專利名稱:乙型肝炎病毒ymdd基序突變檢測特異性引物、液相芯片及方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域,涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù),具體的是涉及與乙型肝炎核苷類似物治療耐藥性相關(guān)的病毒YMDD基序突變檢測特異性引物、液相芯片及其檢測方法。
背景技術(shù):
乙型肝炎是全球廣泛分布的傳染病,在許多國家呈現(xiàn)地域性分布。全世界有超過20億的人群感染過乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV),其中3.5~4億是慢性攜帶者,而在中國就有1.2億人。慢性乙型肝炎可引起肝硬化、肝功能衰竭,肝癌等嚴(yán)重的肝臟疾病,全世界每年約有100萬的人因此而死亡。而中國是慢性乙型肝炎的重災(zāi)區(qū),超過8%的人口為慢性攜帶者,每年因肝病死亡的約有30萬人左右。
慢性乙型肝炎治療近年來得到很大改善,抗病毒藥物的種類主要包括兩大類,一類是核苷類似物,一類是干擾素。干擾素主要是α干擾素和Pegylated干擾素,前者是乙肝治療較早使用的藥物,后者于2005年許可上市。干擾素的特點(diǎn)是既可以直接抑制病毒,又具有免疫調(diào)節(jié)作用,能夠在抑制乙肝病毒復(fù)制的同時(shí)使病人達(dá)到免疫應(yīng)答。但干擾素藥物需注射使用,抑制病毒的時(shí)間比核苷類似物要長,且費(fèi)用相對較高,不良反應(yīng)也比較大,因此部分患者不能耐受干擾素。
現(xiàn)在已上市的核苷類似物藥物有5種,分別是拉米夫定(Lamivudine,1998年上市)、阿德福韋(Adefovir,2002年上市)、恩替卡韋(Entecavir,2005年上市)、汰比夫定(Telbivudine,2006年上市)和泰諾福韋(Tenofovir,2008年上市)。這類藥物通過干擾病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程和抑制DNA合成來抑制病毒DNA的復(fù)制,其特點(diǎn)是直接抑制病毒,因此能使患者的病毒DNA水平快速下降,一、兩個月就有明顯的效果,但是核苷類似物不具備有免疫調(diào)節(jié)的作用。此外,此類藥物只需口服用藥,不良反應(yīng)較小,費(fèi)用較低。
核苷類似物藥物只能抑制病毒復(fù)制,而不能根除病毒,因此需要長期使用。而長期用藥則可能引發(fā)較高的比例的耐藥。臨床研究數(shù)據(jù)顯示,拉米夫定治療1~4年的基因耐藥率分別為14%、38%、49%、66%。研究已經(jīng)證明核苷類似物藥物耐藥與病毒P基因的YMDD(酪氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸)基序變異有直接關(guān)系。
目前報(bào)道的YMDD變異主要有rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S和rtN236T。其中rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T和rtM204V/I/S與拉米夫定的耐藥有關(guān),而rtA181V/T和rtN236T與阿德福韋的耐藥有關(guān),其它核苷酸類似物藥物由于上市時(shí)間較短,暫未發(fā)現(xiàn)顯著的耐藥現(xiàn)象。
YMDD變異導(dǎo)致拉米夫定耐藥后,會使病人血清的谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平和病毒DNA水平升高,甚至病情惡化。因此建立簡單、快速的檢測YMDD變異情況的方法可以及時(shí)、盡早發(fā)現(xiàn)變異,從而調(diào)整用藥和治療方案,這對于控制疾病的進(jìn)程和促進(jìn)臨床治療是非常有意義的。
目前常用于檢測乙肝病毒YMDD變異的技術(shù)主要有直接測序法、基于PCR的限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)技術(shù)、固相基因芯片技術(shù)等。直接測序法雖然一直被認(rèn)為是檢測基因突變的金標(biāo)準(zhǔn),但費(fèi)時(shí)費(fèi)力,不符合臨床檢測的高通量要求,靈敏度也不高。RFLP同樣操作步驟比較復(fù)雜,且檢測結(jié)果受很多方面的影響,因此也不能滿足臨床大規(guī)模、快速、準(zhǔn)確檢測的需求。固相基因芯片雖然能實(shí)現(xiàn)高通量檢測,但價(jià)格昂貴,敏感性不高,檢測結(jié)果可重復(fù)性差。上面這些技術(shù)檢測混合感染中的劣勢型突變病毒株的能力較弱,因此在臨床上均不能做到及時(shí)、盡早地發(fā)現(xiàn)乙肝病毒的YMDD變異株。
