專利名稱：：氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測特異性引物、液相芯片及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測特異性引物、液相芯片及其檢測方法。
背景技術(shù)：
：5-FU(氟尿嘧蛇，fluorouracil)在1957年由Heidelberger和Ansfield發(fā)明。5-FU屬抗代謝類藥物中的氟尿嘧啶類，該類藥物還有替加氟、卡莫氟、氟尿苷、脫氧氟尿苷以及卡培他濱等。這些藥物在體內(nèi)均轉(zhuǎn)化為5-FU，繼而發(fā)揮抗腫瘤作用。5-FU是最早使用的藥物之一，而且至今仍是癌癥治療中不可缺少的廣譜抗腫瘤藥。對消化系統(tǒng)癌(食管癌、胃癌、腸癌、胰腺癌、肝癌)和乳腺癌療效較好，對宮頸癌、卵巢癌、絨毛膜上皮癌、膀胱癌、頭頸部腫瘤也有效，還可作為放射治療的增敏劑。氟尿嘧啶類藥物的抗腫瘤療效雖得到廣泛認(rèn)P了，但患者用藥后藥效的個(gè)體差異很大、且有不同程度的毒副作用。它對骨髓和消化道毒性較大，出現(xiàn)血性腹瀉應(yīng)立即停藥，否則可致命；也常引起脫發(fā)、神經(jīng)毒性和皮膚色素沉著，偶見肝、腎損害。5-FU是尿嘧啶5位上的氫被氟取代的衍生物，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)?-氟尿嘧啶脫氧核苷酸(5F-dUMP),而抑制脫氧胸苷酸合成酶，阻止脫氧尿苷酸(dUMP)甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣剀账?dTMP)，從而影響DNA的合成。此外，5-FU在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶核苷，以偽代謝產(chǎn)物形式摻入RNA中干擾蛋白質(zhì)的合成，故對處于各細(xì)胞周期細(xì)胞也有作用。大量的臨床研究已經(jīng)證實(shí)，氟尿嘧啶類藥物的毒性與患者體內(nèi)三個(gè)基因的突變關(guān)系密切，即DPYD、TS和MTHFR。DPYD編碼的二氫嘧啶脫氫酶(DPD)是5-FU分解代謝的限速酶，體內(nèi)5-Fii劑量的85。/。都是通過DPD代謝失活。DPD的活性高低將直接影響5-FU的代謝速度，進(jìn)而影響到氟尿嘧啶類藥物的療效和毒性反應(yīng)。目前已明確，DPYD的IVS14+1G—A、T1679G和A2846T這三種突變使DPD酶活性喪失或顯著下降，是5-FU治療毒性的良好預(yù)測指標(biāo)。其中IVS14+1G—A檢測在國外已應(yīng)用于臨床預(yù)測5-FU毒副作用。TS基因編碼的胸苷酸合成酶(TS)是嘧啶核苷酸合成反應(yīng)的限速酶，也是5-Fu發(fā)揮細(xì)胞毒作用的目標(biāo)酶。5-Fu的代謝產(chǎn)物5-FdUMP與TS、5，10-亞甲基四氫葉酸結(jié)合，形成穩(wěn)定的三元復(fù)合物，從而阻礙TS催化dUMP轉(zhuǎn)變?yōu)閐TMP。TS基因5，端啟動(dòng)子/增強(qiáng)子區(qū)域(TSER)存在一段28bp的串連重復(fù)序列，帶有3個(gè)重復(fù)序列(TSER*3)的患者TSmRNA水平顯著高于只帶有2個(gè)重復(fù)序列(TSER*2)患者的TS水平。部分TSE"3型患者的TSER第12個(gè)G(3Rg)突變?yōu)镃(3Rc)，該SNP妨礙了上游刺激因子的結(jié)合位置，導(dǎo)致TYMS表達(dá)下降至與TSEI^2相近。TS基因另一個(gè)常見突變是3'UTR有一個(gè)6bp的缺失，具有dd6/del6的患者TYMS表達(dá)量只有野生型的25%。大量臨床數(shù)據(jù)顯示TS基因這三種突變型(TSER*2、TSER^3Rc和de16)顯示患者更容易產(chǎn)生5-FU毒副作用。5-Fu對胸苷酸合成酶功能的阻斷需要與5，10-亞甲基四氫葉酸結(jié)合為三元復(fù)合物。MTHFR(5，10-methylenetetrahydrofolatereductase,5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶)不可逆的催化5，10-亞甲基四氫葉酸，使其轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基四氫葉酸，從而削弱了5-Fu的抗腫瘤作用。MTHFR基因最常見的突變位點(diǎn)是C677T和A1298C。臨床研究顯示，TT677基因型患者的5-FU化療有效率顯著高于CC667基因型患者；而CC1298與5-FU治療后較高的副作用發(fā)生率相關(guān)。因此，專家推薦患者在接受氟尿嘧啶類藥物化療之前，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行相關(guān)的基因突變檢測，幫助臨床醫(yī)生根據(jù)患者的個(gè)體差異制定個(gè)體化用藥方案。這樣將明顯提高藥物療效，減少藥物毒副作用的發(fā)生。目前已建立了若干以PCR為基礎(chǔ)的檢測基因突變的技術(shù)，如直接測序法，PCR—單鏈構(gòu)象突變分析(SSCP)檢測，以上技術(shù)具有靈敏度低，樣品易污染、假陽性率高等缺點(diǎn)。而聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一限制性片段長度多態(tài)(PCR—RFLP)分析技術(shù)和基于TaqMan技術(shù)的等位基因差異分析法一次只能進(jìn)行一種突變的檢測，耗時(shí)費(fèi)力；傳統(tǒng)的固相芯片價(jià)格昂貴，而且敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差。液相芯片技術(shù)利用聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體，以熒光檢測儀作為檢測平臺，對核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)行高通量的多指標(biāo)并行檢測。在微球的制造過程中，摻入不同比例的紅光及紅外光染色劑，從而形成多至100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價(jià)結(jié)合了針對不同待檢測物的蛋白質(zhì)或核酸分子作為探針分子，報(bào)告分子以生物素標(biāo)記，并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、報(bào)告分子、熒光標(biāo)記物就形成完整的微球檢測體系用于Luminex系統(tǒng)的讀取。Luminex閱讀系統(tǒng)分別激發(fā)紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測，其中紅色激光檢測微球表面紅色分類熒光的強(qiáng)度，并根據(jù)微球中不同色彩而編號分類，從而確定反應(yīng)的類型；綠色激光檢測樣本中熒光標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度，再通過機(jī)器與計(jì)算機(jī)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析激光所檢測到微球種類、數(shù)量，從而判定待測樣本多種目標(biāo)測試物各自的濃度。因此，液相芯片技術(shù)既滿足了高通量檢測的要求，同時(shí)具備了快速準(zhǔn)確，靈敏度高，特異性好，結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。我們采用液相芯片技術(shù)可以同時(shí)檢測多個(gè)突變位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)高通量快速簡便化操作，大大提高了檢測效率，在同類檢測技術(shù)中處于領(lǐng)先地位。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供與氟尿嘧啶類藥物療效密切相關(guān)的DPYD、TS和MTHFR基因突變檢測液相芯片。該液相芯片可用于檢測以下6種常見突變位點(diǎn)DPYD的IVS14+1G—A、T1679G、A2846T，TS的3，UTRdel6，以及MTHFR的C677T、A1298C。一種氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測液相芯片，包括有(1).針對每種型別的突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型特異ASPE引物對，每種ASPE引物由3'端的針對目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物序列和5'端的tag序列組成，所述特異性引物序列分別選自SEQIDN0.1及SEQIDN0.2、SEQIDNO,3及SEQIDN0.4、SEQIDN0.5及SEQIDN0.6、SEQIDNO,7及SEQIDNO,8、和/或SEQIDNO.9及SEQIDNO.IO、禾口/或SEQIDNO.ll及SEQIDNO.12;所述tag序列選自SEQIDN0.37SEQIDNO,48中的序列；(2).分別包被有特異的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(1)中所選tag序列互補(bǔ)配對，所述anti-tag序列選自SEQIDN0.13SEQIDN0.24中的序列；(3).用于擴(kuò)增具有DPYD、TS和MTHFR基因突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。優(yōu)選地，所述擴(kuò)增用的引物為選自針對DPYD基因的IVS14+1G—A突變位點(diǎn)的SEQIDN0.25禾口SEQIDNO.26,針對DPYD基因的T1679G突變位點(diǎn)的SEQIDN0.27禾口SEQIDN0.28，針對DPYD基因的A2846T突變位點(diǎn)的SEQIDNO,29禾口SEQIDNO30，針對TS基因的3'UTRdel6突變位點(diǎn)的針對SEQIDN0.31和SEQIDN0.32，針對MTHFR基因的C677T突變位點(diǎn)的SEQIDN0.33和SEQIDNO.34;針對MTHFR基因的A1298C突變位點(diǎn)的SEQIDN0.35和SEQIDN0.36中的序列。本發(fā)明的另一目的是提供用于氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測的特異性序列，該序列特性強(qiáng)，能準(zhǔn)確區(qū)分各種基因型。