一種受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6及其應(yīng)用。本發(fā)明還提供了含有該啟動(dòng)子的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體和宿主菌。利用本發(fā)明的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6驅(qū)動(dòng)抗逆基因表達(dá)，使水稻可以抵抗水淹脅迫正常生長(zhǎng)，適應(yīng)日益惡劣的氣候環(huán)境，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和實(shí)用價(jià)值。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明的啟動(dòng)子在與目標(biāo)基因結(jié)合并轉(zhuǎn)入到水稻植株中之后，在水淹脅迫條件下，水淹3天后即可使目的基因表達(dá)量為淹前的6.5倍，水淹6天后可使目的基因表達(dá)量達(dá)到淹前的14.2倍，進(jìn)而可以很好地證明，本發(fā)明的Psub6啟動(dòng)子具有顯著的受水淹脅迫誘導(dǎo)性狀。
【專利說(shuō)明】
一種受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6及其 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和作物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種受水 淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psube及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是世界上重要的糧食作物之一，近年來(lái)由于氣候的厄爾尼諾現(xiàn)象，使水稻在 生長(zhǎng)階段遭遇干旱或洪澇的極端氣候，嚴(yán)重影響了水稻的產(chǎn)量。通過(guò)植物基因工程的方法 改良農(nóng)作物對(duì)極端氣候的抗性具有重要的應(yīng)用前景。啟動(dòng)子對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控啟示我們通 過(guò)基因工程改變或添加啟動(dòng)子來(lái)激活抗逆基因的表達(dá)，提高農(nóng)作物的抗逆性。
[0003] 植物工程中常用的啟動(dòng)子可分為三類:組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo) 性啟動(dòng)子。常用的CaMV35S啟動(dòng)子就是組成型啟動(dòng)子，能有效驅(qū)動(dòng)抗逆基因在植物各組織中 表達(dá)，增強(qiáng)抗逆性，但在順境中也會(huì)大量表達(dá)抗逆基因，過(guò)量消耗植物能量，降低目標(biāo)基因 的作用效率，甚至可能產(chǎn)生毒害作用。因此，尋求高效、特異的啟動(dòng)子是植物基因工程發(fā)展 的必然方向。
[0004] 誘導(dǎo)啟動(dòng)子是指能夠在某些物理或化學(xué)信號(hào)等的刺激下，顯著地提高轉(zhuǎn)錄活性的 一類啟動(dòng)子。與組成型啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子相比，誘導(dǎo)啟動(dòng)子有著獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：它可 根據(jù)需要在植物特定的發(fā)育階段、組織器官或生長(zhǎng)環(huán)境下，快速誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，適時(shí)地調(diào)控 "開(kāi)"與"關(guān)"。在植物轉(zhuǎn)基因研究中，應(yīng)用誘導(dǎo)啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)在特定環(huán)境下啟動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄， 可有效避免因外源基因不必要表達(dá)造成的物質(zhì)能量浪費(fèi)和對(duì)植物的傷害，也能減少人們對(duì) 轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物長(zhǎng)期存留的擔(dān)心。目前研究較多的有非生物脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子，如光誘導(dǎo)表 達(dá)啟動(dòng)子、溫度誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子和水分誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子，以及生物脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子。隨著轉(zhuǎn) 基因水稻研究的深入，基于轉(zhuǎn)基因水稻產(chǎn)量、品質(zhì)與安全性的多元需求，對(duì)驅(qū)動(dòng)外源基因表 達(dá)的啟動(dòng)子的要求越來(lái)越高。
[0005] 但是，目前對(duì)水淹或漬澇脅迫的啟動(dòng)子的研究并不充分。水稻是一種半水生作物， 對(duì)水分的需求量很大，但正常生長(zhǎng)的水層深度也有一定范圍，長(zhǎng)期沒(méi)頂淹水下不能生存。具 體表現(xiàn)為，水稻在淹水條件下，其有氧呼吸收到抑制，水稻由有氧呼吸轉(zhuǎn)成以生成乙醇的無(wú) 氧酵解途徑，進(jìn)而引發(fā)乙醇、R0S、N0等有害物質(zhì)的生成。同時(shí)，淹水條件下，水稻的光合作用 也受到嚴(yán)重的抑制，這些都影響了水稻的正常生長(zhǎng)，造成減產(chǎn)甚至絕收。
