本發(fā)明涉及植物病理學(xué)技術(shù)。具體是一種避免污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
稻曲病是水稻上的重要病害，可給水稻生產(chǎn)造成重大損失。該病害由稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)侵染造成。分生孢子是稻曲病菌的無性繁殖體，在稻曲病的病害循環(huán)和病害流行中發(fā)揮重大作用。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，分生孢子也是稻曲病研究不可缺少的材料。有關(guān)孢子的形成發(fā)育生理、對不良環(huán)境的生存適應(yīng)性或抵抗性，孢子與寄主的識別互作反應(yīng)等研究，都需要使用孢子形態(tài)的材料；新型防治藥物研發(fā)方面的有關(guān)研究，如藥劑對孢子的致毒效應(yīng)等，也需要孢子；分子生物學(xué)領(lǐng)域的有關(guān)研究，如致病相關(guān)基因的誘變、定位與克隆等；也離不開孢子；可見，分生孢子是稻曲病日常研究的重要的菌體形態(tài)。而且在許多工作中，往往要求研究所用的分生孢子純凈無污染。
稻曲病菌可形成兩種形態(tài)的分生孢子，一種為厚壁分生孢子，另一種為薄壁分生孢子。在實(shí)驗(yàn)室工作中，由于培養(yǎng)制備厚壁分生孢子存在較大的技術(shù)困難，因而多使用其薄壁分生孢子，后文的“分生孢子”或“孢子”均指稻曲病菌的薄壁分生孢子。
長期以來，文獻(xiàn)公開的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)方法，主要是液體培養(yǎng)方法，該方法的主要技術(shù)步驟是，先培養(yǎng)準(zhǔn)備稻曲病菌的菌絲體，再將菌絲體移植入液體培養(yǎng)基進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)，直至獲得孢子；該培養(yǎng)方法可以獲得大量的分生孢子，不過，實(shí)踐工作中也發(fā)現(xiàn)一些不足，如耗時較長，整個過程一般需要15天以上；培養(yǎng)產(chǎn)物混合液中包含有大量的培養(yǎng)基組分、菌體代謝產(chǎn)物和菌絲團(tuán)等；培養(yǎng)工作需要振蕩培養(yǎng)設(shè)備；由于該孢子較小且培養(yǎng)產(chǎn)物呈粘稠狀態(tài)，要沉淀獲得較為單純的孢子液，往往需要高速離心機(jī)設(shè)備。
隨著研究探索的進(jìn)展，最近已經(jīng)建立了稻曲病菌薄壁分生孢子的固體培養(yǎng)方法，即用培養(yǎng)皿作培養(yǎng)器具，用瓊脂固體培養(yǎng)基培養(yǎng)制備孢子。該方法可彌補(bǔ)上述液體培養(yǎng)方法的一些不足，不過又出現(xiàn)另一弊病，就是緣于培養(yǎng)皿的結(jié)構(gòu)特性，制備培養(yǎng)的孢子成品容易被污染。
一般實(shí)驗(yàn)室使用的培養(yǎng)皿由皿底和皿蓋組成，限于當(dāng)前培養(yǎng)皿的制作工藝技術(shù)，皿底與皿蓋間很難達(dá)到均勻貼合的程度，大多數(shù)培養(yǎng)皿的皿底與皿蓋間存在較大縫隙，培養(yǎng)皿內(nèi)外的空氣流動可暢通無阻。因此，利用普通培養(yǎng)皿制備培養(yǎng)的分生孢子產(chǎn)物容易受外界污染空氣的干擾，容易得到帶有雜菌污染的孢子成品。尤其是一般的植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，當(dāng)前均偏好于配置具有降溫/升溫功能的培養(yǎng)箱，該類培養(yǎng)箱通常為了實(shí)現(xiàn)工作室內(nèi)快速恒溫及溫度均勻分布狀態(tài)，往往將工作室設(shè)計(jì)為循環(huán)空氣的模式。利用這類培養(yǎng)箱進(jìn)行的產(chǎn)孢培養(yǎng)，培養(yǎng)皿周圍空氣處于常流動狀態(tài)，造成培養(yǎng)皿內(nèi)材料污染的機(jī)率相當(dāng)高，通常培養(yǎng)5天可造成50％以上的培養(yǎng)平板被雜菌污染，即使一些培養(yǎng)平板上看不到明顯的青霉菌等污染菌的菌落，但肉眼看不到的污染機(jī)率仍然較大。因此，利用培養(yǎng)皿制備培養(yǎng)稻曲病菌分生孢子，在技術(shù)上很難排除污染的可能。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種避免污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：
