含高病變水平，而從胸區(qū)觀測的縈光素酶活性(低病變水平)。圖45是直方圖，說明給誘發(fā)傷口愈合的C57BL/6小鼠全身注射AMPPE-lLuc(黑色條)或AMCMVLuc(空心條)后5天的絕對螢光素酶活性(光單位/pg蛋白)。圖46是直方圖，說明誘發(fā)Lewis肺癌的小鼠的正常肺、轉(zhuǎn)移肺和原發(fā)性腫瘤中的螢光素酶活性。通過給原發(fā)性腫瘤模型的背部和轉(zhuǎn)移模型的爪墊注射D122-96細(xì)胞誘發(fā)Lewis肺癌。全身注射Ad5PPE-lLuc(n=9;空心條)或Ad5CMVLuc(n=12;黑色條)后5天測量螢光素酶活性?；钚砸怨鈫挝?嗎蛋白表示。圖47A-D是顯微照片，說明在腫瘤內(nèi)注射Ad5PPE-lGFP后在帶有LLC的小鼠肺和胂瘤中的GFP表達(dá)和組織形態(tài)學(xué)。將組織在OCT中冷凍，然后用恒冷切片機切成IOiam的切片。所有照片都在放大25倍的情況下拍攝。圖47A—肺轉(zhuǎn)移的血管生成性血管中的GFP;圖47B—圖47A中所拍攝切片的CD31抗體免疫染色；圖47C—原發(fā)性胂瘤血管中的GFP表達(dá)；圖47D—說明血管的C切片的相差。圖48是直方圖，說明注射Ad5CMVLuc、Ad5PPE-lLuc和Ad5PPE-l-3X-Luc的"i秀發(fā)的Lewis肺癌小鼠的正常肺和轉(zhuǎn)移肺中的安光素酶表達(dá)。通過給轉(zhuǎn)移才莫型的爪墊注射D122-96細(xì)胞誘發(fā)Lewis肺癌。全身注射Ad5CMVLuc(n=7;黑色條)、Ad5PPE-lLuc(n=6;灰色條)或Ad5PPE-l-3XLuc(n=13;褐色條)后5天測量螢光素酶活性?；钚砸怨鈫挝?lug蛋白表示。圖49是直方圖，說明注射Ad5CMV、Ad5PPE-lLuc和Ad5PPE-l(3X)的誘發(fā)的Lewis肺癌小鼠的正常肺和肺轉(zhuǎn)移中以肝活性的百分比表示的螢光素酶活性(其中肝中的活性為100%)。圖50A-B是顯微照片，說明注射Ad5PPE-l-3X-GFP的LLC肺轉(zhuǎn)移小鼠中GFP表達(dá)(圖50A)和CD31免疫染色(圖50B)共定位。圖51是直方圖，說明股結(jié)扎后2天、5天、10天和18天和對照(未結(jié)扎動物一第0天；每組n:8)的PPE-l螢光素酶轉(zhuǎn)基因小鼠肌肉(局部缺血和正常)中的螢光素酶活性(光單位/pg蛋白)。圖52是直方圖，說明股結(jié)扎后5天(11=6)、10天0=6)和18天(n=8)以及對照(未結(jié)扎動物一第0天)的PPE-1螢光素酶轉(zhuǎn)基因小鼠的肝、肺和肌肉主動脈(局部缺血和正常)中的安光素酶活性(光單位/Vg蛋白)。圖53是直方圖，說明在原發(fā)性腫瘤中注射Ad5CMVLuc(黑色條)或Ad5PPE-lLuc(空心條)的LLC小鼠肝、肺和原發(fā)性肺瘤中檢測的營光素酶活性(光單位/pg蛋白)。圖54A-H是原位雜交圖像，說明各種轉(zhuǎn)基因的組織特異性表達(dá)或組成型表達(dá)的組織分布。圖54A-C說明與以下的代表性局部缺血肌肉上的VEGF特異性反義探針的原位雜交A，Ad5PPE-l-3XVEGF治療小鼠；B,Ad5CMVVEGF治療小鼠；C,鹽水治療小鼠；D,Ad5CMVVEGF治療小鼠的肝切片。箭標(biāo)表示陽性染色細(xì)胞。圖54E-G說明與來自以下的代表性局部缺血肌肉的PDGF-B特異性反義探針的原位雜交E,Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療小鼠:F,Ad5CMVPDGF-B治療小鼠:G,鹽水治療小鼠；H,Ad5CMVPDGF-B治療小鼠的肝切片。圖55A-B是直方圖，說明Ad5PPE-l-3XVEGF或Ad5CMVVEGF對小鼠局部缺血肢體中的血液灌注和血管生成的長期作用。A,股動脈結(jié)扎后50天各種治療組US圖像中的平均信號強度。B,股動脈結(jié)扎后70天根據(jù)各種治療組中CD31+細(xì)胞數(shù)目/mm2測量的平均毛細(xì)血管密度。圖56A-D是直方圖，說明Ad5PPE-l-3XPDGF-B對小鼠局部缺血肢體新血管形成的早期作用和長期作用。圖56A-B—通過US成像測量的平均灌注強度(56A,股動脈結(jié)扎后30天；56B，股動脈結(jié)扎后80天)。圖56C-D—根據(jù)各種治療組中CD31+細(xì)胞數(shù)目/mm2測量的平均毛細(xì)血管密度(56C，股動脈結(jié)扎后35天；56D,股動脈結(jié)扎后90天)。圖57A-G說明單獨或聯(lián)合使用處于內(nèi)皮特異性啟動子或組成型啟動子調(diào)節(jié)之下的PDGF-B和VEGF的血管生成療法對小鼠局部缺血肢體的新血管形成和血流的長期作用。A,股動脈結(jié)扎后80天各種治療組US圖像中的平均信號強度。B，股動脈結(jié)扎后90天根據(jù)各種治療組CD31+細(xì)胞數(shù)目/mm2測量的平均毛細(xì)血管密度。圖57C-G是股動脈結(jié)扎后90天募集到局部缺血肢體肌肉成熟血管內(nèi)的平滑肌細(xì)胞。平滑肌細(xì)胞用抗a-SM肌動蛋白抗體進(jìn)行免疫染色(著紅色，X20)。C，Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療的小鼠D,聯(lián)合療法治療的小鼠；E,Ad5PPE-l-3XVEGF治療小鼠;F，對照，Ad5PPE-l-3XGFP治療小鼠;G,正常對側(cè)肢體(注意到僅大血管被染色)。圖58說明動脈結(jié)扎后50天單獨的或與促血管生成因子VEGF聯(lián)用的PDGF-B對小鼠局部缺血肢體血液灌注的作用。圖59是基因定向酶前藥治療(gene-directedenzymeprodrugtherapy)(GDEPT)基本原理的示意圖。圖60A-B是代表質(zhì)粒pEL8(3x)-TK構(gòu)建的示意圖。圖60A是代表質(zhì)粒pEL8(3x)-TK構(gòu)建的示意圖。圖60B是質(zhì)粒pACPPE-l(3x)-TK的圖語。圖61是通過UV熒光顯現(xiàn)的AdPPE-l(3x)-TK載體PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠分離。使用兩種引物正向引物5'-ctcttgattcttgaactctg-3'(前內(nèi)皮素原啟動子序列中的455-474bp)(SEQIDNO:9)和反向引物5'-taaggcatgcccattgttat畫3'(HSV-TK基因序列中的1065-1084bp)(SEQIDNO:10)。其它載體的特異性引物未產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。觀察到lkb條帶，證實在AdPPE-l(3x)-TK病毒中存在PPE-l(3x)啟動子和HSV-TK基因。泳道l:100bp大小的大小標(biāo)記梯。泳道2:pACPPE-l(3x)-TK質(zhì)粒。泳道3:AdPPE-l(3x)-TK病毒。泳道4:無DNA。圖62A-C顯示了載體AdPPE-l(3x)-TK(圖62a)、AdPPE-l(3x)-Luc(圖62b)和AdCMV-TK(圖62c)的線性示意圖。圖63是一系列顯微照片，說明處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK的優(yōu)良內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞毒性。用O.l、1、10、100和1000感染復(fù)數(shù)(m.o丄)的AdPPE-l(3x)-TK、AdCMV-TK和AdPPE-l(3x)-Luc轉(zhuǎn)導(dǎo)牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后4小時加入GCV(lpg/ml)。對照是用無GCV的載體或無載體的GCV轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。實驗在96孔板中進(jìn)行兩次，每組12個孑L。兩個對照都不誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(未列出數(shù)據(jù))。以顯著低于AdCMV-TK的m.o丄在AdPPE-l(3x)+GCV處理細(xì)胞中明顯觀察到細(xì)胞毒性特有的形態(tài)學(xué)變化(細(xì)胞擴大、延伸和膨脹)和細(xì)胞毒性(匯合喪失)。用AdPPE-l(3x)-Luc轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞保持健康(小尺寸、圓形并匯合)。圖64圖示了處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK的內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞毒性。BAEC在96孔板中制備，并如圖13轉(zhuǎn)導(dǎo)，接著在轉(zhuǎn)導(dǎo)后4小時加入1fig/mlGCV。加入載體后10天，使用結(jié)晶紫染色測定細(xì)胞生存力。觀察到AdPPE-l(3x)+GCV在高m.o丄時的優(yōu)良細(xì)胞毒性。圖65是一系列顯微照片，說明在PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK和更昔洛韋施用的內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞毒性的優(yōu)良協(xié)同作用。如上文所述用感染復(fù)數(shù)(m.o丄)為10的AdPPE-l(3x)-TK、AdCMV-TK和AdPPE-l(3x)-Luc轉(zhuǎn)導(dǎo)牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC),并使其接觸在轉(zhuǎn)導(dǎo)后4小時加入的濃度漸增的GCV(如所示的0.001-10|ug/ml)。對照為用無GCV的載體或無載體的GCV轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)月包。實-驗在96孔板中進(jìn)4亍兩次，每組12個孔。兩個對照都不誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(未列出數(shù)據(jù))。在顯著低于接觸AdCMV-TK的細(xì)胞的GCV濃度，于AdPPE-l(3x)+GCV處理細(xì)胞中明顯觀察到細(xì)胞毒性特有的形態(tài)學(xué)變化(細(xì)胞擴大、延伸和膨脹)和細(xì)胞毒性(匯合喪失)。圖66圖示了在PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK和更昔洛韋施用的內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞毒性的協(xié)同作用。BAEC在96孔板中制備，并如圖65轉(zhuǎn)導(dǎo)，接著在轉(zhuǎn)導(dǎo)后4小時加入漸增濃度(0.0001-10lug/ml)的GCV。加入載體后IO天，使用結(jié)晶紫染色測定細(xì)胞生存力。與AdCMV-TK的強組成型TK表達(dá)相比，觀察到AdPPE-l(3x)+GCV在高于0.01pg/ml的GCV濃度時的優(yōu)良細(xì)胞毒性。圖67是一系列顯微照片，說明處于PPE-1(3x)啟動子控制之下的TK和更昔洛韋施用的特異性協(xié)同內(nèi)皮細(xì)胞毒性。內(nèi)皮細(xì)胞[牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)]和非內(nèi)皮細(xì)胞[人肝癌細(xì)胞(HepG-2)、人正常皮膚成纖維細(xì)胞(NSF)]用m.o丄為10的AdPPE-l(3x)-TK、AdPPE-l(3x)-Luc或AdCMV-TK轉(zhuǎn)導(dǎo)，接著在轉(zhuǎn)導(dǎo)后4小時施用1pg/mlGCV。實驗在96孔板中進(jìn)行兩次，每組12個孔。轉(zhuǎn)導(dǎo)后4天用顯微鏡檢測細(xì)胞毒性和細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。觀察到BAEC和HUVEC培養(yǎng)物中AdPPE-l(3x)-TK+GCV的優(yōu)良細(xì)胞毒性作用[細(xì)胞毒性特有的形態(tài)學(xué)變化(細(xì)胞擴大、延伸和膨脹)和細(xì)胞毒性(匯合喪失)],及這種作用在HepG-2和NSF培養(yǎng)物中不存在(細(xì)胞保持小尺寸、圓形和匯合)。AdPPE-l(3x)-Luc+GCV對所有細(xì)胞類型都無毒性。圖68是直方圖，代表處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK和更昔洛韋施用的特異性協(xié)同內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞毒性。內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC和HUVEC)和非內(nèi)皮細(xì)胞(HepG-2和NSF)在96孔板中制備，并如圖67轉(zhuǎn)導(dǎo)，接著在轉(zhuǎn)導(dǎo)后4小時加入濃度漸增(liug/ml)的GCV。加入載體后10天，使用結(jié)晶紫染色測定細(xì)胞生存力。與AdCMV-TK+GCV的非特異性細(xì)胞毒性相比，觀察到AdPPE-l(3x)+GCV的優(yōu)良內(nèi)皮特異性細(xì)胞毒性。圖69是一系列直方圖，說明處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK和更昔洛韋施用在極端感染復(fù)數(shù)時的內(nèi)皮選擇性細(xì)胞毒性。如在圖66中一樣，以較高m.o丄100的AdPPE-l(3x)-TK、AdPPE畫l(3x)畫Luc或AdCMV-TK轉(zhuǎn)導(dǎo)非內(nèi)皮細(xì)胞(NSF),接著在轉(zhuǎn)導(dǎo)后4小時施用1jug/mlGCV。實驗在96孔板中進(jìn)行兩次，每組12個孔。轉(zhuǎn)導(dǎo)后4天用顯微鏡斥企測細(xì)胞毒性和細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。與AdCMV-TK+GCV的非特異性細(xì)胞毒性相比，觀察到AdPPE-l(3x)-TK+GCV對NSF細(xì)胞形態(tài)學(xué)沒有作用。圖70是一系列照片，說明處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內(nèi)表達(dá)和更昔洛韋(GCV)施用對轉(zhuǎn)移生長的協(xié)同抑制。在14周齡雄性C57BL/6小鼠(n=77)中通過將LLC肺瘤細(xì)胞接種入左爪墊誘發(fā)Lewis肺癌(LLC)肺轉(zhuǎn)移，該爪墊在原發(fā)性腫瘤一達(dá)到7mm大小時就截除。5天后，將1011PFU的腺病毒載體[AdPPE-l(3x)-TK+GCV;AdCMV-TK+GCV;無GCV的AdPPE-l(3x)-TK]注射入尾靜脈，接著注射100mg/kgGCV達(dá)14天。在載體注射后第24天時處死小鼠，取出肺進(jìn)行一全查和分析。對照小鼠接受鹽水和GCV。與AdCMV-TK+GCV;無GCV的AdPPE-1和無腺病毒的GCV治療的小鼠肺相比，在AdPPE-l(3x)+GCV治療的小鼠肺中觀察到程度顯著降低的轉(zhuǎn)移擴散。圖71是直方圖，說明處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內(nèi)表達(dá)和更昔洛韋(GCV)施用對轉(zhuǎn)移生長的協(xié)同抑制。如上文所述在C57BL/6小鼠中誘發(fā)肺轉(zhuǎn)移，且用1011PFU的腺病毒載體[AdPPE-l(3x)曙TK+GCV;AdCMV曙TK+GCV;無GCV的AdPPE-l(3x)-TK]和GCV(100mg/kg)治療小鼠。在載體注射后第24天時處死小鼠，且取出肺進(jìn)行肺轉(zhuǎn)移評價。對照小鼠接受鹽水和GCV。與無GCV(超過85%)和AdCMV-TK+GCV以及鹽水+GCV對照(超過75%)中的轉(zhuǎn)移塊相比，在AdPPE-l(3x)+GCV治療小鼠中觀察到對轉(zhuǎn)移塊的顯著抑制。圖72a-72c是肺轉(zhuǎn)移的代表性組織病理學(xué)切片，說明處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內(nèi)表達(dá)和更昔洛韋(GCV)施用對轉(zhuǎn)移病理的協(xié)同抑制。如上文所述在C57BL/6小鼠中誘發(fā)肺轉(zhuǎn)移，且用10"PFU的腺病毒載體[AdPPE-l(3x)-TK+GCV;AdCMV國TK+GCV;無GCV的AdPPE-l(3x)-TK]和GCV(100mg/kg)治療小鼠。在載體注射后第24天時處死小鼠，且制作肺轉(zhuǎn)移組織(圖72a和72b)或肺組織(圖72c)的切片，并用蘇木精和伊紅染色。在施用AdPPE-l(3x)+GCV的肺轉(zhuǎn)移中觀察到大范圍的中心壞死和眾多單核浸潤物簇(圖72a和72b)。圖73a-73b是肺轉(zhuǎn)移的TUNEL和抗胱天蛋白酶-3染色的誘發(fā)性LLC肺轉(zhuǎn)移的代表性組織病理學(xué)切片，說明處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內(nèi)表達(dá)和更昔洛韋(GCV)施用對腫瘤凋亡的協(xié)同增強作用。對如圖71a-71b所述誘發(fā)和制備的LLC肺轉(zhuǎn)移的切片進(jìn)行固定并包埋在石蠟中，通過4吏用Klenow-FragEl(Oncogene,Cambridge,MA)的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)測定(圖73a)和抗胱天蛋白酶-3特異性免疫組織病理學(xué)(73b)分析凋亡指示物。在靜脈內(nèi)AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠的肺轉(zhuǎn)移中觀察到凋亡增強。圖74a和74b是用肺轉(zhuǎn)移的TUNEL和抗胱天蛋白酶-3染色的誘發(fā)性LLC肺轉(zhuǎn)移的代表性組織病理學(xué)切片，說明處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內(nèi)表達(dá)和更昔洛韋(GCV)施用對腫瘤凋亡的內(nèi)皮特異性協(xié)同增強作用。如圖73a-73b所述對誘發(fā)和制備的LLC肺轉(zhuǎn)移的切片進(jìn)行固定并包埋在石蠟中，且通過使用Klenow-FragEl(Oncogene,Cambridge,MA)的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)測定(圖74a)和抗胱天蛋白酶-3特異性免疫組織病理學(xué)(74b)分析凋亡指示物。黑色箭標(biāo)指示紅細(xì)胞，紅色箭標(biāo)指示凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞，而白色箭標(biāo)指示凋亡腫瘤細(xì)胞。在靜脈內(nèi)AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠的肺轉(zhuǎn)移的血管(內(nèi)皮)區(qū)中觀察到凋亡增強。圖75a-75d是鼠肺癌組織的代表性免疫組織病理學(xué)切片，說明處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內(nèi)表達(dá)和更昔洛韋(GCV)施用對血管生成的內(nèi)皮特異性協(xié)同抑制作用。如圖73a-73b所述對誘發(fā)和制備的LLC肺轉(zhuǎn)移(圖75a)、肝(圖75c)和正常肺組織(圖75b)的切片進(jìn)行固定并包埋在石蠟中，且通過抗CD-31免疫熒光分析血管生成指示物。在AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠的肺轉(zhuǎn)移中觀察到短的、模糊的血管，沒有連續(xù)性或分支。圖75d是直方圖，顯示了肺轉(zhuǎn)移血管形成(血管生成)的基于計算機的血管密度評價(ImagePro-Plus,MediaCyberneticksIncorporated)。左條AdPPE-l(3x)TK+GCV;右條無GCV的AdPPE-l(3x)TK。圖76是鼠肝組織的代表性組織病理學(xué)切片，說明在處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內(nèi)表達(dá)和更昔洛韋(GCV)施用中沒有肝臟毒性。如圖73a-73b所述誘發(fā)和制備的帶有LLC肺轉(zhuǎn)移的小鼠肝切片進(jìn)行固定并包埋在石蠟中，且用蘇木精和伊紅染色。與用組成型表達(dá)的AdCMV-TK+GCV(右圖)治療小鼠肝中的顯著細(xì)胞毒性相比，在AdPPE-l-TK+GCVpx)(左圖)治療小鼠肝中沒有觀察到細(xì)胞毒性指示物。圖77描述了RT-PCR分析，說明了處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK表達(dá)和更昔洛韋(GCV)施用的器官特異性表達(dá)。如圖73a-73b所述，在9只15周齡的性肺瘤去除后14天靜脈內(nèi)遞送腺病毒載體[AdPPE-l(3x)-TK和AdCMV-TK]和鹽水對照。在注射載體后6天處死小鼠，且收獲器官。如下文所述提取不同器官的RNA,且用PPE-l(3x)啟動子引物和HSV-TK基因引物通過RT-PCRPCR擴增PPE-l(3x)和HSV-TK轉(zhuǎn)錄物。觀察到處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK的內(nèi)皮特異性表達(dá)(中部，底部圖)。圖78a和78b圖示了Balb/c鼠結(jié)腸癌肺瘤才莫型中的亞治療和無毒輻射范圍。用CT-26結(jié)腸癌細(xì)胞接種入20只8周齡Balb/c雄性小鼠的左股，且其在肺瘤直徑已達(dá)到4-6mm時在全身麻醉下接受0、5、10或15Gy的局部輻射。對于肺瘤體積(76a),按照式V=7i/6xa2x(3(a是短軸，且P是長軸)計算腫瘤軸。5Gy劑量僅誘導(dǎo)部分的、非統(tǒng)計學(xué)顯著的腫瘤發(fā)展延遲(圖78a),且沒有顯著的體重減輕(圖78b)。圖79a-79g說明聯(lián)合亞治療放療與處于PPE-1(3x)啟動子控制之下的TK表達(dá)和更昔洛韋(GCV)施用在鼠結(jié)腸癌中協(xié)同抑制腫瘤生長。用CT-26結(jié)腸癌胂瘤細(xì)胞接種100只8周齡的雄性Balb/C小鼠。胂瘤軸一達(dá)到4-6mm,就將1011PFU的病毒載體[AdPPE-l(3x)-TK或AdCMV-TK]靜脈內(nèi)注射入尾靜脈，接著按指示每日腹膜內(nèi)注射GCV(100mg/kg體重)達(dá)14天。載體施用后3天，用局部5Gy劑量輻射小鼠。按照式V=7i/6xa2x(3(a是短軸，且(3是長軸)評價腫瘤體積。圖79a顯示了載體注射后14天時的平均腫瘤體積士S.E.。圖79b顯示了放療治療組中隨時間變化的平均胂瘤體積進(jìn)展。圖79c顯示了AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠中隨時間變化的平均胂瘤體積進(jìn)展。圖79d顯示了AdCMV-TK十GCV治療小鼠中隨時間變化的平均胂瘤體積進(jìn)展。圖79e顯示了對照鹽水+GCV治療小鼠中隨時間變化的平均腫瘤體積進(jìn)展。圖79f顯示了無GCV的AdPPE-l(3x)-TK治療小鼠中隨時間變化的平均肺瘤體積進(jìn)展。圖79g是處死當(dāng)天Balb/C小鼠中CT-26原發(fā)性肺瘤總病理學(xué)的代表性示例。與非耙向載體AdCMV-TK(p-0.04)(圖79c-79f)相比,觀察到放療僅顯著加強血管生成性內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄粑向的載體AdPPE-l(3x)-TK。在沒有放療的情況下，采用所有病毒載體的治療方案都是無效的。圖80a-80b是原發(fā)性CT-26胂瘤的代表性組織病理學(xué)切片，表明亞治療放療與處于PPE-1(3x)啟動子控制之下的TK表達(dá)和更昔洛韋(GCV)施用聯(lián)合在鼠結(jié)腸癌中協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤壞死。對如圖79a-79g所述誘發(fā)和制備的CT-26結(jié)腸癌胂瘤切片進(jìn)行固定并包埋在石蠟中，且用蘇木精和伊紅染色。觀察聯(lián)合的AdPPE-l(3x)+GCV+低劑量放療情況下的壞死區(qū)域(圖80a)和肉芽組織區(qū)域(圖80b)。圖81a-81b是用TUNEL和抗胱天蛋白酶-3染色的誘發(fā)原發(fā)性結(jié)腸癌腫瘤的代表性組織病理學(xué)切片，說明放療與處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內(nèi)表達(dá)和更昔洛韋(GCV)施用聯(lián)合協(xié)同增強內(nèi)皮細(xì)胞和肺瘤的凋亡。對如圖77a-77g所述誘發(fā)和制備的CT-26原發(fā)性結(jié)腸癌肺瘤切片進(jìn)行固定并包埋在石蠟中，且通過使用Klenow-FragEl(OncogeneCambridge,MA)的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)測定(圖81a)和抗胱天蛋白酶-3特異性免疫組織病理學(xué)(81b)測定凋亡指示物。在用聯(lián)合的放療和靜脈內(nèi)AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠的腫瘤中觀察到大范圍的凋亡(圖81a)和胱天蛋白酶-3陽性內(nèi)皮細(xì)胞(81b)。圖82是用抗胱天蛋白酶-3染色的誘發(fā)原發(fā)性結(jié)腸癌腫瘤的代表性組織病理學(xué)切片，表明放療與處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內(nèi)表達(dá)和更昔洛韋(GCV)施用聯(lián)合協(xié)同增強內(nèi)皮細(xì)胞和肺瘤的凋亡。對如圖79a-79g所述誘發(fā)和制備的CT-26原發(fā)性結(jié)腸癌腫瘤切片進(jìn)行固定并包埋在石蠟中，且通過抗胱天蛋白酶-3特異性免疫組織病理學(xué)測定凋亡指示物。黑色箭標(biāo)指示紅細(xì)胞，紅色箭標(biāo)指示凋亡內(nèi)皮細(xì)胞，且白色箭標(biāo)指示凋亡肺瘤細(xì)胞。觀察到GCV依賴性凋亡作用。圖83a和83b是用抗CD-31染色的肝組織和誘發(fā)的原發(fā)性結(jié)腸癌腫瘤的代表性組織病理學(xué)切片，說明放療與處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK體內(nèi)表達(dá)和更昔洛韋(GCV)施用聯(lián)合協(xié)同增強對肺瘤血管形成的抑制。對肝組織(83b)和如圖79a-79g所述誘發(fā)和制備的CT-26原發(fā)性結(jié)腸癌腫瘤(83a)切片進(jìn)行固定并包埋在石蠟中，且與內(nèi)皮特異性抗CD-31反應(yīng)，用于免疫組織病理分析。黑色箭標(biāo)指示紅細(xì)胞，紅色箭標(biāo)指示凋亡內(nèi)皮細(xì)胞，且白色箭標(biāo)指示凋亡肺瘤細(xì)胞。與肝細(xì)胞中的正常血管形成(83b)相比，觀察到放療和靜脈內(nèi)AdPPE-l(3x)-TK+GCV聯(lián)合治療小鼠胂瘤中的廣泛血管破壞(83a)。圖84是小鼠肝組織的代表性組織病理學(xué)切片，表明放療與處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK表達(dá)和更昔洛韋(GCV)施用的組織特異性細(xì)胞毒性。對接觸單獨及聯(lián)合的載體(AdPPE-l(3x)-TK和AdCMV-TK)和GCV的小鼠肝切片進(jìn)行固定，并包埋在石蠟中，且用蘇木精和伊紅染色。觀察到AdCMV-TK和更昔洛韋(左圖)的典型輕微肝臟毒性，在AdPPE-1(3x)-TK治療的肝中(右圖)沒有血管異常。圖85a和85b圖示了C57B1/6肺癌轉(zhuǎn)移沖莫型中的亞治療和無毒輻射范圍。用Lewis肺癌(LLC)細(xì)胞接種入35只8周齡C57B1/6雄性小鼠的左爪墊，并在去除原發(fā)性腫瘤后8天在全身麻醉下以0、5、10或15Gy接受輻射到胸壁內(nèi)。在去除腫瘤后28天時處死小鼠。體重減輕指示轉(zhuǎn)移性疾病。5Gy劑量不是治療性的(圖85a),也不是有毒的(圖85b)。圖86a-86d說明了亞治療放療與處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK表達(dá)和更昔洛韋(GCV)施用聯(lián)合在鼠肺癌中協(xié)同抑制轉(zhuǎn)移性疾病。將LLC細(xì)胞接種入180只8周齡雄性Balb/C小鼠的左爪墊中。一發(fā)展原發(fā)性腫瘤就在全身麻醉下截除該爪。截除后5天，將101QPFU載體[AdPPE-l(3x)-TK或AdCMV-TK]注射入尾靜脈，接著每日腹膜內(nèi)注射GCV(100mg/kg)達(dá)14天。載體注射后3天，在全身麻醉下施用針對小鼠胸壁的單次5Gy劑量放療。圖86a顯示了在55天內(nèi)輻射過的、無載體治療的小鼠的存活。圖86b顯示了AdPPE-l(3x)-TK治療小鼠的存活。圖86c顯示了AdCMV-TK治療小鼠的存活。圖86d顯示了鹽水治療的對照小鼠的存活。與非耙向載體AdCMV-TK(圖86b-86d)相比，觀察到放療僅顯著增強血管生成內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄耙向的載體AdPPE-l(3x)-TK。在沒有放療的情況下使用所有病毒載體的治療方案都是無效的。圖87a-87c是一系列直方圖，顯示了在CMV啟動子控制之下的Fas-c的內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞毒性。牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)在用100(左)、1000(右)和10000(左下)moi的CMV-FAS(黑色)或CMV-LUC(灰色，陰性對照)轉(zhuǎn)導(dǎo)后72小時和在以不同濃度加入人TNF-a配體后24小時用結(jié)晶紫染色。觀察到在高moi和TNF-a濃度時BAE細(xì)胞的生存力下降。圖88是噬斑發(fā)展圖，表明相比于CMV-LUC(紅色正方形)，用CMV-FAS(藍(lán)色菱形)增強了293細(xì)胞中病毒復(fù)制的擴散。CMV-FAS和CMV-LUC的CsCl帶狀原液的滴度如下文所述通過PFU測定來測定。數(shù)據(jù)按照對數(shù)比例以每2-3天噬斑測定觀察到的噬斑數(shù)作圖。圖89a和89b是一系列293細(xì)胞培養(yǎng)物的照片，說明與CMV螢光素酶相比，采用CMV-FAS-c的病毒感染的細(xì)胞-細(xì)胞擴散(噬斑形成)速率較高。轉(zhuǎn)染后4天，拍攝相同稀釋度的CMV-FAS(左圖)和CMV-LUC(右圖)的噬斑照片。CMV-FAS的噬斑明顯大于CMV-LUC的噬斑，從而表明可能由凋亡誘導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞擴散速率較高。圖90是直方圖，說明在PPE-l(3x)啟動子控制之下的Fas-c和阿霉素施用的特異性協(xié)同內(nèi)皮細(xì)胞毒性。BAE細(xì)胞在載體(PPE-l(3x)-FAS)轉(zhuǎn)導(dǎo)(103moi)后48小時接觸100nM阿霉素。Dox+PPE-fas=阿霉素+PPE-l(3x)-Fas-c(橙色)；Dox=單獨的阿霉素(綠色)；PPE-FAS=PPE-l(:3x)-FAS(紅色)；未處理=黑色。細(xì)胞在載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后96小時用結(jié)晶紫染色，且顯微鏡評價細(xì)胞生存力。觀察到AdPPE-l(3x)-Fas-c和阿霉素之間有內(nèi)皮細(xì)胞毒性的顯著協(xié)同作用。圖91a-91b圖示說明了處于內(nèi)皮素(PPE-13X)控制之下的VEGF對工程化組織構(gòu)建體中的血管生成的優(yōu)良誘導(dǎo)作用。組織工程化構(gòu)建體(未公開的程序)在培養(yǎng)基有或沒有補加VEGF(50ng/ml)的情況下生長。用Ad5PPEC-l-3xVEGF病毒或?qū)φ誂d5PPEC-l-3xGFP腺病毒(對照病毒)感染平行構(gòu)建體(達(dá)4小時)。在培養(yǎng)2周后固定構(gòu)建體，包埋、制作切片并染色。血管形成表示為血管數(shù)/mm2和切片中血管形成的面積百分比。圖91a表明，用Ad5PPEC-l-3xVEGF感染細(xì)胞對在工程化構(gòu)建體中形成的血管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)目和大小具有誘導(dǎo)作用。與接觸培養(yǎng)基中的VEGF(VEGF培養(yǎng)基)的構(gòu)建體相比，觀察到Ad5PPEC-l-3xVEGF轉(zhuǎn)導(dǎo)的組織構(gòu)建體(VEGF病毒)中血管形成的兩個參數(shù)急劇增加(4-5X)。圖91b是LUC發(fā)光強度的直方圖，說明與Ad5PPEC-l-3xGFP對照相比，與Ad5PPEC-l-3xVEGF感染的細(xì)胞一起生長的植入組織構(gòu)建體的存活和血管形成較好。圖92是野生型鼠PPE-1啟動子DNA序列。所述啟動子包含內(nèi)源內(nèi)皮特異性正轉(zhuǎn)錄元件(黑色斜體)、NF-1反應(yīng)元件(粉色斜體)、GATA-2元件(紅色斜體)、HIF-1反應(yīng)元件(藍(lán)色斜體)、AP-1位點(綠色斜體)、CAAT信號(橙色斜體)和TATA框(紫色斜體)。圖93是修飾型鼠前內(nèi)皮素原-1啟動子的3x片段序列。所述片段包含2個完整內(nèi)皮細(xì)胞特異性正轉(zhuǎn)錄元件(紅色)和兩個作為反向的半個原始序列定位的部分(藍(lán)色)SEQIDNO:15(轉(zhuǎn)錄元件SEQIDNO:6的3'部分的核苷酸)和SEQIDNO:16(轉(zhuǎn)錄元件SEQIDNO:6的5'部分的核苷酸)。圖94是直方圖，說明了在轉(zhuǎn)基因小鼠中在PPE-l(3x)啟動子控制之下的LUC基因表達(dá)的組織特異性的、波生坦誘導(dǎo)的增強。圖95a和95b是直方圖，說明根據(jù)ELISA測量的，不存在針對PPE-l(3x)啟動子控制下表達(dá)的轉(zhuǎn)基因的宿主免疫應(yīng)答。與在PPE-l(3x)Fas-c治療小鼠中引起的最小抗TNF-R1應(yīng)答(圖95b)相比，觀察到非特異性的抗腺病毒載體(adenovector)應(yīng)答(圖95a)。圖96是直方圖，說明了內(nèi)皮細(xì)胞中在PPE-1啟動子控制下的LUC基因表達(dá)的ET-B特異性的增強。如上文所述，用PPE-l-螢光素酶構(gòu)建體(pEL-8)瞬時地轉(zhuǎn)染牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞。用不同濃度的內(nèi)皮素拮抗劑處理后l小時，計算相對螢光素酶活性。將相對螢光素酶活性計算為光單位與p-半乳糖苷酶單位的比，(3-半乳糖苦酶活性源自組成型活性的lacZ構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)染。相對于未處理的細(xì)胞表達(dá)值(濃度OpM-100%)。值代表著一式三份的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。*相對于未處理的細(xì)胞，P<0.05(斯氏a企-瞼)。注意到BQ788對LUC表達(dá)的劑量依賴性的、ET-b特異性的增強(灰色條)，和ET-U特異性的抑制劑BQ123的增強的缺乏(黑色條)。圖97A和97B是直方圖，說明了雙重ET-U和ET-1B抑制劑波生坦轉(zhuǎn)基因小鼠前內(nèi)皮素原合成和分泌的增強。用波生坦(100mg/kg)處理表達(dá)在前內(nèi)皮素原-l(PPE-l)啟動子控制下的LUC基因的轉(zhuǎn)基因小鼠30天。圖97A顯示了從轉(zhuǎn)基因動物肺提取的總RNA的直方圖。圖97B顯示了前內(nèi)皮素原-1mRNA水平的直方圖(通過半定量RT-PCR測量)。將這些值標(biāo)準(zhǔn)化為P-肌動蛋白，且然后以任意單位圖形顯示。圖97B顯示了對照(空心條)或波生坦-處理的d、鼠(灰色陰影條)中的免疫反應(yīng)性的內(nèi)皮素-1(ET-1)水平。將結(jié)果表達(dá)為與對照未處理的小鼠相比，5只小鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(斯氏t檢驗)。圖98是直方圖，說明了皮質(zhì)類固醇對腺病毒載體轉(zhuǎn)化的內(nèi)皮細(xì)胞中重組蛋白表達(dá)的增強。將BAEC暴露于3地塞米松(灰色條)或無類固醇(黑色條)48小時，然后以10-104的MOI，用含有在組成型CMV啟動子控制下的LUC基因的腺病毒構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。將重組基因表達(dá)表示為。/o螢光素酶/pg細(xì)胞總蛋白。注意到在所有MOI,皮質(zhì)類固醇對表達(dá)的一致增強，在1000的MOI最高達(dá)300%。圖99是焚光顯微照片，說明了皮質(zhì)類固醇對內(nèi)皮細(xì)胞中在PPE-1啟動子控制下的重組蛋白的表達(dá)的增強。在用AdPPE-GFP感染(在100的MOI,48小時)之前48小時，將BAEC暴露于地塞米松(3pM)。顯微照片是2個代表性孔的照片，各自是對照(上面)和地塞米松-處理的(下面)BAEC。注意到在地塞米松處理的細(xì)胞中顯著更強的綠色熒光信號。優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明是表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動子活性的多核苷酸序列及其使用方法。更具體地說，本發(fā)明涉及一種在內(nèi)皮細(xì)胞中表現(xiàn)出增加的活性和特異性的修飾型前內(nèi)皮素原-l(PPE-1)啟動子和核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體可用于在特定細(xì)胞亞群中活化凋亡，由此使得能夠治療特征在于異常新血管形成或細(xì)胞生長的疾病。本發(fā)明還涉及PPE啟動子的修飾，所述修飾響應(yīng)于包括低氧和血管生成在內(nèi)的生理條件而增強其表達(dá)，并涉及新血管生成內(nèi)皮特異性聯(lián)合療法。在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個實施方案之前，要理解的是，本發(fā)明在其應(yīng)用方面不限于在以下描述中敘述的或?qū)嵤├e的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠具有其它實施方案或以各種方式實施或進(jìn)行。同樣，要理解的是，本文所用的短語和術(shù)語4又用于il明目的，且不應(yīng)^皮iL為是限制性的。失衡的血管生成為各種病理狀況的典型特征，且通常支持病理狀態(tài)的進(jìn)展。例如，在實體瘤中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂進(jìn)度是正常組織中的那些細(xì)胞的約35倍(Denekamp和Hobson,1982Br.J.Cancer46:711-20)。這樣的異常增殖是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移所必需的(Folkman,1986CancerRes.46:467-73)。