[0006] 而我國(guó)水稻產(chǎn)區(qū)又主要處在長(zhǎng)江淮河流域，經(jīng)常會(huì)有洪澇災(zāi)害的發(fā)生。因此，能夠 開(kāi)發(fā)出在水稻中特異表達(dá)的水淹脅迫啟動(dòng)子具有顯著的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psube及其應(yīng) 用。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性 啟動(dòng)子Psub6，
[0009] 所述受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6的DNA序列包含序列表中SEQ ID NO: 1所示的序列；或者
[0010] 所述受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6的DNA序列為與序列表中SEQ ID NO: 1所不序列具有至少80%序列同一性的序列;或者
[0011] 所述受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6的DNA序列為在序列表SEQ ID NO: 1所示的序列中添加、取代、插入或缺失一個(gè)或一個(gè)以上核苷酸生成的突變體或衍生 物;或者
[0012] 所述受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6的DNA序列具有與SEQ ID NO: 1所示的序列雜交的產(chǎn)物。。
[0013] 序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列為來(lái)源于日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)的序列，本文中稱為Psub6或啟動(dòng)子Psub6。具體而言，本申請(qǐng)的發(fā)明人從日 本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)分離克隆得到了序列表中SEQ ID No: 1所示的 DNA序列，并發(fā)現(xiàn)這段2122bp的DNA序列能夠驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因在受水淹脅迫誘導(dǎo)的情況下表 達(dá)。
[0014] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psube的DNA序列 為SEQ ID No:l所示的序列，即Psub6或啟動(dòng)子Psub6。
[0015] 另一方面，本發(fā)明還提供一種包含上述受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子 Psub6的表達(dá)盒。
[0016] 又一方面，本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含上述的受水 淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6,在所述重組表達(dá)載體中，所述受水淹脅迫誘導(dǎo) 表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6連接于待表達(dá)的基因序列的上游;優(yōu)選地，所述待表達(dá)的基 因?yàn)镚us基因，所述重組表達(dá)載體為pCAMBIA1391-Psub6,該重組表達(dá)載體為將SEQ ID No:l 所示的序列即Psub6或啟動(dòng)子Psub6構(gòu)建于pCAMBIA1391中得到的重組表達(dá)載體，本文中稱 為pCAMBIA1391-Psub6。
[0017] 或者待表達(dá)基因可以為任何對(duì)水稻的抗水淹脅迫具有改善能力的基因。
[0018] 再一方面，本發(fā)明提供上述受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psube在培 育轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用。所述應(yīng)用包括將本發(fā)明提供的上述受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特 異性啟動(dòng)子Psube連接于載體的待表達(dá)的基因序列上游(例如，將所述啟動(dòng)子序列置于/插 入目標(biāo)基因之前），從而構(gòu)建重組表達(dá)載體，將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到作物細(xì)胞、組織或 器官中進(jìn)行培育。
[0019] 再一方面，所述應(yīng)用可以改良作物抗逆性，所述作物為禾谷類作物:水稻、小麥、高 粱、大麥、燕麥、黑麥等;優(yōu)選為水稻。
[0020]綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)、提取并鑒定了日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)中具有轉(zhuǎn)錄活性的2122bp的DNA序列，并將其命名為Psub6(序列表中的SEQ ID No: 1)。具體而言，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該序列具有在受水淹脅迫誘導(dǎo)情況下驅(qū)動(dòng)基因特異性表 達(dá)的能力，因而提取出該序列并對(duì)上述能力進(jìn)行了鑒定。發(fā)明人將該序列經(jīng)酶切后連接到 作物雙元表達(dá)載體PCAMBIA1391上，獲得相應(yīng)的重組質(zhì)粒（即重組表達(dá)載體），利用該重組質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105,然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行水稻的轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基因水 稻植株。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，水淹處理3天后的Psube-GUS植株葉 片中出現(xiàn)明顯的藍(lán)色，代表著Psub6驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因⑶S表達(dá)，而在未處理的Psub6-GUS植株葉 片仍為白色，代表目標(biāo)啟動(dòng)子沒(méi)有表達(dá)。表明Psube啟動(dòng)子活性受水淹脅迫的誘導(dǎo)，是水淹 誘導(dǎo)啟動(dòng)子。通過(guò)定量PCR檢測(cè)報(bào)告基因 GUS的表達(dá)強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，Psub6-GUS植株葉片水淹3天 后GUS表達(dá)量為淹前的6.5倍，水淹6天后為淹前的14.2倍，這個(gè)結(jié)果表明Psub6啟動(dòng)子受水 淹脅迫的顯著誘導(dǎo)。