基于芯片的原理,美國Luminex公司開發(fā)出了以微球?yàn)檩d體的懸浮液相芯片技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)利用聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體,以熒光檢測儀作為檢測平臺,對核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)行高通量的多指標(biāo)并行檢測。在微球的制造過程中,摻入不同比例的紅光及紅外光染色劑,從而形成多至100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價(jià)結(jié)合了針對不同待檢測物的蛋白質(zhì)或核酸分子作為探針分子,報(bào)告分子以生物素標(biāo)記,并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、報(bào)告分子、熒光標(biāo)記物就形成完整的微球檢測體系用于Luminex系統(tǒng)的讀取。Luminex閱讀系統(tǒng)分別激發(fā)紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測,其中紅色激光檢測微球表面紅色分類熒光的強(qiáng)度,并根據(jù)微球中不同色彩而編號分類,從而確定反應(yīng)的類型;綠色激光檢測樣本中熒光標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度,再通過機(jī)器與計(jì)算機(jī)自動統(tǒng)計(jì)分析激光所檢測到微球種類、數(shù)量,從而判定待測樣本多種目標(biāo)測試物各自的濃度。因此,液相芯片技術(shù)滿足了高通量檢測的要求。
xTAG技術(shù)利用了Tsp DNA聚合酶在3’端的強(qiáng)特異性檢測突變位點(diǎn),并使用高度特異的TAG和anti-TAG序列極大地增強(qiáng)了檢測結(jié)果的信噪比,因此該技術(shù)具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確性。把液相芯片技術(shù)和xTAG技術(shù)相結(jié)合,不僅能同時(shí)對多種突變進(jìn)行檢測,同時(shí)也具備了操作方便,快速準(zhǔn)確,靈敏度高,特異性好,結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),在同類檢測技術(shù)中處于領(lǐng)先地位。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供與核苷類似物治療耐藥性相關(guān)的乙型肝炎病毒YMDD基序突變檢測液相芯片。該液相芯片可用于檢測乙肝病毒YMDD基序的突變位點(diǎn)rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S和/或rtN236T。
一種乙型肝炎病毒YMDD基序突變檢測液相芯片,包括有 (1)ASPE引物每種ASPE引物由3’端的針對目的基序突變的特異性序列和5’端的tag序列組成,所述針對目的基序突變的特異性序列包括有分別針對rtL80I/V的SEQ ID NO.1-4;分別針對rtV173L的SEQ ID NO.5-7;分別針對rtL180M的SEQ ID NO.8-10;分別針對rtA181V/T的SEQ ID NO.11-19;分別針對rtM204V/I/S的SEQ ID NO.20-29;和/或分別針對rtN236T的SEQ ID NO.30-33;所述對應(yīng)的tag序列選自SEQ ID NO.34-66; (2).分別包被有特異的anti-tag序列的微球,所述anti-tag序列與(1)中所選的tag序列互補(bǔ)配對,所述anti-tag序列選自SEQ ID NO.67-99,上述每種微球具有不同顏色編碼; (3).用于擴(kuò)增具有突變位點(diǎn)rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S、和/或rtN236T的目標(biāo)序列的引物。
具體優(yōu)選地,所述ASPE引物包括由SEQ ID NO.1和34組成的序列、由SEQ ID NO.2和35組成的序列、由SEQ ID NO.3和36組成的序列、由SEQ ID NO.4和37組成的序列、由SEQ IDNO.5和38組成的序列、由SEQ ID NO.6和39組成的序列、由SEQ ID NO.7和40組成的序列、由SEQ ID NO.8和41組成的序列、由SEQ ID NO.9和42組成的序列、由SEQ ID NO.10和43組成的序列、由SEQ ID NO.11和44組成的序列、由SEQ ID NO.12和45組成的序列、由SEQ ID NO.13和46組成的序列、由SEQ ID NO.14和47組成的序列、由SEQ ID NO.15和48組成的序列、由SEQID NO.16和49組成的序列、由SEQ ID NO.17和50組成的序列、由SEQ ID NO.18和51組成的序列、由SEQ ID NO.19和52組成的序列、由SEQ ID NO.20和53組成的序列、由SEQ ID NO.21和54組成的序列、由SEQ ID NO.22和55組成的序列、由SEQ ID NO.23和56組成的序列、由SEQID NO.24和57組成的序列、由SEQ ID NO.25和58組成的序列、由SEQ ID NO.26和59組成的序列、由SEQ ID NO.27和60組成的序列、由SEQ ID NO.28和61組成的序列、由SEQ ID NO.29和62組成的序列、由SEQ ID NO.30和63組成的序列、由SEQ ID NO.31和64組成的序列、由SEQID NO.32和65組成的序列、由SEQ ID NO.33和66組成的序列。