一種避免污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)方法，制備培養(yǎng)方法的步驟如下：
1.采用普通三角瓶作制備培養(yǎng)孢子的器具，將三角瓶潔凈備用。
2.基底培養(yǎng)基的制備及空白三角瓶的滅菌
按配比為：馬鈴薯100g、瓊脂20g、水900mL，制備基底培養(yǎng)基，并分裝入步驟1準(zhǔn)備的三角瓶；另取步驟1準(zhǔn)備的三角瓶直接套瓶塞成空白三角瓶；然后把基底培養(yǎng)基與空白三角瓶一起進(jìn)行常規(guī)高壓高溫滅菌，備用。
3.核糖的非高溫滅菌
按配比為：核糖10g、水100mL，用清水將核糖配成核糖溶液，在無菌條件下用細(xì)菌過濾器將該核糖溶液進(jìn)行過濾滅菌，備用。
4.馬鈴薯核糖瓶式培養(yǎng)基的配備
將步驟2制備的基底培養(yǎng)基加熱熔化，水浴平衡至60℃，同時將步驟3過濾滅菌的核糖溶液在水浴中平衡至60℃，然后將二者同時轉(zhuǎn)移到超凈工作臺無菌環(huán)境中，按體積比例：基底培養(yǎng)基/核糖溶液＝9/1，將基底培養(yǎng)基與核糖溶液混合，形成實(shí)際配比為：馬鈴薯100g、核糖10g、瓊脂20g、水1000mL的馬鈴薯核糖培養(yǎng)基，混合搖動均勻后，分裝入步驟2準(zhǔn)備的滅菌空白三角瓶，形成瓶式產(chǎn)孢培養(yǎng)基。
5.母代稻曲病菌的移植
以實(shí)驗(yàn)室已有的稻曲病菌分生孢子液作母代菌體，用移液器將該母代孢子液移植入步驟4制備的瓶式產(chǎn)孢培養(yǎng)基，并使孢子液在培養(yǎng)基面上分散均勻。
6.產(chǎn)孢培養(yǎng)
將步驟5操作完備后的瓶式產(chǎn)孢培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入溫度為28℃的普通培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
7.新一代孢子的收集
通常步驟6培養(yǎng)5天后，培養(yǎng)基面上已形成大量的微小菌落，菌落上形成大量的分生孢子；用無菌水洗脫菌落上的孢子，并集中到滅菌容器內(nèi)，即獲得無雜菌污染的較高質(zhì)量的稻曲病菌薄壁分生孢子液。
本發(fā)明的特色與優(yōu)點(diǎn)是：
1)三角瓶配上常規(guī)瓶塞后，能阻隔普通微生物的通過，很好地保護(hù)三角瓶內(nèi)不受雜菌污染，因而能高效避免污染，獲得高質(zhì)量的孢子成品。
2)無需振蕩培養(yǎng)設(shè)備，獲得的分生孢子液成品含菌絲體、培養(yǎng)基、及菌體代謝外泌產(chǎn)物等較少。
3)制備進(jìn)程快速、效率高，稻曲病菌不僅產(chǎn)孢量大，而且產(chǎn)孢菌落沒有形成大量茂密的氣生菌絲。
4)三角瓶的保護(hù)可使得產(chǎn)孢菌落能隨意放置一段時間而不受污染，并保持產(chǎn)孢狀態(tài)，便于與需要孢子的工作程序銜接。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)是三角瓶與馬鈴薯核糖瓊脂培養(yǎng)基的結(jié)合與應(yīng)用。
三角瓶雖然屬植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室的日常器具，但其常規(guī)用途主要是裝盛培養(yǎng)基滅菌；也常見用于裝盛液體培養(yǎng)基、或植物組織類培養(yǎng)基(如籽粒、秸桿等)進(jìn)行病原菌培養(yǎng)。
瓊脂類培養(yǎng)基的應(yīng)用，現(xiàn)有的技術(shù)規(guī)范都是使用培養(yǎng)皿作培養(yǎng)器具，將瓊脂培養(yǎng)基加熱熔化后，倒入培養(yǎng)皿制成培養(yǎng)基平板，并在該培養(yǎng)平板上培養(yǎng)病原菌。
