專利名稱：氯化鋰誘變赤靈芝原生質(zhì)體選育高產(chǎn)胞外多糖菌株的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靈芝多糖的制備方法，具體是涉及一種氯化鋰誘變赤靈芝原 生質(zhì)體選育高產(chǎn)胞外多糖菌株的制備方法，屬遺傳技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前在食用菌的培育、開(kāi)發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，食用菌的品種繁多，品質(zhì)各異，赤靈 芝多糖是赤靈芝中最具開(kāi)發(fā)價(jià)值的有效成分，具有提高肌體耐缺氧能力、清除自 由基、提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤等廣泛的藥理活性。但是赤靈芝多糖產(chǎn)率普遍不 高且難以工業(yè)化生產(chǎn)。而原生質(zhì)體誘變技術(shù)是一種行之有效的微生物育種新方 法。2001年李剛等采用紫外誘變靈芝原生質(zhì)體，選育出了兩株高產(chǎn)胞內(nèi)多糖的 菌株，其多糖含量比原始菌株分別提高了 39.29%和26.92%， 3噸規(guī)模的中試試 驗(yàn)多糖含量比原始菌株提高了 10.15%。目前原生質(zhì)體誘變基本采用物理紫外誘 變，獲得誘變菌株活性物質(zhì)產(chǎn)量較低，誘變效果較差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種氯化鋰誘變赤靈 芝原生質(zhì)體選育高產(chǎn)胞外多糖菌株的制備方法，它以赤靈芝為菌種，經(jīng)馬鈴薯葡 萄糖瓊脂培養(yǎng)基活化、淀粉液體搖瓶培養(yǎng)后，利用溶壁酶、蝸牛酶和纖維素酶水 解赤靈芝菌絲體，在恒溫下振蕩，制備赤靈芝原生質(zhì)體。經(jīng)氯化鋰誘變后，胞外 多糖含量比原始菌株提高了 8 10倍。誘變菌株經(jīng)過(guò)傳代后，胞外多糖含量比原 發(fā)菌株提高了6 8倍，且遺傳性狀較穩(wěn)定，該誘變菌株可用于工業(yè)化生產(chǎn)靈芝多 糖。
本發(fā)明是以如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種氯化鋰誘變赤靈芝原生質(zhì)體選育高產(chǎn) 胞外多糖菌株的制備方法，其特征是它以赤靈芝為菌種，經(jīng)馬鈴薯葡萄糖瓊脂 培養(yǎng)基活化、淀粉液體搖瓶培養(yǎng)后，利用復(fù)合酶液水解靈芝菌絲體，在28 32。C 下振蕩1.5~4h，制備原生質(zhì)體，采用0.02°/。~0.3%濃度的氯化鋰作為誘變劑，加 入到再生培養(yǎng)基中，誘變靈芝原生質(zhì)體，經(jīng)再生培養(yǎng)、搖瓶深層發(fā)酵獲得胞外多 糖發(fā)酵液，用醇沉法提取多糖，苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。
所述的一種氯化鋰誘變赤靈芝原生質(zhì)體選育高產(chǎn)胞外多糖菌株的制備方法， 其特征是它以赤靈芝為菌種，經(jīng)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基活化、淀粉液體搖瓶
3培養(yǎng)后，利用復(fù)合酶液水解靈芝菌絲體，所述復(fù)合酶液為溶壁酶、蝸牛酶和纖維 素酶。
一種制備權(quán)利要求1所述的氯化鋰誘變赤靈芝原生質(zhì)體選育高產(chǎn)胞外多糖 菌株的方法，其特征是按如下步驟進(jìn)行
(1) 菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基上活化1~2次，取菌塊接
種于搖瓶可溶性淀粉液體培養(yǎng)基中，27 29'C進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)4 5天。
(2) 取液體培養(yǎng)的菌絲，過(guò)濾收集菌絲球，用無(wú)菌水沖洗2 3次，再用甘 露醇沖洗2 3次，轉(zhuǎn)入巰基乙醇中，恒溫?fù)u床振蕩30-60min，過(guò)濾收集菌絲球， 用甘露醇沖洗2 3次，離心分離取沉淀為菌絲體，取菌絲體以1:10 20的比例加 入復(fù)合酶液，恒溫下振蕩酶解2~4h，過(guò)濾后濾液于500 1000r/min離心3~5min， 取上清液于3000~4000 r/min,離心5 10min，沉淀即為原生質(zhì)體，用甘露醇沖 洗并用甘露醇把原生質(zhì)體稀釋10倍。
(3) 將0.02%~0.3%濃度的氯化鋰添加到再生培養(yǎng)基中，取稀釋后的原生質(zhì) 體涂布在再生培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)6 8天。
(4) 將再生菌落接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，恒溫下培養(yǎng)6~7天得 第一代誘變菌株，將其接種新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，恒溫下培養(yǎng)6 7天得 第二代誘變菌株，并接種新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，恒溫下培養(yǎng)得第三代誘 變菌株，接種第二代、第三代菌塊于搖瓶可溶性淀粉液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培 養(yǎng)。