[0021 ]技術(shù)效果
[0022]本發(fā)明所述的受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6可與作物雙元表達(dá) 載體連接，用于取代組成型啟動(dòng)子。在水稻遭遇洪澇災(zāi)害時(shí)，驅(qū)動(dòng)抗逆基因表達(dá)，保護(hù)水稻 抵抗水淹的逆境脅迫，保障水稻的生產(chǎn)安全，具有重要的理論及實(shí)際意義。
【附圖說(shuō)明】
[0023]以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：
[0024] 圖1為將Psub6啟動(dòng)子構(gòu)建于pCAMBIA1391載體質(zhì)粒中的示意圖，其中圖1中A為 PCAMBIA1391示意圖，B為pCAMBIA1391-Psub6示意圖，其中示出了利用Psub6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)位 于其下游的Gus基因表達(dá)；
[0025]圖2為對(duì)本發(fā)明的啟動(dòng)子進(jìn)行酶切驗(yàn)證的結(jié)果示意圖。
[0026] 圖3為Psub6-GUS植株⑶S染色結(jié)果。水淹處理3天后的Psub6-GUS植株葉片中出現(xiàn) 明顯的藍(lán)色，代表著Psub6驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因⑶S表達(dá)，而在未處理的Psub6-GUS植株葉片仍為白 色，代表目標(biāo)啟動(dòng)子沒(méi)有表達(dá)；因此，本實(shí)驗(yàn)表明，Psub6啟動(dòng)子活性受水淹脅迫的誘導(dǎo)，是 水淹誘導(dǎo)啟動(dòng)子。圖中標(biāo)尺為0.2cm 〇
[0027] 圖4為水淹處理不同天數(shù)的Psub6-GUS植株中⑶S相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。Psub6-GUS植株葉 片水淹3天后GUS表達(dá)量為水淹前的6.5倍，水淹6天后為水淹前的14.2倍，這個(gè)結(jié)果表明 Psub6啟動(dòng)子受水淹脅迫的顯著誘導(dǎo)。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅 用于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0029] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的生 化試劑，載體耗材等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售購(gòu)買產(chǎn)品。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 含有酶切位點(diǎn)的Psub6啟動(dòng)子的獲得 [0032]步驟1、引物的設(shè)計(jì)
[0033] 根據(jù)NCBI中提供的水稻品種日本晴（Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因組 序列，依據(jù)水稻啟動(dòng)子Psube的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，并根據(jù)選用的載體及靶標(biāo)基因的特點(diǎn)， 設(shè)計(jì)引物的酶切位點(diǎn)。
[0034] 本實(shí)施例中以水稻雙元表達(dá)載體pCAMBIAl 391 (圖1中A部分，來(lái)自于CAMBIA，公開(kāi) 使用載體，安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心水稻組保存） 為例，靶標(biāo)基因?yàn)镚us基因，具體設(shè)計(jì)的引物為：正向引物5 '端帶酶切位點(diǎn)Hindi 11 (AAGCTT)，反向引物5'端帶酶切位點(diǎn)EcoRI(GAATTC)，引物序列如下(SEQ ID N0:2-3):
[0035] 正向引物：AAGCTTGGACGACTGCTATTGTTGAGAG HindIII
[0036] 反向引物：GAATTCCATGGTGCTCACTACTCACTCA EcoRI [0037]由深圳華大基因公司合成。
[0038]步驟2、啟動(dòng)子Psub6的獲得
[0039]以水稻品種日本晴DNA為模板，利用正向引物、反向引物擴(kuò)增啟動(dòng)子Psub6,按常規(guī) PCR體系，采用如下擴(kuò)增程序：
[0040] 95 °C 預(yù)變性 5min; 95 °C 變性 30s，58 °C 退火 30s，72 °C 延伸 2min30s，35 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 延伸 lOmin。