稻曲病菌分生孢子在瓊脂培養(yǎng)基上的制備培養(yǎng)，均為應(yīng)用常規(guī)的技術(shù)規(guī)范，即利用培養(yǎng)皿結(jié)合瓊脂類培養(yǎng)基的培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行制備培養(yǎng)；至今還未見有利用三角瓶作培養(yǎng)器具，在瓊脂類培養(yǎng)基上進(jìn)行稻曲病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)的孢子制備技術(shù)?？赡茉蚴菍ε囵B(yǎng)皿的長期依賴及習(xí)慣沿用，以及通常認(rèn)為病原菌產(chǎn)孢需要通氣性良好的環(huán)境條件，而培養(yǎng)皿恰好能滿足良好的通氣性。
普通三角瓶套上瓶塞后，雖然形成通氣性較差的封閉環(huán)境，但發(fā)明人反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，稻曲病菌能在該較為封閉的環(huán)境內(nèi)的馬鈴薯核糖瓊脂培養(yǎng)基上形成分生孢子；而三角瓶的應(yīng)用，則正好解決應(yīng)用培養(yǎng)皿容易導(dǎo)致污染的重大技術(shù)問題。
馬鈴薯核糖培養(yǎng)基一般很少用于病原菌的常規(guī)培養(yǎng)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該培養(yǎng)基經(jīng)過常規(guī)高壓高溫滅菌后，抑制稻曲病菌的生長發(fā)育，但用不經(jīng)過高溫處理的核糖配制的培養(yǎng)基，卻促進(jìn)稻曲病菌的薄壁分生孢子形成；稻曲病菌在馬鈴薯核糖培養(yǎng)基上不僅產(chǎn)孢量大，而且菌落沒有形成大量茂密的氣生菌絲。本發(fā)明采用馬鈴薯核糖培養(yǎng)基制備稻曲病菌薄壁分生孢子，該培養(yǎng)基配比為：馬鈴薯100g，核糖10g，瓊脂20g，水1000mL。
馬鈴薯核糖培養(yǎng)基除開組分核糖外，剩下的組分是馬鈴薯瓊脂，該馬鈴薯瓊脂組分提供凝固特性和基本營養(yǎng)，本發(fā)明將其稱為“基底培養(yǎng)基”。由于核糖不能高溫滅菌，因而馬鈴薯核糖培養(yǎng)基的滅菌需要兩種滅菌技術(shù)的合成，即先用高壓高溫滅菌方法將基底培養(yǎng)基滅菌，并用非高溫滅菌方法將核糖滅菌，再將已滅菌的二者在非高溫條件下混合而成。
基底培養(yǎng)基與核糖液的混合無需特定的比例，但需要兼顧瓊脂的凝固性和核糖溶液的過濾操作性，經(jīng)測試比較，以體積混合比例為：基底培養(yǎng)基/核糖溶液組分＝9/1，為較適宜的混合比例。按這個混合比例，基底培養(yǎng)基的配比應(yīng)為：馬鈴薯100g、瓊脂20g、水900mL；而核糖溶液的配比應(yīng)為：核糖10g、水100mL。
實(shí)際工作中，由于基底培養(yǎng)基滅菌冷卻后變成固體，不能任意量取，因而需要在滅菌前定量裝瓶；每瓶定量裝入90mL(或135mL)的基底培養(yǎng)基，使用時加入10mL(或15mL)的核糖溶液，這樣的混合方式，操作起來較為簡單便捷。
使用時，取已滅菌的基底培養(yǎng)基加熱熔化，并置于水浴鍋內(nèi)平衡至60℃，同時把已滅菌的核糖溶液也平衡至60℃，取核糖溶液15mL加入一瓶135mL基底培養(yǎng)基中混合，即獲得配比為：馬鈴薯100g，核糖10g，瓊脂20g，水1000mL的馬鈴薯核糖培養(yǎng)基，混合均勻后分裝到已滅菌的空白三角瓶(規(guī)格250mL)，每瓶裝20～30mL，即成為本發(fā)明的瓶式產(chǎn)孢培養(yǎng)基。
需要特別說明，在母代稻曲病菌的移植步驟中，稻曲病菌菌絲體不適合用作本發(fā)明移植入瓶式培養(yǎng)基的母代菌體，移植用的母代菌體必需使用稻曲病菌孢子本身；這母代孢子液可來源于常規(guī)液體培養(yǎng)方法培養(yǎng)所得，也可來源于本發(fā)明方法培養(yǎng)所得，母代孢子液的孢子量通常無需準(zhǔn)確定量，一般孢子濃度為106個/mL的孢子液，移植20～50μL到一個三角瓶式培養(yǎng)基上，能滿足正常制備培養(yǎng)新一代孢子的菌體量要求。將母代孢子植入三角瓶式培養(yǎng)基后，可用滅菌T形玻棒等工具輕輕抹動，使孢子液在三角瓶式培養(yǎng)基面上分散均勻。