血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖在慢性炎性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬和滑膜炎中也是重要的，其中這些細(xì)胞響應(yīng)于在炎癥部位中釋放的生長因子而增殖(Brown和Weiss,1988,Ann.Rheum.Dis.47:881-5)。另一方面，在局部缺血狀況如心臟缺血、外周血管疾病、傷口愈合、灼傷瘢痕形成和同類疾病中，血管生成的誘導(dǎo)具有治愈作用(Thompson等，PNAS86:7928-7932,1998),且因此是有益的。因此，調(diào)節(jié)或修飾血管生成過程在限制該過程對基礎(chǔ)性疾病狀態(tài)的病理進(jìn)展的影響以及為研究這種疾病的病因?qū)W提供有價值方法方面可具有重要的治療作用。最近，在開發(fā)無論是設(shè)計成抑制性的還是刺激性的內(nèi)皮調(diào)節(jié)劑方面都已取得顯著進(jìn)展(關(guān)于綜述參見Mariam等GenMedGen2003,5:22)。然而，對于促血管生成應(yīng)用和持久功能性血管的大量形成，需要重復(fù)或長期遞送上述蛋白因子，從而限制了它們在臨床情形中的應(yīng)用。此外，除與血管生成調(diào)節(jié)因子生產(chǎn)相關(guān)的高成本之外，這些因子的有效遞送也需要使用待植入冠狀動脈內(nèi)的導(dǎo)管，這進(jìn)一步增加了治療的費用和難度。迄今為止，有前景的臨床實驗已表明，如同Avastin⑥或Bay-43906的抗血管生成治療可通過限制腫瘤周圍的新血管生長而減弱轉(zhuǎn)移進(jìn)展。但是，在其中需要顯著的抗血管生成作用來破壞大部分或全部現(xiàn)有血管生成性血管并誘導(dǎo)肺瘤壞死的癌癥病理學(xué)中，抑制新血管生成和/或部分破壞它們可能并不足夠。此外，盡管在臨床前模型中有前景，但迄今為止在臨床試驗中測試的所有抗血管生成劑的全身施用都顯示出有限的成功率和相當(dāng)大的毒性，包括血小板減少癥、白細(xì)胞減少癥和咯血。因此，治療劑的內(nèi)皮特異性靶向?qū)Υ傺苌芍委熀涂寡苌芍委熓潜匦璧?。本領(lǐng)域業(yè)已描述了內(nèi)皮特異性啟動子，實例包括flk-l、Flt-lTie-2VW因子和內(nèi)皮素-1(參見Gu等的美國專利第6,200,751號；Williams等的美國專利第5,916,763號和Harats等的美國專利第5,747,340號，這些專利全部都在此引入作為參考)。本領(lǐng)域還已經(jīng)描述了在內(nèi)皮特異性啟動子控制下表達(dá)的治療基因的內(nèi)皮細(xì)胞靶向。例如，Jagger等使用KDR或E-選4奪蛋白啟動子在內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá)TNFa[JaggarRT.等，HumGeneTher(1997)8(18):2239-47],而Ozaki等使用von-Willebrand因子(vWF)啟動子向HUVEC遞送單純皰滲病毒胸苷激酶(HSV-tk)[HumGeneTher(1996)7(13》1483-90]。盡管這些啟動子,皮認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的，但研究已表明，這些啟動子中有許多在將表達(dá)導(dǎo)向內(nèi)皮細(xì)胞方面是無效的，沒有所需的嚴(yán)格特異性，僅表現(xiàn)出微弱活性，且未允許高水平表達(dá)。一種構(gòu)建更有效和特異性的治療用內(nèi)皮啟動子的方法一直以來都是鑒別和包含組織特異性增強子元件。例如，Bu等(J.BiolChem.(1997)272(19):32613-32622)先前已描述了內(nèi)皮細(xì)胞特異性的增強子元件，他們證實，3個拷貝的PPE-l增強子元件(含有元件ETE-C、ETE-D和ETE-E)在體外賦予啟動子序列內(nèi)皮細(xì)胞特異性。但是，未能證實增強子元件的體內(nèi)應(yīng)用。如下文的實施例部分清晰闡述的，本發(fā)明已證實了適用于體內(nèi)治療用途的增強子元件。通過生成獨特的、修飾型三次重復(fù)的(3x)增強子元件(SEQIDNO:7)并在體外和體內(nèi)評價其指導(dǎo)內(nèi)皮特異性基因表達(dá)的活性，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)一步構(gòu)建了高度活性的增強子元件，其包含新的、重排方向的3x增強子元件序列的部分。此修飾型增強子元件表現(xiàn)出對參與血管生成的增殖性內(nèi)皮細(xì)胞的增強特異性，而在正常內(nèi)皮細(xì)胞中的體內(nèi)活性可忽略。因此，本發(fā)明的發(fā)明人首次鑒別了在重構(gòu)時賦予鄰近的啟動子序列優(yōu)良活性的增強子元件的部分。因此，按照本發(fā)明的一個方面，提供含順式調(diào)節(jié)元件的分離多核苷酸，所述順式調(diào)節(jié)元件能夠在真核細(xì)胞中指導(dǎo)在轉(zhuǎn)錄上與其連接的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。所述分離多核苷酸包含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列。在一個優(yōu)選實施方案中，在所述順式調(diào)節(jié)元件中，所述至少部分SEQIDNO:15所示序列位于所述至少部分SEQIDNO:16所示序列的上游。在另一個優(yōu)選實施方案中，在所述順式調(diào)節(jié)元件中，至少部分SEQIDNO:16所示序列位于所述至少部分SEQIDN0:15所示序列的上游。SEQIDNO:15是代表鼠內(nèi)皮特異性增強子元件(SEQIDNO:6)的核苷酸坐標(biāo)27-44的多核苷酸序列，在3'末端連接一個額外的鳥苷酸，且SEQIDNO:16是代表鼠內(nèi)皮特異性增強子元件(SEQIDNO:6)的核苷酸坐標(biāo)1-19的多核苦酸序列。對本說明書和所附權(quán)利要求書來說，術(shù)語"增強子"指優(yōu)選但非排它性地以組織特異性方式增加啟動子轉(zhuǎn)錄活性的任意多核苷酸序列。本文使用的術(shù)語"組織特異性增強子"指以組織依賴性或背景序列依賴性(context-dependent)方式增加啟動子轉(zhuǎn)錄活性的增強子。應(yīng)當(dāng)i人識到，這樣的"組織特異性啟動子"在不相容的組織或環(huán)境中降低、抑制或甚至沉默啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。按照本發(fā)明的一些實施方案，分離多核苷酸包含鄰接拷貝的至少部分SEQIDNo:15和16。這樣的序列優(yōu)選以頭-尾方向定位，^旦可構(gòu)建本領(lǐng)域眾所周知的其它方向，例如反向方向(尾-尾或頭-頭)、互補方向(用"t"取代"a"、用"a"取代"t"、用"c，，取代"g，，以及用"g，，取代"c")、反向互補方向等。所述至少部分SEQIDNO:15所示序列可直接共價連接至所述至少部分SEQIDNO:16所示序列，或在優(yōu)選實施方案中，兩個序列可通過接頭多核苷酸序列連接。本文使用的術(shù)語"接頭多核苷酸"指在兩個或更多個側(cè)翼多核苷酸(例如SEQIDNo:15和16)之間連^l妾的多核苷酸序列。一種這樣的優(yōu)選接頭序列例如為三核苷酸序列"cca",其是如SEQIDNO:7的55-57位中的核苷酸所示的接頭序列。其它合適的接頭序列可包括天然或人工的完整附加增強子元件，例如多拷貝的SEQIDN0.15、SEQIDNO:16、PPE-l的lx增強子元件、附加的完整啟動子、低氧反應(yīng)元件(例如SEQIDNO:5)等。本文使用的術(shù)語"部分SEQIDNO:15所示序列......"或"部分SEQIDNO:16所示序列......"定義為代表指明序列的5'末端、3'末端或其間任意序列的至少8個鄰接核苦酸的序列。因此，例如，代表SEQIDNO:15的核苷酸坐標(biāo)1-8、1-9、1-10、1-11......累加l個核苷酸直至核苷酸坐標(biāo)1-17的序列皆構(gòu)成了本發(fā)明的部分SEQIDNO:15,代表SEQIDNO:15的核普酸坐標(biāo)2-9、2-10、2-11......至2-17的全部序列也如是,代表SEQIDNO:15的核普酸坐標(biāo)3-10、3-11、3-12......至3-17的全部序列也如是，直至包含代表SEQIDNO:15的核苷酸坐標(biāo)10-17的序列。同樣，代表SEQIDNO:16的核苷酸坐標(biāo)l-8、1-9、1-10、1-11......累加1個核苷酸直至核苷酸坐標(biāo)1-19的序列皆構(gòu)成了本發(fā)明的部分SEQIDNO:16,代表核苷酸坐標(biāo)2-9、2-10......的序列也如是，如上文所述。在將本發(fā)明付諸實施時，揭示出修飾型增強子PPE-l(3x)包括連接至SEQIDNO:16所示序列的SEQIDNO:15所示序列，緊在其上游和下游側(cè)接鼠內(nèi)皮特異性增強子元件拷貝(lx)(參見SEQIDNO:7)。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件還包含至少一個拷貝的SEQIDNO:6所示序列。在更優(yōu)選實施方案中，所述順式調(diào)節(jié)元件包含至少兩個拷貝的SEQIDNO:6所示序列。在最優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件如SEQIDNO:7所示。優(yōu)選分離多核苷酸還包含內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動子序列元件。對本說明書和所附權(quán)利要求書來說，術(shù)語"啟動子"指能夠介導(dǎo)下游目標(biāo)序列的RNA轉(zhuǎn)錄的任意多核苷酸序列。內(nèi)皮特異性啟動子元件可包括例如至少一個拷貝的PPE-l啟動子。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可使用的適宜啟動子/增強子的實例包括內(nèi)皮特異性啟動子前內(nèi)皮素原-l,PPE-l啟動子(HaratsD,JClinInvest.1995Mar;95(3):1335-44),PPE-l-3x啟動子[PCT/IL01/01059;Varda-BloomN,GeneTher2001Jun;8(11):819-27]，TIE-1(S79347,S79346)和TIE-2(U53603)啟動子[SatoTN,ProcNatlAcadSciUSA1993Oct15;90(20):9355-8],內(nèi)皮糖蛋白啟動子[Y11653;RiusC,Blood1998Dec15;92(12):4677-90],vonWillebrand因子[AF152417;CollinsCJProcNatlAcadSciUSA1987Jul;84(13):4393-7]，KDR/flk-l啟動子[X89777、X89776;RonickeV,CircRes1996Aug;79(2):277-85],FLT-1啟動子[D64016AJ224863;MorishitaK,:JBiolChem1995Nov17;270(46):27948-53],Egr-1啟動子[AJ245926;SukhatmeVP,OncogeneRes1987Sep-Oct;1(4):343-55],E-選擇蛋白啟動子[Y12462;CollinsTJBiolChem1991Feb5;266(4):2466-73];內(nèi)皮粘附分子啟動子ICAM-1[X84737;HorleyKJEMBOJ1989Oct;8(10):2889-96],VCAM-l[M92431;IademarcoMF,JBiolChem1992Aug15;267(23》16323-9],PECAM-1[AJ313330X96849;CD31,NewmanPJ,Science1990Mar9;247(4947):1219-22],血管平滑肌特異性元件CArG框X53154和主動脈羧肽酶樣蛋白(」C丄尸)啟動子[AF332596;LayneMD,CircRes.2002;90:728-736]和主動脈優(yōu)先表達(dá)基因-1[Yen-HsuChenJ.Biol.Chem.,276巻，第50期，47658-47663,2001年12月14日]。其它合適的內(nèi)皮特異性啟動子在本領(lǐng)域眾所周知，例如EPCR啟動子(Gu等的美國專利第6,200,751號)和VEGF啟動子(Williams等的美國專利第5，916,763號)。本文使用的術(shù)語"血管生成調(diào)節(jié)劑"定義為能抑制或增強組織中的血管生成的分子或化合物。這樣的血管生成調(diào)節(jié)劑可以是抗血管生成因子，例如血管生成的重要耙的拮抗劑，例如，內(nèi)皮素受體，或血管生成因子，從而造成內(nèi)皮特異性啟動子活性的上調(diào)或下調(diào)。要認(rèn)識到的是，其它非內(nèi)皮啟動子也可摻入到上述分離多核苷酸中，以在多種組織中指導(dǎo)所需核酸序列表達(dá)。適用于本發(fā)明構(gòu)建體的啟動子在本領(lǐng)域眾所周知。這些啟動子包括但不限于病毒啟動子(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒ITR、LTR、立即早期病毒啟動子(IEp)(例如皰滲病毒IEp(例如ICP4-IEp和ICP0-IEp)和巨細(xì)胞病毒(CMV)IEp)以及其它病毒啟動子(例如晚期病毒啟動子、潛伏期活性啟動子(LAP)、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子和鼠白血病病毒(MLV)啟動子))。其它合適的啟動子是真核啟動子，其包括增強子序列(例如兔P-珠蛋白調(diào)節(jié)元件)、組成型活性啟動子(例如(3肌動蛋白啟動子等)、信號和/或組織特異性啟動子(例如誘導(dǎo)型和/或阻遏型啟動子，例如TNF或RU486反應(yīng)性啟動子、金屬硫蛋白啟動子、PSA啟動子等)和肺瘤特異性啟動子，例如端粒酶、絲束蛋白(plastm)和己糖激酶啟動子。優(yōu)選地，分離的多核苷酸還包含j氐氧反應(yīng)元件，例如至少一個拷貝的SEQIDNO:5所示序列。本發(fā)明的分離核酸序列可用于在真核組織中調(diào)節(jié)基因表達(dá)，且具體地說是在增殖性內(nèi)皮細(xì)胞(例如涉及血管生成的內(nèi)皮細(xì)胞)中調(diào)節(jié)基因表達(dá)，或者可用于在靜息內(nèi)皮細(xì)胞中沉默(抑制)基因表達(dá)。因此，在一些情況下，可提供本發(fā)明的分離多核苷酸序列，作為核酸構(gòu)建體的部分，所述核酸構(gòu)建體還包含處于本發(fā)明的分離多核苷酸調(diào)節(jié)控制之下的核酸序列。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體還可包含另外的多核苷酸序列，例如編碼選擇標(biāo)記或報告多肽的序列、編碼細(xì)菌中的復(fù)制起點的序列、允許由單個mRNA翻譯幾種蛋白的序列(IRES)、用于啟動子-嵌合多肽編碼區(qū)的基因組整合的序列和/或一般包含在哺乳動物表達(dá)載體中的序列，所述哺乳動物表達(dá)載體例如為可得自Invitrogen的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pZeoSV2(+A)、pSecTag2、pD邵lay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1;可得自Promega的pCI;可得自Stratagene的pBK-RSV和pBK-CMV;可得自Clontech的pTRES,以及它們的書亍生物。這樣的核酸構(gòu)建體優(yōu)選構(gòu)建用于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)，且可為病毒來源的。適用于哺乳動物表達(dá)的核酸構(gòu)建體的眾多實例是本領(lǐng)域已知的；以下的實施例部分提供了幾個此種構(gòu)建體的其它細(xì)節(jié)。對本說明書和所附權(quán)利要求書來說，術(shù)語"處于......調(diào)節(jié)控制之下的核酸序列"指具有被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的能力的任意多核苷酸序列，其轉(zhuǎn)錄可由順式調(diào)節(jié)元件指導(dǎo)，例如本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件。該定義包括可翻譯為多肽的編碼序列以及反義RNA、結(jié)合DNA的RNA、核酶和并非注定會經(jīng)歷翻譯的其它分子部分的序列。本發(fā)明構(gòu)建體可使用的核酸序列的實例為例如血管生成的正和負(fù)調(diào)節(jié)物，例如VEGF、FGF-1、FGF-2、PDGF、促血管生成素-1和促血管生成素-2、TGF-P、IL-8(關(guān)于血管生成調(diào)節(jié)物的廣泛清單，參見上文表l);細(xì)胞毒性藥物；報告基因等。在優(yōu)選實施方案中，所述核酸序列選自血管生成調(diào)節(jié)物VEGF、p55、促血管生成素-1、bFGF和PDGF-BB。適于本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件控制的其它可轉(zhuǎn)錄核酸序列提供于下文和以下的實施例部分。下文提出的實施例表明，在全身體內(nèi)施用后，本發(fā)明的新順式調(diào)節(jié)元件可以在局部缺血和/或血管生成(增殖)性內(nèi)皮組織中優(yōu)先的方式將報告基因(GFP和LUC)表達(dá)可靠地引導(dǎo)至內(nèi)皮組織。更有意義的是，所述實施例還表明，本發(fā)明的分離多核苷酸可用于在腫瘤、轉(zhuǎn)移、局部缺血組織和/或血管生成組織中優(yōu)先表達(dá)治療基因，從而提供有關(guān)本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件及其衍生物在治療應(yīng)用中的重要性的直接證據(jù)。在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體用于上調(diào)組織中的血管生成，及治療或預(yù)防與局部缺血相關(guān)的疾病或狀況。這些應(yīng)由增強的血管生成獲益的疾病和狀況在本領(lǐng)域眾所周知，例如傷口愈合、缺血性中風(fēng)、缺血性心臟病和胃腸損害。本文使用的術(shù)語"下調(diào)血管生成"指減緩或阻止導(dǎo)致新血管生成的血管生成過程。術(shù)語"上調(diào)血管生成，，指增強休眠的或起最低作用的內(nèi)皮細(xì)胞血管生成活化劑的表達(dá)。因此，本發(fā)明可用于基因治療。本文使用的基因治療指將目標(biāo)遺傳材料(例如DNA或RNA)轉(zhuǎn)移至宿主中，以治療或預(yù)防遺傳性或獲得性疾病或狀況或表型。目標(biāo)遺傳材料編碼期望其在體內(nèi)生產(chǎn)的產(chǎn)物(例如蛋白、多肽、肽、功能性RNA、反義序列)。例如，目標(biāo)遺傳材料可編碼有治療價值的激素、受體、酶、多肽或肽。關(guān)于綜述，一般參見教科書"GeneTherapy"(AdvancedinPharmacology40,AcademicPress,1997)。已發(fā)展出基因治療的兩種基本方法(1)先體外后體內(nèi)和(2)體內(nèi)基因治療。在先體外后體內(nèi)基因治療中，從患者取出細(xì)胞，在培養(yǎng)的同時體外處理。一般來說，經(jīng)合適的基因遞送載體/方法(轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、同源重組等)和符合需要的表達(dá)系統(tǒng)將功能替代基因?qū)爰?xì)胞中，然后在培養(yǎng)物中擴增修飾型細(xì)胞，并將其返回宿主/患者中。業(yè)已表明，這些經(jīng)遺傳再植的細(xì)胞原位表達(dá)轉(zhuǎn)染的遺傳材料。在體內(nèi)基因治療中，不從受試者取出靶細(xì)胞，而是將待轉(zhuǎn)移的遺傳材料原位(即處于接受者內(nèi))導(dǎo)入到接受者生物細(xì)胞中。在替代實施方案中，如果宿主基因是缺陷型的，則所述基因原位被修復(fù)(Culver,1998.(摘要)AntisenseDNA&RNAbasedtherapeutics,1998年2月，Coronado,CA)。業(yè)已表明，這些基因改造細(xì)胞原位表達(dá)轉(zhuǎn)染的遺傳材料?；虮磉_(dá)載體能夠?qū)愒春怂徇f送/轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞中。表達(dá)載體可包含以本領(lǐng)域已知的細(xì)胞選擇性方式控制核酸的耙向、表達(dá)和轉(zhuǎn)錄的元件。應(yīng)當(dāng)指出的是，經(jīng)?？捎帽磉_(dá)載體的5'UTR和/或3'UTR替換所述基因的5'UTR和/或3'UTR。因此，本文使用的表達(dá)載體根據(jù)需要可不包含待轉(zhuǎn)移的實際基因的5'UTR和/或3'UTR,而僅包含特定的氨基酸編碼區(qū)。表達(dá)載體可包含控制異源材料轉(zhuǎn)錄的啟動子，且可為組成型或可誘導(dǎo)啟動子以允許選擇性轉(zhuǎn)錄。任選地，可包括獲得必需的轉(zhuǎn)錄水平可能需要的增強子。增強子一般為這樣的任意非翻譯DNA序列，其與編碼序列鄰接(以順式方式)而起作用，以改變啟動子控制的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平。表達(dá)載體還可包括如下文所述的選擇基因。可通過本領(lǐng)域的多種已知方法中的任一種將載體導(dǎo)入細(xì)胞或組織中。這樣的方法一4殳可見于Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringsHarborLaboratory,NewYork1989,1992);Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland1989);Chang等，SomaticGeneTherapy,CRCPress,AnnArbor,MI1995);Vega等，GeneTargeting,CRCPress,AnnArborMI(995),Vectors:ASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses,Butterworths,BostonMA1988);和Gilboa等(Biotechniques4(6):504-512:1986)中的描述，且包括例如穩(wěn)定或瞬時轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、電穿孔和用重組病毒載體感染。另外，參見關(guān)于涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的載體的美國專利4,866,042,還參見關(guān)于正-負(fù)選擇方法的美國專利5,464,764和5,487,992。通過感染導(dǎo)入核酸提供了幾種超越其它列出方法的優(yōu)勢。由于其感染特性可獲得較高效率。而且，病毒是非常特化的，且通常在特定細(xì)胞類型中感染和繁殖。因此，其天然特異性可用于將載體耙向體內(nèi)或組織中或混合細(xì)胞培養(yǎng)物中的特定細(xì)胞類型。還可用特異性受體或配體修飾病毒載體，以通過受體介導(dǎo)的事件改變耙向特異性。導(dǎo)入并表達(dá)重組序列的DNA病毒載體的具體實例是腺病毒衍生載體Adenop53TK。該載體表達(dá)用于正或負(fù)選擇的皰滲病毒胸苷激酶(TK)基因和所需重組序列的表達(dá)盒。該載體可用于感染具有腺病毒受體的細(xì)胞，包括大部分上皮起源的癌癥以及其它癌癥。該載體以及表現(xiàn)出相似所需功能的其它載體可用于處理混合的細(xì)胞群，且其可包括例如體外或先體外后體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或人受試者。還可包括限制特定細(xì)胞類型表達(dá)的特征。這樣的特征包括例如對所需細(xì)胞類型特異性的啟動子和調(diào)節(jié)元件。另外，重組病毒載體可用于所需核酸的體內(nèi)表達(dá)，因為它們提供了諸如側(cè)向感染(lateralinfection)和靶向特異性的優(yōu)勢。側(cè)向感染是例如逆轉(zhuǎn)錄病毒生活周期中固有的，是單個感染細(xì)胞產(chǎn)生許多子代病毒體、而這些病毒體出芽并感染鄰近細(xì)胞的過程。結(jié)果是大面積被快速感染，其中大部分開始時未被原始病毒顆粒感染。這與垂直型感染相對照，在垂直型感染中，感染因子僅通過子代傳播。還可產(chǎn)生不能側(cè)向傳播的病毒載體。如果所需目的是將特定基因?qū)雰H局部化的大量靶細(xì)胞中，則該特征可能有用。如上所述，病毒是高度特化的感染因子，其在許多情況下已進(jìn)化得能避開宿主防御機制。通常，病毒在特定細(xì)胞類型中感染和繁殖。病毒載體的耙向特異性利用其天然特異性，以特異性地耙向預(yù)定的細(xì)胞類型，且由此將重組基因?qū)氡桓腥炯?xì)胞中。本發(fā)明方法使用的載體取決于被靶向的所需細(xì)胞類型，且將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，如果要治療乳腺癌，則應(yīng)使用對此種上皮細(xì)胞特異性的載體。同樣，如果要治療造血系統(tǒng)的疾病或病理狀況，則應(yīng)使用對血細(xì)胞及其前體特異性的病毒載體，優(yōu)選對特定類型的造血細(xì)胞特異性的病毒載體?？蓸?gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒，以起感染性顆粒的作用，或僅進(jìn)4亍單次初始感染輪次。在前一種情況下，修飾病毒基因組，從而使得其保持合成新病毒蛋白和RNA的全部必需基因、調(diào)節(jié)序列和包裝信號。一旦合成了這些分子，宿主細(xì)胞就將RNA包裝成新病毒顆粒，新病毒顆粒能夠進(jìn)行更多輪的感染。還對載體基因組進(jìn)行工程改造，以編碼和表達(dá)所需重組基因。對非感染性病毒載體來說，通常使載體基因組突變，以破壞將RNA被嚢化到病毒顆粒中所需要的病毒包裝信號。如果沒有此信號，形成的任何顆粒都將不含基因組，且因此不能進(jìn)行至隨后輪次的感染。載體的具體類型取決于預(yù)期用途。實際的載體也是已知的，且在本領(lǐng)域容易獲得，或者可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用眾所周知的方法構(gòu)建。重組載體可以幾種方式施用。例如，如果^吏用病毒載體，則所述程序可利用其革巴向特異性，并因此不必在患病部位局部施用。但是，局部施用可提供更快速和更有效的治療，施用還可通過例如靜脈內(nèi)或皮下注射入患者中實施。將病毒載體注射入脊髓液也可用作施用模式，尤其是對神經(jīng)變性疾病而言。在注射后，病毒載體將循環(huán)，直至它們識別具有適宜的感染靶向特異性的宿主細(xì)胞。在現(xiàn)有技術(shù)中基因治療規(guī)程遇到的最常見問題是效力差和宿主對載體的免疫應(yīng)答。效力差可能起因于所遞送的材料不能進(jìn)入細(xì)胞中、不能整合入基因組中或不能以合適水平表達(dá)。另外，隨著時間推移應(yīng)答經(jīng)常較差。這意味著可能有利的再施用經(jīng)常由于上述免疫應(yīng)答而成問題。這樣的治療應(yīng)用包括靶組織中的血管生成的增強和抑制。根據(jù)針對本發(fā)明順式調(diào)節(jié)元件指導(dǎo)的核酸序列優(yōu)先表達(dá)的細(xì)胞反應(yīng)，可產(chǎn)生導(dǎo)致血管生成增強的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，或?qū)е卵苌上陆岛途植咳毖膬?nèi)皮細(xì)胞增殖抑制。因此，在本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中包含其表達(dá)有細(xì)胞毒性的核酸序列，提供了在例如腫瘤的血管生成血管中將細(xì)胞死亡靶向快速增殖內(nèi)皮細(xì)胞的方法。因為這樣的載體可全身施用，所以其可用于在發(fā)展中的轉(zhuǎn)移病灶中有效誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，優(yōu)于任何目前可獲得的鑒別和定位這種轉(zhuǎn)移擴散病灶的能力。這些可與本發(fā)明的構(gòu)建體一起用于癌癥基因治療的治療性核酸序列經(jīng)常分類為目標(biāo)在于恢復(fù)突變基因活性和控制的矯正性基因治療、目標(biāo)在于敏化抗癌細(xì)胞之免疫系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)性基因治療以及目標(biāo)在于通過前藥或毒性劑(自殺基因治療)、促凋亡基因、抗血管生成基因或增強化療或放療來殺傷癌細(xì)胞的細(xì)胞減少性基因治療。適于與本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件一起用于矯正性基因治療的核酸序列包括但不限于p53基因(GenBank登記號BC018819),其表達(dá)在癌細(xì)胞中受到抑制的抗瘤性DNA穩(wěn)定基因；Cip/Kip(p21,GenBank登記號NM000389;和p27,GenBank登記號NM004064)和Ink4(pl4,GenBank登記號NM058197),細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑。適于與本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件一起用于抑制癌基因功能的核酸序列包括但不限于干擾癌基因(例如ras、myc、erbB2和bcl-2)轉(zhuǎn)錄和翻譯的反義寡核普酸以及干擾其翻譯的催化性核酶?？拱┗蚍戳x多核苷酸和核酶多核苷酸的合成和使用方法在本領(lǐng)域眾所周知，且詳述于例如Roth等的美國專利第6,627,189號、Bennet等的美國專利第6,265,216號和Calabretta等的美國專利第5,734,039號，所有這些專利都完整地在此引入作為參考。制備和使用催化性抗癌基因核酶的方法描述于例如Leopold等的美國專利第5,635,385號，該專利完整地在此引入作為參考。在本發(fā)明的再一個實施方案中，在本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件控制下表達(dá)的核酸序列涉及免疫調(diào)諧基因表達(dá)，設(shè)計用于防止肺瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)移細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。編碼適于與本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件一起使用的免疫調(diào)諧因子的核酸序列是細(xì)胞因子基因，用于增強細(xì)胞毒性T細(xì)胞識別腫瘤抗原和外源外來免疫原的胞內(nèi)分子基因(以誘導(dǎo)非特異性局部免疫反應(yīng))。合適的免疫刺激因子包括但不限于人IL-2、干擾素如人a、P或y干擾素、人T細(xì)胞粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、人肺瘤壞死因子(TNF)和淋巴毒素(TNF-b)。人IL-2基因已克隆并測序，且可作為例如pBC12/HIV/IL-2(可得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心("ATCC"),保藏號67618)的0.68kBBamHI-HinDIII片段獲得。此外，人(3干擾素、人GM-CSF、人TNF和人淋巴毒素的序列是已知的并可獲得的。具體地說，人y干擾素的序列是已知的(Fiers等，(1982)Philos.Trans.R.Soc.Lond.,BBiol.Sci.299:29-38),且已登錄于GenBank,登記號M25460。人GM-CSF的序列是已知的(Wong等(1985)Science228:810-815),且已登錄于GenBank,登記號M10663。人TNF序列業(yè)已描述(Wang等，(1985)Science228:149-154)，且登錄于GenBank,登記號M10988。人淋巴毒素(TNF-b)的序列也已公開(Iris等，(1993)NatureGenet3:137-145),且登錄于GenBank,登記號Z15026。在又一個實施方案中，在本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件控制下表達(dá)的核酸序列涉及細(xì)胞減少性基因治療或通過直接或間接基因遞送殺傷耙細(xì)胞。在一個優(yōu)選實施方案中，核酸序列是細(xì)胞毒性基因，例如但不限于自殺基因，如p53和egr-l-TNF-a,用于藥物易感性治療的細(xì)胞毒性前藥/酶，例如更昔洛韋/胸苷激酶和5-氟胞嘧啶/胞嘧咬脫氨酶，以及抗轉(zhuǎn)移基因，如5E1A。具體細(xì)胞毒性構(gòu)建體的實例詳述于以下的實施例部分。在另一個實施方案中，在本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件控制下表達(dá)的核酸序列可涉及遺傳放射性同位素治療將放射性標(biāo)記的兒茶酚胺1131-間碘千基胍攝取入表達(dá)去曱腎上腺素受體(NAT)的細(xì)胞中，是已確立的用于嗜鉻細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、類癌瘤和甲狀腺髓樣癌的治療形式。或者，鈉硤同向轉(zhuǎn)運蛋白(symporter)(NIS)介導(dǎo)碘攝取入正常和惡性甲狀腺細(xì)胞中。業(yè)已報道，NIS基因作為轉(zhuǎn)基因在體外和體內(nèi)模型中抑制前列腺癌?？墒褂孟喾吹姆椒ㄊ菇M織再血管形成，例如在動脈粥樣硬化患者中或在由于疾病或損傷(例如糖尿病)而罹患顯著的外周循環(huán)損傷的患者中。在此情況下，可使用AdPPE-l-3X-GF型構(gòu)建體，其中GF是生長因子(例如細(xì)胞因子)或其修飾物(例如AdPPE-l-SEQIDNO:7_GF)。用于本文上下文的合適生長因子包括但不限于VEGF(GenBank登記號M95200)和大鼠PDGF-BB(GenBank登記號；與mus-AF162784具有99%同一性)和EGR-1(GenBank登記號M22326)、FGF(包括但不限于GenBank登記號XM003306)及其組合。要認(rèn)識到的是，優(yōu)選按照本發(fā)明的該方面使用超過一種血管生成因子，以避免已表明與單獨施用VEGF相關(guān)的血管不成熟和血管退化的問題(關(guān)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見實施例部分的實施例27和31)。聯(lián)合治療可模擬內(nèi)皮通道出芽的第一階段，且隨后募集平滑肌細(xì)胞以穩(wěn)定新生血管[RichardsonDM等，(2001)Nat.Biotechnol.19:1029-1034]。本發(fā)明該方面的聯(lián)合治療可通過將目標(biāo)多核苷酸克隆在相同核酸構(gòu)建體上實施，所述目標(biāo)多核苷酸的每一個都處于本發(fā)明的分離核酸調(diào)節(jié)之下。備選地或優(yōu)選地，目標(biāo)多核普酸的每一個都可分別克隆入本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中，由此使得能夠?qū)φT導(dǎo)的血管生成過程更緊密地調(diào)節(jié)。低氧反應(yīng)元件(例如SEQIDNO:5)摻入到本發(fā)明的啟動子序列中也可用于本發(fā)明，以進(jìn)一步增強對局部缺血組織的表達(dá)選擇性，由此導(dǎo)致選定組織的新血管形成。隨著血液供應(yīng)改善，局部缺血減輕，j氏氧反應(yīng)元件不再被誘導(dǎo)，GF水平下降，且新血管形成過程被停止。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，4吏用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體對內(nèi)皮組織進(jìn)行基因治療，提供了用不能靶向血管生成內(nèi)皮細(xì)胞的其它方法不可達(dá)到的時序協(xié)調(diào)。如以下的實施例部分所闡述的，含本發(fā)明的新增強子元件[例如PPE-l(3x)]的順式調(diào)節(jié)元件特異性地引導(dǎo)在經(jīng)歷血管增殖的組織中的重組基因表達(dá)增加，同時防止重組基因在其它非血管生成組織中表達(dá)(參見實施例12、14、16、19、20、23、27、29、34和35)。在本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件和構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄控制下的治療基因表達(dá)與基因產(chǎn)物所針對的細(xì)胞過程(血管生成性生長過程)的活化相一致，從而允許更高的效力和治療所需的有效劑量顯著下降。因此，預(yù)期含本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件的構(gòu)建體在基因治療背景中的使用可將向肺瘤的遞送最大化，同時使對周圍正常組織的毒性作用最小化。有意義的是，如在以下實施例部分中闡述的，即便在周圍組織含內(nèi)皮組分的情況下也是如此。這是因為即便在PPE-1啟動子背景下，本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件也極大地提高了快速增殖的內(nèi)皮組織中的表達(dá)水平，如實施例16所^正實的。PPE-1啟動子的用途，但預(yù)期本發(fā)明的增強子元件在與其它真核啟動子序列一起使用時也將發(fā)揮其細(xì)胞特異性作用。這樣的預(yù)期基于現(xiàn)有技術(shù)的觀察結(jié)果，該結(jié)果表明，增強子元件經(jīng)常是可移動的，即它們可由一個啟動子序列轉(zhuǎn)移至另一個不相關(guān)的啟動子序列并仍保持活性。例如，參見D.Jones等.(Dev.Biol.(1995)171(1》60-72);N.S.Yew等，(Mol.Ther.(2001)4:75畫820)和L.Wu.等，(GeneTher.(2001)8;1416-26)。實際上，Bu等(J.BiolChem.(1997)272(19):32613-32622)的早期工作強有力地表明，與本發(fā)明的那些增強子元件(例如含SEQIDNo.15和16或SEQIDNO:6的增強子)相關(guān)的增強子元件，可與組成型啟動子如SV-40啟動子一起使用。同樣，對于經(jīng)修飾含本發(fā)明增強子序列的真核啟動子，包含其的構(gòu)建體、使用其的方法和包含其的分離多核苷酸，完全屬于要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。因此，假定本發(fā)明增強子元件的最小配置是含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列的分離多核苷酸。預(yù)期該增強子與各種各樣的啟動子一起起作用，所述啟動子包括但不限于內(nèi)皮特異性啟動子(例如PPE-1;SEQIDNO.:l)和組成型啟動子，例如病毒啟動子，如來源于CMV和SV40的啟動子。此增強子應(yīng)當(dāng)能夠向各種各樣的啟動子賦予內(nèi)皮特異性。所述增強子元件可被增大，例如通過加入一個或多個拷貝的SEQIDNO:6所示序列。這些額外的序列可鄰接或非鄰接地加入到SEQIDNO:8序列中。