所述用于氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測的特異性引物序列，包括針對DPYD基因的IVS14+1G—A突變位點(diǎn)的SEQIDN0.1和SEQIDN0.2，針對DPYD基因的T1679G突變位點(diǎn)的SEQIDN0.3和SEQIDN0.4,針對DPYD基因的A2846T突變位點(diǎn)的SEQIDN0.5和SEQIDN06，針對TS基因的3，UTRdel6突變位點(diǎn)的針對SEQIDN0.7和SEQIDN0.8，針對MTHFR基因的C677T突變位點(diǎn)的SEQIDN0.9和SEQIDNO.10;禾卩/或針對MTHFR基因的A1298C突變位點(diǎn)的SEQIDNO.1l和SEQIDNO.12中的序列。本發(fā)明的另一目的是提供使用上述液相芯片對DPYD、TS和MTHFR基因突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測的方法。一種使用上述液相芯片對氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)因突變檢測的方法，主要包括以下步驟(一)PCR擴(kuò)增待測樣品DNA;(二)PCR反應(yīng)產(chǎn)物用ExoSAP-IT試劑盒進(jìn)行酶切處理；(三)用所述ASPE引物進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP，從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個(gè)的生物素標(biāo)記；(四)將對應(yīng)ASPE引物的包被有特異的anti-tag序列的微球與上述延伸反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng)；(五)雜交反應(yīng)后的產(chǎn)物與鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)；(六)通過熒光檢測儀檢測。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1.本發(fā)明所提供的液相芯片檢測方法與測序法的吻合率高達(dá)100%。所制備的氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設(shè)計(jì)的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)。2.本發(fā)明設(shè)計(jì)的ASPE型特異性引物具有非常好的特異性，能準(zhǔn)確區(qū)分各種類型的突變位點(diǎn)。3.本發(fā)明所述的氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測液相芯片的檢測方法步驟簡單，6種突變檢測可通過一步多重PCR即可完成6個(gè)具有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的并行分析特征。4.本發(fā)明所提供的檢測方法所需要的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測序技術(shù)，特別符合臨床需要。5.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷，同時(shí)對現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使得所制備微球能適用于不同的檢測項(xiàng)目，具有很強(qiáng)的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進(jìn)一步得到提高，信噪比增強(qiáng)，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測液相芯片試劑盒，主要包括有一、ASPE引物針對氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因的各種常見突變位點(diǎn)等位基因分別設(shè)計(jì)特異性的引物序列。ASPE引物由Tag+特異性引物序列組成.特異性引物序列如下表所示:表lASPE引物的特異性引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2ASPE引物5'端的Tag序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>選擇的12種微球(購自美國Luminex公司)，將anti-tag序列包被與微球上，每個(gè)anti-tag序列前加上一段5—IO個(gè)T的間隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將合成的anti-tag序列用滅菌ddH20配成100nmol/ml的貯存液。所述間隔臂為用于將特異性的探針與微球表面間隔開來或是將特異性探針置于親水性環(huán)境中的序列。通過在探針序列與氨基之間設(shè)置適當(dāng)長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。常見的間隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT),寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n間隔臂(論3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干擾，還可以用poly(TTG)作為間隔臂。