專利名稱：異檸檬酸測定試劑(盒)及異檸檬酸濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種異檸檬酸測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定異檸檬酸濃度
的方法，屬于食品檢驗測定技術領域。
背景技術：
異擰檬酸isocitric acid是擰檬酸的異構(gòu)體，雖然量少，但廣泛存在于生物界。 在落地生根屬(Bryophyllum)等多汁植物的葉、或懸鉤子類中特別多，生物能夠利用的是D 型。是三羧酸循環(huán)中的一個成分。檸檬酸在鳥頭酸酶的作用下可逆地生成異檸檬酸和順鳥 頭酸。在異檸檬酸脫氫酶(EC 1. 1. 1.41 ;EC 1. 1. 1.42)的作用下變成a-酮戊二酸，在異 檸檬酸裂合酶(isocitrate lyase, EC4. 1. 3. 1)的作用下變成琥珀酸與乙醛酸。
中華人民共和國國家標準，GB T16771-1997，規(guī)定了橙、柑、桔汁及其飲料中D_異 檸檬酸的測定方法_紫外分光光度法。該方法適用于判定橙、柑、桔濃縮汁和果汁，以及果 汁含量不低于2. 5%的橙、柑、桔汁飲料的總D-異檸檬酸的測定。其測定原理異檸檬酸脫 氫酶isocitrate dehydrogenase有兩種類型以NAD為輔酶的酶(EC1. 1. 1. 41)和要NADP 為輔酶的酶(EC1. 1. 1.42)，兩者催化同一反應。
異檸檬酸+ NAD(P)+鋒oc-酮戊二酸+ C02 + NAP(P)H + 在異檸檬酸脫氫酶催化下，樣品中的D-異檸檬酸鹽與NAD或NADP作用，生成NADH 或NADPH的含量，相當于D-異檸檬酸鹽的量。在波長340nm處測定吸光度，確定樣品中總 D-異檸檬酸的含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出 一 種利用酶倍增法(Enzymatic DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法 (CoupleReaction)技術，計量/連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處 吸光度的變化，得以測定異檸檬酸濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的異 檸檬酸測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析 儀上進行異檸檬酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發(fā)明異檸檬酸濃度測定方法如下 異檸檬酸+輔酶異檸檬酸脫氡酶二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶
二氧化碳+過氧化氫+乙酰輔酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+輔酶A
+氧 輔酶A+谷胱甘肽+輔酶輔酶A-谷胱甘肽還原酶輔酶A-谷胱甘肽
+還原型輔酶 這種方法應用異擰檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase ;EC 1.1.1.41; EC1. 1. 1. 42)酶(偶)聯(lián)丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase ;EC 1. 2. 3. 6)、輔酶A_谷胱甘肽還原酶(CoA-glutathione reductase ;EC 1. 8. 1. 10)酶促反應比色終點法。異檸檬酸脫 氫酶酶解異檸檬酸反應產(chǎn)生二氧化碳，再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸氧化酶、輔酶A-谷胱甘肽 還原酶的作用，最終二次將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm 處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過測量340nm處 吸光度上升的程度，可以測算異檸檬酸的濃度大小。 實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單 劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明異檸檬酸測定試劑(盒)較為理想緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 500mmol/L輔酶 3mmol/L異檸檬酸脫氫酶 10000U/L丙酮酸氧化酶 12000U/L輔酶A-谷胱甘肽還原酶 12000U/L乙酰輔酶A 7mmol/L過氧化氫 12mmol/L谷胱甘肽 3mmol/L本發(fā)明的異檸檬酸測定試劑(盒)可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-谷胱甘肽還原酶、
乙酰輔酶A、過氧化氫、谷胱甘肽。
試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑試劑l緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酰輔酶A、過氧化氫、谷胱甘肽。試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-谷胱甘肽還原酶。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-谷胱甘肽還原酶、乙酰輔酶A、過氧
化氫、谷胱甘肽在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑試劑l緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酰輔酶A、過氧化氫、谷胱甘肽。試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、輔酶A-谷胱甘肽還原酶。試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-谷胱甘肽還原酶、乙酰輔酶A、過氧
化氫、谷胱甘肽在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定異檸檬酸濃度的方法，其輔酶可以是 NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一 本實施例的異檸檬酸測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
輔酶 3mmol/L
異檸檬酸脫氫酶 10000U/L
丙酮酸氧化酶 12000U/L
輔酶A-谷胱甘肽還原酶 12000U/L
乙酰輔酶A 7mmol/L
過氧化氫 12mmol/L
谷胱甘肽 3mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復溶后使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間10分鐘，起始吸光度《0. l，測 試主波長340nm，測試副波長405nm，被測異檸檬酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方 向為正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。實施例二本實施例的異檸檬酸測定試劑為雙試劑，包括