本發(fā)明還包括在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)核酸序列的方法，該方法使用依賴于增強子元件和啟動子的構(gòu)建體，所述增強子元件含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列，以將目標(biāo)序列高水平表達(dá)特異性地導(dǎo)向內(nèi)皮細(xì)胞。本文所用的"對從受試者身體取出的細(xì)胞先體外后體內(nèi)施用并隨后將所述細(xì)胞再導(dǎo)入所述受試者身體內(nèi)，，具體包括干細(xì)胞的應(yīng)用，如在(Lyden等(2001)NatureMedicine7:1194-1201)中所描述的。盡管在下文給出的實施例中描述的實驗中使用腺病毒，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地使本發(fā)明的構(gòu)建體適合于其它病毒遞送系統(tǒng)。含有內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動子的病毒載體也可以與其它方法聯(lián)合使用，以增強所述病毒載體的耙向。這樣的方法包括短肽配體和/或雙特異性或雙功能性分子或雙抗體(Nettelbeck等，MolecularTherapy3:882;2001)。要指出的是，在基因治療背景下針對組織中表達(dá)的治療性轉(zhuǎn)基因的宿主免疫應(yīng)答，在開發(fā)和設(shè)計有效的基因治療規(guī)程方面是重要考慮因素。針對重組轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的不利免疫應(yīng)答既可干擾藥物遞送的效力，又可導(dǎo)致炎癥、細(xì)胞毒性和疾病。因此，所表達(dá)的重組治療性分子的抗原性潛力在基因治療中極為重要。在將本發(fā)明付諸實施時，出乎意料地揭示出作為Ad5PPE-l(3x)核酸構(gòu)建體的部分表達(dá)的人多肽(TNF-R1)(實施例41,圖95b)在小鼠中沒有抗原性，且在宿主中不誘導(dǎo)顯著的免疫應(yīng)答，盡管明顯存在針對施用處于CMV啟動子控制下的Fas-c嵌合基因的抗TNF-R1應(yīng)答(圖95)。因此，本發(fā)明的分離多肽可用于降低或消除針對一種或多種內(nèi)源表達(dá)的重組轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的宿主免疫應(yīng)答，這可通過在細(xì)胞中表達(dá)處于本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件轉(zhuǎn)錄控制下的重組轉(zhuǎn)基因(或基因)來實現(xiàn)。優(yōu)選地，所述順式調(diào)節(jié)元件是PPE-1(3x)啟動子。在將本發(fā)明付諸實施時，令人驚奇地揭示出血管生成內(nèi)皮特異性啟動子PPE-l(3x)響應(yīng)于抗血管生成治療的額外增強。圖94表明，響應(yīng)于施用雙重內(nèi)皮素受體(ETA和ETB)拮抗劑波生坦，在攜帶核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因小鼠的高度血管形成器官(主動脈、心臟、肺、氣管和腦)中的螢光素酶表達(dá)優(yōu)先增強，其中所述核酸構(gòu)建體含處于PPE-l(3x)控制下的的治療性重i基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)組合的這種協(xié)同作用提供了先前未公開的藥物靶向和降低的抗血管生成治療劑量需求的可能性。盡管不希望受限于單一假設(shè)，但認(rèn)為針對抗血管生成治療的內(nèi)源組織反應(yīng)，在經(jīng)自分泌環(huán)活化內(nèi)皮素啟動子誘導(dǎo)物時，實際上增強了本發(fā)明核酸構(gòu)建體的內(nèi)皮素啟動子元件。因此，在一個實施方案中，包含本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件的構(gòu)建體與附加的抗血管生成治療聯(lián)合施用，其中選定的抗血管生成治療能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮特異性啟動子活性的內(nèi)源增強子。抗血管生成治療在本領(lǐng)域眾所周知，包括但不限于內(nèi)皮素受體拮抗劑如波生坦、VEGF受體拮抗劑、制管張素和內(nèi)皮抑制素以及抗血管生成抗體，例如貝伐單抗(Bevacizumab)和Novast。動子活性的其它順式調(diào)節(jié)元件的構(gòu)建體的施用，和能誘導(dǎo)內(nèi)皮特異性啟動子活性的這些附加療法的組合，可以用于增加包含促血管生成序列的構(gòu)建體的表達(dá)，從而增強血管生成活性，例如，在局部缺血狀況的治療中。在將本發(fā)明進(jìn)一步付諸實施時，表明與B-形式特異性內(nèi)皮素受體拮抗劑(BQ788)溫育牛主動脈內(nèi)皮細(xì)月包(BAEC)i秀導(dǎo)內(nèi)皮特異性啟動子[PPE-1(3X)]活性的增強，而暴露于A-形式內(nèi)皮素受體激動劑(BQ123)對內(nèi)皮素啟動子活性沒有作用(圖96)。使用表達(dá)在PPE-1啟動子控制下的螢光素酶基因的轉(zhuǎn)基因小鼠的進(jìn)一步實施已經(jīng)表明，BQ-788對B-形式內(nèi)皮素受體的阻斷導(dǎo)致增加的內(nèi)皮素轉(zhuǎn)錄和循環(huán)血漿內(nèi)皮素的增加(圖97A和97B)。因而，在一個實施方案中，與附加療法相組合地施用包含本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件的構(gòu)建體，其中所述附加療法是B-形式內(nèi)皮素受體的阻斷。這樣的阻斷可以通過非選擇性的內(nèi)皮素受體拮抗劑，例如、但不限于波生坦；A-186086;Ro畫61畫6612;SB-209,670;SB-217,243;PD142,893;和PD145，065,或通過選4奪性的B亞型內(nèi)皮素受體拮抗劑，例如、<旦不限于A192,621;BQ788;Res701-1和Ro46-8443(Sigma-Aldrich,Inc.StLouis,MO)。應(yīng)當(dāng)理解，宿主細(xì)胞對腺病毒載體感染的響應(yīng)的減弱，可以提高在這樣的載體中遞送的編碼重組蛋白的構(gòu)建體的表達(dá)。最近，已經(jīng)表明，皮質(zhì)類固醇(地塞米松)施用可以預(yù)防有些免疫-和細(xì)胞凋亡-有關(guān)的重組腺病毒感染的內(nèi)皮的損傷(Murata,等人ArteriosclerThrombVaseBiol2005;25:1796-803),從而抑制促炎基因表達(dá)和最優(yōu)化體外和體內(nèi)重組基因表達(dá)效率。顯示了皮質(zhì)類固醇對腺病毒中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的增強作用是特異性的，在內(nèi)皮細(xì)胞中比在有些腫瘤細(xì)胞系中更顯著。另外，最近已經(jīng)表明，用N-乙酰半胱氨酸處理細(xì)胞(Jornot等人,JournalofGeneticMedicine2002;4:54-65)增強腺病毒-處理的內(nèi)皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)和病毒穿入。在將本發(fā)明付諸實施時，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)類固醇治療增強腺病毒介導(dǎo)的瞬時表達(dá)中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。在用表達(dá)在組成型CMV啟動子控制下的螢光素酶的腺病毒構(gòu)建體(Ad-CMV-LUC)感染之前用3地塞米松處理過的BAEC細(xì)胞中按照每叱總蛋白的螢光素酶百分比測得的縈光素酶表達(dá)增加了超過3倍。另外，在用在內(nèi)皮特異性啟動子PPE-1控制下的攜帶報告基因綠色熒光蛋白(GFP)的腺病毒構(gòu)建體感染之前用3|iM地塞米松處理過的BAEC中的重組基因表達(dá)與未處理的對照相比顯著增強(參見下文實施例42)。因而，在另一個實施方案中，與用于增加病毒顆粒的拷貝數(shù)和/或增強轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的其它一種或多種化合物組合地施用包含本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件的病毒構(gòu)建體，其中所述其它一種或多種化合物是皮質(zhì)類固醇(例如，例如地塞米松)和/或N-乙酰半胱氨酸(NAC)。本發(fā)明的構(gòu)建體和方法尤其適用于組織工程改造。VEGF和PDGF常用于誘導(dǎo)血管形成，但是，這些因子以有效方式施用的方法仍不是最佳的。在體外，將所述生長因子加入到生長培養(yǎng)基中。在這種方法中需要相對較高的濃度。在體內(nèi)，工程化組織構(gòu)建體需要快速血管形成和誘導(dǎo)植入部位的血管生成。本發(fā)明的順式調(diào)節(jié)元件和核酸構(gòu)建體可用于體內(nèi)和先體外后體內(nèi)的組織新血管形成，例如用于組織工程改造、傷口愈合處理等。在將本發(fā)明付諸實施時，首次證實處于PPE-l(3x)調(diào)節(jié)控制下的血管生成因子優(yōu)先在血管形成的體外工程化組織中表達(dá)，且在體外和體內(nèi)工程化組織中提供優(yōu)良的新血管形成。用Ad5PPEC-l-3xVEGF感染細(xì)胞對在工程化構(gòu)建體中形成的血管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)目和大小具有誘導(dǎo)作用，從而導(dǎo)致與向培養(yǎng)基中加入VEGF相比，Ad5PPEC-l-3xVEGF病毒處理樣品中的血管數(shù)目和血管面積百分比增加至4-5倍(圖91a)。在體內(nèi)研究中，分析基于植入支架的組織構(gòu)建體的存活、分化、整合和血管形成。與對照構(gòu)建體相比，用Ad5PPEC-l-3xVEGF病毒感染的構(gòu)建體顯示血管結(jié)構(gòu)增加。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體用于調(diào)節(jié)組織中的血管生成，所述組織是天然組織或工程化組織。使用基于螢光素酶的成像系統(tǒng)，本發(fā)明的發(fā)明人揭示，用Ad5PPEO1-3xVEGF感染的植入構(gòu)建體具有比僅用AAV-螢光素酶感染的對照構(gòu)建體更高的信號，從而表明用Ad5PPEC-l-3xVEGF體外感染可提升所植入的工程化組織構(gòu)建體的存活和血管形成(圖91b)。此外，含用本發(fā)明的腺病毒構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的這種工程化組織構(gòu)建體可經(jīng)細(xì)胞裂解，構(gòu)成用于周圍組織的治療性的重組病毒顆粒來源。因此，按照本發(fā)明的一個方面，提供含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的細(xì)胞。按照本發(fā)明的另一方面，這些細(xì)胞用于接種待用支架，例如用于組織工程改造。使用支架進(jìn)行組織工程改造的方法在本領(lǐng)域眾所周知(參見例如美國專利第6,753,181、6,652,583、6,497,725、6,479,064、6,438,802、6,376,244、6,206,917、6，783,776、6,576,265、6,521,750、6,444,803、6,300,127、6,183,737、6,110,480、6,027,743和5,906,827號，以及美國專利申請第0040044403、0030215945、0030194802、0030180268、0030124099、0020160510、0020102727號,這些文獻(xiàn)在此引入作為參考，所有這些文獻(xiàn)都講述了組織支架上工程化組織的產(chǎn)生)。合適的支架可由合成聚合物、細(xì)胞粘附分子或胞外基質(zhì)蛋白組成。本發(fā)明使用的細(xì)胞粘附/ECM蛋白可為任何細(xì)胞粘附和/或胞外基質(zhì)蛋白，包括但不限于血纖蛋白原、膠原蛋白、整聯(lián)蛋白(StefanidakisM等，2003;JBiolChem.278:34674-84)、細(xì)胞間粘附分子(ICAM)1(vandeStolpeA和vanderSaagPT.1996;J.Mol.Med.74:13-33)、生腱蛋白、纖連蛋白(JoshiP等，1993;J.CellSci.106:389-400)、波形蛋白、微管相關(guān)蛋白ID(TheodosisDT.2002;FrontNeuroendocrinol.23:101-35)、gicerin、神經(jīng)突增生因子(NOF)(TsukamotoY等，2001;Histo1.Histopathol.16:563-71)、聚羥基鏈烷酸酯(PHA)、細(xì)菌纖維素(BC)、明膠和/或神經(jīng)損傷諸導(dǎo)蛋白2(mnjurin2)(ArakiT和MilbrandtJ.2000;J.Neurosci.20:187-95)。本發(fā)明使用的合成聚合物可為聚乙二醇(PEG)、羥基磷灰石(HA)、聚乙醇酸(PGA)(FreedLE,Biotechnology(NY).1994Jul;12(7):689-93.)、用聚-l-交酯編織加固的s-己內(nèi)酯和l-乳酸[KN-PCLA](OzawaT等，2002;J.Thome.Cardiovasc.Surg.124:1157-64)、織物(WV-PCLA)[Ozawa,2002(出處同上)]、互連多孔羥基磷灰石《丐陶資(IP-CHA)、聚D,L,-乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)(KaitoT等，2005;Biomaterials.26:73-9)、不飽和聚酯(丙二醇-富馬酸)共聚物(PPF)(TrantoloDJ等，2003;Int.J.OralMaxillofac.Implants.18:182-8)、交酯畫乙交酯共聚物(PLAGA)(LuHH等，2003;J.Biomed.Mater.Res.64A(3):465-74)、聚-4-羥基丁酸酯(P4HB)和/或聚磷腈(CohenS等，1993;Clin.Mater.13(1-4):3-10)。在將本發(fā)明付諸實施時，本發(fā)明的發(fā)明人已揭示，將促凋亡試劑的組織特異性表達(dá)與特異性活化組合能夠選擇性地使參與血管生成的細(xì)胞凋亡，而不使非靶組織或細(xì)胞接觸這些試劑，從而避免了現(xiàn)有技術(shù)中的治療方法特有的毒性副作用和冗余現(xiàn)象。因此，按照本發(fā)明的一個方面，提供在受試者組織中下調(diào)血管生成的方法。此處所用的短語"下調(diào)血管生成，，指減緩或者阻止導(dǎo)致新血管生成的血管生成過程。本發(fā)明該方面的方法通過向受試者施用經(jīng)設(shè)計并構(gòu)建用于血管生成細(xì)胞亞群中的細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體來實現(xiàn)。此處所用的短語"血管生成細(xì)胞"指參與或有助于血管生成過程的任何細(xì)胞。因此，血管生成細(xì)胞包括但不限于內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞。本文使用的術(shù)語"細(xì)胞毒性"指化合物或過程以潛在不可逆的方式破壞細(xì)胞的正常代謝、功能和/或結(jié)構(gòu)、更經(jīng)常導(dǎo)致細(xì)胞死亡的能力。"細(xì)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性過程或途徑的能力的分子。這樣的細(xì)胞毒性分子包括細(xì)胞毒性藥物，例如但不限于抗代謝物，如氨曱蝶呤、核苷類似物、氮芥化合物、蒽環(huán)類、凋亡誘導(dǎo)物如胱天蛋白酶以及編碼細(xì)胞毒性藥物和細(xì)胞毒性過程的其它誘導(dǎo)物的基因例如Fas-c嵌合基因。細(xì)胞毒性藥物和分子可為絕對細(xì)胞毒性的，與其它因子無關(guān)，例如抗代謝藥物；或者可為條件型細(xì)胞毒性的，依賴于其它細(xì)胞毒性或非細(xì)胞毒性因子的相互作用。產(chǎn)生細(xì)胞毒性的結(jié)構(gòu)域定義為細(xì)胞毒性分子中能夠誘導(dǎo)或啟動細(xì)胞毒性的部分，例如細(xì)胞毒性基因的編碼序列。細(xì)胞毒性途徑尤其包括凋亡和壞死。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)胞毒性劑的表達(dá)針對血管生成細(xì)胞亞群。為了將細(xì)胞毒性劑的特異性表達(dá)引導(dǎo)至血管生成細(xì)胞亞群，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體包含編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區(qū)，所述嵌合多肽包含配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其例如可為受體酪氨酸激酶、受體絲氨酸激酶、受體蘇氨酸激酶、細(xì)胞粘附分子或磷酸酶受體的細(xì)胞表面受體結(jié)構(gòu)域，該細(xì)胞表面受體結(jié)構(gòu)域融合至細(xì)力包毒性分子(例如Fas、TNFR和TRAIL)的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域。這樣的嵌合多肽可包括融合至任意細(xì)胞毒性結(jié)構(gòu)域的任何配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，只要配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的活化(即經(jīng)配體結(jié)合)通過細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域觸發(fā)細(xì)胞毒性。配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和與之融合的產(chǎn)生細(xì)胞毒性的結(jié)構(gòu)域的選才奪根據(jù)被靶向用于凋亡的血管生成細(xì)胞類型受影響。例如，當(dāng)靶向特定的內(nèi)皮細(xì)胞亞群(例如增殖的內(nèi)皮細(xì)胞或表現(xiàn)出腫瘤表型的內(nèi)皮細(xì)胞)時，嵌合多肽所包含的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合天然存在于該內(nèi)皮細(xì)胞的環(huán)境中并優(yōu)選不存在于其它非輩巴向組織的內(nèi)皮細(xì)胞中的配體(例如TNF、VEGF)。這樣的配體可由內(nèi)皮細(xì)胞分泌(自分泌)、由鄰近的腫瘤細(xì)胞分泌(旁分泌)或特異性地靶向這些內(nèi)皮細(xì)胞。在上文、以及以下的實施例部分的實施例7和33-36中提供了合適的嵌合多肽的實例。優(yōu)選地，嵌合多肽為詳述于以下的實施例部分的實施例7-9中的Fas-c嵌合體，或描述于實施例33-36的HSV-TK基因。業(yè)已表明，F(xiàn)as-c嵌合體的表達(dá)經(jīng)FADD介導(dǎo)的Fas死亡途徑的活化來誘導(dǎo)凋亡。HSV-TK轉(zhuǎn)基因的表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞對藥物(例如更昔洛韋和阿昔洛韋)的超敏感性，從而導(dǎo)致凋亡和壞死性細(xì)胞死亡。使用這樣的嵌合多肽是特別有利的，因為如后文的實施例部分所示，其使得能在特定的血管生成細(xì)胞亞群中有效和有力地活化細(xì)胞毒性，同時避免在其它不一皮細(xì)胞死亡靶向的細(xì)胞亞群中活化。如在以下的實施例部分的實施例33-38中所闡述的，體外和體內(nèi)施用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體(包括處于PPE-1(3x)啟動子元件的轉(zhuǎn)錄控制之下的HSV-TK基因)，產(chǎn)生優(yōu)良的、更昔洛韋依賴性的內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒性限于血管生成內(nèi)皮細(xì)胞，在肺瘤和轉(zhuǎn)移中產(chǎn)生選擇性的凋亡性和壞死性細(xì)力包死亡。因此，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可用于遞送能夠?qū)⑶八庌D(zhuǎn)變?yōu)槎拘曰衔锏淖詺⒒颉Ｔ谝粋€優(yōu)選實施方案中，所述核酸構(gòu)建體包括編碼此自殺基因的第一多核苷酸區(qū)和編碼能夠引導(dǎo)所述自殺基因在血管生成細(xì)胞中表達(dá)的順式作用調(diào)節(jié)元件的第二多核苷酸區(qū)。在本發(fā)明的構(gòu)建體和方法中，治療性核酸序列或"自殺基因"是編碼產(chǎn)物的核酸，其中所述產(chǎn)物通過其自身或在其它化合物存在下引起細(xì)胞死亡。要認(rèn)識到的是，上述構(gòu)建體僅代表自殺構(gòu)建體的一個實例。其它實例是水痘帶狀皰滲病毒胸苷激酶和可將5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨榷拘缘幕衔?-氟尿嘧，定的細(xì)菌基因胞嘧啶脫氨酶。本文使用的"前藥"指可用于本發(fā)明方法的、可轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘援a(chǎn)物(即對腫瘤細(xì)胞有毒性)的任意化合物。所述前藥通過用于本發(fā)明方法的載體中的治療性核酸序列(自殺基因)的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘援a(chǎn)物。此前藥的代表性實例是更昔洛韋，其通過HSV-胸苷激酶在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘曰衔?。更昔洛韋衍生物隨后對胂瘤細(xì)胞有毒性。前藥的其它代表性實例包括阿昔洛韋、FIAU[l-(2-脫氧-2-氟-P-D-呋喃型阿糖基)-5-碘尿嘧啶]、用于VZV-TK的6-曱氧基嘌p令阿糖胞普以及用于胞嘧啶脫氨酶的5-氟胞嘧啶。優(yōu)選的自殺基因/前藥組合是細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶和5-氟胞嘧啶及其衍生物、水痘帶狀皰滲病毒TK和6-甲基嘌呤阿糖胞苷及其衍生物、HSV-TK和更昔洛韋、阿昔洛韋、FIAU或其衍生物。制備和使用自殺基因/前藥構(gòu)建體的方法詳述于Woo等的美國專利第6,066,624號以及下文的實施例部分。在一個優(yōu)選實施方案中，順式作用調(diào)節(jié)元件是內(nèi)皮或內(nèi)皮周特異性啟動子。因為用條件復(fù)制型腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞明顯在粑細(xì)胞裂解和病毒感染傳播方面更有效，所以核酸構(gòu)建體優(yōu)選包括條件復(fù)制型腺病毒。本發(fā)明的這種CRAD構(gòu)建體詳述于以下的實施例部分。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體通過例如全身施用途徑或經(jīng)口、直腸、跨粘膜(尤其是經(jīng)鼻)、腸或腸胃外施用途徑施用于受試者。全身施用包括肌內(nèi)、皮下和髓內(nèi)注射以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)注射或瘤內(nèi)施用。優(yōu)選地，所述受試者是哺乳動物，更優(yōu)選是人，最優(yōu)選是患有特征為過度或異常新血管形成的疾病的人，所述疾病例如為以胂瘤生長、增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病、關(guān)節(jié)炎等為特征的疾病。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可以自身或作為藥物組合物的部分(活性成分)施用于受試者?，F(xiàn)有技術(shù)講述了多種遞送策略，可用于向多種細(xì)胞類型有效遞送棵的或載體提供的多核苷酸(參見例如Luft(1998)JMolMed76(2):75-6;Kronenwett等，(1998)Blood91(3):852-62;Rajur等，(1997)BioconjugChem8(6):935-40;Lavigne等，(1997)BiochemBiophysResCommun237(3):566-71和Aoki等，(1997)BiochemBiophysResCommun231(3):540-5)。本文所用的"藥物組合物"指本文所述的一種或多種活性成分或試劑與其它化學(xué)成分(如生理學(xué)適宜的載體或賦形劑)的制劑。藥物組合物的目的在于便于將化合物施用于生物。在下文中，短語"生理學(xué)可接受的載體"和"藥學(xué)可接受的載體"可互換使用，指不對生物造成明顯刺激、且不取消所施用的核酸構(gòu)建體之生物活性和特性的載體或稀釋劑。佐劑包含在這些短語之中。術(shù)語"賦形劑"在本文中指添加到藥物組合物中以進(jìn)一步促進(jìn)活性成分施用的惰性物質(zhì)。賦形劑的非限制性實例包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和各類淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。藥物的配制和施用才支術(shù)可參見"Remington'sPharmaceuticalSciences,"MackPublishingCo.,Easton,PA,最新版，其在此引入作為參考。適宜的施用途徑可包括例如經(jīng)口、直腸、跨粘膜(尤其是經(jīng)鼻)、腸或腸胃外遞送，包括肌內(nèi)、皮下和髓內(nèi)注射以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射?；蛘?，人們可將所述藥物組合物以局部方式而非全身方式施用，例如經(jīng)由將所述藥物組合物直接注射到患者的組織區(qū)域內(nèi)。在本發(fā)明上下文中，直接施用于腫瘤組織是局部施用的相關(guān)實例。本發(fā)明的藥物組合物可以利用本領(lǐng)域已知的方法制造，例如通過傳統(tǒng)的混合、溶解、造粒、裹覆糖衣(dragee-making)、研磨、乳化、被嚢化、包載或凍干方法。因此，按照本發(fā)明使用的藥物組合物可通過傳統(tǒng)方式用一種或多種生理學(xué)可接受的、含斌形劑和助劑的載體配制，所述載體有助于將活性成分加工到藥學(xué)可用的制劑中。適當(dāng)?shù)闹苿┤Q于所選的施用途徑。對于注射，藥物組合物的活性成分可配制在水溶液中，優(yōu)選地配制在生理學(xué)相容的緩沖液中，比如Hank氏溶液、林才各液或生理鹽緩沖液。對于跨粘膜施用，在制劑中應(yīng)用適合于待透過屏障的滲透劑。這種滲透劑在本領(lǐng)域通常是已知的。域眾所周知的藥學(xué)上可接i的載體組:配制。所述載體使得能夠?qū)⑺幬锝M合物配制成片劑、丸劑、糖衣片、膠嚢、液體、凝膠、糖漿、漿、懸浮液等用于由病人口服。經(jīng)口使用的藥學(xué)制劑可利用固體賦形劑制造，任選地將所得混合物研磨，在根據(jù)需要加入適當(dāng)助劑后加工顆?；旌衔铮垣@得片劑或糖衣核。適宜的賦形劑具體地說是填料，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纖維素制劑，例如玉米淀粉、小麥淀粉、稻淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、西黃蓍膠、曱基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧曱基纖維素鈉；和/或生理學(xué)可接受的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要時可以添加崩解劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、或藻酸或其鹽，如藻酸鈉。為糖衣核提供適當(dāng)?shù)陌隆榇四康?，可使用濃縮糖溶液，其任選地可包含阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波泊爾凝膠、聚乙二醇、二氧化鈦、漆溶液和適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑或溶劑混合物?？上蚱瑒┗蛱且缕绿砑又珓┗蛏?，以鑒別或表征不同的活性化合物劑量的組合?？山?jīng)口使用的藥物組合物包括由明膠制成的推入契合(push-fit)膠嚢，以及由明膠和增塑劑(如甘油或山梨糖醇)制成的密封軟膠嚢。推入契合膠嚢可包含活性成分，其與填料(如乳糖)、粘合劑(如淀粉)、潤滑劑(如滑石或硬脂酸鎂)和任選的穩(wěn)定劑混合。在軟膠嚢中，所述活性成分可溶解或懸浮在合適的液體中，如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。另外，可添加穩(wěn)定劑。所有經(jīng)口施用的制劑都應(yīng)為適于選定施用途徑的劑量。對于口腔含化施用，所述組合物可采用以常規(guī)方式配制的片劑或糖錠形式。對于經(jīng)鼻吸入施用，按照本發(fā)明使用的活性成分可方便地以氣溶膠噴霧劑形式遞送，所述氣溶膠噴霧劑由加壓包裝或噴霧器使用適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳提供。對于加壓氣溶膠，劑量單位可通過提供閥確定以遞送計量的量。分配器中所用的膠嚢和藥筒(例如明膠)可配制成包含所述化合物和適當(dāng)?shù)姆勰┗|(zhì)(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。本文所述的藥物組合物可一皮配制成用于腸胃外施用，例如快速濃注或連續(xù)輸注。注射用制劑可以單位劑型提供，例如在安瓿中或多劑容器中，任選地添加防腐劑。所述組合物可為在油性或水性載體中的懸浮液、溶液或乳劑，且可包含例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑的配制試劑。用于腸胃外施用的藥物組合物包括為水溶性形式的活性制劑水溶液。另外，活性成分的懸浮液可制成合適的油性或水基注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯、甘油三酯或脂質(zhì)體。水性注射懸浮液可包含增加懸浮液粘性的物質(zhì)，如羧曱基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。任選地，所述懸浮液還可包含合適的穩(wěn)定劑或增加活性成分溶解性的試劑，以使得可以制成高濃縮溶液?；蛘?，所述活性成分可為粉末形式，用于在使用前用適當(dāng)?shù)妮d體如無菌無致熱原水基溶液進(jìn)行構(gòu)建。還可以利用例如傳統(tǒng)的栓劑基材如可可脂或其它甘油酯將本發(fā)明的藥物組合物配制成直腸組合物，例如栓劑或滯留型灌腸劑。適用于本發(fā)明上下文的藥物組合物包括其中含有有效實現(xiàn)預(yù)期目的的量的活性成分的組合物。更具體地說，治療有效量指有效阻止、減輕或改善疾病癥狀(例如進(jìn)行性骨量損失)或延長治療受試者存活的活性成分(例如反義寡核苦酸)量。治療有效量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力內(nèi)，尤其是在依照本文提供的詳細(xì)公開內(nèi)容的情況下。對于用于本發(fā)明方法的任何制劑，所述治療有效量或治療有效劑量首先可由體外和細(xì)胞培養(yǎng)測定估測。例如，可在動物才莫型如骨硬化病的鼠Src缺陷模型中配制劑量(Boyce等，(1992)J.Clin.Invest.90,1622-1627;Lowe等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90,4485-4489;Soriano等，(1991)Cell64,693-702),以達(dá)到所需的濃度或滴度。這樣的信息可用于更準(zhǔn)確地確定人中的有用劑量。本文所述的活性成分的毒性、細(xì)胞毒性和治療功效可通過標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)程序在體外、細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)峖全動物中確定。從這些體外和細(xì)胞培養(yǎng)可根據(jù)所用劑型和所用施用途徑變化。精確的制劑、施用途徑和劑量可由個別醫(yī)師根據(jù)病人的情況選擇。(參見例如Fingl等，1975,載于"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics",第一章笫1頁)。劑量和間隔可被單獨調(diào)整到足以阻礙腫瘤進(jìn)展的活性成分水平(最低有效濃度，MEC)。MEC隨各個制劑變化，但可由體外數(shù)據(jù)估測。達(dá)到MEC所必需的劑量取決于個體特征和施用途徑?？衫脵z測測定確定血漿濃度。根據(jù)被治療狀況的嚴(yán)重性和反應(yīng)性，給藥可以是單次或多次施用，療程持續(xù)幾天到幾周或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)減輕。所施用組合物的量當(dāng)然將取決于治療受試者、病痛嚴(yán)重程度、施用方式、處方醫(yī)師的判斷等等。需要時，本發(fā)明的組合物和組合物的組合可以以制品提供，例如包裝或分配裝置，例如經(jīng)FDA核準(zhǔn)的試劑盒，其可包括含有一種或多種活性成分的一個或多個單位劑型。例如，所述包裝可包括金屬或塑料箔，例如泡罩包裝。所述包裝或分配器裝置可隨附施用說明書。所述包裝或分配器還可提供有管理藥品生產(chǎn)、使用或銷售的政府機構(gòu)規(guī)定形式的伴隨容器的通知書，該通知書反映了該政府機構(gòu)對所述組合物形式或人或獸醫(yī)施用的批準(zhǔn)。此通知書例如可為經(jīng)美國食品和藥品管理局(U.S.FoodandDrugAdministration)批準(zhǔn)的處方藥標(biāo)簽，或者可為批準(zhǔn)產(chǎn)品的插頁。還可以制備含有在相容藥學(xué)載體中配制的本發(fā)明制劑的組合物，其放置在合適的容器中，且標(biāo)識出治療指定狀況，如上文的進(jìn)一步詳述一樣。也可以制備包含配制在適合的藥用載體中的本發(fā)明的肽的組合物，置于適當(dāng)容器中，標(biāo)記上指定狀況的治療或預(yù)防或希望的事件的誘導(dǎo)。標(biāo)簽上的合適適應(yīng)癥可以包括血管生成有關(guān)的疾病或狀況、與過度的新血管形成有關(guān)的疾病或狀況的治療和/或預(yù)防，胂瘤形成或生長的治療和/或預(yù)防，與局部缺血、血管生成的下調(diào)有關(guān)的疾病或狀況的治療和/或預(yù)防，癌癥、轉(zhuǎn)移性疾病、過度增殖疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牛皮痺)和傷口愈合等的治療和/或預(yù)防。本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步包括任何附加成分，所述附加成分可改善細(xì)胞對所述核酸構(gòu)建體的攝取，提升由所述核酸構(gòu)建體編碼的嵌合多肽或自殺基因在細(xì)胞中的表達(dá)，或提升所表達(dá)的嵌合多肽或自殺基因產(chǎn)物的活性。在一個實施方案中，所述附加成分可以是能增加腺病毒的拷貝數(shù)或增強血管生成調(diào)節(jié)物(例如皮質(zhì)類固醇和/或N-乙酰半胱氨酸和/或內(nèi)皮素受體拮抗劑、尤其B-形式特異性內(nèi)皮素受體拮抗劑)的表達(dá)的化合物，如在下面的實施例部分所顯示的。例如，用工程化抗體或小肽處理載體可提高EC細(xì)胞對腺病毒載體的攝取。這樣的"腺體(adenobody)"治療顯示出將腺病毒構(gòu)建體有效導(dǎo)向細(xì)胞上的EGF受體(Watkins等，1997,GeneTherapy4:1004-1012)。另夕卜，Nicklin等已表明，通過噬菌體展示分離的小肽增加了載體在內(nèi)皮細(xì)胞中的特異性和效率，且降低了在培養(yǎng)物肝細(xì)胞中的表達(dá)(Nicklm等，2000,Circulation102:231-237)。在最近的研究中，F(xiàn)GF再耙向的腺病毒載體降低了tk在小鼠中的毒性(Printz等，2000,HumanGeneTherapy11:191-204)。業(yè)已表明，低劑量輻射主要在G2/M期引起DNA鏈斷裂，引起細(xì)胞膜損傷，從而增強旁觀者效應(yīng)，且由此在聯(lián)合施用時可加強其它細(xì)胞毒性和抗瘤治療。血管內(nèi)皮細(xì)胞尤其適合于這樣的聯(lián)合或附加治療，因為已證實低劑量輻射特異性地靶向微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡系統(tǒng)(Kolesnick等，Oncogene2003;22:5897-906)。業(yè)已表明制管張素加強低劑量輻射的療效(Gorski等，CanRes1998;58:5686-89)。但是，對輻射的作用仍了解不多，因為也已經(jīng)表明輻射增加促血管生成性"組織修復(fù)因子，，(Itasaka等，AmAssocCaneRes,2003;摘要115)。類似地，已表明某些化療劑活化特定細(xì)胞毒性和凋亡途徑[阿霉素、順鉑和絲裂霉素C誘導(dǎo)Fas受體、FADD和FADD/MORT-1途徑中的其它促凋亡信號累積(Micheau等，BBRC1999256:603-07)]。在將本發(fā)明付諸實施時，令人驚奇地揭示出，低劑量輻射治療對核酸構(gòu)建體(包括處于PPE-l(3x)控制下的TK和更昔洛韋施用)的抗胂瘤和抗轉(zhuǎn)移有效性具有明顯的協(xié)同作用(實施例35和36，圖79-86)。這在本發(fā)明上下文中是特別有關(guān)聯(lián)的，因為已證實這樣的低劑量輻射可活化TK表達(dá)和療效，可特異性地加強阿霉素化療作用，并已知活化FADD/MORT-1凋亡途徑(Kim等，JBC2002;277:38855-62)。此聯(lián)合治療的效力的進(jìn)一步證據(jù)描述于實施例37,該實施例闡述了在內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)中聯(lián)合施用阿霉素和AdPPE-l(3x)-Fas-c嵌合構(gòu)建體的協(xié)同作用(圖91)。因此，對于與異常血管生成相關(guān)的疾病或狀況，可使用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體和含其的藥物組合物單獨地或與一種或多種針對該疾病的其它確立的或?qū)嶒炐灾委煼桨嘎?lián)合進(jìn)行治療。適于與本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或編碼其的多核苷酸聯(lián)合的治療癌癥的治療方案包括但不限于化學(xué)療法、放射療法、光線療法和光動力學(xué)治療、外科手術(shù)、營養(yǎng)療法、切除療法、聯(lián)合的放射療法和化學(xué)療法、臂療法(brachiotherapy)、質(zhì)子射束療法、免疫療法、細(xì)胞療法和質(zhì)子射束力丈射外科手術(shù)療法?？