用于擴(kuò)增目標(biāo)序列的引物包括有SEQ ID NO.100~SEQ ID NO.101;SEQ ID NO.102~SEQ ID NO.103擴(kuò)增出一條具有另外五個突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列。
優(yōu)選地,所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列,更優(yōu)選為,間隔臂序列為5-10個T。
本發(fā)明的另一目的是提供使用上述液相芯片對乙肝病毒YMDD基序rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S和/或rtN236T突變進(jìn)行檢測的方法。
一種使用上述液相芯片對乙肝病毒YMDD基序rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S和rtN236T突變檢測的方法,主要包括以下步驟 (1)PCR擴(kuò)增待測樣品DNA,得PCR反應(yīng)產(chǎn)物; (2)PCR反應(yīng)產(chǎn)物用ExoSAP-IT試劑盒進(jìn)行酶切處理; (3)再用所述ASPE引物進(jìn)行引物延伸反應(yīng),在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP,從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個的生物素標(biāo)記; (4)將對應(yīng)ASPE引物的包被有特異的anti-tag序列的微球與上述延伸反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng); (5)雜交反應(yīng)后的產(chǎn)物與鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng); (6)通過熒光檢測儀檢測。
本發(fā)明的另一目的,是提供一種用于乙型肝炎病毒YMDD基序突變檢測液的特異性引物。
具體方案如下 一種用于乙型肝炎病毒YMDD基序突變檢測液的特異性引物,該引物包括分別針對rtL80I/V的SEQ ID NO.1-4;分別針對rtV173L的SEQ ID NO.5-7;分別針對rtL180M的SEQID NO.8-10;分別針對rtA181V/T的SEQ ID NO.11-19;分別針對rtM204V/I/S的SEQ IDNO.20-29;和/或分別針對rtN236T的SEQ ID NO.30-33。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于 1.本發(fā)明所提供的檢測方法與測序法的吻合率高,并且因其具有很高的靈敏度,可以檢測出測序法無法檢測到的低比例的混合突變。所制備的乙型肝炎病毒YMDD基序突變檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比,所設(shè)計(jì)的探針以及anti-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)。
2.本發(fā)明設(shè)計(jì)的ASPE特異性引物具有非常好的特異性,能準(zhǔn)確區(qū)分各種類型的突變位點(diǎn)。
3.本發(fā)明的檢測方法步驟簡單,使用多重ASPE技術(shù),6個突變位點(diǎn)檢測可在同一個反應(yīng)中完成,操作方便,并且避免了多次操作過程中存在的諸多不確定因素,因而可大大提高檢測準(zhǔn)確率。
4.本發(fā)明所提供的檢測方法所需要的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測序技術(shù),特別符合臨床需要。
5.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高,檢測結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷,同時(shí)對現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn),使得所制備微球能適用于不同的檢測項(xiàng)目,具有很強(qiáng)的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高,從而使得檢測的靈敏度進(jìn)一步得到提高,信噪比增強(qiáng),檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1乙型肝炎病毒YMDD基序突變檢測液相芯片,主要包括有 一、特異性引物序列和ASPE引物 針對與核苷類似物治療耐藥性相關(guān)的乙肝病毒YMDD基序的六個常見突變位點(diǎn)rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S和rtN236T分別設(shè)計(jì)特異性的引物序列。ASPE引物由Tag+特異性引物序列組成。ASPE引物序列如下表所示(SEQ ID NO.1~SEQ IDNO.33為特異性序列) 表1ASPE引物序列
表2ASPE特異性引物5’端的Tag序列
每條ASPE引物包括兩個部分,5’端為針對相應(yīng)微球上anti-tag序列的特異性tag序列(如表2所示),3’端為突變型或野生型特異的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。合成后的每條引物分別用10mmol/L Tris Buffer配制成1000pmol/mL的貯存液。