產(chǎn)孢培養(yǎng)可在普通培養(yǎng)箱內(nèi)實(shí)施，溫度控制在稻曲病菌生長的適宜溫度，本發(fā)明培養(yǎng)溫度采用28℃；培養(yǎng)過程對光照條件和濕度條件無特別需求。
通常產(chǎn)孢制備培養(yǎng)5天后，三角瓶內(nèi)的培養(yǎng)基面上已均勻形成大量的微小菌落，菌落上已形成大量的分生孢子。
在收集制備培養(yǎng)獲得的新一代分生孢子操作中，可采用光滑的T形玻棒或滅菌小毛刷刷洗菌落，使孢子釋放到洗孢液中；由于產(chǎn)孢菌落很小以及新一代孢子處于堆積密集狀態(tài)，用小毛刷刷洗孢子的洗脫效率更高。
實(shí)施例1
應(yīng)用本發(fā)明一種避免污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)方法，制備培養(yǎng)稻曲病菌菌株Uv-111的分生孢子，按如下步驟實(shí)施操作：
1.采用250mL普通三角瓶作制備培養(yǎng)孢子的器具，將三角瓶潔凈備用。
2.基底培養(yǎng)基的制備及空白三角瓶的滅菌
按配比為：馬鈴薯100g、瓊脂20g、水900mL，制備基底培養(yǎng)基，并分裝入步驟1準(zhǔn)備的三角瓶，每瓶裝135mL；另取步驟1準(zhǔn)備的三角瓶直接套瓶塞成空白三角瓶；把基底培養(yǎng)基與空白三角瓶一起進(jìn)行常規(guī)高壓高溫滅菌，備用。
3.核糖的非高溫滅菌
按配比為：核糖10g、水100mL，用清水將核糖配成核糖溶液，在無菌條件下用細(xì)菌過濾器將該核糖溶液進(jìn)行過濾滅菌，備用。
4.馬鈴薯核糖瓶式培養(yǎng)基的配備
將步驟2制備的基底培養(yǎng)基加熱熔化，水浴平衡至60℃，同時將步驟3過濾滅菌的核糖溶液在水浴中平衡至60℃，然后將二者同時轉(zhuǎn)移到超凈工作臺無菌環(huán)境中，取核糖溶液15mL與一瓶基底培養(yǎng)基混合，形成實(shí)際配比為：馬鈴薯100g、核糖10g、瓊脂20g、水1000mL的馬鈴薯核糖培養(yǎng)基，混合搖動均勻后，分裝入步驟2準(zhǔn)備的滅菌空白三角瓶，每瓶裝30mL，形成瓶式產(chǎn)孢培養(yǎng)基。
5.母代稻曲病菌的移植
以實(shí)驗(yàn)室已有的稻曲病菌菌株Uv-111分生孢子液作母代菌體，用移液器將該母代孢子液50μL移植入步驟4制備的瓶式產(chǎn)孢培養(yǎng)基，并用滅菌T形玻棒輕輕抹動，使孢子液在培養(yǎng)基面上分散均勻。
6.產(chǎn)孢培養(yǎng)
將步驟5操作完備后的瓶式產(chǎn)孢培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入溫度為28℃的普通培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
7.新一代孢子的收集
步驟6培養(yǎng)5天后，培養(yǎng)基面上形成大量的微小菌落，菌落上形成大量的分生孢子；用無菌水15mL洗脫一瓶菌落上的孢子，可獲得孢子濃度為21.47×106個/mL，無雜菌污染的分生孢子液。
實(shí)施例2
應(yīng)用本發(fā)明一種避免污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)方法，制備培養(yǎng)稻曲病菌菌株Uv-110分生孢子，按實(shí)施例1的步驟1至步驟7操作實(shí)施，不同的只是步驟5的菌株是Uv-110；結(jié)果用無菌水15mL洗脫一瓶菌落上的孢子，可獲得孢子濃度為5.74×106個/mL，無雜菌污染的分生孢子液。
實(shí)施例3
應(yīng)用本發(fā)明一種避免污染的稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)方法，制備培養(yǎng)稻曲病菌菌株Uv-105分生孢子，按實(shí)施例1的步驟1至步驟7操作實(shí)施，不同的只是步驟5的菌株是Uv-105；結(jié)果用無菌水15mL洗脫一瓶菌落上的孢子，可獲得孢子濃度為4.55×106個/mL，無雜菌污染的分生孢子液。