一種快速分離蘋果果肉單細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明一種快速分離蘋果果肉單細胞的方法，屬于細胞分離技術(shù)領(lǐng)域。所述方法包括將蘋果果肉切成薄片的步驟，還包括將果肉薄片放置于含0.1％(W/V)離析酶的CPW溶液中，在黑暗條件下酶解0.5h的步驟。本發(fā)明具有使用的試劑簡單、過程方便并且得到的單細胞多且完整的優(yōu)點并且確立了一種快速分離蘋果果肉細胞的方法以及所采用的酶液組成以及酶解條件的優(yōu)點。
【專利說明】
一種快速分離蘋果果肉單細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于細胞分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速分離蘋果果肉單細胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單個活體細胞是生命活動的基本單元和進化的基本單位，對單個活體細胞的識 另IJ、分選及分析，能夠解析生命體系最"深"層次的異質(zhì)性和運作機制。同時，因其不依賴于 細胞的培養(yǎng)和擴增，單細胞技術(shù)在生物發(fā)育、生物能源、氣候變化、疾病診斷、食品安全、農(nóng) 業(yè)生態(tài)等領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。
[0003] 分離植物精細胞用于離體培養(yǎng)，可以為通過離體有性繁殖途徑進行植物品種改良 打下基礎(chǔ);分離保衛(wèi)細胞原生質(zhì)體，使研究保衛(wèi)細胞本身的生理生化特性及其與氣孔功能 的關(guān)系成為可能；分離維管束組織和韌皮部組織細胞，可以進行組織特異表達基因的鑒定 (Van Beijnum,Rousch et al.2008)。利用棉纖維單細胞研究細胞壁和纖維素的形成過程， 能幫助人們更好地提高棉纖維的質(zhì)量(Haigler,Betancur et al.2012)。
[0004] 目前，研究基因表達都是一群細胞的基因表達，這種表達實際上每個細胞特異表 達的平均情況，但是單個細胞的基因表達分析能夠提供隱藏在群體細胞中單個細胞發(fā)育的 新機理（Narsinh, Ning et al. 2011 ;Bloch and Yalovsky 2013)。細胞膜上有各種離子通 道如鈣離子通道、鉀離子通道及鈉離子通道等，這些通道調(diào)節(jié)離子進出，利用膜片鉗技術(shù)可 研究單個細胞的離子通道的特性等，從而深入地研究生物體信號傳導(dǎo)、細胞滲透壓、細胞營 養(yǎng)及抗逆性等各種生理機制。李樂功等利用膜片鉗等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了控制K +通道的流向轉(zhuǎn)換 機制，揭開了使同一離子通道的離子流向發(fā)生逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵因素(Li,Liu et al.2008)。果實 的發(fā)育過程就是果肉細胞發(fā)育的過程，決定著果實的硬度、甜度、營養(yǎng)物質(zhì)的含量等，與果 實貯藏時間長短、病害發(fā)生等都有關(guān)系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 因此研究分離有活性果肉單細胞是研究蘋果果實發(fā)育的基礎(chǔ)，本發(fā)明的目的在于 公開了一種快速分離蘋果果肉單細胞的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0007] -種快速分離蘋果果肉單細胞的方法，包括將蘋果果肉切成薄片的步驟，其中，所 述快速分離蘋果果肉單細胞的方法還包括將果肉薄片放置于含0.1 % (W/V)離析酶的CPW溶 液中，在黑暗條件下酶解〇.5h的步驟。
[0008] 上述技術(shù)方案所述的一種快速分離蘋果果肉單細胞的方法，其中，所述CPW溶液的 組成成分為l〇l.〇mg/L KN03,27.2mg/L KH2P〇4,246.0mg/L MgSO4 ·7Η2〇，1480.0π^/? CaCl2 · 2H2〇,0.16mg/L KI，0.025mg/L CuSO4 · 5H2〇,0.4mol/L甘露醇，4°C低溫保存?zhèn)溆谩?br>[0009] 上述技術(shù)方案所述的一種快速分離蘋果果肉單細胞的方法，其中，含0.1 % (W/V) 離析酶的CPW是通過將離析酶溶于CPW溶液中制備而成。
[0010] 上述技術(shù)方案所述的一種快速分離蘋果果肉單細胞的方法，其中，所述在黑暗條 件下的酶解溫度為27°C。