二、anti-tag序列包被的微球 根據(jù)所設(shè)計(jì)的ASPE特異性引物片段,選擇tag序列,最大限度地減少各微球的anti-tag序列之間以及tag與ASPE特異性引物片段可能形成的二級結(jié)構(gòu),選擇的三十三種tag序列及其微球上相應(yīng)的anti-tag序列如表3所示 表3微球上對應(yīng)的anti-tag序列
選擇的33種微球購自美國Luminex公司,將anti-tag序列包被與微球上。anti-tag序列與微球之間連接有5-10個T的間隔臂序,即在每個anti-tag序列前加上一段5-10個T的間隔臂序列,anti-tag序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。將合成的anti-tag序列用滅菌ddH2O配成100nmol/ml的貯存液。
所述間隔臂為用于將特異性的探針與微球表面間隔開來或是將特異性探針置于親水性環(huán)境中的序列。通過在探針序列與氨基之間設(shè)置適當(dāng)長度的間隔臂序列,可減少空間位阻,提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。常見的間隔臂序列包括多聚dT,即poly(dT),寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n間隔臂(n≥3),如(CH2)12、(CH2)18等。另外,如果存在poly(dA)干擾,還可以用poly(TTG)作為間隔臂。本發(fā)明間隔臂優(yōu)選為5-10個T,在中國,poly(dT)的合成技術(shù)比較成熟,成本相對較低。
微球包被的過程如下 分別取5×106個上述編號的羧基化的微球(購自Luminex公司)懸浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5),加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(購自Pierce Chemical公司)工作液。往微球懸液中加入2.5ul的EDC工作液,恒溫孵育30分鐘,再加入2.5ul的EDC工作液,再恒溫孵育30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后,用0.02%的Tween-20洗滌一次,再用0.1%的SDS液洗滌一次。將洗滌后的包被有anti-tag序列的微球重懸于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0),1mmol/LEDTA]中,2-8℃避光保存。
三、擴(kuò)增出具有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物 除rtL80I/V外,rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S和rtN236T五個突變位點(diǎn)相近。利用Primer5.0在乙肝病毒基因組的保守序列設(shè)計(jì)兩對引物(見表4),其中SEQ ID NO.100~SEQ ID NO.101擴(kuò)增出一條具有rtL80I/V突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列,SEQ ID NO.102~SEQ IDNO.103擴(kuò)增出一條具有另外五個突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列。
表4擴(kuò)增出具有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物 所有PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。合成后的每條引物分別用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的貯存液。
實(shí)施例2運(yùn)用乙型肝炎肝拉米夫定耐藥性檢測液相芯片對臨床樣本的檢測 所述各種溶液的配方如下 50mM的MES緩沖液(pH5.0)配方(250ml) 2×Tm雜交緩沖液 過濾后貯存于4℃。
ExoSAP-IT試劑盒購自美國USB公司。
生物素標(biāo)記的dCTP購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。
一、待測樣本的準(zhǔn)備(血清中病毒核酸的提取) 參照Omega病毒DNA提取試劑盒說明,提取得到待檢的病毒DNA。
二、待測樣品的PCR擴(kuò)增 利用Primer5.0在乙肝病毒基因組的保守序列設(shè)計(jì)兩對引物,多重PCR分別擴(kuò)增出乙肝病毒包含rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S和rtN236T所在位點(diǎn)的兩條序列,長度分別為和234bp和599bp。引物序列(SEQ ID NO.100~SEQ ID NO.103)見上述表4所示。
PCR反應(yīng)體系如下 10×緩沖液(含Mg2+)5μL dNTP(各2.5mM) 4μL Taq酶(5U/μL) 0.5μL 多重PCR引物工作液(各100nM)1μL 模板DNA 10μL ddH2O 29.5μL 共50μL PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃3min;94℃20s,60℃30s,72℃30s,35個循環(huán);72℃10min;4℃保存?zhèn)溆谩?br>