膳c本發(fā)明的化合物共同施用的抗癌藥物包括但不限于異喁唑醋酸(Acivicin)、阿柔比星(Aclambicin)、鹽酸阿可達(dá)哇(AcodazoleHydrochloride)、阿克羅寧(Acronine)、亞得里亞霉素(Adriamycin)、阿多來新(Adozelesin)、阿地白介素(Aldesleukin)、六甲密胺(Altretamine)、丙氨肽霉素(Ambomycin)、阿美坦醌(AmetantroneAcetate)、氨魯米特(Aminoglutethimide)、安吖咬(Amsacrine)、阿那曲哇(Anastrozole)、氨茴霉素(Anthramycin)、天冬酰胺酶(Asparaginase)、曲林菌素(Asperlin)、氮雜胞普(Azacitidine)、阿扎替派(Azetepa)、阿佐霉素(Azotomycin)、巴馬司他(Batimastat)、苯佐替派(Benzodepa)、比卡魯胺(Bicalutamide)、鹽酸比?？?BisantreneHydrochloride)、二曱石黃酸雙奈法德(BisnafideDimesylate)、比折來新(Bizelesin)、硫酸博來霉素(BleomycinSulfate)、白瑞夸爾鈉(Br叫uinarSodium)、溴匹利明(Bropirimine)、白消安(Busulfan)、放線菌素C(Cactinomycin)、卡魯睪酮(Calusterone)、卡拉酰胺(Caracemide)、卡貝替姆(Carbetimer)、卡柏(Carboplatin)、卡莫司汀(Carmustine)、鹽酸卡米諾霉素(CambicinHydrochloride)、卡折來新(Carzelesin)、西地芬戈(Cedefingol)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、西羅里霉素(Cirolemycin)、順鉑(Cisplatin)、克拉屈濱(Cladribine)、甲磺酸克雷斯托(CrisnatolMesylate)、環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide)、阿糖胞苷(Cytarabine)、達(dá)卡巴漆(Dacarbazine)、放線菌素D(Dactinomycin)、鹽酸柔紅霉素(DaunorubicinHydrochloride)、脫氧氮雜胞苷(Decitabine)、右奧馬賴(Dexormaplatin)、地扎胍寧(Dezaguanine)、甲石黃酸地扎呱寧(DezaguanineMesylate)、地吖酉昆(Diaziquone)、多西他賽(Docetaxel)、阿霉素(Doxorubicin),鹽酸阿霉素(DoxorubicinHydrochloride)、屈洛西芬(Droloxifene)、獰檬酸屈洛西芬(DroloxifeneCitrate)、丙酸2-曱氬睪酮(DromostanolonePropionate)、偶氮霉素(Duazomycin)、依達(dá)曲沙(Edatrexate)、鹽酸艾佛鳥氨酸(EflornithineHydrochloride),依沙，星(Elsamitrucin)、恩絡(luò)鉑(Enloplatin)、恩普氨酯(Enpromate)、依匹哌啶(Epipropidine)、鹽酸表阿霉素(EpirubicinHydrochloride),厄布洛唑(Erbulozole)、鹽酸去羥阿霉素(EsorubicinHydrochloride)、雌莫司汀(Estramustine)、站,莫司汀石舞酉臾4內(nèi)(EstramustinePhosphateSodium)、依j也》宵p坐(Etanidazole)、I才乇泊苦(Etoposide)、石岸酉臾I托泊苦(EtoposidePhosphate)、氯苯乙嘧胺(Etoprine)、鹽酸法羅哇啉(FadrozoleHydrochloride)、法扎拉濱(Fazarabine)、芬維A胺(Fenretinide)、氟尿苷(Floxundine)、磷酸氟達(dá)拉濱(FludarabinePhosphate)、氟尿嘧咬(Fluorouracil)、氟西他賓(Flurocitabine)、磷p套酮(Fosquidone)、福司曲辛鈉(FostriecinSodium)、吉西他濱(Gemcitabine)、鹽酸吉西他濱(GemcitabineHydrochloride)、羥基脲(Hydroxyurea)、鹽酸去曱柔毛霉素(IdambicinHydrochloride)、異環(huán)磷酰胺(Ifosfamide)、伊莫佛新(Ilmofosine)、干擾素a-2a、干擾素a-2b、干擾素a-nl、干擾素a-n3、干擾素J3-Ia、干擾素y-Ib、異丙4白(Iproplatin)、鹽酸伊立替康(IrinotecanHydrochloride)、生長妥林(LanreotideAcetate)、來曲唑(Letrozole)、醋酸亮丙瑞林(LeuprolideAcetate)、鹽酸利阿峻(LiarozoleHydrochloride),洛美曲索鈉(LometrexolSodium)、洛莫氮芥(Lomustine)、鹽酸洛索蒽醌(LosoxantroneHydrochloride)、馬丙考(Masoprocol)、美登素(Maytansine)、鹽酸氮芥(MechlorethamineHydrochloride)、醋酸曱地孕酮(MegestrolAcetate)、醋酸美侖孕酮(MelengestrolAcetate)、美法侖(Melphalan)、美洛才各端(Menogaril)、巰噤呤(Mercaptopurine)、曱氨蝶呤(Methotrexate)、甲氨蝶呤鈉(MethotrexateSodium)、氯苯氨啶(Metoprine)、四甲尿烷亞胺(Meturedepa)、米汀多酰胺(Mitindomide)、米托克星(Mitocarcin)、絲裂紅素(Mitocromin)、絲裂吉菌素(Mitogillin)、絲裂馬菌素(Mitomalcin)、絲裂霉素(Mitomycin),絲裂帕菌素(Mitosper)、米托坦(Mitotane)、鹽酸米4乇蔥酉昆(MitoxantroneHydrochloride)、麥考盼酉臾(MycophenolicAcid)、》各可達(dá)口坐(Nocodazole)、i若力口4立霉素(Nogalamycin)、奧馬4白(Ormaplatin)、奧昔舒侖(Oxisuran)、紫杉醇(Paclitaxel)、培加帕酶(Pegaspargase)、培利霉素(Peliomycin)、戊氮齊(Pentamustine)、疏酸培來霉素(PeplomycinSulfate)、哌磷酰胺(Perfosfamide)、哌泊溴烷(Pipobroman)、。底泊舒凡(Piposulfan)、鹽酸必散特隆(PiroxantroneHydrochloride)、普卡霉素(Plicamycin)、普洛美坦(Plomestane)、口卜p分姆鈉(PorfimerSodium)、泊非羅霉素(Porfiromycin)、松龍苯芥(Prednimustine)、鹽酸丙卡巴肼(ProcarbazineHydrochloride)、噤呤霉素(Puromycin)、鹽酸噤呤霉素(PuromycinHydrochloride)、p比p坐霉素(Pyrazofurin)、利》皮A泉脊(Riboprine)、吡魯米特(Rogletimide)、沙芬戈(Safingol)、鹽酸沙芬戈(SafingolHydrochloride)、司莫司汀(Semustme)、雙曲秦(Simtrazene)、斯帕石壽酸鈉(SparfosateSodium)、司帕素霉素(Sparsomycin)、鹽酸鍺螺胺(SpirogermaniumHydrochloride)、蟲累施氮芥(Spiromustine)、"l頁蟲系4白(Spiroplatin)、鏈黑霉素(Streptonigrin)、鏈脲霉素(Streptozocin)、磺氯苯脲(Sulofenur)、他利霉素(Talisomycin)、他克唑(Taxol)、替可加蘭鈉(TecogalanSodium)、喃氟咬(Tegafur)、鹽酸替洛蒽醌(TeloxantroneHydrochloride)、替莫泊芬(Temoporfin)、替尼泊苦(Teniposide)、臺羅西隆(Teroxirone)、睪內(nèi)酯(Testolactone)、硫唑鳥嘌呤(Thiamiprine)、石充鳥噪呤(Thioguanine)、噻替派(Thiotepa)、噻唑呋林(Tiazofuirin)、替拉扎明(Timpazamine)、鹽酸拓樸替康(TopotecanHydrochloride)、擰檬酸托瑞米芬(ToremifeneCitrate)、醋酸7-曱諾酮(TrestoloneAcetate)、磷酸曲西瑞賓(TriciribinePhosphate)、曲美沙特(Trimetrexate)、三甲曲沙葡糖醛酯(TnmetrexateGlucuronate)、曲普瑞林(Triptorelin)、鹽酸九布洛峻(TubulozoleHydrochloride)、尿嘧啶氮芥(UracilMustard)、烏瑞替哌(Uredepa)、伐普肽(Vapreotide)、維替泊芬(Verteporfin)、石危酸長春堿(VinblastineSulfate)、硫酸長春新堿(VincristineSulfate),長春地辛(Vindesine)、硫酸長春地辛(VindesineSulfate),硫酸長春匹定(VinepidineSulfate),硫酸長春甘酯(VinglycinateSulfate),硫酸長春素(VinleurosineSulfate)、長春瑞賓(VinorelbineTartrate)、碌u酸異長春石咸(VinrosidineSulfate)、硫酸長春氮芥(VinzolidineSulfate)、伏羅唑(Vorozole)、折尼拉汀(Zeniplatin)、凈司他丁(Zinostatin)、鹽酸佐柔比星(ZorubicinHydrochloride)。其余的抗瘤劑包括^>開于AntineoplasticAgents(PaulCalabresi和BruceA.Chabner)笫52章和其中的引言、Goodman和Gilman的"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics",第8版,1990,McGraw-Hill,Inc.(HealthProfessionsDivision)的1202-1263中的那些抗瘤劑。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，盡管優(yōu)選靶向接觸配體或細(xì)胞毒性前藥的細(xì)胞，但本發(fā)明還設(shè)想本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在不接觸配體或細(xì)胞毒性前藥或者天然不受其影響的細(xì)胞中表達(dá)。在此情況下，本發(fā)明的方法包括將此配體或前藥施用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的步驟。這樣的施用可通過使用任一種上述施用方法實現(xiàn)。優(yōu)選地，所述配體或前藥使用例如抗體綴合的耙向以細(xì)月包耙向的方式施用，從而使得細(xì)胞毒性的活化是高度特異性的。細(xì)胞毒性或凋亡活化的這種方法詳述于以下的實施例部分。因此，本發(fā)明提供核酸構(gòu)建體、含此種構(gòu)建體的藥物組合物和使用此種構(gòu)建體在以過度或異常血管生成為特征的組織區(qū)中下調(diào)血管生成的方法。由于本發(fā)明使得能夠在特定細(xì)胞亞群中靶定表達(dá)，所以本發(fā)明還可進(jìn)行修改并用于治療各種腫瘤。因此，按照本發(fā)明的另一方面，提供治療胂瘤的方法。本發(fā)明該方面的方法通過在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上述嵌合多肽或自殺基因來實施。因此，根據(jù)本發(fā)明的這一方面，所述多肽嵌合體或自殺基因的表達(dá)由腫瘤特異性元件指導(dǎo)，所述腫瘤特異性元件例如但不限于胃泌素釋放肽(GRP)啟動子[AF293321S3;MorimotoEAnticancerRes2001年1月畫2月；21(1A):329-31]、hTERT啟動子[AH007699;GuJ,GeneTher2002年l月；9(1):30-7]、己糖激酶II型啟動子[AF148512;KatabiMM,HumGeneTher.1999年1月20日；10(2):155-64]或L絲束蛋白啟動子[L05490,AH002870,MMU82611;PengXY,CancerRes.2001年6月1日；61(11):4405-13]。多肽嵌合體(例如Fas-c)或自殺基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)激活這些細(xì)胞中的細(xì)胞毒性和/或凋亡，并從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這進(jìn)而引起腫瘤生長減緩或停滯，并有可能引起腫瘤收縮。在檢查以下的非限制性實施例后，本發(fā)明的其它目的、優(yōu)點和新特征對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。另外，上文敘述的和下文權(quán)利要求書部分所要求保護(hù)的本發(fā)明各種實施方案和方面的每一個都在以下實施例中得到實驗支持。,滋奔現(xiàn)在參考以下實施例，連同以上的描述一起，以非限制性方式闡述本發(fā)明。分子技術(shù)、生物化學(xué)技術(shù)、、微生物學(xué)技術(shù)和重組DNA:術(shù)r這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳盡解釋。參見例如"MolecularCloning:AlaboratoryManual"Samb謹(jǐn)k等，(1989);"CurrentProtocolsinMolecularBiology"I-III巻,Ausubel,R.M.編輯,(1994);Ausubel等,"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,"APracticalGuidetoMolecularCloning",JohnWiley&Sons,NewYork(1988);Watson等，"RecombinantDNA，，，ScientificAmericanBooks,NewYork;Birren等(編輯)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries",1-4巻，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998);在美國專利第4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192，659和5,272,057號中敘述的方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook"，I畫III巻Cellis,J.E.編著(1994);"CurrentProtocolsinImmunology"I-III巻ColiganJ.E.編輯，(1994);Stites等(編輯)，"BasicandClinicalImmunology，，(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);Mishell和Shiigi(編輯)，"SelectedMethodsinCellularImmunology",W.H.FreemanandCo.,NewYork(1980);可用的免疫測定在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中有全面描述，參見例如美國專利第3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4，034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521號；"OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.編專耳，(1984);"NucleicAcidHybridization"Hames,B.D.和HigginsS.J.編輯,(1985);"TranscriptionandTranslation，，Hames,B.D.和HigginsS.J.編輯，(1984);"AnimalCellCulture"Freshney,R丄.編輯，(1986);"ImmobilizedCellsandEnzymes，，IRLPress,(1986);"APracticalGuidetoMolecularCloning，，Perbal,B.,(1984)和"MethodsinEnzymology"l-317巻，AcademicPress;"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications",AcademicPress,SanDiego,CA(1990);Marshak等，"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual"CSHLPress(1996》所有這些文獻(xiàn)均如同在本文完整敘述一樣引入到本文中。其它通用參考文獻(xiàn)貫穿于本文件提供。其中的程序一般認(rèn)為是本領(lǐng)域眾所周知的，且僅為方便讀者而提供。其中所包含的所有信息都在此引入作為參考。具體地說，結(jié)合下文提及的實施例進(jìn)行的實-瞼使用以下方法和材料使Lewis肺癌細(xì)胞-(D122-96)、人胚腎細(xì)胞(293)和HeLa細(xì)胞在補加了10。/。胎牛血清(FCS)、50U/ml青霉素、50g/ml鏈霉素和2mM谷氨酰胺的4.5gr/1DMEM(Biologicalindustries,Belt畫Haemek,以色列)中生長。使牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞-BAEC、正常皮膚成纖維細(xì)胞-NSF、HepG2和人臍內(nèi)皮細(xì)胞-HUVEC-304(ATCC,USA)在補加了5%FCS、50U/ml青霉素、50g/ml鏈霉素和2mM谷氨酰胺的1.0gr/1DMEM(Biologicalindustries,Beit-Haemek,以色列)中生長。給BAEC細(xì)胞補加完全成纖維細(xì)胞生長因子(Sigma,St.Louis.MO.)。使RINrl046-38(RIN-38)在補加了5%FCS(BiologicalIndustries,Beit-Haemek,以色列)、50U青霉素/ml、50g鏈霉素/ml和2mM谷氨酰胺的199Earle氏鹽(5.5mM葡萄糖)培養(yǎng)基中生長。本文所用的"HepG2，，指ATCC-HB-8065。本文所用的"HeLa"指ATCC-CCL-2。本文所用的"人支氣管上皮細(xì)胞"和"B2B"指ATCC-CRL-9609。本文所用的"HUVEC"和"人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞"指ATCC-CRL-1730。本文所用的"CHO"和"中國倉鼠卵巢"指ATCC-61。轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)后26小時，將細(xì)胞在分離的室中溫育，用以N2平衡的含有0.5%02、5%C02的氣流洗滌30分鐘。將該分離的室置于5%C02、37。C濕潤培養(yǎng)箱中。匆/《f^^歡^資i為了定量測定PPE-1啟動子的體外和體內(nèi)活性，使用螢光素酶基因表達(dá)系統(tǒng)試劑盒(PromegaCorp.,Madison,WI)。轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時，洗滌細(xì)胞，加入2001裂解緩沖液達(dá)15分鐘。收集細(xì)胞裂解液，于4。C離心15分鐘(14,000rpm)。隨后，加入101上清液至501螢光素酶測定緩沖液中。用發(fā)光計測量20秒時間段內(nèi)的所述活性。為了測定實體組織中的螢光素酶活性，切取20mg樣品，且在1ml勻漿溶液中勻漿，并于4°C離心15分鐘(14,000rpm),如上所述測定10ml上清液中的螢光素酶活性。結(jié)果以螢光素酶光單位/lg蛋白表示。蛋白質(zhì)采用Bradford測定測量，以牛血清清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)。謬^^^t力GF尸承#為了測試GFP的體外表達(dá)，細(xì)胞用PBS洗滌兩次，并用新鮮制備的4。/。低聚甲醛的PBS溶液固定30分鐘。固定后，通過熒光顯微鏡術(shù)進(jìn)行檢查。為了測試所遞送基因的體內(nèi)細(xì)胞分布，將組織在新鮮制備的溶于0.1M磷酸鹽緩沖液的4%低聚甲醛中于4。C固定6小時，在30%蔗糖中于4°C浸泡過夜，然后在OCT化合物(Sakura,USA)中冷凍。用恒冷切片機將組織塊切成10m厚的切片，然后直接在熒光顯微鏡(FITC濾光片)乂#豸勿/《和靜,感勿應(yīng)為了比4支增殖和靜息BAEC中的PPE-1啟動子活性，將細(xì)胞分成兩組1.增殖細(xì)胞一在10。/oFCS培養(yǎng)基中生長和感染。2.靜息細(xì)胞一轉(zhuǎn)導(dǎo)前72小時內(nèi)開始在無血清培養(yǎng)基中生長和感染。使所有細(xì)胞皆在5%C02、37。C濕潤培養(yǎng)箱中生長。f邀《劍^潛曹麇;^善^斬務(wù)構(gòu)建幾個重組復(fù)制缺陷型腺病毒(5型)。包含鼠前內(nèi)皮素原-1(PPE-1)啟動子(SEQIDNO:l)的表達(dá)盒位于螢光素酶基因(來源于pGL2-basic,GenBank登記號X65323)上游，且將SV40聚腺苷酸化位點(來源于pGL2-basic,GenBank登記號X65323)連接到pPAC.plpA(無啟動子構(gòu)建體)的BamHI限制位點。將GFP基因(來源于pEGFP,GenBank登記號AAB02572)于Notl限制位點與PPE-1啟動子連接。按照Becker,T.C.等(MethodsCellbiol.43;RothM.(編著)NewYork.AcademicPress,1994,161-189頁)所述，通過將pPACPPE-lLuc或Ad5PPE-lGFP與腺病毒質(zhì)粒pJM17共轉(zhuǎn)染，制備^皮稱為Ad5PPE-lLuc或Ad5PPE-lGFP的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，然后收獲重組病毒體。制備大規(guī)模生產(chǎn)用病毒。將濃度為109-1012噬斑形成單位/ml(pfu/ml)的病毒原液于4。C貯存。按照對PPE-1病毒載體的描述制備供大規(guī)^t制備用的含有巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動子(GenBank登記號U47119)的病毒Ad5CMV畫Luc和Ad5CMV-GFP(Quantumbiotechnologies,Carlsbad,加拿大)，并將其用作非組織特異性對照。尸尸E啟動子^發(fā)謬通過將Bu等(J.BiolChem.(1997)272(19):32613-32622)發(fā)現(xiàn)的正轉(zhuǎn)錄元件的三個拷貝插入到位于43個堿基對內(nèi)源正元件(-364至-320bp)下游(-286bp)的Nhel限制酶位點，開發(fā)修飾型鼠PPE-1啟動子。本文稱為"3X"的增強子片段是鼠PPE-1啟動子中存在的內(nèi)源序列元件(SEQIDNO:1的核普酸坐標(biāo)407-452)的三重拷貝。先前已經(jīng)表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞中PPE-1啟動子活性的誘導(dǎo)依賴于該元件的存在(Bu等，J.BiolChem.(1997)272(19):32613-32622)。通過用長度為96個堿基對的兩條互補單鏈DNA鏈(BioTechnologyindustries;NesTziona,以色列)(SEQIDNO:2和3)合成3X片段。使所述兩個單鏈DNA片段退火，且用克列諾(Klenow)片段(NEB)填補；所得的雙鏈DNA長145個堿基對，并包含Nhe-l限制位點(SEQIDNO:4)。用T4連接酶，將所述3X片段連接到內(nèi)源Nhe-l位點下游的鼠PPE-1啟動子中。讓所得的構(gòu)建體在DH5感受態(tài)細(xì)胞中繁殖，且用大量制備Qiagene試劑盒生產(chǎn)大規(guī)沖莫質(zhì)粒制劑。絲#在野^，尸尸￡-/y^^子含有1.4kb鼠前內(nèi)皮素原-1(PPE-1)啟動子、具有SV40聚腺苷酸化信號(GenBank登記號X65323)位點的螢光素酶基因和鼠ET-1基因的第一內(nèi)含子的PPE-l-螢光素酶盒(5249bp)來源于Harats等(J.Clin.Inv.(1995)95:1335-1344)使用的pEL8質(zhì)粒(8848bp)。用BamHI限制酶從pEL8質(zhì)粒中提取PPE-l-螢光素酶盒，然后用提取試劑盒(Qiagen，Hilden,德國)從1%瓊脂糖凝膠中提取DNA片段。尤啟動子p尸」G>//^4|在含有腺病毒5型序列的無啟動子pPAC.plpA質(zhì)粒(7594bp)來源于pPACCMV.pLpA(8800bp)。用Notl限制酶除去CMV啟動子、多克隆位點和SV40聚腺普酸化位點(1206bp),從1%瓊脂糖凝膠中提取片段化DNA。該線性質(zhì)粒(7594bp)通過克列諾片段填補，且用快速DNA連接試劑盒將BamHI接頭與兩個粘性末端連接。該線性質(zhì)粒用T4DNA連接酶再連接，并轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，以擴增具有BamHI限制位點的pPAC.plpA。制備供大規(guī)模制備用的質(zhì)粒，并用大量制備DNA純化試劑盒純化。盧C尸尸E-/f^,凝婁在通過用T4DNA連接酶，將PPE-l-螢光素酶盒插入到pPAC.plpA質(zhì)粒的BamHI限制位點中，構(gòu)建pPACPPE-l安光素酶質(zhì)粒。隨后用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。制備大規(guī)模制備用質(zhì)粒(12843bp),并用大量制備DNA純化試劑盒純化。盧C尸尸E腿/GF尸者在通過用T4DNA連接酶，將位于PPE-1啟動子下游的GFP基因(來源于pEGFP,GenBank登記號AAB02572)亞克隆到Notl限制位點中，構(gòu)建pPACPPE-1GFP質(zhì)粒。隨后用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。制備大規(guī)模制備用質(zhì)粒(11,801bp),并用大量制備DNA純化試劑盒純化。/^C尸尸五-"Z#乂,雄|在和;^403尸五-/3;^(^^,在通過將經(jīng)BamHI限制酶消化由含有Luc或GFP的pEL8-3X(圖26B)獲得的PPE-l-3XLuc盒或PPE-1-3XGFP盒插入到pPAC.plpA質(zhì)粒的BamHI限制位點中，構(gòu)建pPACPPE-l-3X螢光素酶和pPACPPE-l-3XGFP。pEL8-3X含有位于BamHI和Notl之間的修飾型鼠PPE-1啟動子(1.55kb)(紅色)，所述啟動子含有位于兩個NheI位點之間的三重內(nèi)皮特異性增強子3X(如SEQIDNO:7所示)。所述啟動子、螢光素酶基因或GFP基因、SV40聚腺苷酸化位點和內(nèi)皮素-1基因的第一內(nèi)含子，它們一起被稱為PPE-1修飾性啟動子盒，如材料和方法中所述，用BamHI限制酶對其進(jìn)行消化和提取。制備供大規(guī)模制備用的質(zhì)粒(12843bp)，并通過大量制備DNA純化試劑盒純化。SV40-螢光素酶才艮道質(zhì)粒(PromegaGmbh,Manheim,德國)用作BAEC實-瞼中的非選^奪性啟動子對照。Z)A^脊^-轉(zhuǎn)導(dǎo)前24小時，將細(xì)胞接種到24孔或96孔亞中。對樣品孔內(nèi)的分匯合(subconfluent)細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。然后，吸出各孔中的生長培養(yǎng)基，且將指定病毒載體以指定的感染復(fù)數(shù)(MOI)在感染培養(yǎng)基(DMEM或RPMI1640,2%FBS)中稀釋并加入到單層中。將細(xì)胞在室溫下溫育4小時。然后，加入完全培養(yǎng)基，且將該細(xì)胞在37°C、5%(:02下溫育72小時。動參所有動物程序都得到ShebaMedicalCenter,Tel-Hashomer的"AnimalCareandUseCommittee，，批準(zhǔn)。使用以下的不同小鼠品系(i)3月齡雄性野生型C57BL/6小鼠(Harlanfarms,Jerusalem,以色列)。(ii)3月齡雄性BALB/C小鼠(Harlanfarms,Jerusalem,以色列)。(111)6月齡雄性和雌性ApoE基因缺陷型、C57BL/6xSJ129小鼠的小鼠雜種(PlumpAS.等，Cell(1991)71:343-353)。(iv)3月齡雄性和雌性小鼠，該小鼠超表達(dá)處于鼠PPE-1啟動子控制之下的螢光素酶基因(5.9Kb),由Harats等產(chǎn)生(J.Clin.Inv.(1995)95:1335-1344)。所有小鼠都在脂質(zhì)和動脈粥樣硬化研究所(LipidsandAtherosclerosisResearchInstitute)生長。j￡,v、it哞w逸歡差^4這為了測定效率和組織特異性，如上文所述，將101Qpfu/ml的Ad5PPElLuc或Ad5CMVLuc(作為非組織特異性對照)懸浮于100l生理鹽水中，然后注射到小鼠尾靜脈內(nèi)。注射后1天、5天、14天、30天和90天測定螢光素酶活性。為了定位所表達(dá)報告基因的細(xì)胞分布，將Ad5PPE-lGFP或Ad5CMVGFP(1010pfu/ml，在100|ul生理鹽水中)注射到3月齡正常雄性C57BL/6小鼠尾靜脈內(nèi)。注射后5天檢測GFP表達(dá)。所有小鼠看來都健康，并且在肝或其它組織中未見毒性或炎癥。邀織哞的GF尸活#為了測試所遞送基因的體內(nèi)細(xì)胞分布，將取自注射小鼠的組織樣品在新鮮制備的溶于0.1M磷酸鹽緩沖液的4%低聚甲醛中于4。C固定6小時，在30%蔗糖中于4。C浸泡過夜，然后在OCT化合物(Sakura,California,USA)中冷凍。將組織塊切成10m厚的切片，且直接在熒光顯微鏡(FITC濾光片)下觀察。用胰蛋白酶/EDTA收獲Lewis肺癌纟田月包(LLC),用PBS洗滌3次，且用0.1。/o錐蟲藍(lán)(Biologicalindustries,Beit隱Haemek,以色列)計數(shù)，以評價其生存力。為了測試小鼠腫瘤血管生成中的PPE-1啟動子活性的活性水平，使用兩種不同的腫瘤膜型。在原發(fā)性肺瘤膜型中，將細(xì)胞(lxl(^細(xì)胞/ml，在100l生理鹽水中)皮下注射入小鼠背部(n=17)。注射后21天，將Ad5PPE-1、Ad5PPE-1GFP、Ad5CMV或Ad5CMVGFP(101Qpfu/ml)注射到腫瘤組織(IT)中或進(jìn)行靜脈內(nèi)注射，且如上所述才企測其活性。在轉(zhuǎn)移性腫瘤^t型中，給小鼠爪墊(n=12)注射細(xì)胞(5x105纟田月包/ml，在501生理鹽水中)。當(dāng)肺瘤組織的直徑達(dá)到0.7mm大小時，在麻醉和無菌條件下切除爪墊(帶有原發(fā)性腫瘤)。外科手術(shù)后14天，給小鼠尾靜脈內(nèi)注射病毒(Ad5PPE-l、Ad5PPE-lGFP、Ad5CMVLuc或Ad5CMVGFP)。在這兩種胂瘤實驗?zāi)Ｐ椭?，注射病毒?天處死小鼠，切下其組織，且測試螢光素酶活性或GFP活性。^口奮合微通過皮下注射戊巴比妥鈉(6mg/kg)麻醉3月齡雄性C57BL/6小鼠。剃下其背上的毛，且作5cm直切口。立即用4/0無菌絲線將切口縫合。通過H&E和抗von陽Willibrand抗體免疫組織化學(xué)染色,每兩天檢查愈合傷口中的血管生成過程。作切口后io天，尾靜脈全身注射101Qpfu/ml的Ad5PPE-lLuc或Ad5CMVLuc。注射后5天，處死小鼠，且如上所述測定切口部位皮膚和作為對照的正常對側(cè)部位中的螢光素酶活性。逾歡夢#》普-為了評價肺瘤和轉(zhuǎn)移組織中血管生成的程度，將組織切成5pm厚的切片，且用蘇木精和伊紅(H&E)染色。用抗CD31(大鼠抗小鼠CD31單克隆抗體，Pharminogen,NJ,USA)抗體分析胂瘤模型中的新血管形成。^f口尸Z)G/^8脊羞^《這-重組復(fù)制在夬陷型A泉病毒血;青型5長口Varda-Bloom,N.等[Tissue-specificgenetherapydirectedtotumorangiogenesis.(2001)G置77zw8,819陽27]所述構(gòu)建。筒而言之，對pACCMV.pLpA質(zhì)粒進(jìn)行修飾，以包含處于巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動子調(diào)節(jié)之下的鼠VEGF165(GenBank登記號M95200)或大鼠PDGF-B(GenBank登記號AF162784)的cDNA。用相同的cDNA序列構(gòu)建pACPPE-l-3X質(zhì)粒，其中CMV啟動子一t修飾型鼠前內(nèi)皮素原-l(PPE-1-3X)啟動子取代。每種質(zhì)粒與pJM17質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，以產(chǎn)生各種重組腺病毒。讓病毒在HEK293細(xì)胞中繁殖并降至101QPFU/ml的濃度。對照載體用類似地產(chǎn)生。V、薦^麼^^4ii&模f我差^治^-至少12周齡的雄性和雌性C57B16小鼠(HarlanLaboratoriesLtd.,以色列)4姿照AnimalCareandUseCommitteeofShebaMedicalCenter的指南進(jìn)行維持。才艮據(jù)先前介紹的規(guī)程[Couffinhal,T.等,Mousemodelofangiogenesis.爿m/尸^oZ152,1667-79.(1998)],誘導(dǎo)后肢局部缺血。簡而言之，用戊巴比妥鈉(40mg/kg,IP)麻醉動物。剃掉肢體軟毛后，對鄰近隱動脈和腦動脈分叉處的右股動脈進(jìn)行結(jié)扎。結(jié)扎后5天，靜脈內(nèi)施用1(^PFU的各種腺病毒載體。-采用Synergy超聲波系統(tǒng)(GeneralElectric,USA),于7.5MHz以血管造影方式，在結(jié)扎后以7天的間隔，進(jìn)行超聲波成像。在成像時讓動物蘇醒并受約束。讓動物在常規(guī)條件下適應(yīng)最高達(dá)90天。^瘦逸織必夢-將處死的局部缺血小鼠的兩個后肢骨胳肌和肝組織在OCT化合物中冷凍，并進(jìn)行冷凍切片。內(nèi)皮細(xì)胞用大鼠單克隆抗CD31抗體(PharMingen,SanDiego,CA)進(jìn)行免疫染色。平滑肌細(xì)胞用小鼠多克隆抗-a-SMactin抗體(SIGMA，St.Louis,MO)進(jìn)行免疫染色。背景用蘇木精染色。-由局部缺血動物的兩個后肢制備5pm骨胳肌切片。用有義或反義DIG-標(biāo)記探針對VEGF165或PDGF-B進(jìn)行原位雜交，然后用抗DIG畫AP綴合物(RocheMolecularBiochemicals,Mannheim,德國)斥企測洋地黃毒苦(DIG)。背景用曱基綠染色。塔謬*工-運用Image-ProPlus軟件工具(MediaCybernetics,SilverSpring,MD)處理超聲波圖像。計算出每幅圖像說明最強灌注的著色像素數(shù)。血管生成的調(diào)節(jié)劑-給轉(zhuǎn)基因小鼠飼喂正常食物飲食或補加了波生坦(ActelionLtd.,Allschwil,瑞士)，雙重ET-1A/B受體拮抗劑的々大食。假定一只動物每天消耗4g食物，給每只小鼠施用100mg波生坦/kg體重，持續(xù)30天。處死動物，并4企測螢光素酶活性，肺ET-lmRNA水平和irET-l血清水平。統(tǒng)^夢為、if運用t-檢驗ANOVA或Mann-Whitney秩檢驗，對各組間統(tǒng)計學(xué)顯著性差異進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以平均值+SE表示。力發(fā)勿/^U4五C)和"3勿應(yīng)^炎源亡差^;矛####源定在癌癥治療中，抗血管生成治療靶向滋養(yǎng)生長中的腫瘤的發(fā)展中脈管系統(tǒng)[FolkmanJ.NEnglJMed(1995)333(26):1757-63]。隨著凋亡或程序性細(xì)胞死亡研究的進(jìn)展，已鑒定出了眾多編碼選擇性和有效的細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)劑的基因[Strasser等，AnnuRevBiochem(2000)69:217-45]。本研究篩選了幾種促凋亡基因，以鑒別最適于抗血管生成治療的試劑。經(jīng)PCR擴增幾種促凋亡基因，包括MORT1(FADD-Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白，GenBank登記號NM—003824)、RIP(受體-相互作用-蛋白，GenBank登記號U25995)、CASH(c-FLIP,GenBank登記號AF0]0127)、MACH(胱天蛋白酶8GenBank登記號X98172)、CPP32(胱天蛋白酶3,GenBank登記號U13737)、胱天蛋白酶9(U60521)和先前描述的兩個"死亡受體"的融合體Fas-嵌合體(Fas-c),其是由TNFR1的胞外區(qū)和Fas的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)域構(gòu)建的[BoldinMP等，JBiolChem(1995)270(14):7795-8,參見圖la],并利用眾所周知的現(xiàn)有克隆技術(shù)克隆入pcDNA3(Invitrogen,Inc.)哺乳動物表達(dá)載體中。這些促凋亡基因構(gòu)建體隨pGFP—起在BAEC(牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞)和用作非內(nèi)皮對照細(xì)胞的293細(xì)胞中共表達(dá)。轉(zhuǎn)染后24小時，利用熒光顯微鏡術(shù)分析細(xì)胞。用熒光顯微鏡術(shù)根據(jù)典型形態(tài)學(xué)(即小而圓的形狀)鑒別凋亡細(xì)胞(圖2a-b)。用電子顯微鏡術(shù)實施凋亡表型的進(jìn)一步評價(圖3a-f)。凋亡作用的定量表明，M0RT1、TNFR1和Fas-嵌合體在BAEC和293細(xì)胞中誘導(dǎo)最高的凋亡活性(圖4a-b)。在這方面，胱天蛋白酶3和9效力較低，這可能是因為它們?yōu)闊o活性酶原形式。根據(jù)這些結(jié)果，選擇Fas-嵌合體(Fas-c)基因來產(chǎn)生用于抗血管生成治療的腺病毒載體。于修謬f尸尸五-/^^^f7V^-/pjc"^^7"#/^v-^^##,將編碼全長Fas-嵌合體的cDNA亞克隆到包含修飾型前內(nèi)皮素原1啟動子的質(zhì)粒pPACPPEl-3x中(參見圖lb)。通過將該質(zhì)粒與pJM17質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到人胚腎293細(xì)胞中制備重組腺病毒。通過PCR擴增驗證成功的病毒克隆(圖5a)。為了測定Fas-c在粑細(xì)胞中的表達(dá)，用指示滴度的Ad-PPE-l(3x)-Fas-c轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)皮BAEC細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)后72小時裂解細(xì)胞，并用非還原性SDS-PAGE凝膠分離細(xì)胞蛋白。用抗TNFR1抗體(Sc-7895，Santa-CruzBiotech)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。如圖5b所試實的，于45kD處遷移的主條帶非常明顯，且其表達(dá)是劑量依賴性的，提示所述嵌合蛋白正確折疊和表達(dá)。相反，在非轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞或用對照空病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中沒有明顯的對應(yīng)條帶。