專利名稱：一種添加海藻糖強(qiáng)化2-酮基-l-古龍酸生產(chǎn)強(qiáng)度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種添加海藻糖強(qiáng)化2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，屬于發(fā)酵制備維生 素C技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
維生素C (即L-抗壞血酸)是人體必需的一種維生素，生理作用廣泛，在 醫(yī)藥、食品工業(yè)上均有重要用途，在整個(gè)維生素類藥物生產(chǎn)中占有十分重要的 地位。目前我國(guó)維生素C生產(chǎn)主要采用"二步發(fā)酵法"。該工藝的主要特點(diǎn)在于 第二步發(fā)酵，即從L-山梨糖到2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)的轉(zhuǎn)化需要由酮古龍酸 菌(Xetogw/o"/gem'譜vw/gare，通禾爾"小菌")與巨大芽抱桿菌(Sat"'〃w megafm'wm, 通稱"大菌")搭配而成的組合菌系進(jìn)行混合發(fā)酵。
雖然"二步發(fā)酵法"以微生物發(fā)酵代替了化學(xué)合成法，簡(jiǎn)化了工藝，減少 了污染，降低了成本，但現(xiàn)在仍未完全發(fā)揮其潛在的生產(chǎn)能力。比如，工業(yè)發(fā) 酵過程中的補(bǔ)糖以及為維持pH穩(wěn)定所采取的補(bǔ)堿措施都會(huì)引起培養(yǎng)體系滲透 壓的上升，從而抑制組合菌系的產(chǎn)酸能力。因此，提高菌株對(duì)高滲的耐受能力， 從而加強(qiáng)2-KLG的生產(chǎn)強(qiáng)度是非常有必要的。
海藻糖是一種獨(dú)特的非還原性二糖，能夠作為相容性溶質(zhì)使受滲透脅迫的 細(xì)胞保持穩(wěn)定。此外，在其它環(huán)境脅迫下，如熱脅迫、脫水、缺氧等，也常常 涉及海藻糖的積累來提高細(xì)胞的生存能力。因此，海藻糖是一種優(yōu)良的脅迫保 護(hù)劑。目前，添加海藻糖提高混合菌系對(duì)高滲的耐受能力，從而加強(qiáng)2-KLG的 生產(chǎn)強(qiáng)度尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種添加海藻糖作為滲透保護(hù)劑，促進(jìn)酮古龍酸菌 (A^togw/ow/g^n'w附vw/garg)與巨大芽抱桿菌08" '//"1 wgg"fer/ww)混合菌系細(xì)胞生 長(zhǎng)和2-KLG生產(chǎn)，加強(qiáng)2-KLG生產(chǎn)強(qiáng)度，縮短發(fā)酵周期的方法。
1、 菌株
酮古龍酸菌CS^ogw/ow/gem'w附vw/gaw) DSM 4025及巨大芽孢桿菌(5a"7/^ megafen'wm)ATCC 21916，由江蘇江山制藥有限公司(江蘇靖江)提供。
2、 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法
種子培養(yǎng)基(g丄")L-山梨糖20，酵母膏3，牛肉膏3，大豆蛋白胨10， 玉米漿1.5,尿素1， KH2P041， MgS042， CaC03l。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g丄")L-山梨糖80，玉米漿5，尿素12， KH2P041， MgS04l， CaC03 5。 NaCl作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，根據(jù)要求適量添加。滲透保護(hù)劑 海藻糖添加濃度為lOmmol，L'1。
3所有培養(yǎng)基由自來水配置并用2 molvL/1 NaOH調(diào)節(jié)pH為6.7 7.0。 L-山梨 糖和氮源分開滅菌，滅菌條件為12rC, 15min。
3、 大菌與小菌混合菌系的培養(yǎng)
用接種環(huán)挑取新鮮平板上小菌單菌落兩環(huán)，再挑取大菌單菌落一環(huán)，于無 菌水中制成混菌懸液，取混菌懸液涂斜面，30'C培養(yǎng)48h;取斜面混合菌0.4mL 接種于種子培養(yǎng)液75mL/750mL搖瓶中。3(TC， 200 rpm下培養(yǎng)18 h，即制成 大小菌混合菌系，接入甘油管中進(jìn)行保藏。
4、 培養(yǎng)方法從冷凍甘油管中取混菌保藏培養(yǎng)物種液10mL接入發(fā)酵培養(yǎng) 基(75 mL/750 mL搖瓶)，30°C， 200rpm培養(yǎng)72h，定期取樣測(cè)定參數(shù)。
5、 分析方法
菌體濃度測(cè)定取適量的菌懸液置于10 mL容量瓶中，加入等體積2 mol-L/1 鹽酸溶解菌懸液中的碳酸鈣，再加入去離子水定容至10mL，搖勻，用UV7500 型可見分光光度計(jì)，于660 nm處比色測(cè)OD值。
滲透壓測(cè)定用冰點(diǎn)滲透壓計(jì)測(cè)定。
2-KLG與L-山梨糖含量的測(cè)定采用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定。色譜柱 AminexHPX-87H(Bio-Rad)，流動(dòng)相0.005 mol'L" H2S04，流速O-SmLmin", 柱溫35'C，進(jìn)樣量:5^iL，檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器。