本發(fā)明間隔臂優(yōu)選為5—IO個(gè)T，在中國，poly(dT)的合成技術(shù)比較成熟，成本相對較低。微球包被的過程如下分別取5xl06個(gè)上述編號的羧基化的微球(購自Luminex公司)懸浮于50ul0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配律!]10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(購自PierceChemical公司)工作液。往微球懸液中加入2.5ul的EDC工作液，恒溫孵育30分鐘，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒溫孵育30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用0.02X的Tween-20洗滌一次，再用O.l%的SDS液洗滌一次。將洗滌后的包被有anti-tag序列的微球重懸于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)，lmmol/LEDTA]屮，2-8。C避光保存。三、擴(kuò)增出具有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物目標(biāo)檢測的6種常見基因突變DPYD的IVS14+1G—A、T1679G、A2846T，TS的3'UTRde16以及MTHFR的C677T和A1298C都在不同的基因或外顯子上。因此，利用Primer5.0設(shè)計(jì)6對引物(見表3)，分別擴(kuò)增出6條具有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列。表4擴(kuò)增出具有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>大小分別為592bp、412bp、708bp、623bp、534bp和357bp。引物序列(SEQNO.25-36)見上述表3所示o首先配制多重PCR引物工作液分別各取SEQNO.25-36的引物lfc存液100ul于1.5ml微量離心管中，混合均勻即為多重PCR引物工作液。多重PCR反應(yīng)體系如下10x緩沖液(含Mg2+)5uldNTP(各2.5mmol/L)4ulTaq酶(5U/ul)0.5ul多重PCR引物工作液(各20pmol/mL)5ul模板DNA(10ng/ul)1ulddH2034.5ul共50ulPCR擴(kuò)增程序?yàn)?5。C3min;94°C20s，56°C30s，72°C30s，30個(gè)循環(huán)；72°ClOmin;4。C保存?zhèn)溆?。三、PCR產(chǎn)物的酶切處理參照ExoSAP-IT試劑盒說明，詳細(xì)步驟如下1.取7.5ulPCR反應(yīng)后的產(chǎn)物，加入3ulExoSAP-IT酶；2.37'C孵育15min。80。C孵育15min，使多余的酶滅活。酶切處理后的產(chǎn)物直接用于后續(xù)的ASPE引物延伸反應(yīng)。四、位點(diǎn)特異的引物延伸反應(yīng)(ASPE)利用上述設(shè)計(jì)的位點(diǎn)特異性引物進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP，從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個(gè)的生物素標(biāo)記。首先配制混合的ASPE引物工作液分別各取IVS14-w、IVS14-m、T1679G-w、T1679G-m、A2846T-w、A2846T-m、del6-w、del6-m、C677T-w、C677T-m、A1298C-w、和A1298C-m相應(yīng)的ASPE引物貯存液10ul于1.5ml微量離心管中，加入10mmol/LTrisBuffer補(bǔ)至200ul，混合均勻即為ASPE混合引物工作液。ASPE反應(yīng)的體系如下10x緩沖液2ulMgCl2(50mmol/L)0.5ulBiotin-dCTP(400umol/L)0.25uldATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L)1ulTsp酶(5函)混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L)1ul酶切處理的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5ulddH2010ul共20ulPCR程序?yàn)?6。C2min;94°C30s，58°Clmin，72°C2min，30個(gè)循環(huán)；4。C保存?zhèn)溆?。五、雜交反應(yīng)1.取25ul上述包被好的微球(40個(gè)100個(gè)/ul)懸液于96孔濾板相應(yīng)的孔中，對照孔加25ul的d膽20;2.取5-25ul的ASPE反應(yīng)液于相應(yīng)的孔中，用ddH2O補(bǔ)足至50ul;3.用錫箔紙包住96孔板以避光，95°C60s,37°C15min孵育雜交；4.雜交后的微球于^3000g離心2—5min;5.去上清，將微球重懸于75ul的lxTm雜交緩沖液中；6.微球于^3000g離心2—5min;7.將微球重懸于75ul的lxTm雜交緩沖液中，加入15ul濃度為10ug/ml的鏈酶親和素-藻紅蛋白(SA-PE);8.37。C孵育15min，于Luminex儀器上檢測。