因此，這些結(jié)果證實，腺病毒介導(dǎo)的Fas-c基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)致靶細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。爿^尸/^-7f3;c」-F^-c襲迷謬^力發(fā)細(xì)^源亡測定Ad-PPE-l(3x)-Fas嵌合體誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的能力。如圖6a-b所示，前內(nèi)皮素原指導(dǎo)的、腺病毒介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致明顯且大量細(xì)胞死亡；用Ad-PPE-l(3x)-Fas-c(103MOI)感染的HUVEC和BAEC有經(jīng)受凋亡的粘附細(xì)胞的形態(tài)特征，包括膜起泡、變圓和皺縮以及脫離培養(yǎng)皿。相反，用對照病毒以相同MOI感染的細(xì)胞維持正常外觀和生長速率。用100MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞僅表現(xiàn)出最低程度的細(xì)胞死亡(數(shù)據(jù)未顯示)。通過在表達(dá)受PPE-1啟動子控制的報告基因GFP的細(xì)胞中表達(dá)此病毒，對Ad-PPE-l(3x)-Fas-c的細(xì)胞毒性特性實施進(jìn)一步評價。如從圖6c-d中明顯可見，大部分轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)后72小時獲得典型凋亡外觀，而用對照病毒和Ad-PPE-GFP共轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞看起來正常。利用結(jié)晶紫染色來定量Fas-c的細(xì)胞毒性作用。如圖7所示，用Ad-PPE-Fas-c感染BAEC和HUVEC分別導(dǎo)致57%和65%的死亡率，而對照病毒不影響細(xì)胞生存力。通過用此載體感染NSF(正常皮膚成纖維細(xì)胞)證實促凋亡載體Ad-PPE-Fas-的內(nèi)皮細(xì)胞特異性。這些表達(dá)低水平PPE-1的細(xì)胞[Varda畫Bloom,N.等,GeneTher8,819-27.(2001)]不受Ad-PPE-Fas-c感染影響。相反，重組載體Ad-CMV-Fas-c在這些細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。#^7^^7yW-P/^-/px」-/^w-cr€77^/^潔#以這#"#才4'乂#義傻游亡/，研究了TNFot增大表達(dá)Fas-c的細(xì)胞中的凋亡作用的能力。將人TNFa添加到用Ad-PPE-Fas-c(MOI100)病毒感染后48小時的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物中。24小時后測定細(xì)月包生存力。如圖8所示，TNFoc(10ng/ml)誘導(dǎo)Ad-PPE-l(3x)-Fas-c感染的細(xì)胞生存力下降73%,而單獨的TNFa或?qū)φ詹《?Ad-Luc)感染的細(xì)胞中沒有實現(xiàn)顯著死亡率。為證實TNFa的作用，處理細(xì)胞特異性。用Ad-PPE-Fas-c或?qū)φ詹《靖腥綨SF(正常皮膚成纖維細(xì)胞)、DA3(小鼠乳腺癌)、D122(Lewis肺癌)和B16黑素瘤細(xì)胞。48小時后，向培養(yǎng)物中補力。TNFoc,且用結(jié)晶紫染色后評定細(xì)胞形態(tài)學(xué)。如圖9a-e所示，用Ad-PPE-Fas-c感染的非內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出正常外觀，且不受TNF影響。另一方面，腺病毒介導(dǎo)的Fas-c感染BAEC在添加TNF時導(dǎo)致細(xì)胞生存力明顯下降。圖10a顯示了由CMV啟動子驅(qū)動的Fas-c的非選擇性凋亡活性，說明Ad-CMV-Fas-c對內(nèi)皮細(xì)胞的TNF依賴性凋亡作用。與TNF溫育后測定用指示MOI的Ad-CMV-Fas-嵌合體感染的BAEC細(xì)胞的生存力。值得注意的是，非內(nèi)皮特異性載體Ad-CMV-Fas-c引起內(nèi)皮細(xì)胞和非內(nèi)皮細(xì)胞兩者的TNFa依賴性凋亡(圖lOb-d)。y^-尸尸E7f3"-F^-c,"^小^^^SM,要#4#:力蘭關(guān),/夢用B16黑素瘤小鼠模型來檢驗由PPEl-3x啟動子表達(dá)的Fas-c的抗腫瘤作用。將B16黑素瘤細(xì)胞(8xl0"皮下注射到40只C57bl/6小鼠脅腹區(qū)。當(dāng)腫瘤可觸知(約5x5毫米)時，將小鼠隨機分成如下4組(i)對照一鹽水注射；(ii)對照病毒(包含受PPE啟動子控制的營光素酶的腺病毒)；(iii)包含受前內(nèi)皮素原(PPE)啟動子控制的Fas-TNF受體嵌合基因的Ad-PPE1-3x-Fas-c-病毒；和(iv)包含受非內(nèi)皮特異性CMV啟動子控制的Fas-TNF受體嵌合基因的Ad-CMV-Fas-c-病毒。用手持測徑器測量腫瘤大小(長和寬)。如圖lla所示，與對照小鼠相比，用Ad-PPEl-3x-Fas-c或Ad-CMV-Fas-c處理的小鼠肺瘤尺寸較小。在治療期結(jié)束時，Ad-PPEl-3x-Fas-c處理小鼠中的肺瘤重量也4支4氐(圖llb)。用Ad-PPEl-3x-Fas-c注射的小鼠顯示其肺瘤明顯壞死(圖llc)。脊移^^^,賴.'丄eM^都「4模婁,在轉(zhuǎn)移性Lewis肺癌模型中進(jìn)一步檢驗PPE-l(3x)-Fas-c嵌合體的表達(dá)特異性和抑制腫瘤生長的功效。如下文詳述在雄性C57BL/6J中誘發(fā)肺LLC轉(zhuǎn)移，且以9天的間隔給小鼠注射兩次病毒載體AdPPe-l(3x)LUC、AdPPE-l(3x)-Fas-c和AdCMV-Fas-c(Greenberger等，JClmInvest2004;113:1017-1024)。在病毒施用后6天由小鼠收獲器官，且通過PCR測定Fas-c表達(dá)。PPE-l(3x)啟動子對Fas-c的轉(zhuǎn)錄控制導(dǎo)致表達(dá)受限于具有腫瘤的肺(結(jié)果未顯示)，與CMV-Fas-c-處理小鼠中的Fas-c表達(dá)的廣泛分布完全相反(未顯示數(shù)據(jù),參見Greenberger等，JClmInvest2004;113:1017-1024)。此外，處理組和對照組的肺的總體病理學(xué)纟企查揭示，向具有轉(zhuǎn)移的小鼠施用AdPPE-l(3x)-Fas-c抑制腫瘤生長，且降低肺表面上生長肺瘤的大小，而對照動物肺幾乎被腫瘤組織完全取代(未顯示數(shù)據(jù)，參見Greenberger等，JClinInvest2004;113:1017-1024)。另外，處理小鼠和對照小鼠肺切片的組織病理學(xué)以及TUNEL和內(nèi)皮特異性CD31染色揭示，向具有轉(zhuǎn)移的小鼠施用AdPPE-l(3x)-Fas-c在肺瘤組織中引起與對胂瘤血管內(nèi)皮的廣泛損傷相關(guān)的大范圍凋亡和壞死。相反，對照處理小鼠的血管未受影響(未顯示數(shù)據(jù)，參見Greenberger等，JClinInvest2004;113:1017-1024)。31尸/^-/^在謬,/v^/i^為、^f為了分析PPE-l-3X的活性，對PPE-l-3X啟動子質(zhì)粒和未經(jīng)修飾的PPE-l啟動子質(zhì)粒的報告基因表達(dá)進(jìn)行比較。將含有PPE-1-3X片段或未經(jīng)修飾的PPE-1片段以及報告基因螢光素酶的報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到內(nèi)皮細(xì)胞系和非內(nèi)皮細(xì)胞系以及表達(dá)PPE-l啟動子的支氣管上皮細(xì)胞系(B2B)中(參見上文的材料和方法)。選擇B2B細(xì)胞系是為了提供相對于PPE-1啟動子而言所述3X元件降低非內(nèi)皮細(xì)胞系中表達(dá)的能力的指示。采用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(PromegaCorp.,Madison,WI)完成轉(zhuǎn)染。每種情況下，按照公認(rèn)的分子生物學(xué)實踐，用p-gal-neo質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)染效率的指示劑。轉(zhuǎn)染后48小時，用裂解緩沖液(PromegaCorp.,Madison,WI)收獲細(xì)胞，且用發(fā)光計(TD-20e—TurnerDesigns,Sunnyvale,California)分析螢光素酶活性。在平行實驗中，分析？gal活性，以將不同的轉(zhuǎn)化效率標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果總結(jié)于圖12和表2中。處于PPE-3X控制之下的螢光素酶活性為處于未經(jīng)修飾的PPE-l控制之下的螢光素酶活性的15-20倍。在非內(nèi)皮細(xì)胞系中，用PPE-l和PPE-1-3X兩者片企測最4氐表達(dá)。這證明PPE-3X是用于在體內(nèi)將基因特異性地遞送到內(nèi)皮細(xì)胞中的有前景候選物。,2—1#p/V^-/-3ir資^#雜淘建#脊襲#勿應(yīng)^^資i<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>JW尸尸五-〃,^#躇^傳#活^和掙7^#也將PPE-1/螢光素酶、PPE-l-3X/螢光素酶、PPE-1/GFP和PPE-1-3X/GFP連接到Ad5質(zhì)粒中，以產(chǎn)生Ad5PPE-l/Luc和Ad5PPE-l-3X/luc、Ad5PPE-l/GFP和Ad5PPE-l-3X/GFP(Varda-Bloom等,(2001)Genetherapy8:819-827)。如下文詳述，分別測定這些構(gòu)建體。為了測試Ad5PPE-l/luc的活性，對B2B(人支氣管上皮)、BAEC(牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞)和HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。這三個細(xì)胞系都表達(dá)內(nèi)皮素基因，且選擇這些細(xì)胞系以指示被測構(gòu)建體在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平。用不表達(dá)內(nèi)皮素的RIN(大鼠胰島素瘤)細(xì)胞系作為陰性對照，且用相同構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用Ad5CMVLuc(處于CMV啟動子控制之下的螢光素酶)作為所有細(xì)胞系中的非內(nèi)皮特異性對照。圖13清楚說明，用PPE-1啟動子比用CMV啟動子在內(nèi)皮BAEC和HUVEC細(xì)胞系中達(dá)到的螢光素酶表達(dá)要高。在非內(nèi)皮來源的RIN細(xì)胞中，CMV啟動子比PPE-1啟動子產(chǎn)生的螢光素酶活性要高。這些結(jié)果證實了未經(jīng)修飾的PPE-1啟動子的內(nèi)皮特異性。爿必尸尸E-3ZLwc^M必尸尸E-3IGF尸用Ad5PPE-3X/螢光素酶和Ad5PPE-3X/GFP構(gòu)建體轉(zhuǎn)染上文實施例7中所述的細(xì)胞系，以確定3X元件對特異性和表達(dá)水平的影響。如同在實施例7中一樣，用Ad5CMVLuc作為非內(nèi)皮特異性對照。與CMV啟動子相比，在BAEC細(xì)胞系和HUVEC細(xì)胞系中檢測出處于PPE-3X啟動子控制之下的較高螢光素酶表達(dá)。圖14A是顯微照片，說明在BAEC細(xì)胞系中處于Ad5PPE-l-3X控制之下的GFP表達(dá)。圖14B是顯微照片，說明BAEC系中Ad5CMV的GFP表達(dá)。如這些圖所清楚顯示的，PPE-1-3X啟動子在內(nèi)皮細(xì)胞中更有活性。這些結(jié)果清楚表明，所述3X元件不降低PPE-1啟動子的內(nèi)皮特異性。下文實施例11中給出了PPE-1啟動子和PPE-1-3X啟動子在細(xì)胞培養(yǎng)物中的相對活性。,^辨;55i^炎源亡法'/iW傳々",;C將P55(TNFR1,GenBank登記號M75866)亞克隆到PACPPE3X(含有PPE-1-3X啟動子)和PACCMV中后，如上文所述將這些質(zhì)粒和GFP(pEGFP-Cl載體；CLONTECH，PaloAlto,CA)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。簡而言之，通過T4DNA連接酶將所述基因亞克隆到PPE-1啟動子(而不是螢光素酶基因)下游的Notl限制位點中，然后將其轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后24小時，目測可辨別小而圓的凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞。用促凋亡質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的電子顯微鏡術(shù)顯示出典型凋亡外觀，從而證實所述目測評1介。在PPE-1-3X啟動子控制之下，p55僅在內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(圖15),而CMV啟動子沒有顯示任何細(xì)胞特異性活性。處于PPE-1-3X控制之下的螢光素酶在任何被測細(xì)胞系中都沒有誘導(dǎo)調(diào)亡。這些結(jié)果表明，通過應(yīng)用PPE-1-3X啟動子，在內(nèi)皮細(xì)胞中特異性地誘導(dǎo)凋亡是可行的。錄真A^^伴f7/Z^;T增強/庶真敏4V4力發(fā)-取敏f^/S差^^i^低氧是血管緊張性和結(jié)構(gòu)的重要調(diào)節(jié)劑。還已表明，它是血管生成的有效刺激物(在缺血性心臟病和癌癥中(Semenza,G丄.等，(2000)AdvExpMedBiol.;475:123-30;Williams,K.J.(2001)BreastCancerRes.2001:3;328-31和Shimo,T.(2001)CancerLett.174;57-64))。此外，據(jù)報道低氧調(diào)節(jié)許多基因包括促紅細(xì)胞生成素、VEGF、糖酵解酶和ET-1的表達(dá)。這些基因受共同的氧傳感途徑(oxygen-sensingpathway),稱為低氧誘導(dǎo)型因子-1(HIF-1)的誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄復(fù)合體控制。所述HIF-1復(fù)合體通過結(jié)合靶基因的順式作用低氧反應(yīng)元件(HRE)來介導(dǎo)對低氧的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。HRE是位于對低氧應(yīng)答的少數(shù)基因啟動子中的保守序列，所述基因包括VEGF、氧化氮合酶-2、促紅細(xì)胞生成素和包括內(nèi)皮素-l-ET-1在內(nèi)的其它基因。ET-1啟動子在轉(zhuǎn)錄起始位點上游-118bp位含有反向低氧反應(yīng)元件，該元件含有7個堿基對，且位于GATA-2和-50堿基對的API位點5'GCACGTT3'之間。(SEQIDNO:5)。前內(nèi)皮素原-1(PPE-l)啟動子含有具有增加其在胂瘤或局部缺血組織的低氧微環(huán)境中表達(dá)之潛力的低氧反應(yīng)元件(HRE),從而使其具有"腫瘤組織特異性"和/或"局部缺血組織特異性"。為了評價該HRE的實際功能，結(jié)合荄光素酶或GFP報告基因以及用腺病毒載體遞送對PPE-1啟動子和PPE-1-3X啟動子進(jìn)4亍測定。比較在BAEC細(xì)胞中在常氧和低氧條件(0.5%02達(dá)16小時)下處于PPE-1啟動子或PPE-1-3X啟動子控制之下的螢光素酶活性。處于PPE-1啟動子控制之下的安光素酶活性當(dāng)暴露于低氧時提高至5倍(圖16和圖17)。此外，處于PPE-1-3X啟動子控制之下的螢光素酶活性在低氧條件下提高至2.5倍。概括地講，將3X元件導(dǎo)入PPE1啟動子中仍能夠增加下游基因?qū)Φ脱鯌?yīng)答的表達(dá)水平，即使在用PPE-1-3X基因時常氧的表達(dá)水平比用未經(jīng)修飾的PPE-1啟動子所觀察的表達(dá)水平高。乂力^7乂敘應(yīng)屑f尸尸五-/-3J^和尸尸EW^^子談##遽一#伊估圖18總結(jié)了得自用pPPE-l/螢光素酶和pPPE-l-3X/螢光素酶的B2B、HUVEC和BAEC轉(zhuǎn)染實驗的結(jié)果。分別在B2B、HUVEC和BAEC中觀察到處于PPE-1-3X啟動子控制之下的螢光素酶表達(dá)高于處于PPE-1啟動子控制之下的安光素酶表達(dá)(是后者的30倍、8.5倍和1.5倍)。這些結(jié)果證實了上文給出的結(jié)果，并可用于確立PPE-1-3X非常適合將高水平表達(dá)特異性地導(dǎo)向內(nèi)皮細(xì)胞。在將來的體內(nèi)遞送背景中，用PPE-1-3X構(gòu)建體實現(xiàn)的較高表達(dá)水平轉(zhuǎn)化為施用更少量的DNA。這進(jìn)而會用來甚至進(jìn)一步增加特異性。爿必尸尸￡-/Lwc^沐力^放羊、為了證實在實施例7-10中所觀察的表達(dá)的內(nèi)皮特異性不是細(xì)胞培養(yǎng)物的人為產(chǎn)物，如上文在"正常小鼠中的組織基因表達(dá)，，中所述，將Ad5PPE-l/螢光素酶構(gòu)建體注射到C57BL/6小鼠中。如同在所述體外研究中一樣，用Ad5CMV/螢光素酶作為陰性對照。注射腺病毒載體后，測定血管形成組織和非血管形成組織中的螢光素酶的特異性活性和穩(wěn)定性。結(jié)果總結(jié)于圖19(相對于肝中表達(dá)的螢光素酶表達(dá))和表3(螢光素酶表達(dá)以身體總表達(dá)的百分比表示)。正如所料，在Ad5CMV/螢光素酶治療的小鼠中，在肝中發(fā)現(xiàn)大部分螢光素酶活性(〉總身體表達(dá)的80%)。由PPE-1啟動子控制的螢光素酶活性在肝中較低(總身體表達(dá)的37-54%)。與Ad5CMV/螢光素酶治療的小鼠相比(最高達(dá)總身體表達(dá)的1.8%;表2),PPE-1驅(qū)動的表達(dá)在主動脈中高得多(在注射后5天和14天分別為總身體表達(dá)的23-33%)。這些結(jié)果證實了在細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察到的內(nèi)皮特異性。應(yīng)記得的是，肝是高度血管形成器官。因此，如下文詳述對器官內(nèi)的細(xì)胞表達(dá)進(jìn)行檢查?！?—S#差于尸尸E-/和CMK^種建傳y^5乂和"乂器^^W:f尉麟顛<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>圖41A和圖41B圖示了110只注射小鼠的主動脈(A)和肝(B)中的絕對螢光素酶活性(光單位/pg蛋白)。注射后1天0=13)、5天(11=34)、14天0=32)、30天(11=20)和90天(11=ll)測量螢光素酶活性。主動脈中的結(jié)果代表主要在內(nèi)皮細(xì)胞中的啟動子(PPE-1或CMV)活性，而肝中的結(jié)果代表其主要在肝細(xì)胞中的活性。5J丄B/CV、itf爿必尸尸5W^謬力放羊，#一###口潛定^#都定在12周齡BALB/C小鼠(每組n=IO)中重復(fù)實施例12的實驗，以證明所觀察的結(jié)果不是特定動物品系的人為產(chǎn)物。因為用腺病毒載體得到的絕對結(jié)果在BALB/C小鼠中比在C57BL/6小鼠中低，所以螢光素酶表達(dá)以所有組織中總螢光素酶活性的百分比表示。在注射Ad5PPE-l的小鼠脾(90.9。/。)和注射Ad5CMV的小鼠肝(86.20/0)中觀察到注射后5天的最高相對螢光素酶表達(dá)。還觀察到注射后14天注射Ad5PPE-l的小鼠主動脈中的相對螢光素酶活性(32.9%)與注射后5天的其活性(1.75%)相比顯著增力口(圖42A和圖42B;Ad5PPE-lLuc—空心條Ad5CMVLuc—黑色條)。這些結(jié)果證實，無論用何種小鼠品系，PPE-1啟動子的組織特異性都足以強烈地有效消除肝細(xì)胞表達(dá)，盡管肝細(xì)胞優(yōu)先攝入注射的DNA。爿^/5尸尸￡-/摩遽這差^^^力-欲應(yīng)定在為了確定PPE-1表達(dá)的基因在體內(nèi)的細(xì)胞表達(dá)部位，使用通過腺病毒載體Ad5PPE-l-GFP遞送的綠色熒光蛋白(GFP)。用Ad5CMVGFP(Quantum,加拿大)作為非內(nèi)皮細(xì)胞特異性陰性對照。靜脈內(nèi)注射后5天處死小鼠，并通過熒光顯微鏡術(shù)分析其組織。在注射Ad5CMVGFP載體的小鼠中，在肝細(xì)胞中檢測到大部分表達(dá)，而在肝內(nèi)皮細(xì)胞中沒有檢測到表達(dá)(圖20A)。與之形成鮮明對比的是，注射Ad5PPE-l-GFP的小鼠(圖20B)顯示在肝細(xì)胞中沒有表達(dá)，但在肝血管內(nèi)皮細(xì)胞中有顯著表達(dá)。在其它組織中也獲得相似的結(jié)果，在那里于內(nèi)皮中檢測到幾乎所有PPE-1驅(qū)動的表達(dá)，而CMV驅(qū)動的表達(dá)是非內(nèi)皮性的。這些結(jié)果表明，內(nèi)皮特異性甚至在含有內(nèi)皮細(xì)胞和非內(nèi)皮細(xì)胞的器官中也可保持。這一發(fā)現(xiàn)對預(yù)防生長中肺瘤的血管生成具有重大意義。^必尸尸五-/-37丄^^y4必尸尸EW-3ZGF尸^##放羊^力發(fā)#"###都定為了測定Ad5PPE-l和Ad5PPE-l-3X在細(xì)胞中驅(qū)動報告基因螢光素酶和綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)的相對功效，用上文所述細(xì)胞系體外測試內(nèi)皮細(xì)胞中的特異性活性。用Ad5CMVLuc和Ad5CMVGFP作為非組織特異性對照。Ad5PPE-lLuc和Ad5PPE-lGFP用來確定因加入3X序列所引起的表達(dá)水平的相對變化。在圖21和圖22中總結(jié)的結(jié)果表明，在EC系(牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞-BAEC)中處于PPE-1-3X啟動子控制之下的螢光素酶活性是在非內(nèi)皮細(xì)胞一大鼠胰島素瘤-RIN、HeLA、HePG2和正常皮膚成纖維細(xì)胞(NSF)中的活性的5-l(H咅(圖21和圖22)。圖21顯示在Ad5PPE-lLuc、Ad5PPE-l-3XLuc和Ad5CMVLuc轉(zhuǎn)導(dǎo)的B2B細(xì)胞、BAEC細(xì)胞和RIN細(xì)胞中以光單位/pg蛋白表示的安光素酶活性。在Ad5CMVLuc轉(zhuǎn)導(dǎo)的RIN細(xì)胞中觀察到最高的螢光素酶表達(dá)，然而，該構(gòu)建體在BAEC細(xì)胞和B2B細(xì)胞中表達(dá)差。在Ad5PPE-l-3Xluc轉(zhuǎn)導(dǎo)的BAEC細(xì)胞中觀察到次最高水平的螢光素酶表達(dá)。Ad5PPE-lLuc在BAEC細(xì)胞中以較低水平表達(dá)。在B2B細(xì)胞系中，Ad5PPE-lLuc和Ad5PPE-l-3Xluc以幾乎相同的水平表達(dá)?？偟膩碇v，在相同感染條件下(moi=10),在內(nèi)皮細(xì)胞系中處于PPE-1-3X啟動子控制之下的縈光素酶活性是處于PPE-1啟動子控制之下的螢光素酶活性的23倍，且是處于CMV啟動子控制之下的螢光素酶活性的23-47倍，而處于CMV啟動子控制之下的非內(nèi)皮RIN細(xì)胞中的螢光素酶表達(dá)高達(dá)3000倍(圖21)。為了確立PPE-1和PPE-1-3X在其它非內(nèi)皮細(xì)胞語系中是無活性的，轉(zhuǎn)導(dǎo)了HeLA、HepG2、NSF細(xì)胞系。用BAEC作為內(nèi)皮對照。圖22顯示了在用Ad5PPE-lLuc、Ad5PPE-l-3XLuc和Ad5CMVLuc轉(zhuǎn)導(dǎo)的HeLA細(xì)月包、HepG2纟田胞、NSF細(xì)胞和BAEC細(xì)胞中以光單位/pg蛋白表示的螢光素酶活性。用Ad5CMVLuc轉(zhuǎn)導(dǎo)在HeLA細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和NSF細(xì)胞中引起高水平的螢光素酶表達(dá)。這些細(xì)胞系不能表達(dá)處于PPE-1控制之下的螢光素酶，在PPE-1-3X啟動子控制之下以低水平表達(dá)螢光素酶。正如所料，用Ad5PPE-lLuc或Ad5PPE-l-3XLuc轉(zhuǎn)導(dǎo)的BAEC細(xì)胞表現(xiàn)出高螢光素酶表達(dá)。綜合考慮，這些結(jié)果表明，將所述3X序列導(dǎo)入PPE-1啟動子中引起內(nèi)皮細(xì)胞系中較高水平的表達(dá)，同時防止非內(nèi)皮細(xì)胞中不想要的表達(dá)。加入3X序列至PPE-1啟動子中還增加EC系(牛主動月永內(nèi)皮細(xì)月包-BAEC)中綠色焚光蛋白表達(dá)的水平，如描繪了以moi=l轉(zhuǎn)導(dǎo)的BAEC中的GFP表達(dá)的圖23A-C所示。在該實驗中，用CMV啟動子沒有觀察到GFP的表達(dá)。在圖23中，圖A表示Ad5PPE-l-3XGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，圖B表示Ad5PPE-lGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，而圖C表示Ad5CMVGFP。再次，將3X序列導(dǎo)入PPE-1啟動子中顯著增加報告基因的表達(dá)。這一結(jié)果表明，所述3X序列作為內(nèi)皮特異性增強子起作用的能力并不隨待轉(zhuǎn)錄的下游基因而變。此外，相比于在CMV啟動子下的高表達(dá)，Ad5PPE-l-3X-GFP和Ad5PPE-lGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致在非內(nèi)皮細(xì)胞SMC、HeLa、HePG2和正常皮膚成纖維細(xì)胞(NSF)中無GFP表達(dá)，如圖24-27中總結(jié)的。圖24顯示了以moi=1的Ad5PPE-l-3XGFP(圖A)或Ad5CMVGFP(圖B)轉(zhuǎn)導(dǎo)的SMC中的GFP表達(dá)。盡管Ad5CMVGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致高水平GFP表達(dá)，但用Ad5PPE-l-3XGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)不引起GFP表達(dá)。圖25顯示了在HeLa細(xì)胞中進(jìn)行的相似實驗的結(jié)果。如同在前面的圖中一樣，圖A表示用Ad5PPE-l-3XGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，而圖B表示用Ad5CMVGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。再次，盡管Ad5CMVGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致高水平GFP表達(dá)，但用Ad5PPE-l-3XGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)不引起GFP表達(dá)。圖26顯示在HepG2細(xì)胞中進(jìn)行的相似實驗的結(jié)果。如同在前面的圖中一樣，圖A表示用Ad5PPE-l(3X)GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，而圖B表示用Ad5CMVGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。再次，盡管Ad5CMVGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致高水平GFP表達(dá)，但用Ad5PPE-l-3XGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)不引起GFP表達(dá)。圖27顯示了在NSF細(xì)胞中進(jìn)行的相似實驗的結(jié)果。如同在前面的圖中一樣，圖A表示用Ad5PPE-l-3XGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，而圖B表示用Ad5CMVGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。再次，盡管Ad5CMVGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致高水平GFP表達(dá)，但用Ad5PPE-l-3XGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)引起極低的GFP表達(dá)。這些結(jié)果綜合起來表明，高水平的內(nèi)皮特異性和高水平的內(nèi)皮表達(dá)通過使用含SEQIDNO.:7的3X序列的修飾型PPE-1啟動子而獲得。遽這#孩普差^力*應(yīng)定在為了測定處于PPE-1-3X啟動子控制之下表達(dá)的報告基因的體內(nèi)細(xì)胞定位才莫式，如上文所述將Ad5PPE-l-3XGFP和Ad5PPE-lGFP注射到小鼠內(nèi)。靜脈內(nèi)注射后5天，處死小鼠并通過熒光顯微鏡術(shù)分析其組織。注射Ad5PPE-l-3XGFP的小鼠與注射Ad5PPE-lGFP的小鼠相比，在肝血管、腎血管和脾血管的內(nèi)皮細(xì)胞中觀察到顯著更高的GFP活性。圖28A-B顯示了代表性結(jié)果。圖28A顯示了注射Ad5PPE-lGFP的小鼠血管內(nèi)襯內(nèi)皮細(xì)胞中的低水平GFP表達(dá)。圖28B顯示了由于加入3X序列至構(gòu)建體中產(chǎn)生的水平高得多的GFP表達(dá)。盡管在血管內(nèi)襯中高表達(dá)，但是在肝細(xì)胞、腎小球、上皮細(xì)胞和脾細(xì)胞中沒有檢測到表達(dá)(圖18和圖19)。圖29顯示了得自注射小鼠腎組織的代表性結(jié)果。注射Ad5CMVGFP的小鼠(圖29A)、注射Ad5PPE-lGFP的小鼠(圖29b)和注射Ad5PPE-l-3XGFP的小鼠(圖29C)在腎細(xì)胞中都表現(xiàn)出低GFP活性。在圖29B中，在血管壁中可見略高的GFP表達(dá)(箭標(biāo)所指)。圖30顯示了注射小鼠脾組織的代表性結(jié)果。注射Ad5CMVGFP的小鼠(圖30A)、注射Ad5PPE-lGFP的小鼠(圖30B)和注射Ad5PPE-l-3XGFP的小鼠(圖30C)在脾細(xì)胞中都表現(xiàn)出低水平的GFP活性。在注射Ad5PPE-l-3XGFP的小鼠血管可見較高的GFP活性(箭標(biāo)所指)。這些結(jié)果證實，PPE-1啟動子和PPE-1-3X啟動子在體內(nèi)均為內(nèi)皮細(xì)胞特異性的。它們進(jìn)一步提示，這兩種啟動子的活性限于非增殖性內(nèi)皮組織(即健康器官的血管。因此，在腫瘤血管生成模型中進(jìn)行測定。方/Vf新j&會形^^爿必尸尸￡-7^々建#的謬力溯/定為了確定AD5PPE將報告基因的表達(dá)特異性地導(dǎo)向腫瘤中血管生成性血管的能力，使用鼠LLC模型(上文在材料和方法中描述的)。在一個實驗中，全身注射Ad5PPE-lLuc或Ad5CMVLuc(各1010pfu/ml)后5天測試肺瘤新血管形成中的螢光素酶表達(dá)。在該實驗中，給原發(fā)性腫瘤模型和轉(zhuǎn)移腫瘤模型全身注射Ad5CMVLuc導(dǎo)致在原發(fā)性肺瘤或轉(zhuǎn)移肺中均產(chǎn)生最低表達(dá)。該表達(dá)水平與在首次用于實驗的正常肺中由CMV指導(dǎo)的螢光素酶的最低表達(dá)相似(圖35;黑色條；n=12)。與之鮮明對比的是，在PPE-1啟動子控制下(圖35;空心條；n=9),高血管生成性肺轉(zhuǎn)移與螢光素酶活性相關(guān)，所述螢光素酶活性為在血管形成程度低的原發(fā)性腫瘤和首次用于實驗的肺中的螢光素酶活性的約200倍。在諸如肝、腎、心臟和胰的非轉(zhuǎn)移瘤組織中的螢光素酶表達(dá)最低。主動脈中的表達(dá)水平大約是轉(zhuǎn)移肺中所述水平的30%。在LLC才莫型的另一個實-瞼中，用Ad5PPE-lGFP構(gòu)建體和Ad5CMVGFP構(gòu)建體將報告基因表達(dá)定位于原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移肺中。注射Ad5PPE-lGFP的小鼠在原發(fā)性胂瘤血管中顯示高水平的GFP特異性表達(dá)(圖47C),盡管在腫瘤細(xì)胞自身中沒有檢測到表達(dá)。此觀察結(jié)果與實施例20中提供的LLC細(xì)胞培養(yǎng)物模型的結(jié)果相一致。在肺轉(zhuǎn)移中，在轉(zhuǎn)移病灶的大動脈和小血管生成性血管兩者中均檢測到高水平的GFP表達(dá)(圖47A)。在正常肺組織中沒有檢測到表達(dá)。內(nèi)皮細(xì)胞定位為GFP表達(dá)(圖47A)和CD31抗體免疫染色(圖47B)的共定位所證實。與之形成鮮明對比的是，在注射Ad5CMVGFP的小鼠中，在原發(fā)性胂瘤和肺轉(zhuǎn)移兩者中均沒有檢測到GFP活性。圖47C說明瘤內(nèi)注射Ad5PPE-lGFP后在原發(fā)性肺瘤血管中的GFP表達(dá)。圖47D是與說明肺瘤及其血管的圖C一樣歸檔的相差圖像。這些結(jié)果表明，盡管PPE-1不驅(qū)動腫瘤細(xì)胞自身中的高水平表達(dá)，但所述啟動子的確驅(qū)動肺瘤內(nèi)血管內(nèi)皮中、尤其是在快速增殖的血管生成性血管中的高水平表達(dá)。給原發(fā)性皮下腫瘤沖莫型瘤內(nèi)注射Ad5CMV,導(dǎo)致在肺瘤組織中的高螢光素酶表達(dá)，及在肝中導(dǎo)致中等水平表達(dá)(胂瘤表達(dá)量的10%;圖53)。在轉(zhuǎn)移肺中沒有檢測到表達(dá)。另一方面，當(dāng)瘤內(nèi)注射時，處于PPE-1啟動子控制之下的螢光素酶表達(dá)在原發(fā)性胂瘤和轉(zhuǎn)移肺中產(chǎn)生相似的螢光素酶表達(dá)水平，而在肝中沒有檢測到表達(dá)。;#*/《乂##參,秀遂#爿必尸尸E-/W,i/定為了測定Ad5PPE-l和Ad5CMV在癌性細(xì)胞中驅(qū)動螢光素酶表達(dá)的效率，使用D122-96Lewis肺癌細(xì)胞系。以不同的感染復(fù)數(shù)(moi)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)導(dǎo)。結(jié)果表明，兩種腺病毒載體均能夠?qū)⑽灩馑孛富蜣D(zhuǎn)導(dǎo)給這些細(xì)胞(表4)。然而，由PPE-1啟動子指導(dǎo)的螢光素酶活性在LLC細(xì)胞中比在內(nèi)皮細(xì)胞中檢測到的所述活性低得多，分別為50光單位/g蛋白對1000-2500光單位/g蛋白。44一^爿6/5尸尸五畫/Lwc和爿6/5CvWXwcy^膚勿/g屑<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>為了確定3X序列對血管生成性血管中PPE-1啟動子的作用，使用Lewis肺癌(LLC)轉(zhuǎn)移^f莫型(上文材料和方法中所描述的)。如材料和方法所述的，靜脈內(nèi)注射1010感染單位的Ad5PPE-lGFP、Ad5PPE-l-3XGFP或Ad5CMVGFP后5天，處死小鼠并分析其組織。圖31A-D總結(jié)了注射鹽水的對照小鼠(圖31A)、注射Ad5CMVGFP的小鼠(圖31B)、注射Ad5PPE-lGFP的小鼠(圖31C)和注射Ad5PPE-l-3XGFP的小鼠(圖31D)的轉(zhuǎn)移肺中的GFP表達(dá)?？笴D31免疫染色(圖31C'-20D')證實每種轉(zhuǎn)移組織中GFP表達(dá)的位置。結(jié)果表明，盡管在對照一注射鹽水的小鼠中沒有檢測到GFP表達(dá)(圖31A),在注射CMV的小鼠上皮支氣管周圍有微弱表達(dá)，但在這些小鼠轉(zhuǎn)移肺血管生成性血管中沒有表達(dá)(圖31B)。在注射Ad5PPE-lGFP的小鼠轉(zhuǎn)移肺中觀察到低GFP表達(dá)(圖31C和31C'),而在注射Ad5PPE-l-3XGFP的小鼠新血管中觀察到高且特異性的表達(dá)(圖31D和31D')。這些結(jié)果解釋了實施例15的體內(nèi)結(jié)果和實施例7、8和11的體外結(jié)果之間明顯不一致之處。PPE-1啟動子和PPE-1-3X啟動子兩者都是內(nèi)皮特異性的。然而，所述3X序列大大增加了快速增殖的內(nèi)皮組織(諸如生長腫瘤中的新形成血管)中的表達(dá)水平。3JT元斧乂^產(chǎn);^i^^成Vij^15^7尸尸E-7啟動子^斧^Z為了研究本發(fā)明的3X元件對腫瘤血管生成性血管中PPE-1啟動子功效和特異性活性的作用，使用LLC轉(zhuǎn)移模型。如上文所述，靜脈內(nèi)注射101Qpfu/ml的Ad5PPE國lLuc、Ad5PPE國l畫3XLuc、Ad5CMVLuc、Ad5PPE-lGFP、Ad5PPE-l-3X-GFP或Ad5CMVGFP后5天，處死小鼠并分析其組織的螢光素酶表達(dá)或GFP表達(dá)。圖48是直方圖，比較全身注射Ad5PPE-l-3Xluc、Ad5PPE-lLuc或Ad5CMVLuc后在正常肺和轉(zhuǎn)移肺中的螢光素酶表達(dá)。各實-瞼組為Ad5CMVLuc(n=7;黑色條)、Ad5PPE-lLuc(n=6;灰色條)和Ad5PPE-l-3XLuc(n=13;褐色條)?；钚砸怨鈫挝?iug蛋白表示。處于PPE-1-3X啟動子控制之下的螢光素酶表達(dá)在轉(zhuǎn)移肺中是其在正常肺中的活性的35倍，且是由無所述3X元件的PPE-1啟動子驅(qū)動的表達(dá)的3.5倍(p〈0.001)。在注射Ad5PPE-l-3XLuc的小鼠的其它組織中檢測到非常低的螢光素酶活性。計算每只經(jīng)注射的動物肺中螢光素酶表達(dá)占肝中表達(dá)的百分比揭示出，與正常肺中的所述活性相比，轉(zhuǎn)移肺中的所述活性增加至IO倍(圖49)。為了將報告基因表達(dá)定位至特定細(xì)胞類型，使用GFP構(gòu)建體。圖50A-B顯示了注射Ad5PPE-l-3XGFP的小鼠轉(zhuǎn)移肺中的GFP表達(dá)(圖50A)。通過CD31抗體免疫染色(圖50B)證實GFP表達(dá)定位于新血管中。在對照一注射鹽水的小鼠中沒有檢測到GFP表達(dá)。注射CMV的小鼠上皮支氣管周圍有低水平表達(dá)，但在轉(zhuǎn)移肺的血管生成性血管中沒有表達(dá)。概括地講，這些結(jié)果表明，表達(dá)水平大大增加是由于將3X元件導(dǎo)入Ad5PPE-l構(gòu)建體中所致，并且這種增加的表達(dá)對腫瘤血管生成性血管是特異性的。可能是，所觀察的作用可能與上文所述的低氧應(yīng)答結(jié)合，以進(jìn)一步增強目標(biāo)序列的表達(dá)水平。尸尸五-/瓶真^吝#遽一#4在為了進(jìn)一步表征低氧對鼠PPE-1啟動子活性的作用，用DNA質(zhì)粒(pEL8;圖37A)轉(zhuǎn)染牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)。pEL8質(zhì)粒含有鼠PPE-1啟動子(1.4kb)(紅色)、螢光素酶基因(1842bp)、SV40聚腺苷酸化(polyA)位點和內(nèi)皮素-1基因的第一內(nèi)含子，它們合稱為PPE-1啟動子盒，如材料和方法中所述，用BamHI限制酶對其進(jìn)行消化和提取。轉(zhuǎn)染后，讓細(xì)胞經(jīng)歷低氧條件。經(jīng)歷18小時低氧(0.5%02)的轉(zhuǎn)染的BAEC中的縈光素酶表達(dá)高達(dá)常氧環(huán)境下生長的細(xì)胞中的螢光素酶表達(dá)的8倍(圖32)。圖32顯示，用含有鼠PPE-1啟動子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BAEC中的螢光素酶活性(光單位/pg蛋白)當(dāng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在低氧環(huán)境下溫育時明顯更高。