[00411回收PCR擴(kuò)增的目的片段，將其連接到PGEM-T-Easy載體(購(gòu)自Promega公司，按載 體說(shuō)明書(shū)中的比例混合)上，按照熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-Blue感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)菌落PCR篩 選獲得陽(yáng)性克隆，挑取單克隆搖菌液提質(zhì)粒，用HindIII和EcoRI進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，目的片段 長(zhǎng)度2122bp，如圖2所示。將經(jīng)過(guò)鑒定的陽(yáng)性克隆送交Invitrogen公司測(cè)序。驗(yàn)證正確的克 隆即為所要獲得的啟動(dòng)子Psub6,其核酸序列如SEQ ID No: 1所示。
[0042]重組表達(dá)載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
[0043]從上面"啟動(dòng)子Psub6的獲得"過(guò)程中獲得的陽(yáng)性克隆中提取質(zhì)粒，用HindII I和 EcoRI雙酶切，回收啟動(dòng)子Psub6片段。同時(shí)利用HindIII和EcoRI對(duì)pCAMBIA1391進(jìn)行線性化 處理、回收PCAMBIA1391，將上述的Psub6片段和pCAMBIA1391片段用T4DNA連接酶（購(gòu)于 TaKaRa公司）進(jìn)行連接，得到啟動(dòng)子Psub6與Gus基因融合的作物表達(dá)載體pCAMBIA1391-Psub6(圖1B)，利用凍融法將作物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心水稻組保存）。
[0044] 利用啟動(dòng)子Psub6驅(qū)動(dòng)Gus報(bào)告基因在水稻中表達(dá)
[0045] 步驟1:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化
[0046] 將成熟水稻種子去掉穎殼后，用70%酒精浸泡種子lmin，倒掉酒精。用含有1滴 Tween 20的50%次氯酸鈉(原液有效氯濃度大于4% )溶液浸泡種子40min(150r/min)。倒掉 次氯酸鈉，無(wú)菌水洗5遍至溶液澄清，無(wú)次氯酸鈉味道。無(wú)菌水浸泡種子過(guò)夜。用解剖刀沿種 子的糊粉層將胚剝下，將胚接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。30°C下暗培養(yǎng)11天后將愈傷組織與 胚乳及胚芽分離，將去芽的狀態(tài)良好、分裂旺盛的初級(jí)愈傷組織進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)3~5天后用于 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。
[0047] 采用上述"重組表達(dá)載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化"過(guò)程中轉(zhuǎn)入了重組表達(dá)載體的 根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，該遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化子篩選及轉(zhuǎn)基因植株再生等參 照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al. An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(0ryza sativa L.) [J] .Plant Cell Report，2012.D0I 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。獲得 Psub6-GUS株系植株。
[0048] 步驟2、水淹脅迫實(shí)驗(yàn)
[0049] 1 · Psub6_GUS 株系 GUS 染色
[0050] 將Psube-GUS株系種子消毒后，于無(wú)菌條件下在浸潤(rùn)有超純水的濾紙上萌發(fā)，注意 超純水不要沒(méi)過(guò)種子。在萌發(fā)5天后，將材料按數(shù)量均分為兩份，其中一份繼續(xù)在濾紙上有 氧萌發(fā)3天作為對(duì)照；另一份置于IOcm深無(wú)菌水底部，在28°C，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗條件 下水淹處理3天。剪取對(duì)照和水淹處理材料的葉片，用于⑶S組織化學(xué)染色，參照J(rèn)efferson (Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J] .EMBO J.，1987,6:3901_3907)等提出的方法。 將需要染色的組織抽真空，然后浸入染色液中，在⑶S染液中染色0.5小時(shí)后，即可觀察結(jié)果 (見(jiàn)圖3)。水淹處理3天后的Psub6-GUS植株葉片中出現(xiàn)明顯的藍(lán)色，代表著Psub6驅(qū)動(dòng)報(bào)告 基因 GUS表達(dá)，而在未處理的Psub6-GUS植株葉片仍為白色，代表目標(biāo)啟動(dòng)子沒(méi)有表達(dá)；因 此，本實(shí)驗(yàn)表明，Psub6啟動(dòng)子活性受水淹脅迫的誘導(dǎo)，是水淹誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
[0051 ] 2 · Psub6-GUS株系⑶S定量分析
[0052]取萌發(fā)后21天的水稻植株，將全株完全置于水面下進(jìn)行水淹處理。分別在水淹前 (0天），淹后3天和6天剪取葉片材料，通過(guò)定量PCR檢測(cè)報(bào)告基因⑶S的表達(dá)強(qiáng)度。RT-PCR采 用天根生化科技有限公司的SuperReal熒光定量預(yù)混液試劑盒（TIANGEN SYBR Green， FP205)。以水稻ACTIN基因作為內(nèi)參基因?qū)λ肦NA模板量進(jìn)行定量。每個(gè)基因做3次重復(fù)。 本實(shí)驗(yàn)用到的基因的定量引物為(SEQ ID NO 4-7):
[0053] ACTIN-FP:5 '-CCTGACGGAGCGTGGTTAC-3'，
[0054] ACTIN-RP:5 '-CCAGGGCGATGTAGGAAAGC-3 '