(5) 取發(fā)酵液過(guò)濾后離心取上清液，80~90 "C水浴濃縮成原體積的0.2~0.25 倍，加入4~5倍體積95%乙醇，4。C靜置，濃縮液離心，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀兩 次，烘干至恒重，得胞外粗多糖。
(6) 將粗多糖稀釋10~1000倍，測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出多糖含量。
(7) 誘變菌株放置石蠟油或砂土管中，4'C保存，每一年傳代一次。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是采用該技術(shù)所獲得的赤靈芝誘變菌株通過(guò)深層發(fā)酵后在培 養(yǎng)、i中生產(chǎn)胞外多糖，經(jīng)提取、分離后可作為醫(yī)藥產(chǎn)品及食品添加劑，廣泛應(yīng)用 于醫(yī)療工業(yè)和食品工業(yè)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明 實(shí)施例1、
赤靈芝菌株在28'C下保溫培養(yǎng)活化菌種7天，取活化后的菌塊接種于三角
瓶的淀粉液體培養(yǎng)基中，28T:溫度下在搖床上培養(yǎng)5天，過(guò)濾收集菌絲體，用甘 露醇沖洗后，轉(zhuǎn)入0.3%巰基乙醇中，振蕩40min,過(guò)濾收集菌絲體，用甘露醇 沖洗過(guò)濾，1200r/min離心8min。取0.5g菌絲體以1:15的比例加入復(fù)合酶液， 在28'C下振蕩酶解菌絲體3h，濾液用1000r/min離心3min， 2次。上清液采用 3000r/min離心10min制得原生質(zhì)體。采用0.02%的氯化鋰添加到再生培養(yǎng)基中， 取原生質(zhì)體'lml涂布在再生培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)7天。取活化后的菌塊接種于三 角瓶可溶性淀粉液體培養(yǎng)基中，置于28'C搖床培養(yǎng)5天。發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾后離心， 取上清液在8(TC水浴中濃縮至原體積的0.2倍，加入4倍體積95%乙醇，4'C靜 置12h，然后4500r/min離心5min，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀2次，70'C烘干至恒重， 得胞外粗多糖。采用苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量。誘變菌株胞外多糖含量比原始菌 株提高9倍，經(jīng)傳代后多糖含量仍能提高7倍。 實(shí)施例2、
在27'C下活化赤靈芝菌株，接種活化后的菌塊于250ml搖瓶中，27'C搖床 培養(yǎng)5天。過(guò)濾收集菌絲體，用無(wú)菌水、甘露醇沖洗，轉(zhuǎn)入0.2%巰基乙醇中， 搖床振蕩30min，溫度28°C，過(guò)濾收集菌絲體，甘露醇沖洗過(guò)濾，菌絲體用 1500r/min離心10min分離菌絲體。取lg菌絲體以1:20的比例加入復(fù)合酶液(溶 壁酶+蝸牛酶+纖維素酶)，在30。C下振蕩酶解4h，濾液用600r/min離心5min， 2 次。上清液用4000r/min離心5min得原生質(zhì)體。將0.2%濃度的氯化鋰添加到再 生培養(yǎng)基中，取原生質(zhì)體1.5ml涂布在再生培養(yǎng)基上，27'C培養(yǎng)6天。將活化后 的菌塊接種于250ml搖瓶可溶性淀粉液體培養(yǎng)基中，置27'C搖床培養(yǎng)5天。發(fā) 酵液用無(wú)菌紗布過(guò)濾，濾液在4000r/min離心10min，取上清液，卯'C水浴濃縮 成原體積的0,25倍，加入5倍體積95%乙醇，4'C過(guò)夜。離心后用無(wú)水乙醇洗滌 沉淀2次，60。C真空干燥后稱重，得胞外粗多糖，測(cè)定誘變株胞外多糖含量比原 始菌株提高10倍。實(shí)施例3、
在29'C下活化赤靈芝菌株7天，將活化后的菌塊接種于150ml搖瓶的可溶 性淀粉液體培養(yǎng)基中，29。C搖床培養(yǎng)4天。過(guò)濾收集菌絲體，用Tris緩沖液和甘 露醇溶液沖洗，轉(zhuǎn)入0.2%巰基乙醇中，搖床振蕩60min,溫度28。C，過(guò)濾收集 菌絲體，Tris緩沖液沖洗，菌絲體用1000r/min離心5min。取lg菌絲體以l:10 的比例加入復(fù)合酶液，32。C下振蕩酶解2h，無(wú)菌紗布過(guò)濾，濾液用600 r/min離 心5min， 2次，上清液用3500r/min，離心10min得原生質(zhì)體。將0.04%濃度的 氯化鋰添加到再生培養(yǎng)基中，取原生質(zhì)體2ml涂布于再生培養(yǎng)基上，29'C培養(yǎng)6 天，將活化菌株取小塊接種于250ml搖瓶80ml可溶性淀粉液體培養(yǎng)基中，置于 29。C搖床培養(yǎng)5天。發(fā)酵液過(guò)濾后用4800r/min離心5min，取上清液，90'C水浴 濃縮成原體積的0.2倍，加入4倍體積95%乙醇，4。C靜置12h以上。濃縮液 4000r/min離心10min，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀2次，70。C真空干燥、恒重，得胞 外粗多糖。按苯酚硫酸法測(cè)定胞外多糖含量，誘變菌株傳代3代后，多糖含量比 原始菌株提高6倍。誘變菌株用石蠟油斜面保存。