[0011] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0012] 1、本發(fā)明確立了一種快速分離蘋果果肉細胞的方法并確立了所采用的酶液組成 以及酶解條件。
[0013] 2、采用本發(fā)明的方法，使用的試劑簡單、過程方便并且得到的單細胞多且完整。
【附圖說明】：
[0014] 圖1為用VBL檢測細胞壁完整性和用FDA檢測細胞活性的結(jié)果圖，其中：圖IA為未分 離的細胞，經(jīng)Π )Α染色；（暗場）；圖IB: VBL檢測細胞的完整性；（暗場）；圖IC:酶解0.5h，獲得 完整單細胞;圖ID: FDA染色檢測細胞的活性(暗場）。
【具體實施方式】：
[0015] 為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗例對本發(fā)明一種快速分離蘋 果果肉單細胞的方法作進一步的說明。
[0016] 實施例1: 一種快速分離蘋果果肉單細胞的方法:
[0017] -、材料與方法：
[0018] 1 · 1材料:從青島農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)實習(xí)基地，取成熟富士(Malus Xdomestica Borkh. 'Fuji'）蘋果，貯藏于4°C備用。
[0019] 1.2器材與試劑：
[0020] 熒光顯微鏡(LEICA，DM2500,德國），勻漿機，低速離心機，恒溫搖床，磁力攪拌器。
[0021] 1.3試驗方法：
[0022] 1.3.1單細胞分離：
[0023] 配制CPW溶液（張寧，李威et al.2015)，101.0mg/L KN03,27.2mg/L KH2P〇4， 246 · Omg/L MgS〇4 · 7H20,1480.Omg/L CaCl2 · 2H20,0.16mg/L KI，0.025mg/L CuS〇4 · 5H20， 0.4mol/L甘露醇，4°C低溫保存?zhèn)溆?。纖維素酶，果膠酶和離析酶分別按照表1中的濃度溶于 CPW溶液中，如離析酶(Macerozyme R-10)溶于CPW溶液中，濃度是0.1% (W/V:質(zhì)量與體積 比）。
[0024] 表1酶液組成(W/V)
[0026] 將蘋果表皮以下的果肉用手術(shù)刀切成邊長0.5cm的小方塊，再徒手切成薄片。將切 好的蘋果薄片分別置于50ml的溶有I、Π 和ΙΠ 酶液組成的CPW溶液中（酶液的組成見表1 )，于 70r/min搖床中在27°C、黑暗條件振蕩酶解0.5h、Ih和2h。
[0027] 靜置后，用CPW溶液清洗3次，以洗去酶液，再移到50ml燒杯，在磁力攪拌器上攪拌 Ih后，在顯微鏡上檢測，比較各個酶液在不同處理時間的獲取單細胞結(jié)果。
[0028] 1.3.2采用VBL檢測細胞壁完整性：
[0029] VBL與植物細胞壁中的纖維素有強烈的親和力，在紫外光下，產(chǎn)生熒光，利用這個 特性，常被用于檢測細胞的完整性(Huang and Yan 1980)。
[0030] 米用黃祥輝和顏季瓊的方法，配制￥131^(4,4'-13丨8(4-&11；[1;[110-6-117(11'(?5^1:1171-amine-S-triazin-2-yIamino)-2，2'-stilbene disulfonic acid)細胞壁染色液(Huang and Yan 1980)。先配制0.5mol/L甘露醇，調(diào)pH為7.0(Tris)。再用甘露醇溶液配制VBL，使 VBL終濃度為0.1 %。避光，4 °C備用。
[0031] 染色步驟:第一步，吸取Iml細胞懸浮液到1.5ml離心管，吸取IOyL，滴加于載玻片 上，在顯微鏡下觀察。第二步，吸取400yL細胞懸浮液至新的離心管，加20yL上述0.1 %的 VBL，避光，染色5min。第三步，染色后，用CPW重復(fù)漂洗三次，以除去背景中的熒光。第四步， 漂洗后，懸浮于CPW中，避光，焚光顯微鏡下觀察。VBL的激發(fā)波長為345nm，發(fā)射波長為 430nm。
[0032] 1.3.3?0六檢測細胞活性：
[0033] FDA是一種非熒光的化合物，滲入活細胞后才釋放出熒光素，在藍色光激發(fā)下顯示 出綠色熒光(張先杰and李鐸2000)。
[0034] FDA常用于動植物細胞生活力的鑒定的染料（Yang 1986;Boyd，Cholewa et al. 2008)，當(dāng)活細胞具有完整細胞膜時，細胞內(nèi)Π )Α經(jīng)水解產(chǎn)生的熒光素在胞內(nèi)積累，在藍 光下產(chǎn)生綠色熒光，而死細胞，細胞膜使去了選擇透性，熒光素?zé)o法在胞內(nèi)積累，而不產(chǎn)生 焚光（Saruyama,Sakakura et al. 2013) 〇