試劑l三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L穩(wěn)定劑50mmol/L輔酶3mmol/L乙酰輔酶A7mmol/L過氧化氫12mmol/L谷胱甘肽3mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L穩(wěn)定劑50mmol/L異檸檬酸脫氫酶10000U/L丙酮酸氧化酶12000U/L輔酶A-谷胱甘肽還原酶12000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時間10分鐘，起始吸光度《0. 1，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測異檸檬酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為
2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。 實施例三
本實施例的異檸檬酸測定試劑為三試劑，包括 試劑l

















三(羧甲基)氨基甲烷-
穩(wěn)定劑
輔酶
乙酰輔酶A 過氧化氫 谷胱甘肽 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷-穩(wěn)定劑
丙酮酸氧化酶
輔酶A-谷胱甘肽還原酶
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷-穩(wěn)定劑
異檸檬酸脫氫酶
鹽酸緩沖液lOOmmol, 50mmol/L 3mmol/L 7mmol/L 12mmol/L 3mmol/L
鹽酸緩沖液lOOmmol, 500,1/L 12000U/L 12000U/L
鹽酸緩沖液lOOmmol,
500,1/L
10000U/L
1
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定異檸檬酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，
起始吸光度《0. 1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測異檸檬酸樣品與試劑1、試劑 2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約0分鐘左 右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的程度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。 申請人:經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本發(fā)明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0009 ;吸光度時間反應曲線應呈上 升曲線直至終點；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達20mmol/L ;試劑測試的不準確 度，其相對偏差不超過±3% ;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑 的靈敏度可達O. 024±0. 012 AA/mmol/L ;試劑在2-8"下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本 發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應用。
權(quán)利要求
一種酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法的異檸檬酸的濃度測定方法，其方法如下異檸檬酸+輔酶 異檸檬酸脫氫酶 二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶二氧化碳+過氧化氫+乙酰輔酶A 丙酮酸氧化酶 丙酮酸+輔酶A+氧輔酶A+谷胱甘肽+輔酶 輔酶A-谷胱甘肽還原酶 輔酶A-谷胱甘肽 +還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度，測算出異檸檬酸的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種異檸檬酸測定試劑(盒)，主要成分包括試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會反應作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-谷胱甘肽還原酶、乙酰輔酶A、過氧化氫、谷胱甘肽組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-谷胱甘肽還原酶、乙酰輔酶A、過氧化氫、谷胱甘肽組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酰輔酶A、過氧化氫、谷胱甘肽組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-谷胱甘肽還原酶組成。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-谷胱甘肽還原酶、乙酰輔酶A、過氧化氫、谷胱甘肽在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-谷胱甘肽還原酶、乙酰輔酶A、過氧化氫、谷胱甘肽組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酰輔酶A、過氧化氫、谷胱甘肽組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、輔酶A-谷胱甘肽還原酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、異檸檬酸脫氫酶組成。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-谷胱甘肽還原酶、乙酰輔酶A、過氧化氫、谷胱甘肽在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述異檸檬酸測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑+氧輔酶A+谷胱甘肽+輔酶輔酶A-谷胱甘肽還原酶輔酶A-谷胱甘肽+還原型輔酶緩沖液穩(wěn)定劑輔酶異檸檬酸脫氫酶丙酮酸氧化酶輔酶A-谷胱甘肽還原酶乙酰輔酶A過氧化氫谷胱甘肽l-4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(A,niaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術的異檸檬酸測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定異檸檬酸濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于食品檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、乙酰輔酶A、過氧化氫、谷胱甘肽、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A-谷胱甘肽還原酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。
文檔編號C12Q1/32GK101793705SQ20091002821
公開日2010年8月4日 申請日期2009年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月4日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司