同樣的轉(zhuǎn)染效率通過與P-半乳糖普酶報告載體共轉(zhuǎn)染和LacZ活性測定得以證實。為了確定由腺病毒載體遞送的鼠PPE-1啟動子是否也受到低氧的上調(diào)，用Ad5PPE-lLuc轉(zhuǎn)導(dǎo)BAEC。在該實驗中用Ad5CMVLuc作為非特異性對照。結(jié)果總結(jié)于圖33中。用Ad5PPE-lLuc轉(zhuǎn)導(dǎo)的BAEC中的低氧螢光素酶活性。與之明顯相反，在Ad5CMV轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中沒有檢測到常氧和低氧之間的顯著性差異(圖33)。為了了解PPE-1啟動子活性的增強是否是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的，用Ad5PPE-l(moi=IO)轉(zhuǎn)導(dǎo)不同的細(xì)胞系(BAEC、B2B、CHO、RIN和心肌細(xì)胞)，且讓其經(jīng)歷低氧(0.5%02)或常氧環(huán)境。結(jié)果總結(jié)于圖34中。螢光素酶表達(dá)在低氧環(huán)境下培養(yǎng)的B2B細(xì)胞中略微增力口，而在低氧環(huán)境中培養(yǎng)的BAEC細(xì)胞中顯著增加。與常氧相比，低氧環(huán)境降低其它細(xì)胞系中的縈光素酶表達(dá)。這些結(jié)果證實，PPE-1啟動子的低氧誘導(dǎo)主要在內(nèi)皮細(xì)胞語系中發(fā)生。為了確定3X序列對PPE-14氐氧應(yīng)答的作用，用Ad5PPE-lLuc和Ad5PPE-l(3X)Luc轉(zhuǎn)導(dǎo)BAEC。轉(zhuǎn)導(dǎo)后，如上文詳述，將BAEC細(xì)胞或者在低氧環(huán)境中或者在常氧環(huán)境中溫育。結(jié)果總結(jié)于圖35中。使用Ad5PPE-lLuc構(gòu)建體的螢光素酶表達(dá)在對低氧應(yīng)答時顯著增加(7倍)(低氧條件下為2578,而常氧條件下為322.1)。相比之下，Ad5PPE-l(3X)Luc構(gòu)建體在對低氧應(yīng)答時僅表現(xiàn)出增加至1.5倍(從常氧條件下的2874.5增加至低氧條件下的4315)。這些結(jié)果表明，當(dāng)在PPE-1啟動子中加入3X序列時所觀察的高常氧表達(dá)水平在一定程度上起掩蔽低氧應(yīng)答的作用。^脊差^V、薦模fX,效IL^吝^姅;t為了檢查經(jīng)歷區(qū)域低氧/局部缺血的組織中的鼠PPE-1啟動子活性，使用如上文在材料和方法中描述的mPPE-l-Luc轉(zhuǎn)基因小鼠。如先前(CouffinhalT.等，(1998)Am.J.Pathol.152;1667-1679)所述，誘發(fā)小鼠發(fā)生區(qū)域性后肢局部缺血。簡而言之，用戊巴比妥鈉(40mg/kg,IP)麻醉動物。通過對鄰近隱動脈和腯動脈分叉處約2mm的右股動脈結(jié)扎，誘發(fā)后肢單側(cè)局部缺血。為了證實灌注功能變化的誘導(dǎo)，通過配備7.5MHz轉(zhuǎn)換器和血管造影軟件的Synergy超聲波系統(tǒng)(GE),在第4天和第14天進(jìn)行超聲波成像。將動物在常規(guī)條件下圈養(yǎng)最高達(dá)18天。結(jié)扎后2天、5天、10天和18天，測定局部缺血肌肉、正常未結(jié)扎肌肉、肝、肺和主動脈中的螢光素酶表達(dá)。在圖36中總結(jié)的結(jié)果顯示，盡管在結(jié)扎后數(shù)天期間，在肝、肺和主動脈中沒有檢測到顯著性差異，但是在股動脈結(jié)扎后螢光素酶基因表達(dá)在正常未結(jié)扎肌肉和局部缺血肌肉兩者中均增加。盡管在結(jié)扎后5天在局部缺血肌肉中檢測到峰值螢光素酶表達(dá)，但在股動脈結(jié)扎后10天在未結(jié)扎肌肉中也檢測到峰值螢光素酶表達(dá)。這表明PPE-1啟動子的低氧應(yīng)答在體內(nèi)系統(tǒng)中是有功能的。非局部缺血肌肉中的螢光素酶表達(dá)在所測試的天數(shù)期間與其在對照未經(jīng)手術(shù)組織中的表達(dá)(天數(shù)=O)相比并沒有變化。相比之下，第5天在局部缺血肌肉中的螢光素酶表達(dá)明顯高于其它時間點。笫5天，PPE-1驅(qū)動的螢光素酶表達(dá)在對照未經(jīng)手術(shù)小鼠中，及與第10天和第18天局部缺血肌肉相比為2.5倍高(圖51)。在經(jīng)歷區(qū)域局部缺血的轉(zhuǎn)基因小鼠的其它非局部缺血組織包括肝、肺和主動脈中的縈光素酶表達(dá)揭示出，在誘發(fā)局部缺血后18天內(nèi)，在這些組織中的螢光素酶表達(dá)沒有顯著變化(圖52)。此外，這些結(jié)果證實，螢光素酶表達(dá)在含有高百分比內(nèi)皮組織的組織(肺和主動脈)中比在含有^氐百分比內(nèi)皮組織的組織(肝和非局部缺血肌肉)中高。細(xì)應(yīng)增遂^乎義/力發(fā)勿應(yīng)^爿J5尸尸5-7Z^c為了確定細(xì)胞增殖水平對Ad5PPE-lLuc的效率和特異性活性的作用，體外測試內(nèi)皮細(xì)胞血管生成性^t型(BAEC)。通過血清除盡誘導(dǎo)經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的BAEC靜息，或者讓其在10%FCS中生長而正常增殖。簡而言之，將細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時，作為靜息細(xì)胞一血清除盡后72小時，或者作為增殖細(xì)胞一在正常培養(yǎng)基(10%FCS)中。螢光素酶活性以光單位/g蛋白表示，以對細(xì)胞量差異標(biāo)準(zhǔn)化。所給出的結(jié)果是得自4個代表性獨立實驗的一式三份試驗的平均值。處于PPE-1啟動子控制之下的螢光素酶表達(dá)(空心條；圖28)在正常增殖的BAEC中是在靜息細(xì)胞中的4倍，且在正常增殖的BAEC中是處于CMV啟動子控制之下的螢光素酶表達(dá)的25倍(黑色條；圖28)。此外，在增殖細(xì)胞中，處于PPE-1啟動子控制之下的活性是處于CMV啟動子控制之下的活性的10倍。為了體外才莫擬血管生成性狀況，測試通過加入40ng/ml血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)誘導(dǎo)快速增殖的BAEC中的Ad5PPE-lLuc活性。如上文所述，比較在這些條件下正常增殖細(xì)胞和靜息細(xì)胞中的活性。用VEGF誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的BAEC中的螢光素酶表達(dá)是在正常增殖細(xì)胞中的44倍，且是在靜息細(xì)胞中的83倍(圖40)?？偟膩碇v，這些實驗表明，處于PPE-1啟動子轉(zhuǎn)錄控制之下的目標(biāo)序列的活性水平隨細(xì)胞增殖水平而變動，快速增殖引起較高水平的表達(dá)。乂,滲發(fā)'^^:游/f硬必^V、it^^尸尸E-/W^W定為了測試動脈粥樣硬化血管中Ad5PPE-l載體的效率和特異性，給6月齡ApoE缺陷型小鼠(Plump，A.S.等Cell;1991;71:343-353)全身注射101Qpfu/ml病毒載體。隨著ApoE缺陷型小鼠衰老，在沒有脂質(zhì)獲取膳食(lipidreachdiet)誘導(dǎo)的情況下，它們發(fā)展高膽固醇值和廣泛的致動脈粥樣化斑。圖43是從ApoE缺陷型小鼠解剖的Sudan-IV著色的主動脈照片。注意到胸主動脈含有的紅色染色的動脈粥樣硬化病變較少，而腹區(qū)高度動脈粥樣硬4匕(圖43,摘自ImagingofAorticatheroscleroticlesionsby125I-HDLand125I-BSA.A.Shaish等，Pathobiology畫Pathobiol2001;69:225-9)。圖44總結(jié)了給ApoE缺陷型小鼠全身注射Ad5PPE-lLuc(空心條；n=12)和Ad5CMVLuc(黑色條；n=12)后5天所觀察到的螢光素酶表達(dá)。結(jié)果以含有較少動脈粥樣硬化病變的胸主動脈和富含動脈粥樣硬化病變的腹主動脈中的絕對螢光素酶表達(dá)來表示。與處于對照CMV啟動子之下的表達(dá)相比，受PPE-1啟動子控制的螢光素酶表達(dá)在高度動脈粥樣硬化的腹部中為其6倍，而在輕微動脈粥樣硬化的胸主動脈中為其1.6倍。在注射Ad5PPE-lLuc的小鼠的兩個主動脈區(qū)之間沒有觀察到顯著性差異，而與含有病變的腹主動脈中的低表達(dá)相比，在Ad5CMVLuc注射組的胸主動脈中觀察到較高的螢光素酶表達(dá)。這些結(jié)果表明，盡管組成型啟動子(CMV)在動脈粥樣硬化最嚴(yán)重的區(qū)域往往不起作用，^旦PPE-1啟動子相對而言不受疾病進(jìn)程影響?？趭^合^^fy^^fW溯/定為了測試Ad5PPE-l構(gòu)建體在將螢光素酶表達(dá)導(dǎo)向愈合傷口血管方面的效率和特異性活性，使用如上文在材料和方法中描述的鼠傷口愈合。如同在其它實驗中一樣，用Ad5CMVLuc作為非組織特異性對照。處于PPE-1啟動子(圖45;空心條)控制之下的螢光素酶活性在正常區(qū)域(6.8士3.2)和愈合傷口區(qū)域(5士1.6)中均比處于CMV控制(圖45;黑色條)之下所觀察到的活性高。因為CMV啟動子和PPE-1啟動子在愈合傷口中均表現(xiàn)出降低的表達(dá)水平，所以這些結(jié)果難以解釋。盡管這是意想不到的觀察結(jié)果，但顯然PPE-1啟動子在正常組織和愈合組織中都比CMV啟動子驅(qū)動的表達(dá)水平高。壞死性瘢痕組織的存在可能是在愈合傷口中用兩種啟動子所觀察到的表達(dá)水平降低的原因。^口尸ZX7i^S乂,—局舉^j&y^力j&f這些新生血管容易破裂、有退化和滲漏傾向并且灌注差。為了克服這些局限，需要定位、定時和劑量可控地遞送各種能夠募集內(nèi)皮細(xì)胞以及內(nèi)皮周細(xì)胞(即小血管中的周細(xì)胞或較大血管中的平滑肌細(xì)胞)的血管生成因子。修飾型前內(nèi)皮素原-1啟動子PPE-1-3X用于在局部缺血肢體肌肉的內(nèi)皮中表達(dá)VEGF或PDGF-B,即將平滑肌細(xì)胞募集到分泌起源的內(nèi)皮分泌的因子，從而阻止新形成的血管的高滲透性。為了測定VEGF和PDGF-B在局部缺血組織中的表達(dá)，進(jìn)行原位雜交。如圖54A-C所示，盡管在來自Ad5PPE-l-3XVEGF治療小鼠的局部缺血肌肉切片中可檢測到VEGFmRNA的顯著表達(dá)，但在Ad5CMVVEGF或鹽水治療小鼠的肌肉切片中基本上沒有觀測到信號。類似地，在用Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療的小鼠的局部缺血肢體肌肉中檢測到PDGF-BmRNA的存在，但在Ad5CMVPDGF-B或鹽水治療小鼠中卻沒有檢測到(圖54E-G)。有趣的是，圖12A和圖12E中的信號模式類似血管結(jié)構(gòu)。值得注意的是，各種治療組的代表性肝切片證明VEGF或PDGF-B在Ad5CMV治療的動物中大量表達(dá)(圖54D和54H),而在Ad5PPE-l-3X載體治療小鼠的肝中沒有檢測到表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)?？偠灾?，該測定表明，Ad5PPE-l-3X載體介導(dǎo)血管生成因子在耙器官中的可測量表達(dá)，而組成型Ad5CMV載體幾乎只在肝組織中表達(dá)其轉(zhuǎn)基因。尸尸￡介爭的將Ad5PPE-l-3XVEGF的治療作用與先前寺艮道的Ad5CMVVEGF的治療作用進(jìn)行比較。股動脈結(jié)扎后5天，將109PFU的任一治療載體以及報告載體Ad5CMV螢光素酶和等體積的鹽水(作為對照)全身施用于小鼠。以血管造影模式獲得兩個肢體的內(nèi)側(cè)面(medialaspect)的超聲波(US)圖像。如圖38A-D所示，在結(jié)扎后21天，對照動物中的灌注信號減少并截短；然而，在Ad5PPE-l-3XVEGF治療小鼠和Ad5CMVVEGF治療小鼠的US圖像中均觀察到持續(xù)增強的信號。在兩個VEGF治療組中，第21天的平均灌注強度是對照組平均灌注強度的3倍以上(p〈0.01),并且與所述動物的正常對側(cè)肢體記錄的結(jié)果相似(圖38E)。股動脈結(jié)扎并使用內(nèi)皮特異性標(biāo)記抗CD-31后21天進(jìn)行的免疫組織化學(xué)分析顯示，分別與Ad5CMVVEGF組和對照組中的585和485個CD31+細(xì)胞/mm2相比，在Ad5PPE-l-3XVEGF治療小鼠的局部缺血肌肉切片中的平均值為546個CD31+細(xì)胞/mm2(圖38F)。該數(shù)據(jù)表明，用Ad5PPE-l-3XVEGF短期治療與Ad5CMVVEGF的有效CMV啟動子治療同樣有效。此外，用H&E染色的小鼠肝切片顯示，沒有肝炎或其它慢性病理變化的指征(數(shù)據(jù)未顯示)，從而排除了腺病毒對肝細(xì)胞的向性效應(yīng)?？疾灬槍ρ苌烧T導(dǎo)的促血管生成因子的組織特異性表達(dá)和組成型表達(dá)的對比。在長達(dá)70天的實-驗中，對PPE調(diào)節(jié)的和CMV調(diào)節(jié)的VEGF表達(dá)對灌注和血管生成的作用進(jìn)行了測試。具有局部缺血肢體的小鼠如上進(jìn)行治療(參見實施例28)。US成像揭示出自病毒施用后1-2周開始在兩個治療組中灌注方面的顯著改善，而在對照組中檢測到微小變化(數(shù)據(jù)未顯示)。股動脈結(jié)扎后50天和60天，檢測到Ad5PPE-l-3XVEGF治療的長期作用。與Ad5CMVVEGF或鹽水治療的小鼠相比，在Ad5PPE-l-3XVEGF治療的小鼠中灌注顯著增加。Ad5CMVVEGF治療動物和對照治療動物之間的灌注差異隨時間間隔的增加而減少。第50天，Ad5PPE-l-3XVEGF治療組的平均灌注強度比Ad5CMVVEGF或鹽水治療小鼠的平均灌注強度高約50%,而與對側(cè)正常肢體的平均灌注強度相似(p〈0.01，圖55A)。第70天處死動物后，Ad5PPE-l-3XVEGF治療小鼠的肌肉切片中的毛細(xì)血管密度為747個CD31+細(xì)胞/mm2,分別比Ad5CMVVEGF組(474個CD31+細(xì)胞/mm2)和對照組(342個CD31+細(xì)胞〃mm2)高57%和117%(p<0.01,圖55B)。尸尸^^動f《這增強^J&^J^成PDGF-B是旁分泌內(nèi)皮分泌的因子，已經(jīng)表明它通過募集平滑肌細(xì)胞而參與血管成熟，且也可能參與血管生成[Edelberg,J.M.等，Ocw/a"ow105，608-13.(2002);Hsu等，■/Ce〃尸/zjwo/165,239-45.(1995);Koyama,N.等，JCe〃尸/7",。/158,1-6.(1994)]。另外，已經(jīng)表明PDGF-B參與內(nèi)膜增厚[Sano,H.等，Ocw/a,,ow103,2955-60.(2001);Kaiser,M.等，爿^7〃toW/^ww41,623-33.(1998)]，并參與成纖維細(xì)胞增殖[Nesbit,M.等，LW/"veW81,1263-74.(2001);Kim,WJ.等，/"veW(9盧/za/膨/40,1364-72.(1999).]。在體外和體內(nèi)測試PDGF國B處于內(nèi)皮特異性調(diào)節(jié)下誘導(dǎo)血管生成的能力。同Ad5PPE-l-3XVEGF—樣，Ad5PPE-l-3XPDGF-B載體在體外誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中的血管生成性變化(數(shù)據(jù)未顯示)。用10MOI的Ad5PPE-l-3XPDGF-B轉(zhuǎn)導(dǎo)在血纖蛋白包^皮的培養(yǎng)器具中培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致形成二維環(huán)狀結(jié)構(gòu)和血纖蛋白降解。對于體內(nèi)作用，在股動脈結(jié)扎后5天用109PFU的Ad5PPE-l-3XPDGF-B對小鼠進(jìn)行全身治療。結(jié)扎后30天，Ad5PPE-1-3XPDGF-B治療小鼠的平均灌注強度比對照組的平均灌注強度高約90%(圖56A)。結(jié)扎后80天，Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療組的灌注強度比對照組的灌注強度高60%(圖56B)。結(jié)扎后35天和90天測量毛細(xì)血管密度。在短時間間隔內(nèi)，Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療小鼠的局部缺血月幾肉切片中的平均毛細(xì)血管密度為516個CD31+細(xì)胞/mm2,而在鹽水治療組中，平均毛細(xì)血管密度為439個CD31+細(xì)胞/mm2(圖56C)。結(jié)扎后90天，Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療小鼠的平均毛細(xì)血管密度略微增加到566個CD31+細(xì)胞/mm2，而在對照組中檢測到中等減少(378個CD31+細(xì)胞/mm2,圖56D)。結(jié)果表明，Ad5PPE-l-3XPDGF-B載體本身是有效的血管生成治療，它不僅在施用后短期內(nèi)誘導(dǎo)血管生成，而且能夠長時間段地維持治療作用。在用Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療小鼠的肝中沒有檢測到慢性變化。力發(fā)*應(yīng)f^^這炎f^成',熟采用兩種治療模式檢驗以下假設(shè)在聯(lián)合療法中使用VEGF和PDGF-B這兩者可實現(xiàn)血管生成和血管系統(tǒng)成熟的進(jìn)一步增強，這兩種治療才莫式是(i)單次施用109PFU的Ad5PPE-l-3XVEGF和Ad5PPE-l-3XPDGF-B;(ii)在施用Ad5PPE-l-3XVEGF后5天施用相似劑量的Ad5PPE-l-3XPDGF-B。這兩種才莫式均獲得相同的結(jié)果，且因此將其認(rèn)為是相同的。結(jié)扎后90天，與對照Ad5PPE-l-3XGFP治療的小鼠相比，所述聯(lián)合療法和Ad5PPE-l-3XVEGF治療小鼠均表現(xiàn)出顯著更高的毛細(xì)血管密度，但在各種治療組中不存在顯著性差異(圖57B)。然而，聯(lián)合療法組中US成像的平均灌注強度比Ad5PPE-l-3XVEGF治療組最高42%(圖57A)。這可用聯(lián)合療法組和Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療小鼠的局部缺血肌肉小血管的成熟來解釋。在用聯(lián)合療法或Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療小鼠的對a-SMactin免疫染色的肌肉切片中，觀察到血管平滑肌細(xì)胞的明顯染色(圖57C-D)。在對照和Ad5PPE-l-3XVEGF治療小鼠中可以觀察到稀疏染色(圖57E-F)。在正常肢體肌肉中，較大的小動脈和小靜脈周圍存在明顯染色(圖57G)。在用Ad5PPE-l-3XPDGF-B治療的小鼠中，相似的結(jié)果早在結(jié)^^后35天就可獲得(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)扎后35天，治療小鼠肝切片中的慢性變化不明顯。這些結(jié)果在獨立的實驗中得到進(jìn)一步證實，該實驗考察單獨的和聯(lián)合療法中的PDGF-B對結(jié)扎后50天血液灌注的作用。如圖58所示，結(jié)扎后50天，聯(lián)合療法組的血液灌注強度與正常肢體的十分相似。該作用是PPE-3X依賴性的，因為這兩種生長因子的組成型表達(dá)(CMV啟動子)僅導(dǎo)致產(chǎn)生一半的灌注能力。有趣的是，單獨的PDGF-B的PPE-3X依賴性表達(dá)可以介導(dǎo)與聯(lián)合療法誘導(dǎo)幾乎相同的灌注(即77%)。然而，使用組成型啟動子時這樣的結(jié)果并不明顯。這些結(jié)果證實，PPE-1-3X啟動子盡管全身施用也能夠足夠強地激活治療基因，而不損害在血管生成性內(nèi)皮細(xì)胞中的優(yōu)先表達(dá)。此外，這些結(jié)果還證實PDGF-B為可介導(dǎo)其血管生成作用的促血管生成因子，而無需再加入公認(rèn)的血管生成生長因子如VEGF。種^^^^在^^尸尸￡-/(0^-7^裁'#HSV-TK/GCV是最廣泛研究和實施的細(xì)胞減少性基因藥物聯(lián)合。使用含HSV-TK的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或用含HSV-TK的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞對包括阿昔洛韋、更昔洛韋(GCV)、伐昔洛韋和泛昔洛韋在內(nèi)的藥物超家族敏感。鳥苦類似物GCV在與TK組合時是活性最強的藥物。HSV-TK陽性細(xì)胞產(chǎn)生病毒TK,其將GCV磷酸化成單磷酸GCV(GCV-MP)的有效性高達(dá)人TK的3個數(shù)量級。GCV-MP隨后由天然胸苷激酶磷酸化成二磷酸GCV，且最終磷酸化成三磷酸GCV(GCV-TP)。首先，制備兩種質(zhì)粒。一種質(zhì)粒包含受控于修飾型鼠前內(nèi)皮素原-1(PPE-13x)啟動子的HSV-TK基因，且制備該質(zhì)粒以檢驗由PPE-l(3x)啟動子控制的基因的體外功效。制備含由PPE-l(3x)啟動子控制的HSV-TK基因以及腺病毒序列的更大質(zhì)粒，用于通過同源重組制備病毒載體。通過兩種限制酶由4348bp的質(zhì)粒pORF-HSVlTK消化出HSV-TK基因(1190bp)。Sail限制位點靠著(against)HSV-TK基因的5'末端定位，且EcoRI位點靠著3'末端定位。將HSV-TK基因連接至3400bp質(zhì)粒pBluescript-SK的多克隆位點，質(zhì)粒pBluescript-SK在插入的基因的上游含Notl限制位點(靠著HSV-TK基因的3'末端)。Sail位點經(jīng)受克列諾(Klenow)程序，且Notl接頭連接至HSV-TK基因的5'末端。HSV-TK基因(現(xiàn)在由兩個Notl限制位點翼側(cè)包圍)連接至上文所述的兩個質(zhì)粒pEL8(3x)-Luc和pACPPE-l(3x)-GFP的Notl限制位點中1.8600bp質(zhì)粒稱為pEL8(3x)-Luc,代替1842bp的螢光素酶基因，側(cè)接兩個Notl限制位點。pEL8(3x)-TK質(zhì)粒包含PPE-l(3x)啟動子、HSV-TK基因、SV-40聚腺苦酸化位點和鼠內(nèi)皮素-1基因的笫一內(nèi)含子(圖60a)。2.11946bp質(zhì)粒pACPPE-l(3x)-GFP，代替1242bp的綠色焚光蛋白(GFP)基因，由兩個NotI限制位點翼側(cè)包圍(圖60b)。溝建^^"憂控f修謬f^^//SK-7X名欲^厲^#-5裁'#。在第一代(E1基因缺失，E3不完整)腺病毒-5載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建稱為AdPPE-l(3x)-TK的復(fù)制缺陷型載體。使用眾所周知的常規(guī)克隆技術(shù)，通過質(zhì)粒pACPPE-1(3x)-TK和pJM-17(40.3kb)在人胚腎-293(HEK-293)中的共轉(zhuǎn)染制備重組載體。pJM-17質(zhì)粒包含除El基因之外的完整腺病毒-5基因組。HEK-293細(xì)胞系替代了El缺失，因為它們含反式E1基因。40種同源重組中有一種誘導(dǎo)載體AdPPE-l(3x)-TK。爿6/尸尸￡-/(0^-7^我##在。對病毒DNA進(jìn)行PCR分析，以驗證重組腺病毒中TK轉(zhuǎn)基因和啟動子的存在。使用兩種引物正向引物5'-ctcttgattcttgaactctg-3'(前內(nèi)皮素原啟動子序列中的455-474bp)(SEQIDNo:9)和反向引物5'-taaggcatgcccattgttat曙3'(HSV-TK基因序列中的1065-1084bp)(SEQIDNo:10)。使用在我們的實驗室中產(chǎn)生的其它載體引物，以驗證載體純度。約1kb的條帶證實在AdPPE-l(3x)-TK病毒中存在PPE-l(3x)啟動子和HSV-TK基因(圖61)。但是，構(gòu)建的腺病毒載體的其它引物沒有一個能提供任何產(chǎn)物。因此，所述載體是純集落。所述病毒在HEK-293細(xì)胞中進(jìn)一步純化，以分離單個病毒克隆。在雙脫氧核苷酸存在下通過循環(huán)測序反應(yīng)對AdPPE-l(3x)-TK的病毒DNA測序，對其進(jìn)行化學(xué)修飾，以在UV光下發(fā)熒光。4種引物用于驗證完整轉(zhuǎn)基因的存在1.正向引物5'-ctcttgattcttgaactctg-3'(在前內(nèi)皮素原啟動子中的455-474bp)(SEQIDNO:9)，之后是"3x"元件。2.反向引物5'-gcagggctaagaaaaagaaa-3'(在前內(nèi)皮素原啟動子中的551-570bp)(SEQIDNO:11)。3.正向引物5'-tttctttttcttagccctgc畫3'(在前內(nèi)皮素原啟動子中的551-570bp)(SEQIDNO:12)。4.反向引物5'-taaggcatgcccattgttat-3'(在HSV-TK基因中的1065-1084bp)(SEQIDNO:10),其處于HSV-TK基因中。使用稱為2(SEQIDNO:1l)和3(SEQIDNO:12)的引物，因為僅由引物1(SEQIDNO:9)和3(SEQIDNO:10)不能獲得產(chǎn)物。結(jié)果顯示出與小鼠(Musmusculus)Balb/c前內(nèi)皮素原-1基因啟動子區(qū)gil560542|gblU07982.1|MMU07982[560542](SEQIDNO:l)具有99%同一性，以及顯示出與單純皰滲病毒胸苷激酶基因gil59974lemblV00470.1IHERPES[59974]具有99.4%同一性。AdPPE-l(3X)序列詳述于圖92。3x序列(圖93)包含內(nèi)皮特異性正轉(zhuǎn)錄元件的額外一式三份重復(fù)。如上文所述，在此145bp序列中，有兩個完整的內(nèi)皮特異性正轉(zhuǎn)錄元件和一個被切成兩個反向順序的片段的序列。乂六裙裁'舉。構(gòu)建兩個腺病毒載體，一個沒有PPE-l(3x)啟動子，且第二個沒有Luc基因，以用作AdPPE-1(3X)載體的對照。載體AdCMV-TK(用作非組織特異性啟動子對照)包含由早期巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子控制的HSV-TK基因(圖62c)。載體AdPPE-l(3x)-Luc包含由修飾型鼠前內(nèi)皮素原-1啟動子控制的荄光素酶(Luc)基因(圖62b)。所述病毒以按比例放大批次培養(yǎng)，并以10、10"顆粒/ml的濃度儲存于-20。C。^者洛，和義于尸尸￡"-/(3々^動子#賴之7"^^尸尸￡-/^^^^子控賴之7^4###說'處力發(fā)*應(yīng)勿應(yīng)^#通過與對照載體AdCMV-TK和AdPPE-l(3x)-Luc對比，在內(nèi)皮細(xì)胞系中體外評價AdPPE-l(3x)-TK的特異性內(nèi)皮細(xì)胞耙向的細(xì)胞毒性。爿^尸尸7-/廣3力-7^##:用感染復(fù)數(shù)(m.o丄)為O.l、1、10、100和1000的AdPPE-l(3x)-TK、AdCMV隱TK和AdPPE-l(3x)-Luc轉(zhuǎn)導(dǎo)牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后4小時加入GCV(l)Lig/ml)。對照是用無GCV的載體或無載體的GCV轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。兩個對照都未謙導(dǎo)細(xì)胞死亡(數(shù)據(jù)未顯示)。于顯著低于AdCMV-TK的m.o.i.在AdPPE-l(3x)+GCV處理細(xì)胞中注意到明顯的細(xì)胞毒性的特征性形態(tài)學(xué)變化(細(xì)胞擴大、延伸和膨脹)和匯合喪失。AdPPE-l(3x)-Luc轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞保持健康(小尺寸、圓形和匯合，圖63)。通過用結(jié)晶紫染色測定評價細(xì)胞生存力(圖64),證實與GCV施用組合的AdPPE-l(3x)-TK載體在BAE細(xì)胞中于低于受強組成型CMV啟動子控制的TK基因的m.o丄表現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒性。y^尸尸j5Wf3;c;-7X+GCr^/^^^GC7如上文所述，用AdPPE-l(3x)-TK、AdCMV-TK和AdPPE-l(3x)-Luc以感染復(fù)數(shù)(m.o丄)10轉(zhuǎn)導(dǎo)牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC),并使該細(xì)胞接觸轉(zhuǎn)導(dǎo)后4小時加入的濃度漸增的GCV(0.001-10pg/ml，如所示)。用無GCV的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照細(xì)胞或接受無載體的GCV的對照細(xì)胞在任何濃度都未顯示出細(xì)胞死亡的指征(數(shù)據(jù)未顯示)。在比接觸AdCMV-TK(中間系歹'J)的細(xì)胞顯著低的GCV濃度，在AdPPE-l(3x)-TX+GCV處理細(xì)胞中注意到明顯的細(xì)胞毒性的特征性形態(tài)學(xué)變化(細(xì)胞擴大、延伸和膨脹)和匯合喪失(圖65)。通過用結(jié)晶紫染色測定評價細(xì)胞生存力(圖66),證實與GCV施用組合的AdPPE-l(3x)-TK載體在BAE細(xì)胞中且于比受強組成型CMV啟動子控制的TK基因低的GCV濃度表現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒性。^W尸尸五-7(Ox」-7X+GCK*/《##X,^^^i^€#>f為了評價載體AdPPE-l(3x)-TK對內(nèi)皮細(xì)胞的特異性和功效，用AdPPE-l(3x)-TK、AdPPE-l(3x)-Luc或AdCMV-TK以m.o丄10轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞[牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)]和非內(nèi)皮細(xì)胞[人肝癌細(xì)胞(HepG-2)、人正常皮膚成纖維細(xì)胞(NSF)],接著在轉(zhuǎn)導(dǎo)后4小時施用1|ug/mlGCV。轉(zhuǎn)導(dǎo)后4天檢測細(xì)胞毒性和細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。AdPPE-l(3x)-TK+GCV在BAEC和HUVEC中特異性地誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，而AdCMV-TK+GCV僅在HepG-2中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性。NSF對m.o丄=10的所有載體都有抗性。AdPPE-l(3x)-Luc+GCV對所有細(xì)胞類型都無毒(圖67)。通過用結(jié)晶紫染色測定評價細(xì)胞生存力(圖68),證實與受強組成型CMV啟動子控制的TK基因(AdCMV-TK+GCV)的非特異性細(xì)胞毒性相比，與GCV施用組合的AdPPE-l(3x)-TK載體表現(xiàn)出協(xié)同的內(nèi)皮細(xì)胞特異性細(xì)胞毒性。用AdPPE-l(3x)陽TK、AdPPE-l(3x)-Luc或AdCMV-TK以較高的m.o丄100轉(zhuǎn)導(dǎo)非內(nèi)皮性NSF細(xì)胞，接著在轉(zhuǎn)導(dǎo)后4小時施用1pg/ml的GCV時，未觀察到AdPPE-l(3x)-TK+GCV對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的作用(圖69)。相反，用處于強組成型CMV啟動子控制之下的TK(AdCMV-TK+GCV)處理的細(xì)胞顯示出強的非特異性細(xì)胞毒性，從而證實了即使在極端的感染復(fù)數(shù)下，處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的TK和更昔洛韋施用也有內(nèi)皮選擇性細(xì)胞毒性?？傊?，這些結(jié)果首次表明，載體AdPPE-l(3x)-TK能夠特異性誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞包括人內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷。而且，載體AdPPE-l(3x)-TK完全受控于前藥GCV,且于相對低的GCV濃度具有相當(dāng)?shù)幕钚?。最后，盡管腺病毒載體的內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)功效相對低，但內(nèi)皮細(xì)胞殺傷是高效的。尸尸五-7(Ox」啟動子控斜之7"的IX在#力^說'處力發(fā)勿應(yīng)勿應(yīng)##在癌癥胂瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移生長的動物模型中，通過與全身施用GCV和對照載體AdCMV-TK和AdPPE-l(3x)-Luc相比，體內(nèi)評價AdPPE-1(3x)-TK的特異性內(nèi)皮細(xì)胞耙向的細(xì)胞毒性的治療功效。處f尸尸E-7(0^啟《f控賴7"^謬^7^i^和^者洛4rGC"滋^/乂,Z^t^,蕃(2XC」^脊移^^Lewis肺癌是充分表征的、具有高度轉(zhuǎn)移潛力的嚴(yán)重侵襲性惡性癌癥的動物模型。已嘗試了使用細(xì)胞因子IL-2(Kwong等，Chest119;112:1332-37)、采用內(nèi)皮啟動子Tie/Tek和GCV(dePalma等，NatMed2003;9:789-795)以及體外VEGF啟動子和GCV(Koshikowa等，CaneRes2000;60:2936-4l)與HSV-TK進(jìn)行聯(lián)合治療。為了測試全身施用AdPPE-l(3x)和GCV對轉(zhuǎn)移性疾病的作用，通過用腫瘤細(xì)胞接種左足且一發(fā)展原發(fā)性胂瘤就截足來誘發(fā)LLC肺轉(zhuǎn)移。去除原發(fā)性腫瘤后5天靜脈內(nèi)施用腺病毒載體[AdPPE-l(3x)-TK+GCV;AdCMV-TK+GCV;無GCV的AdPPE-l(3x)-TK]，接著每日腹膜內(nèi)施用GCV達(dá)14天。如下排除小鼠22只小鼠由于無發(fā)展原發(fā)性腫瘤而被排除，l只小鼠由于載體注射失敗而被排除，8只小鼠無任何肺轉(zhuǎn)移蹤跡而死亡。在排除的小鼠中，18只小鼠在入選前被排除，6只由組1(AdPPE-l(3x)-TK+GCV)排除，2只由組2(AdCMV-TK+GCV)排除，3只由組3(無GCV的AdPPE-l(3x)-TK)排除，且2只由組4(鹽水+GCV)排除。在載體注射后第24天處死小鼠。在第24天，對照組(鹽水+GCV和無GCV的AdPPE-l(3x)-TK)中25%的小鼠由于肺轉(zhuǎn)移擴散而死亡。圖70顯示了治療組和對照組的代表性肺組織，從而表明在AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠的肺中的轉(zhuǎn)移擴散程度比AdCMV-TK+GCV、無GCV的AdPPE-l(3x)-TK和無腺病毒的GCV治療的小鼠肺中的轉(zhuǎn)移擴散程度顯著降低。在處死后，AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療的小鼠轉(zhuǎn)移的平均重量(轉(zhuǎn)移性疾病程度指標(biāo))低至用無GCV的AdPPE-l(3x)-TK治療小鼠的該平均重量的1/3.3(平均值士SE:分別為0.3g士0.04對0.8g士0.2;p<0.05)。用AdCMV-TK+GCV或用鹽水+GCV治療的小鼠轉(zhuǎn)移的平均重量與其它組別的該平均重量無統(tǒng)計學(xué)差異(圖71)。^于尸/^-/(3義」^動子控斬之T的7X殺力襲迷和^者洛，(^GCK」乂,脊移7^^紐織^*應(yīng)###^,為了確定AdPPE-l(3x)和GCV施用對LLC轉(zhuǎn)移生長的作用機制，對轉(zhuǎn)移性肺的肺組織進(jìn)行蘇木精和伊紅染色(圖72a-72c)。在取自無GCV的AdPPE-l(3x)匿TK或鹽水+GCV治療小鼠的肺轉(zhuǎn)移中檢測到輕微的外周壞死(圖72a)。取自AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠的肺組織表現(xiàn)出肺泡和支氣管周圍單核浸潤，而在取自用無GCV的AdPPE-l(3x)-TK或鹽水+GCV治療小鼠的肺中未檢測到浸潤。與取自用無GCV的AdPPE-l(3x)-TK或鹽水+GCV治療小鼠的轉(zhuǎn)移相比，取自AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠的肺轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出單核浸潤簇(圖72b、c)。還在取自AdCMV-TK+GCV治療小鼠的標(biāo)本中檢測到最少的壞死和單核浸潤。結(jié)果提示，AdPPE-l(3x)-TK+GCV在肺轉(zhuǎn)移中裔導(dǎo)增加的中心壞死和單核浸潤。為確定負(fù)責(zé)AdPPE-l(3x)-TK+GCV對LLC肺轉(zhuǎn)移的抑制作用的細(xì)胞死亡特征，對肺組織進(jìn)行TUNEL和抗胱天蛋白酶-3染色，以評價凋亡。與無GCV的AdPPE-l(3x)-TK或鹽水+GCV治療小鼠相比，AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠的肺轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)出眾多的凋亡肺瘤細(xì)胞(圖73a和73b)。與AdCMV-TK+GCV治療小鼠的標(biāo)本相比，取自AdPPE-1(3x)-TK+GCV治療小鼠肺之標(biāo)本的組織病理學(xué)切片顯示出顯著更高程度的DNA損傷(TUNEL，圖73a)和胱天蛋白酶-3(圖73b),從而表明胂瘤細(xì)胞凋亡。更有意義的是，轉(zhuǎn)移肺的組織病理切片的TUNEL和胱天蛋白酶-3染色在靜脈內(nèi)AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠肺轉(zhuǎn)移血管(內(nèi)皮)區(qū)中表現(xiàn)出增強的凋亡(圖74),從而表明處于PPE-l(^x)啟動子控制下的TK體內(nèi)表達(dá)和更昔洛韋(GCV)施用對轉(zhuǎn)移細(xì)胞凋亡的協(xié)同增強作用。結(jié)果提示，全身施用AdPPE-l(3x)-TK+GCV誘導(dǎo)大規(guī)模的肺瘤細(xì)胞凋亡。而且，血管生成性內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能是大規(guī)模中心轉(zhuǎn)移壞死和凋亡的才幾制。義、于尸/^-/卩々^《子控賴之7X^這和^者洛，「GCK」滋^7在脊移^疾病^^^"舉力在AI5^^/，^,CD-31是血管生成的特征性內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記。對轉(zhuǎn)移肺組織進(jìn)行抗CD-31染色，以確定內(nèi)皮細(xì)胞涉及全身性AdPPE-1(3x)+GCV的抗轉(zhuǎn)移作用的情況。圖75a-75d揭示，AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠的肺轉(zhuǎn)移中的血管生成性血管短，無連續(xù)性或分支，且邊界模糊(圖75a-75c)。