六、結(jié)果檢測與數(shù)據(jù)分析反應(yīng)后產(chǎn)物通過Luminex系列分析儀器檢測。以聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體，以熒光檢測儀作為檢測平臺，對核酸分子進(jìn)行高通量的多指標(biāo)并行檢測。在微球的制造過程中，摻入不同比例的紅光及紅外光染色劑，從而形成多至100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價(jià)結(jié)合了針對不同待檢測物的核酸分子作為探針分子，報(bào)告分子以生物素標(biāo)記，并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、報(bào)告分子、熒光標(biāo)記物就形成完整的微球檢測體系用于Luminex系統(tǒng)的讀取。Luminex閱讀系統(tǒng)分別激發(fā)紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測，檢測結(jié)果如表4和表5所示。對熒光值(MFI)和數(shù)據(jù)處理有以下要求1.每個(gè)位點(diǎn)需至少有一個(gè)等位基因MFI大于300而且大于10xPCR陰性對照MFI;2.NETMFI=樣品MFI—PCR陰性對照MFI(NETMFI小于O的以O(shè)表示)；3.滿足以上兩個(gè)條件的數(shù)據(jù)，按下列公式計(jì)算突變比值突變比值=突變型NETMFI+(突變型NETMFI+野生型NETMFI)4.根據(jù)經(jīng)驗(yàn)對每個(gè)檢測位點(diǎn)的突變比值確定閾值(cut-off值)，以劃分野生型純合子、雜合子和突變型純合子。使用本方法檢測20份樣本的DPYD、TS和MTHFR基因突變，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合上述要求，因此可計(jì)算得它們的突變比值。閾值(cut-off值)的設(shè)置如下突變比值范圍在0%-20%視為野生型純合子；30%-70°/。視為雜合子；80%-100%視為突變型純合子。以測序法檢測與液相芯片結(jié)果作對照，計(jì)算本發(fā)明所提供的分型方法檢測結(jié)果的吻合率。本方法檢測20份樣本的氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變型檢測結(jié)果與測序結(jié)果吻合率達(dá)到100%?？梢姳景l(fā)明所提供的氟尿噴啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測液相芯片能夠準(zhǔn)確地檢測出DPYD、TS和MTHFR基因突變類型，且結(jié)果穩(wěn)定可靠。表5樣本檢測結(jié)果(MFI)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>采用上述設(shè)計(jì)制備的液相芯片，按實(shí)施例2所述檢測過程和方法對血清樣品1-10進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如下(表中數(shù)據(jù)為檢測熒光值)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>三、數(shù)據(jù)分析:根據(jù)上述檢測的熒光值，可以看出Groupl、Group2和Group3這三組的液相芯片對相同樣品的檢測結(jié)果一致。因此，ASPE引物中，ASPE特異性引物5'端的Tag序列并不是唯一的，而是可以在本發(fā)明SEQIDN0.37-SEQIDN0.48中進(jìn)行選擇，相應(yīng)的，包被于微球上的Anti-tag序列須根據(jù)互補(bǔ)配對的原則，從SEQIDNO.13-SEQIDNO,24中選擇對應(yīng)的序列。其它針對不同的基因突變位點(diǎn)的液相芯片，ASPE引物運(yùn)用不同的Tag序列，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。以上是針對本發(fā)明的可行實(shí)施例的具體說明，但該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明的專利范圍中。序列表〈110〉廣州益善生物技術(shù)有限公司<120〉氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測特異性引物、液相芯片及方法<160〉48<170〉Patentlnversion3.1<210〉1<211〉19〈212〉腿〈213〉人工序列<400>1gctgactttccagacaacg19<210〉2〈211〉19〈212〉DNA〈213>人工序列〈400〉2gctgactttccagacaaca19〈210〉3〈211>19<212>DNA〈213〉人工序列<400〉3ccaccagcacatcaatgat<210〉4<211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉4ccaccagcacatcaatgag<210〉5<211〉20〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉5caagttgtggctatgattga〈210〉6<211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