本發(fā)明的有益效果在髙滲(1067.5 mOsmoHcg—"條件下添加10 mmol，L"海 藻糖，2-KLG含量在72 h時(shí)為對(duì)照組(高滲條件下不加海藻糖)29.23 g丄"的 1.94倍。正常發(fā)酵(不加NaCl)時(shí)添加10mmol丄"海藻糖，發(fā)酵周期縮短到52h， 終點(diǎn)產(chǎn)酸達(dá)到69.38 g丄"，L-山梨糖消耗速度和2-KLG生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了 43.1%和45.5%。
具體實(shí)施例方式
對(duì)照實(shí)施例本發(fā)明所用的菌種為酮古龍酸菌(i^ogM/ow扭W蘭v^gwe)與 巨大芽孢桿菌(5a" /w mega m'"w)混合菌系。從冷凍甘油管中取混菌保藏培養(yǎng) 物0.4mL接入種子培養(yǎng)基(75mL/750mL搖瓶)，30°C， 200rpm培養(yǎng)18h。再 取種液10 mL接入發(fā)酵培養(yǎng)基(75 mL/750 mL搖瓶)，30°C ， 200 rpm培養(yǎng)72 h。 正常發(fā)酵(652.5 10311101'1^-1，不加NaCl)時(shí)，終點(diǎn)2-KLG和L-山梨糖濃度分別 為66.04 g丄"，7.58 g丄"。高滲(1067.5 mOsmol'kg",加NaCl)條件下，終點(diǎn)2-KLG 濃度為29.24 g-L—1。
實(shí)施例1:在正常發(fā)酵(652.5 mOsmol'kg—1，不加NaCl)和高滲脅迫(1067.5 mOsmoHcg'1，加NaCl)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加10 mmol'U1海藻糖，其余條件同 對(duì)照實(shí)施例。正常發(fā)酵(652.5 mOsmol'kg"，不加NaCl)條件下添加10 mmol-U1 海藻糖，52 h時(shí)2-KLG與L-山梨糖濃度分別為69.38 g七"，3.33 g七"。高滲(1067.5 mOsmol'kg'1，加NaCl)條件下添加10 mmol'L"海藻糖，72 h時(shí)2-KLG濃度為 56.83 g.1/1。
權(quán)利要求
1、一種添加海藻糖強(qiáng)化2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，其特征是利用酮古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare)與巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)混合菌系為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)維生素C前體2-酮基-L-古龍酸，通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加海藻糖10mmol·L-1，在過程中作為滲透保護(hù)劑，提高耐高滲能力，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和2-酮基-L-古龍酸的生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)2-酮基-L-古龍酸高效生產(chǎn)。
全文摘要
一種添加海藻糖強(qiáng)化2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，屬于發(fā)酵制備維生素C技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用酮古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare)與巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)混合菌系為生產(chǎn)菌株，通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中外源添加10mmol·L^-1海藻糖作為滲透保護(hù)劑，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)的生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)2-KLG高效生產(chǎn)。高滲(1067.5mOsmol·kg^-1)條件下添加10mmol·L^-1海藻糖，2-KLG含量在72h時(shí)為56.83g·L^-1，為對(duì)照組(高滲條件下不加海藻糖)29.24g·L^-1的1.94倍。正常發(fā)酵(不加NaCl)條件下添加10mmol·L^-1海藻糖，發(fā)酵周期縮短至52h，終點(diǎn)產(chǎn)酸達(dá)到69.38g·L^-1，L-山梨糖消耗速度和2-KLG生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了43.1％和45.5％。
文檔編號(hào)C12P39/00GK101654695SQ20091003477
公開日2010年2月24日 申請(qǐng)日期2009年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月9日
發(fā)明者劉立明, 周景文, 堅(jiān) 陳, 陳克杰 申請(qǐng)人:江南大學(xué)