在無GCV的AdPPE-l(3x)-TK或鹽水+GCV治療小鼠的肺轉(zhuǎn)移中的血管生成性血管表現(xiàn)為具有豐富分支和明顯邊界的長血管(圖75a)。在AdCMV-TK+GCV治療小鼠的肺轉(zhuǎn)移中也檢測到最低程度的異常血管系統(tǒng)，盡管遠(yuǎn)小于AdPPE-l(3x)-TK治療小鼠的狀況(未顯示)。對肝血管沒有作用說明了對增殖的內(nèi)皮組織的這種抗血管生成作用的特異性(圖75c)?；谟嬎銠C的血管密度測量(ImagePro-Plus,MediaCyberneticsIncorporated)表明，AdPPE-l(3x)-TK+GCV組的肺轉(zhuǎn)移中的血管密度小至無GCV的AdPPE-l(3x)-TK治療組的1/1.5(分別為40107.7pm2對61622.6^1112)(圖75d)。綜上所述，這些結(jié)果表明，全身施用AdPPE-l(3x)-TK+GCV通過高度選擇性誘導(dǎo)血管生成內(nèi)皮細(xì)胞凋亡而誘發(fā)中心轉(zhuǎn)移壞死和凋亡。y^CMF-ZX^^l丄丄C/f^^移^V、處^謬發(fā)^f應(yīng)^#。因為全身施用腺病毒載體的其中一種主要副作用是肝毒性，所以在具有誘發(fā)的LLC腫瘤的C57B1/6小鼠中測定肝形態(tài)學(xué)。治療肝組織和對照肝組織的蘇木精和伊紅染色切片分析揭示，用處于組成型啟動子AdCMV-TK控制之下的TK十GCV治療的小鼠的肝表現(xiàn)出門(portal)和門管周單核浸潤以及小匯合壞死區(qū)域，而AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療小鼠和對照組的肝僅表現(xiàn)出最小的單核浸潤和肝細(xì)胞核增大(圖76)。結(jié)果表明，盡管處于CMV啟動子控制之下的TK組成型表達(dá)明顯有肝毒性，但采用血管生成特異性AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療沒有觀察到對肝形態(tài)學(xué)的不利副作用。^于尸尸￡-/^一啟動子控教之7"^謬/^^這^嚴(yán)^薦^V,并^;為評價處于PPE-l(3x)啟動子控制之下的HSV-TK表達(dá)的抗轉(zhuǎn)移作用的器官和組織特異性程度，使用HSV-TK引物和P-肌動蛋白引物對用腺病毒載體治療的具有LLC肺轉(zhuǎn)移的小鼠不同器官的多種組織進(jìn)行PCR分析。9只15周齡的C57BL/6雄性小鼠入選。通過用腫瘤細(xì)胞接種左足以及一發(fā)展原發(fā)性腫瘤就截足來誘發(fā)LLC肺轉(zhuǎn)移。在去除原發(fā)性腫瘤后14天靜脈內(nèi)遞送腺病毒載體(AdPPE-l(3x)-TK和AdCMV-TK)或鹽水。在注射載體后6天處死小鼠，且如所述由收獲的器官提取RNA。對RNA實施逆轉(zhuǎn)錄酶PCR,接著使用HSV-TK引物和P肌動蛋白引物進(jìn)行PCR。在AdPPE-l(3x)-TK治療小鼠的肺中檢測到陽性HSV-TK表達(dá)，而在肝中沒有檢測到HSV-TK表達(dá)。相比之下，在AdCMV-TK治療的小鼠肝中檢測到高度陽性的HSV-TK表達(dá)，且在肺中沒有檢測到表達(dá)(圖77)。根據(jù)(3肌動蛋白校正的基于計算機的光密度測定法(Optiquant,Packard-Instmments)表明，與AdCMV-TK治療小鼠中的肝/肺表達(dá)比率5.8相比，AdPPE-l(3x)-TK治療小鼠中的肝/肺表達(dá)比率為11.3。這些結(jié)果表明，AdPPE-l(3x)-TK治療小鼠主要在富血管生成器官(即轉(zhuǎn)移性肺)中表達(dá)HSV-TK基因，而處于CMV啟動子控制之下的TK表達(dá)(AdCMV-TK治療小鼠)主要在柯薩奇腺病毒受體富集器官如肝中進(jìn)行(圖")。還在AdPPE-l(3x)-TK治療小鼠的睪丸中檢測到強陽性HSV-TK表達(dá)。盡管不希望受限于單一假設(shè)，但要認(rèn)識到，在AdPPE-l(3x)-TK治療小鼠中的陽性表達(dá)可能由性腺中內(nèi)皮素啟動子的高度表達(dá)來解釋。在AdCMV-TK治療小鼠中的陽性表達(dá)由相對高的RNA洗脫(RNAelution)來解釋，如由高度陽性的(3-肌動蛋白條帶反映出來的?？傊@些結(jié)果表明，全身施用AdPPE-l(3x)-TK+GCV通過誘導(dǎo)中心轉(zhuǎn)移壞死和選^f性誘導(dǎo)血管生成性內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，可以安全和組織特異性方式有效抑制甚至高度侵襲性的癌癥轉(zhuǎn)移擴散。就導(dǎo)致不希望的副作用減少的所需劑量降低和治療持續(xù)時間縮短形式抗癌治療提供了超越個別治療的顯著優(yōu)勢(關(guān)于近期綜述參見Fang等，CurrOpinMolTher2003;5:475-82)。為了測試在多形式治療中AdPPE-l(3x)-TK+GCV施用的功效，評價與單劑放療聯(lián)合的全身性AdPPE-l(3x)-TK+GCV施用對Balb/C小鼠中緩慢生長的原發(fā)性CT-26結(jié)腸癌和C57B1/6小鼠中的轉(zhuǎn)移性Lewis肺癌的作用。^f^^^fpf用CT-26結(jié)腸癌接種入20只8周齡雄性BALB/C小鼠的左股，以發(fā)現(xiàn)亞治療性且無毒的輻射劑量。肺瘤直徑一達(dá)到4-6mm,就用局部單劑輻射治療小鼠。檢查4個輻射劑量0Gy(黑色圓)、5Gy(空心圓)、10Gy(黑色三角形)或15Gy(空心三角形)。通過測量大軸和小軸每日評價肺瘤體積[按照式V=7r/6xa2xp(a是短軸，且(3是長軸)計算]。每日通過觀察和稱重監(jiān)控小鼠保持良好狀態(tài)。與未治療的小鼠相比，IO和15Gy劑量抑制腫瘤進(jìn)程的發(fā)展(分別為p=0.039、p=0.029)。但是，5Gy劑量僅誘導(dǎo)部分的、非統(tǒng)計學(xué)顯著的腫瘤發(fā)展延遲(圖78a)，且在5Gy治療小鼠中，既沒有檢測到顯著的重量減輕(圖78b),也沒有檢測到異常行為。根據(jù)這些結(jié)果，在聯(lián)合治療實驗中使用單劑5Gy放療。義、f尸尸5W卩々^^子控斜之7"^7X舉力衷迷和^者洛-^GC「」滋^7炎合^孝5Qy放^^賴n發(fā)'嫂潛應(yīng);^v^vf迷^.'用CT-26結(jié)腸癌肺瘤細(xì)胞接種100只8周齡雄性Balb/C小鼠。肺瘤軸一達(dá)到4-6mm,就向尾靜脈中靜脈內(nèi)注射1011PFU病毒載體[AdPPE-l(3x)-TK或AdCMV-TK],接著每天按指示腹膜內(nèi)注射GCV(100mg/kg體重)達(dá)14天。載體施用后3天，用局部5Gy劑量輻射小鼠。按照式V=7i/6xa2x(3(a是短軸，且p是長軸)評價胂瘤體積。在處死時，給小鼠照相，且收獲肺瘤和肝標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)分析。與其它治療方案相比，AdPPE-1(3x)-TK+GCV+放療抑制腫瘤進(jìn)展。平均腫瘤抑制持續(xù)時間約2周，與腺病毒活性持續(xù)時間相匹配。AdPPE-l(3x)-TK+GCV+放療治療組的平均腫瘤體積進(jìn)展小于AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療組(p=0.04)和AdCMV-TK+GCV治療組(p=0.008)。而且，該組(AdPPE-l(3x)-TK+GCV+放療)中的平均腫瘤體積進(jìn)展小于所有其它組中累積的平均腫瘤體積進(jìn)展(p=0.0025)、所有非輻射組(AdPPE-l(3x)-TK+GCV、Ad5CMV-TK+GCV、無GCV的AdPPE-l(3x)-TK和鹽水+GCV;p=0.0005)中的累積平均胂瘤體積進(jìn)展以及其它輻射組(Ad5CMV-TK+GCV+放療、無GCV的AdPPE-l(3x)-TK+放療以及鹽水+GCV+放療；p=0.041)中的累積平均肺瘤體積進(jìn)展(圖79a、b)。與非耙向載體AdCMV-TK相比，放療僅顯著加強血管生成內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄耙向的載體AdPPE-l(3x)-TK(p-0.04)(圖79c-f)。在沒有放療時采用所有病毒載體的治療方案都無效。總之，這些結(jié)果表明了聯(lián)合的AdPPE-l(3x)-TK+GCV和放療在體內(nèi)對CT-26結(jié)腸癌胂瘤發(fā)展的顯著協(xié)同性腫瘤抑制作用。爿6/尸/^-/(0^-7^+〇(:「農(nóng)合放;^謬爭義說模^9#豕/S;為了確定聯(lián)合的AdPPE-l(3x)-TK+GCV和放療的抗肺瘤發(fā)生作用的機制，對腫瘤組織進(jìn)行蘇木精和伊紅染色。肺瘤組織是細(xì)胞過多的(hypercellular)、凝縮的并具有高有絲分裂指數(shù)。檢測所有組中的兩種要素壞死和壞死區(qū)域中的肉芽組織。與取自非輻射小鼠的胂瘤相比，取自用包含輻射的方案治療的小鼠的胂瘤表現(xiàn)出更大的壞死區(qū)域和肉芽組織。在這些組中，壞死(圖80a)和肉芽組織(圖80b)主要位于中心。AdPPE-l(3x)-TK+GCV聯(lián)合放療治療的小鼠表現(xiàn)出最廣泛的壞死和肉芽組織(圖80a和80b),估計占標(biāo)本面積的約55%-80%(圖80)。與其它非輻射組相比，取自用無放療的AdPPE-l(3x)-TK+GCV治療的小鼠的胂瘤表現(xiàn)出相對更大的壞死區(qū)域(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)果提示，AdPPE-l(3x)-TK+GCV+放療誘發(fā)大規(guī)模中心肺瘤壞死，其部分地被肉芽組織替代。爿^/尸尸￡-/(0^-7^+GCF農(nóng)合i^f滲,力發(fā)勿^^義說^^9f源z^.'為確定負(fù)責(zé)AdPPE-l(3x)-TK+GCV和放療對結(jié)腸癌腫瘤的抑制作用的細(xì)胞死亡特征，對腫瘤組織進(jìn)行TUNEL和抗胱天蛋白酶-3染色，以顯現(xiàn)凋亡細(xì)胞。TUNEL染色在輻射組中顯現(xiàn)出中心壞死區(qū)域周圍的凋亡腫瘤細(xì)胞。在由AdPPE-l(3x)-TK+GCV聯(lián)合放療治療小鼠取出的胂瘤中斗企測到比任何其它組都更多的凋亡腫瘤細(xì)胞(圖30a)。由胂瘤切片的抗胱天蛋白酶-3染色檢測到相同的凋亡細(xì)胞模式。而且，被凋亡肺瘤細(xì)胞包圍的壞死區(qū)域(白色箭標(biāo))為蛇形，且就含有增加的血管密度而言是獨特的(圖81b)。凋亡區(qū)域中的血管內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出陽性抗胱天蛋白酶-3染色(圖82)?？傊@些結(jié)果提示，AdPPE-l(3x)-TK+GCV聯(lián)合放療在結(jié)腸癌腫瘤的壞死區(qū)域周圍誘導(dǎo)大規(guī)^t的肺瘤細(xì)胞凋亡。而且，腫瘤凋亡區(qū)域中的血管生成性血管密度增加、壞死和凋亡區(qū)域的形狀以及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的存在表明血管周圍壞死在血管生成組織損傷之后發(fā)生。炎合#」c^/^-/「3;c,-7Xj才面^l我i^^;成作-CD-31是血管生成的特征性內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記。對腫瘤組織進(jìn)行抗CD-31免疫染色，以證實聯(lián)合治療對內(nèi)皮細(xì)胞的直接作用。由采用含單獨輻射的方案治療的小鼠取出的腫瘤切片的血管生成性血管短，沒有連續(xù)性或分支，且邊界模糊。施用無GCV的單獨載體未引起異常(圖83a),而AdPPE-l(3x)-TK+GCV聯(lián)合放療顯示出最廣泛的血管異常(圖32a)。肝血管未受影響(圖83b)。結(jié)果表明，施用聯(lián)合放療的AdPPl(3x)-TK+GCV在血管生成性血管中誘發(fā)廣泛的血管破壞。全j'/i滋^/爿c/CA/K-7X+GCF但尤」^/尸/^-/^1」滋^^#,Cr-26潛應(yīng)疾^Vf^V、虞^滲發(fā)^f處善^.'因為全身施用腺病毒載體的其中一種主要副作用是肝毒性，所以對載體治療小鼠、聯(lián)合治療小鼠和對照小鼠的肝組織進(jìn)行蘇木精和伊紅染色。每個治療組中的肝標(biāo)本都顯示出增大的肝細(xì)胞核和K叩fer細(xì)胞增生。最顯著的變化在用有或無放療的AdCMV-TK+GCV治療小鼠中表現(xiàn)出來(圖84)。在組間沒有發(fā)現(xiàn)肝功能血漿標(biāo)記(肝酶SGOT、SGPT)或腎功能血漿標(biāo)記(尿素、肌酸酐)的差異。應(yīng)當(dāng)指出的是，肝內(nèi)皮細(xì)胞不受載體AdPPE-l(3x)-TK+GCV聯(lián)合放療的影響(圖84,右圖)。結(jié)果表明，在CMV啟動子控制下表達(dá)HSV-TK的腺病毒載體相對有肝毒性。綜上所述，這些結(jié)果提示，AdPPE-l(3x)-TK+GCV對于靜脈內(nèi)施用是安全的。而且，所述載體〗又在與加入的無毒、局部遞送的放療l關(guān)合時有效抑制緩慢生長的原發(fā)性肺瘤進(jìn)展。盡管不希望受限于單一假設(shè)，然而看起來經(jīng)由凋亡而特異性抑制腫瘤血管生成似乎是肺瘤抑制的機制。而且，AdPPE-l(3x)-TK載體的細(xì)胞毒性活性依賴于GCV和放療的施用。滋^7^者洛4和義f尸尸丑-/(^義」^《子控教7"的7X炎合^^f:沐力錄^7增強#移^;#癥吵W^;^為了評價AdPPE-l(3x)-TK+GCV和單劑放療的抗血管生成活性對癌癥中的長期存活的聯(lián)合作用，選擇在快速轉(zhuǎn)移的Lewis肺癌模型中全身施用載體和GCV和放療。f口亞治^Vi^,'用LLC細(xì)胞接種入35只8周齡雄性C57BL/6小鼠的左爪墊。一發(fā)展原發(fā)性腫瘤就在全身麻醉下截足。截足后8天在全身麻醉下施用針對小鼠胸壁的單劑放療。4全查5個輻射劑量0、2、50、10和15Gy。去除原發(fā)性腫瘤后3-4周，未輻射小鼠開始體重下降，這是轉(zhuǎn)移疾病的病征。由此按照去除原發(fā)性肺瘤后第28天的計劃處死小鼠。通過觀察和稱重每日監(jiān)控小鼠保持良好狀態(tài)。用15Gy治療的6只小鼠中有5只在輻射后5天內(nèi)死亡，沒有任何肺轉(zhuǎn)移的癥征。如下排除小鼠1只小鼠由于相比于其它組原發(fā)性肺瘤發(fā)展延遲2周而被排除。3只小鼠在隨訪期間死亡，且未進(jìn)行尸體剖檢。在被排除的小鼠中，1只小鼠在入選前纟皮排除，1只來自未治療組，1只來自2Gy組，且1只來自5Gy組。用10Gy治療的小鼠的平均轉(zhuǎn)移重量低于其它組的該重量，但僅與5Gy治療組有統(tǒng)計學(xué)差異(口=0.001)(圖85a)。如前所述，15Gy輻射治療的小鼠在5天內(nèi)死亡，無任何轉(zhuǎn)移蹤跡。10Gy治療小鼠在輻射后10天表現(xiàn)出非顯著性的短暫重量下降(圖85b)。因為單劑5Gy放療既不是治療性的(圖85a)也不是有毒性的(圖85b),所以其用于聯(lián)合治療實驗。聯(lián)合^亞浴^V^^^和^于尸尸E-7(Oc」^^子控斬7的4^遽/^^者洛，fGCF」滋^7鈔^^伊觀虞單;^^^脊移^疾病,將LLC細(xì)胞接種入180只8周齡雄性Balb/C小鼠左爪墊中。一發(fā)展原發(fā)性胂瘤就在全身麻醉下截足。截足后5天，將101GPFU載體[AdPPE-l(3x)-TK或AdCMV-TK]注射入尾靜脈中，接著每日腹膜內(nèi)注射GCV(100mg/kg)達(dá)14天。載體注射后3天，在全身麻醉下施用針對小鼠胸壁的單劑5Gy放療。小鼠分為6組1.Ad5PPE-l(3x)曙TK+GCV;2.Ad5CMV-TK+GCV;3.鹽水+GCV;4.Ad5PPE-l(3x)-TK+GCV+放療；5.Ad5CMV-TK+GCV+放療；和6.鹽水+GCV+放療。小鼠排除4只小鼠在截腿后不久死亡，4只小鼠由于原發(fā)性腫瘤對于入選來說太大而被排除，7只小鼠由于原發(fā)性腫瘤發(fā)展晚而被排除，12只小鼠沒有任何肺轉(zhuǎn)移蹤跡而死亡，1只小鼠由于兩側(cè)眼排出物而被排除。在排除的小鼠當(dāng)中，14只在入選前內(nèi)排除，2只由組1排除，2只由組2排除，2只由組3排除，4只由組4排除，3只由組5排除，且1只由組6排除。用AdPPE-l(3x)-TK+GCV+放療治療的小鼠的存活顯著長于任何其它治療組中的小鼠(p=0.05)(圖86a)。而且，相比于非靶向載體AdCMV-TK，放療僅顯著增強血管生成性內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄靶向的載體AdPPE-l(3x)-TK(p=0.04)(圖86b-d)。結(jié)果表明，全身施用AdPPE-l(3x)-TK載體+GCV+單劑放療的聯(lián)合治療協(xié)同延長了轉(zhuǎn)移性疾病中的存活。|義、f尸尸^-/^^^動子控#之7"^Fm和7W/^^合差^^雙重浴^;與，#^錄^7#強##^發(fā)*####為了測試化療和HSV/TK以外的"自殺基因"的血管生成性內(nèi)皮特異性表達(dá)聯(lián)合的功效，單獨地和與蒽環(huán)類糖苷阿霉素(DOX)聯(lián)合向BAE細(xì)胞施用AdPPE-l(3x)-Fas-c,其具有與Fas-嵌合體(Fas-c,參見上文的詳述)組合的PPE-l(3x)啟動子。根據(jù)BAE細(xì)胞中細(xì)胞存活(％生存力，通過結(jié)晶紫染色評價)測量的凋亡在AdPPE-l(3x)-Fas-c+DOX治療小鼠中顯著高于在AdPPE-l(3x)-Fas-c或單獨的DOX治療小鼠中的凋亡(圖91)。這些結(jié)果表明，PPE-l(3x)啟動子可用于指導(dǎo)其它治療基因構(gòu)建體的有效的、內(nèi)皮特異性的表達(dá)，并且PPE-l(3x)依賴性的、凋亡誘導(dǎo)性的Fas-c表達(dá)和化療的聯(lián)合導(dǎo)致產(chǎn)生高度有效的協(xié)同內(nèi)皮凋亡。務(wù)伴復(fù)教f靡^^戎殺*/《潛#:牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)和人正常皮膚成纖維細(xì)胞-NSF細(xì)胞系在含10%熱滅活FCS、100|ug/ml青霉素和100|iig/ml鏈霉素的低葡萄糖DMEM中培養(yǎng)。HeLa(人子宮頸上皮腺癌)、Lewis肺癌細(xì)胞(D122-96)和293(人胚腎)細(xì)胞系在含10%熱滅活FCS、100pg/ml青霉素、100|ug/ml鏈霉素的高葡萄糖DMEM中培養(yǎng)。人臍內(nèi)皮細(xì)胞-HUVEC(CambrexBioScienceWalkersville,Inc.)在EGM-2Bullet試劑盒(Clonetics,Bio-Whittaker,Inc.,MD,USA)中培養(yǎng)。人肺癌細(xì)胞系(A549)在含10%熱滅活FCS、100|ig/ml青霉素和100|ug/ml鏈霉素的MEM中培養(yǎng)。所有細(xì)胞都在37。C、5%C02、濕潤氣氛中生長。#在^|#我'#身建.'將螢火蟲螢光素酶cDNA亞克隆入pcDNAIII表達(dá)質(zhì)粒(含CMV啟動子區(qū)，Invitrogen)的多克隆位點中，以及亞克隆入含PPEl-3x啟動子和腺病毒-5DNA序列部分的pPACPPE-l.plpA中。通過從pPACPPE-l.plpA質(zhì)粒中缺失PPE-1啟動子的第一內(nèi)含子克隆第三種質(zhì)粒。先前已在我們的實驗室中克隆了這3個質(zhì)粒，并用于細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)染。復(fù)#^潛^戎#^謦,將FAS-嵌合體的cDNA亞克隆入pPACPPE-l.plpA和pPACCMV.plpA質(zhì)粒中。這些質(zhì)粒與含大部分腺病毒-5基因組的pJM17共轉(zhuǎn)染，且用磷酸4丐法共轉(zhuǎn)染入293人胚腎細(xì)胞系(ATCC)中。該細(xì)胞系設(shè)計成包含病毒復(fù)制必需^旦不包含在pPAC.plpA或pJM17質(zhì)粒中的El基因。所述質(zhì)粒在所述細(xì)胞中經(jīng)歷同源重組，且約2周后形成重組病毒，并開始復(fù)制且最終引起細(xì)胞裂解。分離病毒集落并增殖，且其確切插入方向通過PCR驗證。復(fù)制缺陷型載體先前通過現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)克隆技術(shù)制備。務(wù)伴復(fù)賴f應(yīng)病^卩a^4Z)」種建.'使用AdEasy法(Stratagene,LaJollaCA)構(gòu)建CRAD。如下修飾含腺病毒-5DNA序列部分的質(zhì)粒PShuttle-MK:由中期因子(Midkine)(mk)啟動子和連續(xù)的腺病毒El區(qū)替代pShuttle(Stmtagene,LaJolla,CA)中的多克隆位點和右臂。之后，以無內(nèi)含子的PPEl-3x替代MK啟動子。通過在所述啟動子和E1之間亞克隆IRES序列(得自pIRES-EYFP質(zhì)粒，BDBiosciences)和FAS-嵌合體cDNA來構(gòu)建第二種質(zhì)粒。IRES允許由相同轉(zhuǎn)錄物翻譯兩種蛋白質(zhì)。所獲得的兩種穿梭物(shuttle)用Pmel消化線性化，且隨后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BJ5183ADEASY-1(Stmtagene)中。該種細(xì)菌已用pADEASY-l質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，所述pADEASY-l質(zhì)粒含除El和E3基因區(qū)以外的大部分腺病毒-5序列。質(zhì)粒在細(xì)菌中經(jīng)歷同源重組(在pShuttle和pADEASY-l之間)，由此生成完整載體基因組。重組體隨后用Pacl消化，并用磷酸《丐法轉(zhuǎn)染入293人胚腎細(xì)胞系(ATCC)中。余下的程序如對復(fù)制缺陷型載體的描述一樣。通過將普通啟動子CMV(巨細(xì)胞病毒)亞克隆在E1基因之前構(gòu)建陽性對照病毒CMV-E1。CMV-E1病毒是遍在性的，且對內(nèi)皮細(xì)胞沒有特異性。按照上述方法構(gòu)建以下的復(fù)制缺陷型載體和CRAD:復(fù)制缺陷型載體PPE-l(3x)-FAS、CMV-FAS、CMV-LUC(LUC-螢火蟲螢光素酶報告基因的縮寫)、PPE-l(3x)-LUC。CRAD:PPE-l(3x)-CRAD、PPE畫l(3x)-Fas-CRAD、CMV-E1。脊^,-發(fā).'BAEC和HeLa細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng)至60-70%匯合。使用0.4pg/孔表達(dá)構(gòu)建體和作為轉(zhuǎn)染效率對照的0.04iug/孔pEGFP-Cl載體(CLONTECH,PaloAlto,CA)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。Lipofectamine和Lipofectamineplus(Invitrogen,Carlsbad,CA)用于轉(zhuǎn)染。于37。C溫育3小時后，用生長培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染混合物。轉(zhuǎn)導(dǎo)實,驗載體(PPE-FAS、CMV-FAS、CMV-LUC、PPE-LUC)用感染生長培養(yǎng)基(含2。/。FCS,而不是正常生長培養(yǎng)基中的10%)稀釋，以達(dá)到10、100、1000、10000的感染復(fù)數(shù)(moi)。感染復(fù)數(shù)根據(jù)每個耙細(xì)胞的病毒數(shù)計算。靶細(xì)胞(BAEC和293)已在轉(zhuǎn)導(dǎo)前24小時接種。在轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)天，用含以所需moi混合在0.1或2ml感染培養(yǎng)基中的病毒的溶液分別替換96孔板或60mm板的細(xì)胞生長培養(yǎng)基。細(xì)胞溫育4小時，接著向轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中加入新鮮培養(yǎng)基。分別由PFU滴定(參見下文)和ApoPercentage試劑盒(AccurateChemical,Westbury,NY)評價載體復(fù)制和凋亡誘導(dǎo)。結(jié)晶紫染色也用于評價附著于板表面的細(xì)胞量，作為細(xì)胞生存力的指示。^/試病#諒產(chǎn)—逸嫂多4卓在溯0tfPFL9:滴定病毒原液并儲存于-80°C。利用感染培養(yǎng)基稀釋的連續(xù)稀度(10-2-10-13)的病毒載體感染293細(xì)胞的分匯合(80%)培養(yǎng)物2小時。2小時后，用PBS洗滌培養(yǎng)基，且替換為瓊脂覆層。在約2周后有明顯噬斑的最高稀度定為以PFU/ml為單位的濃度(PFU—噬斑形成單位)。潛果敘敏辜^差^^這增獲靡病毒復(fù)餘為了檢驗凋亡誘導(dǎo)對病毒復(fù)制的影響，在293(人胚腎)細(xì)胞系中檢驗CMV-FAS復(fù)制。在該細(xì)胞系中，所述病毒可通過FAS-c或因其復(fù)制引起的細(xì)胞裂解誘導(dǎo)凋亡。早期(病毒感染后幾小時)凋亡可能干擾病毒復(fù)制，而晚期凋亡(病毒感染后幾天)可能增強病毒傳播。為了測試CMV-FAS誘導(dǎo)凋亡的能力，轉(zhuǎn)導(dǎo)BAEC,且通過生存力的ELISA-結(jié)晶紫測定來評價細(xì)胞凋亡(圖89)。較高濃度(IOOOOmoi)的CMV-FAS在沒有活化配體(TNF-a)的情況下誘導(dǎo)凋亡，而在4交低濃度時需要加入所述配體來誘導(dǎo)凋亡。通過293細(xì)胞中的嗜斑發(fā)展來測定細(xì)胞至細(xì)胞的CMV-FAS傳播。如按照噬斑發(fā)展速率和噬斑大小所觀察到的(圖88和89),和非凋亡誘導(dǎo)載體CMV-LUC相比，采用CMV-FAS載體時噬斑發(fā)展以較高速率發(fā)生。通過螢光素酶報告基因評價有和沒有內(nèi)含子時PPEl-3x啟動子誘導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄的能力(未顯示)。未觀察到顯著差異。這些結(jié)果表明，通過宿主細(xì)胞的額外凋亡裂解，可增強腺病毒載體的復(fù)制，所述載體例如為上文所述的血管生成性、內(nèi)皮特異性病毒構(gòu)建體AdPPE-1(3x),其攜帶誘導(dǎo)凋亡的"殺傷"基因如FAS。J^GF《這^尸尸五-/(Ox」控翔增強工在必逸歡^新i^多4和存活為了研究處于內(nèi)皮素啟動子控制下的VEGF表達(dá)在體外和體內(nèi)對工程化組織構(gòu)建體的血管形成的作用，用Ad5PPEC-l-3xVEGF感染細(xì)胞，并分析構(gòu)建體，以觀察對血管形成的作用。圖91a表明，用Ad5PPEC-l-3xVEGF感染細(xì)胞對在工程化構(gòu)建體中形成的血管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)目和大小具有誘導(dǎo)作用。構(gòu)建體在培養(yǎng)基有或沒有補加VEGF(50ng/ml)的情況下培養(yǎng)。用Ad5PPEC-l-3xVEGF病毒或?qū)φ誈FP腺病毒感染平行構(gòu)建體(達(dá)4小時)。在培養(yǎng)2周后，對構(gòu)建體進(jìn)行固定、包埋、切片和染色。在加入VEGF至培養(yǎng)基和用Ad5PPEC-l-3xVEGF感染細(xì)胞之間進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)用Ad5PPEC-l-3xVEGF病毒處理的樣品中的血管數(shù)和血管面積百分比增加至4-5倍(圖91a)。在體內(nèi)研究中，使用3種不同模型分析植入物的體內(nèi)存活、分化、整合和血管形成。這些模型包括(i)在SCID小鼠背部皮下植入，(ii)植入棵大鼠四頭肌中，和(iii)用構(gòu)建體替代棵d、鼠前腹肌節(jié)。構(gòu)建體一皮宿主血管滲透。Ad5PPEC-l-3xVEGF病毒感染的構(gòu)建體與對照構(gòu)建體相比顯示出血管結(jié)構(gòu)增加。為評價組織工程化構(gòu)建體的體內(nèi)存活和整合，我們使用基于螢光素酶的成像系統(tǒng)。體內(nèi)成像系統(tǒng)(IVIS)通過檢測由全身施用的螢光素和局部產(chǎn)生的螢光素酶的相互作用產(chǎn)生的光來工作。構(gòu)建體用編碼螢光素酶的腺伴隨病毒(AAV)載體感染48小時，然后移植。接著將構(gòu)建體原位置于棵小鼠的前腹肌壁中。在外科手術(shù)時將AAV-螢光素酶注射入每只小鼠左下肢，以用作陽性對照。外科手術(shù)后3-4周，小鼠接受螢光素，以評價對組織工程化構(gòu)建體的灌注。用Ad5PPEC-l-3xVEGF感染(和之后用AAV-螢光素酶感染)的構(gòu)建體具有比僅用AAV-螢光素酶感染的對照構(gòu)建體高的信號(未顯示結(jié)果)?？傊?，這些結(jié)果提示，用Ad5PPEC-l-3xVEGF體外感染可改善植入的工程化組織構(gòu)建體的存活和血管形成。我i^蘭成'治#謬力活/A/f3;cjj動子許多組織對血管生成阻抑的常見應(yīng)答是響應(yīng)于由控制血管穩(wěn)態(tài)的自身調(diào)節(jié)的自分泌反饋回路產(chǎn)生的復(fù)雜信號傳導(dǎo)上調(diào)內(nèi)源性血管生成途徑(參見Hahn等，AmJMed1993,94:13S-19S,和Schramek等，SenimNephrol1995;15:195-204)。為了確定此機制如何能影響處于PPE-l(3x)啟動子控制下的核酸序列的表達(dá)，在有和沒有施用有效抗血管生成藥物波生坦的情況下，測量用本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因小鼠組織中的體內(nèi)發(fā)光水平，其中所述核酸構(gòu)建體含處于PPE-l(3x)控制下的螢光素酶(LUC)基因[PPE-l(3x)-LUC]。波生坦(TracleerTM)是雙重內(nèi)皮素受體(ETA和ETB)拮抗劑，目前臨床上批準(zhǔn)用于多種適應(yīng)癥，最重要的是肺動月永高血壓和肺纖維^匕。如上文詳述的，通過本領(lǐng)域眾所周知的克隆方法，產(chǎn)生攜帶本發(fā)明的PPE-l(3x)-LUC構(gòu)建體或Harats等人(JClinInvest1995;95:1335-44)詳述的PPE-1-LUC構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因小鼠。用食物飲食或含100mg/kg/天波生坦的食物飲食經(jīng)口飼喂10周齡PPE-l(3x)-Luc或PPE-1-LUC轉(zhuǎn)基因小鼠(每組11=5)達(dá)30天。如在上文的方法部分中所述，在治療最后一日處死小鼠，并取出器官，取出的小鼠器官用于測量發(fā)光強度。圖94顯示了PPE-l(3x)啟動子賦予轉(zhuǎn)基因小鼠中的重組基因以組織特異性超表達(dá)。一般具有較高內(nèi)皮素活性的器官如心臟和主動脈，以及具有程度低一些的內(nèi)皮素活性的器官腦、氣管和肺，與肝或腎相比顯示出增加的發(fā)光強度。但是，在大部分器官中，波生坦施用使發(fā)光強度顯著增強(在心臟組織中最高達(dá)40%)(圖94),由此表明內(nèi)皮素受體拮抗劑，尤其是和一般的血管生成抑制劑一起，可活化本發(fā)明的內(nèi)皮特異性啟動子，并以組織特異性方式誘導(dǎo)處于PPE-l(3x)轉(zhuǎn)錄控制下的轉(zhuǎn)基因表達(dá)進(jìn)一步增強。細(xì)胞內(nèi)前內(nèi)皮素原-1mRNA和循環(huán)內(nèi)皮素-1的水平的測量，表明給表達(dá)在PPE-1啟動子控制下的縈光素酶的轉(zhuǎn)基因小鼠施用內(nèi)皮素受體拮抗劑(例如波生坦)事實上導(dǎo)致增強的組織內(nèi)皮素-1轉(zhuǎn)錄(圖97A)和在血漿中檢測到的增加的免疫反應(yīng)性的內(nèi)皮素-l(圖97B)。為了進(jìn)一步測定在PPE-1啟動子控制下的基因產(chǎn)物的表達(dá)增強的特異性，將雙重內(nèi)皮素拮抗劑波生坦對內(nèi)皮素受體活性的抑制作用與ET-1A(BQ123,Sigma-Aldnch,St.Louis,Missouri,USA)和ET-1B(BQ788,Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)的個別特異性拮抗劑的抑制作用相對比。圖96顯示了用在PPE-1啟動子(上文所述的質(zhì)粒pEL8-LUC)或?qū)φ誗V40啟動子控制下的螢光素酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、隨后用ET-1受體拮抗劑波生坦、BQ123或BQ788處理1小時的牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)培養(yǎng)物中測量的螢光素酶活性，表達(dá)為未處理對照的百分比。用波生坦和BQ788處理測量到在PPE-1啟動子控制下的螢光素酶活性的顯著增加，但是BQ123(ET-U拮抗劑)不然。波生坦和BQ788處理(在linM)導(dǎo)致螢光素酶活性與未處理對照相比分別有1.6和1.3倍增力口(圖96)。在SV40-螢光素酶轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中沒有觀察到顯著增力口(數(shù)據(jù)未顯示)?？傊@些結(jié)果表明，響應(yīng)于ETB阻斷的增加的前內(nèi)皮素原-1mRNA水平由增加的PPE-1啟動子活性介導(dǎo)，這暗示著響應(yīng)于ET-1受體阻斷在PPE-1控制下的基因增強的轉(zhuǎn)錄。此外，可以體外和體內(nèi)檢測增加的PPE-1啟動子活性，分別用于短期和長期處理。如本文所顯示的，PPE-1mRNA水平與表達(dá)在PPE-1啟動子控制下的螢光素酶報告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠的螢光素酶活性相關(guān)。因而，該模型也可以用于評價包括高血壓、癌癥和急性腎衰竭在內(nèi)的不同病理生理學(xué)狀態(tài)中的ET-1表達(dá)。在尸尸E-/卩jc」^動f控教力《3W脊差^不乂^#W如上文所述，同其它長期治療模式一樣，基因治療經(jīng)常伴有針對持續(xù)接觸所表達(dá)的轉(zhuǎn)基因蛋白產(chǎn)生的內(nèi)源性宿主免疫反應(yīng)。轉(zhuǎn)基因蛋白的免疫刺激可引起治療功效降低、炎癥并有時引起嚴(yán)重副作用。為了測試針對使用本發(fā)明的順式反應(yīng)調(diào)節(jié)元件表達(dá)的轉(zhuǎn)基因的宿主免疫應(yīng)答，在具有LLC微轉(zhuǎn)移、并用攜帶Fas-TNF-Rl嵌合體(Ad5PPE-l(3x)Fas-c和Ad5CMVFas-c)或LUC報告基因(Ad5PPE-l(3x)Luc)的載體治療的小鼠(每組6只小鼠)中測定抗腺病毒異己酮和TNF-R1的抗體效價。對照小鼠用鹽水治療。載體以注射之間5天的間隔注射3次。在最后一次載體注射后10天處死小鼠，以使用ELISA測定來測定抗腺病毒和抗人TNF-R1(由所插入的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的蛋白)的抗體水平。出乎意料的是，發(fā)現(xiàn)抗人TNF-R1的抗體水平低于Ad5-PPE(3x)-Fas-c治療小鼠中的檢測水平，而這些水平在非特異性Ad5-CMV-fas載體治療小鼠中相對較高(圖95b)?？瓜俨《井惣和乖目贵w效價在注射不同病毒的組別間是相似的(圖95a)。這些結(jié)果表明，使用本發(fā)明的PPE-l(3x)構(gòu)建體表達(dá)的轉(zhuǎn)基因被宿主免疫系統(tǒng)良好耐受，與系統(tǒng)發(fā)生接近度(phylogeneticproximity)無關(guān)。,滋辨W發(fā)者類/^攀^理f^力^:勿/《吵脊^^W^^:最近已經(jīng)表明，皮質(zhì)類固醇(地塞米松)施用可以預(yù)防一些免疫-和凋亡-有關(guān)的重組腺病毒感染的內(nèi)皮損傷(Murata，等人ArteriosclerThrombVascBiol2005;25:1796-803),從而抑制促炎癥基因表達(dá)和最優(yōu)化體外和體內(nèi)重組基因表達(dá)效率。為了測試皮質(zhì)類固醇是否可以增強內(nèi)皮細(xì)胞中病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，在轉(zhuǎn)染之前，用地塞米松處理用包含螢光素酶報告分子編碼序列或綠色熒光蛋白(GFP)報告分子編碼序列的腺病毒構(gòu)建體轉(zhuǎn)染過的BAEC細(xì)胞。圖98表明，在用表達(dá)在CMV啟動子控制下的螢光素酶的腺病毒(Ad-CMV-LUC)感染之前用3pM地塞米松處理過的BAEC細(xì)胞中按照每pg總蛋白的安光素酶百分比測得的螢光素酶表達(dá)增加至超過3倍。最突出的作用是用1000感染復(fù)數(shù)。圖99解釋了在PPE-1啟動子控制下的有活性的重組綠色焚光蛋白(GFP)在內(nèi)皮BAEC中的表達(dá)，這由皮質(zhì)類固醇-處理的細(xì)胞的增強的綠色指示。因而，皮質(zhì)類固醇可以增強內(nèi)皮細(xì)胞中病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，且可以與本發(fā)明的方法一起使用。要認(rèn)識到的是，為清楚起見而在獨立實施方案背景下描述的本發(fā)明的某些特征也可組合在單一實施方案中提供。相反，為簡短起見而在單一實施方案背景下描述的本發(fā)明的各種特征也可獨立地或以任意合適的子組合方式提供。盡管已結(jié)合本發(fā)明的具體實施方案描述了本發(fā)明，但是顯然許多替代方案、修改和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。因此，本發(fā)明計劃包括屬于所附權(quán)利要求書的精神和寬泛范圍內(nèi)的所有這樣的替代方案、修改和變化。本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請都全文引入到本說明書中作為參考，其程度如同每個單獨的出版物、專利或?qū)＠暾埦唧w而單獨地被指明引入本文中作為參考。另外，本申請中的任何參考文獻(xiàn)的引用或鑒定不應(yīng)解釋為承認(rèn)這樣的參考文獻(xiàn)對于本發(fā)明而言是現(xiàn)有技術(shù)。權(quán)利要求1.一種產(chǎn)品，其包含包裝材料和(a)核酸構(gòu)建體，它包含(i)內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動子；(ii)SEQIDNO5所述低氧反應(yīng)元件的至少一個拷貝；和(iii)編碼血管生成調(diào)節(jié)物的核酸序列，所述核酸序列在所述啟動子和所述低氧反應(yīng)元件的調(diào)節(jié)控制下；和(b)至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述內(nèi)皮特異性啟動子的活性；其中所述包裝材料包括標(biāo)簽或包裝插頁，它們指示所述核酸構(gòu)建體和所述血管生成調(diào)節(jié)劑用于治療受試者中血管生成有關(guān)的疾病或狀況。2.—種產(chǎn)品，其包含包裝材料和(a)核酸構(gòu)建體，它包含(i)內(nèi)皮特異性啟動子；(ii)編碼血管生成調(diào)節(jié)物的核酸序列，所述核酸序列在所述內(nèi)皮特異性啟動子和順式調(diào)節(jié)元件的調(diào)節(jié)控制下，所述順式調(diào)節(jié)元件包含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列；和(b)至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述內(nèi)皮特異性啟動子的活性；其中所述包裝材料包括標(biāo)簽或包裝插頁，它們指示所述核酸構(gòu)建體和所述血管生成調(diào)節(jié)劑用于治療受試者中血管生成有關(guān)的疾病或狀況。