列說明書第17/30頁1919caagttgtggctatgattgt20<210〉7〈211〉28〈212>■〈213〉人工序列〈400〉7gcaacatataaaacaactataactttaa28〈210〉8〈211〉27<212〉腿<213〉人工序列<400>8gcaacatataaaacaactataaagttc27〈210〉9〈211〉17<212>腿〈213〉人工序列<400>933ggtgtctgCggg3gC17〈210〉10<211〉17〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>1033ggtgtctgCggg3gt17<210〉11<211>19<212>歸<213〉人工序列<400>11aggagctgaccagtgaaga〈210〉12<211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>12aggagctgaccagtgaagc19〈210〉13〈211〉24<212〉DNA23〈213〉人工序列<400〉13aaaggattaaagtgaagtaattga〈210〉14<211〉24〈212〉DNA<213〉人工序列<400>14aaagaaaggatttgtagtaagatt〈210〉15<211〉24<212>膽〈213〉人工序列<400〉15aaagttgagtattgstttg3eiasg〈210〉16〈211>24<212〉■<213〉人工序列〈400〉16asagtgatgt3tatgsgt33attg〈210〉17<211>24<212〉腿<213>人工序列<400>17g3ttgtattg3agt3ttgts33ag<210〉18〈211〉24〈212〉DNA<213〉人工序列<400〉18gattattggattaaaggtaaatga〈210〉19<211〉24〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉19attgattgtgaatgaaatgaattg〈210〉20<211〉24242424列〈400〉20attgttgaaaagtgtaatgattga24<210>21<211>24<212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉21aaagaaagattgttgagattatga24〈210〉22<211>24<212〉DNA<213>人工序列〈400〉22gatttgtsattgttgagtaaatgs24<210〉23〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>23gtaatgataaagatgatgatattg<210>24<211>24〈212〉DNA<213〉人工序列<400〉24gtattgtattgaaaaggtaattga〈210>25<211>21<212>腿<213〉人工序列〈400>25aaaatgtgagaagggacctca<210〉26〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉26ccttcataaataccagccaca<210>27〈211〉2124242121acaatatggagcttccgtttc21<210〉28<211〉21<212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉28aatgagcaatatatgcctgcc21〈210〉29<211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉29tcgtatttctaagccaggcat21〈210〉30〈211〉21<212〉腿〈213〉人工序列〈400〉30<210>31<211>21<212>腿〈213〉人工序列<400〉31atggaaatggctgtttagggt<210〉32〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉32atccaaaccagaatacagcac<210〉33<211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>33tggggtcagaagcatatcag〈210〉3421212120〈211〉20<212〉腿〈213〉人工序列〈400>34aagcaacgctgtgcaagttc20〈210〉35〈211〉20〈212〉DNA<213>人工序列〈400〉35catctttgttcttgggagcg20〈210〉36〈211〉20〈212〉腿〈213>人工序列<400〉36ctccagcatcactcactttg20〈210〉37<211>24〈212〉腿〈213〉人工序列〈400〉37tcaattacttcactttaatccttt〈210〉38〈211〉24〈212〉腿<213〉人工序列〈400〉38aatcttactacaaatcctttcttt〈210〉39〈211〉24<212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉39cttttcaaatcaatactcaacttt<210〉40<211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉40caatttactcatatacatcacttt<210〉41〈211〉24<212>腿<213〉人工序列〈400〉41cttttacaatacttcaatacaatc〈210〉42〈211〉24<212〉DNA<213〉人工序列〈400〉6tcatttacctttaatccaataatc2424〈210〉43<211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉43caattcatttcattcacaatcaat24<210>44<211〉24〈212〉腿〈213〉人工序列<400>44tcaatcattacacttttcaacaat<210〉45<211>24〈212〉DNA〈213>人工序列〈400〉45tcataatctcaacaatctttcttt〈210〉46<211〉24〈212〉DNA<213〉人工序列<400>46tcatttactcaacaattacaaatc<210〉47〈211〉24〈212〉蘭<213〉人工序列<400〉47caatatcatcatctttatcattac24242424〈210〉48<211〉24〈212〉腿〈213>人工序列<400〉48tcaattaccttttcaatacaatac2權(quán)利要求1.一種氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(1).針對每種型別的突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型特異ASPE引物對，每種ASPE引物由3’端的針對目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物序列和5’端的tag序列組成，所述特異性引物序列分別選自SEQIDNO.1及SEQIDNO.2、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4、SEQIDNO.5及SEQIDNO.6、SEQIDNO.7及SEQIDNO.8、SEQIDNO.9及SEQIDNO.10、和/或SEQIDNO.11及SEQIDNO.12；所述tag序列選自SEQIDNO.37～SEQIDNO.48中的序列；(2).分別包被有特異的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(1)中所選tag序列互補(bǔ)配對，所述anti-tag序列選自SEQIDNO.13～SEQIDNO.24中的序列；(3).用于擴(kuò)增具有DPYD、TS和MTHFR基因突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述野生型及突變型特異性ASPE引物對選自針對DPYD基因的IVS14+1G—A突變位點(diǎn)的由SEQIDNO.l和SEQIDN0.37組成的序歹U，及由SEQIDN0.2和SEQIDNO,38組成的序列；針對DPYD基因的T1679G突變位點(diǎn)的SEQIDN0.3和SEQIDN0.39組成的序列及SEQIDN0.4和SEQIDNO.40組成的序列；針對DPYD基因的A2846T突變位點(diǎn)的SEQIDN0.5和SEQIDN0.41組成的序列及SEQIDN0.6和SEQIDN0.42組成的序列；針對TS基因的3，UTRdel6突變位點(diǎn)的SEQIDN0.7和SEQIDN0.43組成的序列及SEQIDN0.8和SEQIDN0.44組成的序列；針對MTHFR基因的C677T突變位點(diǎn)的SEQIDN0.9和SEQIDN0.45組成的序列及SEQIDNO.10和SEQIDN0.46組成的序列；和/或針對MTHFR基因的A1298C突變位點(diǎn)的SEQIDNO.ll和SEQIDN0.47組成的序列及SEQIDN0.12和SEQIDN0.48組成的序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述用于擴(kuò)增的引物包括:針對DPYD基因的IVS14+1G—A突變位點(diǎn)的SEQIDN0.25和SEQIDN0.26,針對DPYD基因的T1679G突變位點(diǎn)的SEQIDN0.27和SEQIDN0.28,針對DPYD基因的A2846T突變位點(diǎn)的SEQIDNO,29和SEQIDNO30,針對TS基因的3'UTRdel6突變位點(diǎn)的SEQIDN0.31和SEQIDN0.32,針對MTHFR基因的C677T突變位點(diǎn)的SEQIDN0.33和SEQIDN0.34;禾Q/或針對MTHFR基因的A1298CT突變位點(diǎn)的SEQIDN0.35和SEQIDN0.36中的序列。4.根據(jù)權(quán)利要求1一3任一項(xiàng)所述的氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測液相芯片，其特征是，(2)中所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂序列為5—10個(gè)T。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測液相芯片，其特征是，主要包括有(1)所述野生型及突變型特異性ASPE引物對為針對DPYD基因的IVS14+1G—A突變位點(diǎn)的SEQIDNO.l和SEQIDN0.37組成的序列，及SEQIDN0.2和SEQIDN0.38組成的序列；針對DPYD基因的T1679G突變位點(diǎn)的SEQIDN0.3和SEQIDN0.39組成的序列及SEQIDN0.4和SEQIDNO.40組成的序列；針對DPYD基因的A2846T突變位點(diǎn)的SEQIDN0.5和SEQIDN0.41組成的序列及SEQIDN0.6和SEQIDNO,42組成的序列；針對TS基因的3，UTRdel6突變位點(diǎn)的SEQIDN0.7和SEQIDNO,43組成的序列及SEQIDN0.8和SEQIDN0.44組成的序列；針對MTHFR基因的C677T突變位點(diǎn)的SEQIDN0.9和SEQIDN0.45組成的序列及SEQIDNO.10和SEQIDN0.46組成的序列；和針對MTHFR基因的A1298C突變位點(diǎn)的SEQIDNO.ll和SEQIDNO,47組成的序列及SEQIDN0.12和SEQIDN0.48組成的序列；(2).