[0035] 配制5ml 5mg/L Π )Α:先配0.65m〇VL的甘露醇，再稱取25mg雙醋酸熒光素 Π )Α，溶 于Iml丙酮，完全溶解之后，再加入上述甘露醇溶液4ml。避光，4 °C保存。取細胞懸浮液0.5ml 于1.5ml離心管，加入Π )Α染色液，使其終濃度為0.01 %，室溫下靜置5min，熒光顯微鏡下觀 察，F(xiàn)DA的最大激發(fā)波長為493nm，發(fā)射波長為510nm。發(fā)綠色熒光的為活細胞，不發(fā)熒光的為 死細胞。
[0036] 2 結(jié)果：
[0037] 不同酶液組合、酶解時間對蘋果果肉單細胞分離的影響見表2所示：
[0038] 表2不同酶液組合、酶解時間對蘋果果肉單細胞分離的影響
[0040]用0.1 % (W/V:質(zhì)量與體積比）離析酶分離蘋果果肉細胞，酶解時間為0.5h，得到11 個/IOyL單細胞，而且?guī)缀鯖]有碎片。
[0041 ]用VBL檢測細胞壁完整性和用FDA檢測細胞活性的結(jié)果見圖1所示，其中：圖IA為未 分離的細胞，經(jīng)FDA染色成為綠色，說明果肉細胞具有活性；（暗場）；圖IB: VBL檢測細胞的完 整性；（暗場）；圖IC:酶解0.5h，獲得完整單細胞;圖ID:FDA染色檢測細胞的活性(暗場）。 [0042]分離蘋果果肉單細胞過程中，在沒有酶的情況下，不能分離出果肉單細胞，用FDA 染色液染色，能夠看到堆疊的有活性的細胞群（圖1A);當(dāng)酶液中含有0.1 %纖維素酶或 0.05 %果膠酶時，獲得單細胞少，有大量碎片存在，如表2中酶液I和酶液Π ，但是當(dāng)酶液中 只含有0.1 %離析酶時，處理時間只有0.5h時，單細胞產(chǎn)量多且完整（圖1C)，當(dāng)處理時間是 Ih和2h時，雖有較多的單細胞，但是碎片較多，因此，酶液m是分離果肉單細胞的最佳酶液， 適宜酶解時間為〇. 5h(表2)。
[0043]離析酶分離得到的蘋果果肉單細胞經(jīng)VBL染色后，細胞周圍有明顯的熒光（圖IB)， 這個結(jié)果說明，經(jīng)離析酶處理果肉可以獲得完整的果肉單細胞。
[0044] 分離得到的單細胞經(jīng)FDA染色五分鐘后，細胞內(nèi)充滿了熒光物質(zhì)（圖ID )，這個結(jié)果 表明，分離得到的果肉單細胞具有活性。
[0045] 以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上和實質(zhì)上的限 制，凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用以上所揭示的技 術(shù)內(nèi)容，而作出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實施例；同時，凡依 據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)對以上實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本 發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種快速分離蘋果果肉單細胞的方法，包括將蘋果果肉切成薄片的步驟，其特征在 于:所述快速分離蘋果果肉單細胞的方法還包括將果肉薄片放置于含0.1 % (w/ν)離析酶的 CPW溶液中，在黑暗條件下酶解0.5h的步驟。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速分離蘋果果肉單細胞的方法，其特征在于:所述CPW 溶液的組成成分為l〇l.〇mg/L KN03,27.2mg/L KH2P〇4,246.0mg/L MgS〇4.7H20，1480.0mg/L CaCl2 · 2H20,0.16mg/L KI，0.025mg/L CuS〇4 · 5H20,0.4mol/L甘露醇，4°C低溫保存?zhèn)溆谩?. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速分離蘋果果肉單細胞的方法，其特征在于:含0.1 % (W/V)離析酶的CPW是通過將離析酶溶于CPW溶液中制備而成。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速分離蘋果果肉單細胞的方法，其特征在于:所述在黑 暗條件下的酶解溫度為27°C。
【文檔編號】C12N5/04GK105861413SQ201610392631
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月6日
【發(fā)明人】屈海泳, 劉珅坤, 王永章, 管押琴, 邢文曦, 劉成連
【申請人】青島農(nóng)業(yè)大學(xué), 山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院