3.—種產(chǎn)品，其包含包裝材料和(a)設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞亞群中產(chǎn)生細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含(i)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區(qū)，所述嵌合多肽包含與細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域融合的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(ii)第二多核普酸區(qū)，其編碼在所述血管生成細(xì)胞亞群中指導(dǎo)所述嵌合多肽表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；其中選擇所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使其能與存在于或提供給所述血管生成細(xì)胞亞群的配體結(jié)合，而所述配體與所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活化所述細(xì)胞毒性分子的所述效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域；和(b)至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性；其中所述包裝材料包括標(biāo)簽或包裝插頁，它們指示所述核酸構(gòu)建體和所述血管生成調(diào)節(jié)劑用于治療受試者中與過度血管生成有關(guān)的疾病或狀況。4.一種產(chǎn)品，其包含包裝材料和(a)設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞亞群中產(chǎn)生細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含(i)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區(qū)，所述嵌合多肽包含與細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域融合的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(n)第二多核苷酸區(qū)，其編碼在所述血管生成細(xì)胞亞群中指導(dǎo)所述嵌合多肽表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；其中選擇所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使其能與存在于或提供給所述血管生成細(xì)胞亞群的配體結(jié)合，而所述配體與所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活化所述細(xì)胞毒性分子的所述效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域；和(b)至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性；其中所述包裝材料包括標(biāo)簽或包裝插頁，它們指示所述核酸構(gòu)建體和所述血管生成調(diào)節(jié)劑用于治療受試者中與過度新血管形成有關(guān)的疾病或一犬;兄。5.—種產(chǎn)品，其包含包裝材料和(a)設(shè)計并構(gòu)建用于在肺瘤細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含(i)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區(qū)，所述嵌合多肽包含與細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域融合的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(ii)第二多核苷酸區(qū)，其編碼在所述肺瘤細(xì)胞中指導(dǎo)所述嵌合多肽的表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；其中選擇所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使其能與存在于或提供給所述肺瘤細(xì)胞的配體結(jié)合，而所述配體與所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活化所述細(xì)胞毒性分子的所述效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域；和(b)至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性；其中所述包裝材料包括標(biāo)簽或包裝插頁，它們指示所述核酸構(gòu)建體和所述血管生成調(diào)節(jié)劑用于治療受試者中的腫瘤生長或發(fā)育。6.—種產(chǎn)品，其包含包裝材料和(a)設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞亞群中產(chǎn)生血管生成的核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含(i)編碼促血管生成因子的第一多核苷酸區(qū)；和(H)第二多核苦酸區(qū)，其編碼在所述血管生成細(xì)胞亞群中指導(dǎo)所述促血管生成因子的表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；和(b)至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性；其中所述包裝材料包括標(biāo)簽或包裝插頁，它們指示所述核酸構(gòu)建體和所述血管生成調(diào)節(jié)劑用于治療受試者中局部缺血相關(guān)的疾病或狀況。7.—種產(chǎn)品，其包含包裝材料和(a)設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞中的細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含(i)編碼自殺基因的第一多核普酸區(qū)，和(ii)第二多核苷酸區(qū)，其編碼能夠在所述血管生成細(xì)胞中指導(dǎo)所述自殺基因的表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；和(b)至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性；其中所述包裝材料包括標(biāo)簽或包裝插頁，它們指示所述核酸構(gòu)建體和所述血管生成調(diào)節(jié)劑用于治療受試者中與過度血管生成有關(guān)的疾病或狀況。8.權(quán)利要求1-7中任一項的產(chǎn)品，其中所述核酸構(gòu)建體另外包含條件復(fù)制型腺病毒。9.權(quán)利要求8的產(chǎn)品，另外包含至少一種能增加所迷腺病毒的拷貝數(shù)的化合物。10.權(quán)利要求9的產(chǎn)品，其中所述化合物是皮質(zhì)類固醇和/或N-乙酰半胱氨酸。11.權(quán)利要求1-7中任一項的產(chǎn)品，其中所述血管生成調(diào)節(jié)劑是除了波生坦以外的內(nèi)皮素受體拮抗劑。12.權(quán)利要求11的產(chǎn)品，其中所述內(nèi)皮素受體拮抗劑是雙重A-形式和B-形式內(nèi)皮素受體拮抗劑。13.權(quán)利要求11的產(chǎn)品，其中所述內(nèi)皮素受體拮抗劑是B-形式特異性內(nèi)皮素受體拮抗劑。14.權(quán)利要求13的產(chǎn)品，其中所述B-形式特異性內(nèi)皮素受體拮抗劑選自A192,621;BQ788;Res701-1和Ro46-8443。15.權(quán)利要求2的產(chǎn)品，其中所述核酸序列編碼促血管生成因子，且其中所述疾病或狀況與減少的血管生成有關(guān)。16.權(quán)利要求2的產(chǎn)品，其中所述核酸序列編碼血管生成抑制劑，且其中所述疾病或狀況與過度血管生成有關(guān)。17.權(quán)利要求3-5中任一項的產(chǎn)品，另外包含所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的配體。18.權(quán)利要求3-7中任一項的產(chǎn)品，其中所述順式作用調(diào)節(jié)元件是動子、PPE-l-3x啟動子、TIE-1啟動子、TIE-2啟動子、內(nèi)皮糖蛋白啟動子、vonWillerband啟動子、KDR/flk-l啟動子、FLT-1啟動子、Egr-l啟動子、ICAM-1啟動子、VCAM-1啟動子、PECAM-1啟動子和主動脈羧肽酶樣蛋白(ACLP)啟動子。19.權(quán)利要求6的產(chǎn)品，其中所述局部缺血相關(guān)的疾病或狀況選自傷口愈合、缺血性中風(fēng)、缺血性心臟病和胃腸損害。20.權(quán)利要求7的產(chǎn)品，其中選擇的所述自殺基因能將前藥轉(zhuǎn)化成毒性化合物，后者能造成所述血管生成細(xì)胞的細(xì)胞毒性或凋亡。21.權(quán)利要求7和20中任一項的產(chǎn)品，另外包含前藥，當(dāng)所述前藥被所述自殺基因轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘曰衔飼r，該前藥能造成所述血管生成細(xì)胞的細(xì)胞毒性或凋亡。22.核酸構(gòu)建體用于生產(chǎn)藥物的用途，所述核酸構(gòu)建體包含(a)內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動子；(b)SEQIDNO:5所述低氧反應(yīng)元件的至少一個拷貝；和(c)編碼血管生成調(diào)節(jié)物的核酸序列，所述核酸序列在所述啟動子和所述低氧反應(yīng)元件的調(diào)節(jié)控制下；所述藥物用于治療受試者中血管生成有關(guān)的疾病或狀況，所述受試者用至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑來治療，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述內(nèi)皮特異性啟動子的活性。23.核酸構(gòu)建體用于生產(chǎn)藥物的用途，所述核酸構(gòu)建體包含(a)內(nèi)皮特異性啟動子；(b)編碼血管生成調(diào)節(jié)物的核酸序列，所述核酸序列在所述內(nèi)皮特異性啟動子和順式調(diào)節(jié)元件的調(diào)節(jié)控制下，所述順式調(diào)節(jié)元件包含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列；所述藥物用于治療受試者中血管生成有關(guān)的疾病或狀況，所述受試者用至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑來治療，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述內(nèi)皮特異性啟動子的活性。24.設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞亞群中產(chǎn)生細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體用于生產(chǎn)藥物的用途，所述核酸構(gòu)建體包含(a)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區(qū)，所述嵌合多肽包含與細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域融合的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(b)第二多核苷酸區(qū)，其編碼在所述血管生成細(xì)胞亞群中指導(dǎo)所述嵌合多肽表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；其中選擇所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使其能與存在于或提供給所述血管生成細(xì)胞亞群的配體結(jié)合，而所述配體與所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活化所述細(xì)胞毒性分子的所述效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域；所述藥物用于治療受試者中與過度血管生成有關(guān)的疾病或狀況，所述受試者用至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑來治療，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性。25.設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞亞群中產(chǎn)生細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體用于生產(chǎn)藥物的用途，所述核酸構(gòu)建體包含(a)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區(qū)，所述嵌合多肽包含與細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域融合的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(b)第二多核苷酸區(qū)，其編碼在所述血管生成細(xì)胞亞群中指導(dǎo)所述嵌合多肽表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；其中選擇所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使其能與存在于或提供給所述血管生成細(xì)胞亞群的配體結(jié)合，而所述配體與所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活化所述細(xì)胞毒性分子的所述效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域；所述藥物用于治療受試者中與新血管形成有關(guān)的疾病或狀況，所述受試者用至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑來治療，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性。26.設(shè)計并構(gòu)建用于在腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體用于生產(chǎn)藥物的用途，所述核酸構(gòu)建體包含(a)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區(qū)，所述嵌合多肽包含與細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域融合的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(b)第二多核芬酸區(qū)，其編碼在所述腫瘤細(xì)胞中指導(dǎo)所述嵌合多肽的表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；其中選擇所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使其能與存在于或提供給所述腫瘤細(xì)胞的配體結(jié)合，而所述配體與所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活化所述細(xì)胞毒性分子的所述效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域；所述藥物用于治療受試者中的腫瘤生長或發(fā)育，所述受試者用至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑來治療，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性。27.設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞亞群中產(chǎn)生血管生成的核酸構(gòu)建體用于生產(chǎn)藥物的用途，所述核酸構(gòu)建體包含(a)編碼促血管生成因子的第一多核苷酸區(qū)；和(b)第二多核苷酸區(qū)，其編碼在所述血管生成細(xì)胞亞群中指導(dǎo)所述促血管生成因子的表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；所述藥物用于治療受試者中局部缺血相關(guān)的疾病或狀況，所述受試者用至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑來治療，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性。28.設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞中的細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體用于生產(chǎn)藥物的用途，所述核酸構(gòu)建體包含(a)編碼自殺基因的第一多核普酸區(qū)，和(b)第二多核苷酸區(qū)，其編碼能夠在所述血管生成細(xì)胞中指導(dǎo)所述自殺基因的表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；所述藥物用于治療受試者中與過度血管生成有關(guān)的疾病或狀況，所述受試者用至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑來治療，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性。29.至少一種血管生成調(diào)節(jié)劑用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于治療受試者中血管生成有關(guān)的疾病或狀況，所述受試者用包含下述的核酸構(gòu)建體治療(a)內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動子；(b)SEQIDNO:5所迷低氧反應(yīng)元件的至少一個拷貝；和(c)編碼血管生成調(diào)節(jié)物的核酸序列，所述核酸序列在所述啟動子和所述低氧反應(yīng)元件的調(diào)節(jié)控制下，其中選擇的所述血管生成調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式增強所述內(nèi)皮特異性啟動子的活性。30.至少一種血管生成調(diào)節(jié)劑用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于治療受試者中血管生成有關(guān)的疾病或狀況，所述受試者用包含下述的核酸構(gòu)建體治療(a)內(nèi)皮特異性啟動子；(b)編碼血管生成調(diào)節(jié)物的核酸序列，所述核酸序列在所述內(nèi)皮特異性啟動子和順式調(diào)節(jié)元件的調(diào)節(jié)控制下，所述順式調(diào)節(jié)元件包含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列；其中選擇的所述至少一種血管生成調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述內(nèi)皮特異性啟動子的活性。31.至少一種血管生成調(diào)節(jié)劑用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞亞群中產(chǎn)生細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體來治療，所述核酸構(gòu)建體包含(a)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區(qū)，所述嵌合多肽包含與細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域融合的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(b)第二多核苷酸區(qū)，其編碼在所述血管生成細(xì)胞亞群中指導(dǎo)所述嵌合多肽表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；其中選擇所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使其能與存在于或提供給所述血管生成細(xì)胞亞群的配體結(jié)合，而所述配體與所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活化所述細(xì)胞毒性分子的所述效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域；其中選擇的所述至少一種血管生成調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性。32.至少一種血管生成調(diào)節(jié)劑用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于治療受試者中與新血管形成有關(guān)的疾病或狀況，所述受試者用設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞亞群中產(chǎn)生細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體來治療，所述核酸構(gòu)建體包含(a)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區(qū)，所述嵌合多肽包含與細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域融合的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(b)第二多核苷酸區(qū)，其編碼在所述血管生成細(xì)胞亞群中指導(dǎo)所述嵌合多肽表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；其中選擇所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使其能與存在于或提供給所述血管生成細(xì)力包亞群的配體結(jié)合，而所述配體與所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活化所述細(xì)胞毒性分子的所述效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域；其中選擇的所述至少一種血管生成調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性。33.設(shè)計并構(gòu)建用于在肺瘤細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體用于生產(chǎn)藥物的用途，所述核酸構(gòu)建體包含(a)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區(qū)，所述嵌合多肽包含與細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域融合的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(b)第二多核苷酸區(qū)，其編碼在所述肺瘤細(xì)胞中指導(dǎo)所述嵌合多肽的表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；其中選擇所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使其能與存在于或提供給所述腫瘤細(xì)胞的配體結(jié)合，而所述配體與所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活化所述細(xì)胞毒性分子的所述效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域；所述藥物用于治療受試者中的腫瘤生長或發(fā)育，所述受試者用至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑來治療，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性。34.至少一種血管生成調(diào)節(jié)劑用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于治療受試者中局部缺血相關(guān)的疾病或狀況，所述受試者用設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞亞群中產(chǎn)生血管生成的核酸構(gòu)建體來治療，所述核酸構(gòu)建體包含(a)編碼促血管生成因子的第一多核苷酸區(qū)；和(b)第二多核苷酸區(qū)，其編碼在所述血管生成細(xì)胞亞群中指導(dǎo)所述促血管生成因子的表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；其中選擇的所述至少一種血管生成調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性。35.至少一種血管生成調(diào)節(jié)劑用于生產(chǎn)藥物的用途，所述藥物用于治療受試者中與過度血管生成有關(guān)的疾病或狀況，所述受試者用設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞中的細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體來治療，所述核酸構(gòu)建體包含(a)編碼自殺基因的第一多核苷酸區(qū)，和(b)第二多核苷酸區(qū)，其編碼能夠在所述血管生成細(xì)胞中指導(dǎo)所述自殺基因的表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；其中選擇的所述至少一種血管生成調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性。36.權(quán)利要求22-35中任一項的用途，其中所述核酸構(gòu)建體另外包含條件復(fù)制型腺病毒。37.權(quán)利要求36的用途，另外包含至少一種能增加所述腺病毒的拷貝數(shù)的化合物。38.權(quán)利要求37的用途，其中所述化合物是皮質(zhì)類固醇和/或N-乙酰半胱氨酸。39.權(quán)利要求22-35中任一項的用途，其中所述血管生成調(diào)節(jié)劑是除了波生坦以外的內(nèi)皮素受體拮抗劑。40.權(quán)利要求39的用途，其中所述內(nèi)皮素受體拮抗劑是雙重A-形式和B-形式內(nèi)皮素受體拮抗劑。41.權(quán)利要求39的用途，其中所述內(nèi)皮素受體拮抗劑是B-形式特異性內(nèi)皮素受體拮抗劑。42.權(quán)利要求41的用途，其中所述B-形式特異性內(nèi)皮素受體拮抗劑選自A192,621;BQ788;Res701-1和Ro46-8443。43.^l利要求23和30中任一項的用途，其中所述核酸序列編碼促44.權(quán)利要求23和30中任一項的用途，其中所述核酸序列編碼血管生成抑制劑，且其中所述疾病或狀況與過度血管生成有關(guān)。45.權(quán)利要求24-26和31-33中任一項的用途，另外包含所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的配體。46.權(quán)利要求24-28和31-35中任一項的用途，其中所述順式調(diào)節(jié)PPE-1啟動子、PPE-l-3x啟動子、TIE-]啟動子、TIE-2啟動子、內(nèi)皮糖蛋白啟動子、vonWillebrand啟動子、KDR/flk-l啟動子、FLT-1啟動子、Egr-l啟動子、ICAM-1啟動子、VCAM-1啟動子、PECAM-1啟動子和主動脈羧肽酶樣蛋白(ACLP)啟動子。47.權(quán)利要求27和34中任一項的用途，其中所述局部缺血相關(guān)的疾病或狀況選自傷口愈合、缺血性中風(fēng)、缺血性心臟病和胃腸損害。48.權(quán)利要求28和35中任一項的用途，其中選擇的所述自殺基因能將前藥轉(zhuǎn)化成毒性化合物，后者能造成所述血管生成細(xì)胞的細(xì)胞毒性或凋亡。49.權(quán)利要求28、35和48中任一項的用途，另外包含前藥，當(dāng)所述前藥被所述自殺基因轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘曰衔飼r，該前藥能造成所述血管生成細(xì)胞的細(xì)胞毒性或凋亡。50.調(diào)節(jié)受試者組織中血管生成的方法，該方法包含(a)在組織中表達(dá)核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含(i)內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動子；(ii)SEQIDNO:5所述低氧反應(yīng)元件的至少一個拷貝；和(iii)編碼血管生成調(diào)節(jié)物的核酸序列，所述核酸序列在所述啟動子和所述低氧反應(yīng)元件的調(diào)節(jié)控制下；和(b)施用至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述內(nèi)皮特異性啟動子的活性；從而調(diào)節(jié)所述受試者的所述組織中的血管生成。51.調(diào)節(jié)組織中血管生成的方法，該方法包含(a)在組織中表達(dá)核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含(i)內(nèi)皮特異性啟動子；(ii)編碼血管生成調(diào)節(jié)物的核酸序列，所述核酸序列在順式調(diào)節(jié)元件的調(diào)節(jié)控制下，所述順式調(diào)節(jié)元件包含共價連接至至少部分SEQIDNO:16所示序列的至少部分SEQIDNO:15所示序列；和(b)給組織施用至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述內(nèi)皮特異性啟動子的活性；從而調(diào)節(jié)所述組織中的血管生成。52.下調(diào)受試者的組織中血管生成的方法，該方法包含(a)給受試者施用設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞亞群中產(chǎn)生細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含(i)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區(qū)，所述嵌合多肽包含與細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域融合的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(ii)第二多核苦酸區(qū)，其編碼在所述血管生成細(xì)胞亞群中指導(dǎo)所述嵌合多肽表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；其中選擇所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使其能與存在于或提供給所述血管生成細(xì)胞亞群的配體結(jié)合，而所述配體與所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活化所述細(xì)胞毒性分子的所述效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域；和(b)給受試者施用至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性；由此在所述組織中下調(diào)血管生成。53.治療與過度的新血管形成有關(guān)的疾病或狀況的方法，該方法包含(a)施用治療有效量的設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞亞群中產(chǎn)生細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含(i)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區(qū)，所述嵌合多肽包含與細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域融合的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(ii)第二多核苷酸區(qū)，其編碼在所述血管生成細(xì)胞亞群中指導(dǎo)所述嵌合多肽的表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；其中選擇所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使其能與存在于或提供給所述血管生成細(xì)胞亞群的配體結(jié)合，而所述配體與所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活化所述細(xì)胞毒性分子的所述效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域；和(b)施用至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性，由此在所述組織中下調(diào)血管生成，并治療與過度的新血管形成有關(guān)的疾病或狀況。54.治療受試者的胂瘤的方法，該方法包含(a)給受試者施用治療有效量的設(shè)計并構(gòu)建用于在腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含(i)編碼嵌合多肽的第一多核苷酸區(qū)，所述嵌合多肽包含與細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域融合的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；和(n)第二多核普酸區(qū)，其編碼在所述胂瘤細(xì)胞中指導(dǎo)所述嵌合多肽的表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；其中選擇所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而使其能與存在于或提供給所述述細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域，以由此在所述腫瘤細(xì)胞中指導(dǎo)細(xì)胞毒性；和(b)施用至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性；從而治療所述受試者的腫瘤。55.治療與局部*夾血相關(guān)的疾病或^1犬況的方法，該方法包含(a)給受試者施用治療有效量的設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞亞群中產(chǎn)生血管生成的核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含(i)編碼促血管生成因子的第一多核普酸區(qū)；和(ii)第二多核苦酸區(qū)，其編碼在所述血管生成細(xì)胞亞群中指導(dǎo)所述促血管生成因子的表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；和(b)施用至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性；從而治療所述受試者中所述局部缺血相關(guān)的疾病或狀況，由此上調(diào)所述組織中的血管生成，并治療與局部缺血有關(guān)的疾病或狀況。56.下調(diào)受試者的組織中血管生成的方法，該方法包含(a)在所述組織中表達(dá)設(shè)計并構(gòu)建用于在血管生成細(xì)胞中的細(xì)胞毒性的核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含(i)編碼自殺基因的第一多核苷酸區(qū)，和(ii)第二多核苷酸區(qū)，其編碼能夠在所述血管生成細(xì)胞中指導(dǎo)所述自殺基因的表達(dá)的順式調(diào)節(jié)元件；和(b)給受試者施用至少一種選擇的血管生成調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑能以協(xié)同方式進(jìn)一步增強所述順式調(diào)節(jié)元件的活性；由此下調(diào)所述組織中的血管生成。57.權(quán)利要求50-56中任一項的方法，其中所述核酸構(gòu)建體另外包含條件復(fù)制型腺病毒。58.權(quán)利要求57的方法，另外包含至少一種能增加所述腺病毒的拷貝數(shù)的化合物。59.權(quán)利要求58的方法，其中所述化合物是皮質(zhì)類固醇和/或N-乙酰半胱氨酸。60.權(quán)利要求50-56中任一項的方法，其中所述血管生成調(diào)節(jié)劑是除了波生坦以外的內(nèi)皮素受體拮抗劑。61.權(quán)利要求51的方法，其中所述核酸序列編碼促血管生成因子，且其中所述疾病或狀況與減少的血管生成有關(guān)。62.權(quán)利要求51的方法，其中所述核酸序列編碼血管生成抑制劑，且其中所述疾病或狀況與過度血管生成有關(guān)。63.權(quán)利要求52-54中任一項的方法，另外包含施用所述配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的配體。64.權(quán)利要求56的方法，其中選擇的所述自殺基因能將前藥轉(zhuǎn)化成毒性化合物，后者能造成所述血管生成細(xì)胞的細(xì)胞毒性或凋亡。65.權(quán)利要求56和64中任一項的方法，另外包含前藥，當(dāng)所述前藥被所述自殺基因轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘曰衔飼r，該前藥能造成所述血管生成細(xì)胞的細(xì)胞毒性或凋亡。全文摘要公開了表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動子活性的分離多核苷酸序列、新順式調(diào)節(jié)元件及其使用方法，所述方法使得能夠治療特征為異常新血管形成或細(xì)胞生長的疾病。文檔編號A61K48/00GK101443049SQ200780014285公開日2009年5月27日申請日期2007年2月22日優(yōu)先權(quán)日2006年2月23日發(fā)明者D·哈拉茨,E·布賴特巴特,L·班喬,M·佩萊德,S·格林伯格申請人:脈管生物生長有限公司