權(quán)利要求
1、一種氯化鋰誘變赤靈芝原生質(zhì)體選育高產(chǎn)胞外多糖菌株的制備方法，其特征是它以赤靈芝為菌種，經(jīng)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基活化、淀粉液體搖瓶培養(yǎng)后，利用復(fù)合酶液水解靈芝菌絲體，在28～32℃下振蕩1.5～4h，制備原生質(zhì)體，采用0.02％～0.3％濃度的氯化鋰作為誘變劑，加入到再生培養(yǎng)基中，誘變靈芝原生質(zhì)體，經(jīng)再生培養(yǎng)、搖瓶深層發(fā)酵獲得胞外多糖發(fā)酵液，用醇沉法提取多糖，苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種氯化鋰誘變赤靈芝原生質(zhì)體選育高產(chǎn)胞外多 糖菌株的制備方法，其特征是它以赤靈芝為菌種，經(jīng)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 活化、.淀粉液體搖瓶培養(yǎng)后，利用復(fù)合酶液水解靈芝菌絲體，所述復(fù)合酶液為溶 壁酶、蝸牛酶和纖維素酶。 —
3、 一種制備權(quán)利要求1所述的氯化鋰誘變赤靈芝原生質(zhì)體選育高產(chǎn)胞外多糖菌株的方法，其特征是按如下步驟進(jìn)行(1) 菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基上活化1 2次，取菌塊接種于搖瓶可溶性淀粉液體培養(yǎng)基中，27 29'C進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)4 5天。(2) 取液體培養(yǎng)的菌絲，過(guò)濾收集菌絲球，用無(wú)菌水沖洗2 3次，再用甘 露醇沖洗2 3次，轉(zhuǎn)入巰基乙醇中，恒溫?fù)u床振蕩30 60min，過(guò)濾收集菌絲球， 用甘露醇沖洗2 3次，離心分離取沉淀為菌絲體，取菌絲體以1:10 20的比例加 入復(fù)合酶液，恒溫下振蕩酶解2 4h，過(guò)濾后濾液于500~1000r/min離心3 5min， 取上清液于3000^4000 r/min,離心5~10 min，沉淀即為原生質(zhì)體，用甘露醇沖 洗并用甘露醇把原生質(zhì)體稀釋10倍。(3) 將0.02%~0.3%濃度的氯化鋰添加到再生培養(yǎng)基中，取稀釋后的原生質(zhì) 體涂布在再生培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)6 8天。(4) 將再生菌落接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，恒溫下培養(yǎng)6 7天得 第一代誘變菌株，將其接種新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，恒溫下培養(yǎng)6 7天得 第二代誘變菌株，并接種新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，恒溫下培養(yǎng)得第三代誘 變菌株，接種第二代、第三代菌塊于搖瓶可溶性淀粉液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培 養(yǎng)。(5) 取發(fā)酵液過(guò)濾后離心取上清液，80 90 。C水浴濃縮成原體積的0.2 0.25 倍，加入4~5倍體積95%乙醇，4。C靜置，濃縮液離心，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀兩 次，烘干至恒重，得胞外粗多糖。 '(6) 將粗多糖稀釋10 1000倍，測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出多糖含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種靈芝多糖的制備方法，具體是涉及一種氯化鋰誘變赤靈芝原生質(zhì)體選育高產(chǎn)胞外多糖菌株的制備方法，屬遺傳技術(shù)領(lǐng)域。它以赤靈芝為菌種，經(jīng)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基活化、淀粉液體搖瓶培養(yǎng)后，利用溶壁酶、蝸牛酶和纖維素酶水解赤靈芝菌絲體，在恒溫下振蕩，制備赤靈芝原生質(zhì)體。經(jīng)氯化鋰誘變后，胞外多糖含量比原始菌株提高了8～10倍。誘變菌株經(jīng)過(guò)傳代后，胞外多糖含量比原發(fā)菌株提高了6～8倍，且遺傳性狀較穩(wěn)定，該工程菌株可用于工業(yè)化生產(chǎn)靈芝多糖。
文檔編號(hào)C12R1/645GK101586101SQ200910032188
公開(kāi)日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2009年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月10日
發(fā)明者劉全德, 呂兆啟, 曹澤虹, 苗敬芝, 董玉瑋, 高明俠 申請(qǐng)人:徐州工程學(xué)院