分別包被有特異的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相應(yīng)地與(1)中所選tag序列互補(bǔ)配對；所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述anti-tag序列為SEQIDN0.13SEQIDN0.24中的序列；(3).用于擴(kuò)增具有DPYD、TS和MTHFR基因突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物，所述引物為針對DPYD基因的IVS14+1G—A突變位點(diǎn)的SEQIDNO,25和SEQIDNO,26，針對DPYD基因的T1679G突變位點(diǎn)的SEQIDN0.27禾卩SEQIDN0.28，針對DPYD基因的A2846T突變位點(diǎn)的SEQIDN0.29和SEQIDNO30，針對TS基因的3'UTRdel6突變位點(diǎn)的針對SEQIDN0.31和SEQIDN0.32,針對MTHFR基因的C677T突變位點(diǎn)的SEQIDN0.33和SEQIDN0.34;和針對MTHFR基因的AI298CT突變位點(diǎn)的SEQIDN0.35和SEQIDN0.36。7.—種使用權(quán)利要求1一6任一項(xiàng)所述液相芯片對氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測的方法，其特征是，主要包括以下步驟(一)PCR擴(kuò)增待測樣品DNA;(二)PCR反應(yīng)產(chǎn)物用ExoSAP-IT試劑盒進(jìn)行酶切處理；(三)用所述ASPE引物進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP，從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個(gè)的生物素標(biāo)記；(四)將對應(yīng)ASPE引物的包被有特異的anti-tag序列的微球與上述延伸反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng)；(五)雜交反應(yīng)后的產(chǎn)物與鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)；(六)通過熒光檢測儀檢測。8.用于氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測的特異性引物，其特征是，包括有針對DPYD基因的IVS14+1G—A突變位點(diǎn)的SEQIDNO.l和SEQIDN0.2，針對DPYD基因的T1679G突變位點(diǎn)的SEQIDN0.3和SEQIDN0.4，針對DPYD基因的A2846T突變位點(diǎn)的SEQIDN0.5和SEQIDN06，針對TS基因的3'UTRdel6突變位點(diǎn)的針對SEQIDN0.7禾口SEQIDN0.8，針對MTHFR基因的C677T突變位點(diǎn)的SEQIDN0.9和SEQIDNO.10;和/或針對MTHFR基因的A1298CT突變位點(diǎn)的SEQIDNO.11和SEQIDNO.12中的序列。全文摘要本發(fā)明公開了氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測特異性引物，液相芯片和方法，所述液相芯片包括針對每種型別的突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型特異ASPE引物對、分別包被有特異的anti-tag序列的微球，和用于擴(kuò)增具有DPYD、TS和MTHFR基因突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。所制備的氟尿嘧啶類藥物療效相關(guān)基因突變檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設(shè)計(jì)的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)。本發(fā)明設(shè)計(jì)的ASPE引物具有非常好的特異性，能準(zhǔn)確區(qū)分各種類型的突變位點(diǎn)。所述檢測方法步驟簡單，6種突變位點(diǎn)可以一步檢測中完成，操作方便，并且避免了多次操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準(zhǔn)確率。文檔編號C12Q1/68GK101624626SQ200910041779公開日2010年1月13日申請日期2009年8月11日優(yōu)先權(quán)日2009年8月11日發(fā)明者何嘉英,許嘉森申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司