[0055] 用于ACTIN的擴(kuò)增；
[0056] Gus-FP:5 '-TACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCA-3 '
[0057] Gus-RP:5 '-CAGGTGTTCGGCGTGGTGTAGAG-3 '
[0058] 用于⑶S的擴(kuò)增。
[0059] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4，？8仙6-61^植株葉片水淹3天后^3表達(dá)量為淹前的6.5倍，水淹6 天后為淹前的14.2倍，這個(gè)結(jié)果表明Psub6啟動(dòng)子受水淹脅迫的顯著誘導(dǎo)。
[0060] 以上對(duì)本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本 發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6,其特征在于，所述啟動(dòng)子 Psub6能夠驅(qū)動(dòng)目的基因在水淹脅迫條件下誘導(dǎo)表達(dá)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6,其特征在 于， 所述受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6的DNA序列為序列表中SEQ ID NO: 1所示的序列;或者 所述受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6的DNA序列為與序列表中SEQ ID NO: 1所不序列具有至少80%序列同一性的序列;或者 所述受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6的DNA序列為在序列表SEQ ID NO: 1所示的序列中添加、取代、插入或缺失一個(gè)或一個(gè)以上核苷酸生成的突變體或衍生物； 或者 所述受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6的DNA序列具有與SEQ ID N0:1所 示的序列雜交的產(chǎn)物。3. -種表達(dá)盒，其特征在于，所述表達(dá)盒包含權(quán)利要求2所述的受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的 水稻特異性啟動(dòng)子Psub6。4. 一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體包含權(quán)利要求2所述的受水淹脅 迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6,在所述重組表達(dá)載體中，所述受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá) 的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6連接于載體中待表達(dá)的基因序列的上游。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體為 pCAMBIA1391-Psub6,其中pCAMBIA1391為作物雙元表達(dá)載體，所述待表達(dá)的基因?yàn)镚us基 因；或者所述待表達(dá)的基因是抗逆境脅迫基因。6. -種根據(jù)權(quán)利要求2所述的受水淹脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6在培育 轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括:將權(quán)利要求2所述的受水淹脅迫誘導(dǎo)表 達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6連接于載體中待表達(dá)的基因序列上游，從而構(gòu)建重組表達(dá)載 體;將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到作物細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育，進(jìn)而獲得相應(yīng)轉(zhuǎn)基因植 株。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用用于改良作物抗逆性，所述作物 為禾谷類作物:水稻、小麥、高粱、大麥、燕麥或黑麥。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，在對(duì)所述重組表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，所采 用的轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括： A) 、以水稻品種日本晴DNA為模板，利用正向引物、反向引物擴(kuò)增所述受水淹脅迫誘導(dǎo) 表達(dá)的水稻特異性啟動(dòng)子Psub6; B) 、將所擴(kuò)增的目的片段與待表達(dá)的基因相連，進(jìn)而獲得相應(yīng)重組表達(dá)載體； C) 、利用凍融法將所獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中； D) 、通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法利用所獲得的根癌農(nóng)桿菌對(duì)水稻愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化； E) 、利用轉(zhuǎn)化后的水稻愈傷組織培育相應(yīng)的水稻植株。
【文檔編號(hào)】C12N15/84GK105861507SQ201610389753
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】秦瑞英, 楊劍波, 李 浩, 李娟 , 魏鵬程, 楊亞春, 李莉, 許蓉芳
【申請(qǐng)人】安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所