三、PCR產(chǎn)物的酶切處理 參照ExoSAP-IT試劑盒說明,詳細(xì)步驟如下 1.取7.5ul PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物,加入3ul ExoSAP-IT酶; 2.37℃孵育15min。80℃孵育15min,使多余的酶滅活。酶切處理后的產(chǎn)物直接用于后續(xù)的ASPE引物延伸反應(yīng)。
四、位點(diǎn)特異的引物延伸反應(yīng)(ASPE) 利用上述設(shè)計(jì)的位點(diǎn)特異性引物進(jìn)行引物延伸反應(yīng),在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP,從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個的生物素標(biāo)記。
首先配制混合的ASPE引物工作液分別各取SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.33的ASPE引物貯存液5ul于1.5ml微量離心管中,加入10mmol/L Tris Buffer補(bǔ)至1ml,混合均勻即為ASPE混合引物工作液。ASPE反應(yīng)的體系如下 10×緩沖液 2μL MgCl2(50mM) 0.5μL Biotin-dCTP(400.μM)0.25μL dATP、dGTP、dTTP混合液(各100μM)1μL Tsp酶(5U/μl) 0.25μL 混合的ASPE引物工作液(各500nM) 1μL 酶切處理的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 5μL ddH2O 10μL 共 20μL PCR程序?yàn)?6℃2min;94℃30s,52℃1min,74℃2min,30個循環(huán);4℃保存?zhèn)溆谩?br>
五、雜交反應(yīng) 1.根據(jù)設(shè)計(jì)的ASPE引物,選擇上述33種微球(微球濃度均為2.5×105個/ml)。每種微球分別帶有不同顏色編碼,同時(shí)每種微球表面分別連接有一段24bp的特異性的寡核苷酸序列(anti-tag),這些anti-tag序列能分別與對應(yīng)的ASPE引物5’端的tag序列特異結(jié)合; 2.分別取1ul每種編號的微球于1.5ml的微量離心管中; 3.微球于≥10000g離心1-2min; 4.棄去上清,微球重懸于100ul的2×Tm雜交緩沖液中,渦旋混勻; 5.取25ul上述微球懸液于96孔濾板相應(yīng)的孔中,對照孔加25ul的ddH2O; 6.取5-25ul的ASPE反應(yīng)液于相應(yīng)的孔中,用ddH2O補(bǔ)足至50ul; 7.用錫箔紙包住96孔板以避光,95℃60s,37℃15min孵育雜交; 8.雜交后的微球于≥3000g離心2-5min; 9.去上清,將微球重懸于75ul的1×Tm雜交緩沖液中; 10.微球于≥3000g離心2-5min; 11將微球重懸于75ul的1×Tm雜交緩沖液中,加入15ul濃度為10ug/ml的鏈酶親和素-藻紅蛋白(SA-PE); 12.37℃孵育15min,于Luminex儀器上檢測。
六、結(jié)果檢測與數(shù)據(jù)分析 反應(yīng)后產(chǎn)物通過Luminex系列分析儀器檢測。以聚苯乙烯微球作為反應(yīng)的載體,以熒光檢測儀作為檢測平臺,對核酸分子進(jìn)行高通量的多指標(biāo)并行檢測。在微球的制造過程中,摻入不同比例的紅光及紅外光染色劑,從而形成多至100種不同顏色編碼的微球。不同的微球共價(jià)結(jié)合了針對不同待檢測物的核酸分子作為探針分子,報(bào)告分子以生物素標(biāo)記,并用高靈敏的熒光染料染色。這些微球與待測物、報(bào)告分子、熒光標(biāo)記物就形成完整的微球檢測體系用于Luminex系統(tǒng)的讀取。Luminex閱讀系統(tǒng)分別激發(fā)紅色激光和綠色激光用于微球體系的檢測,檢測結(jié)果大于100為cut-off值 (1)當(dāng)突變型探針HBV-L80I-m的MFI值大于100時(shí),判定該樣品存在L80I突變; (2)當(dāng)突變型探針HBV-L80V-m的MFI值大于100時(shí),判定該樣品存在L80V突變; (3)當(dāng)突變型探針HBV-V173L-m1或HBV-V173L-m2的MFI值大于100時(shí),判定該樣品存在V173L突變; (4)當(dāng)突變型探針HBV-L180M-m的MFI值大于100時(shí),判定該樣品存在L180M突變; (5)當(dāng)突變型探針HBV-A181V-m1、HBV-A181V-m2或HBV-A181V-m3的MFI值大于100時(shí),判定該樣品存在A181V突變; (6)當(dāng)突變型探針HBV-A181T-m1、HBV-A181T-m2或HBV-A181T-m3的MFI值大于100時(shí),判定該樣品存在A181T突變; (7)當(dāng)突變型探針HBV-M204V-m1或HBV-M204V-m2的MFI值大于100時(shí),判定該樣品存在M204V突變; (8)當(dāng)突變型探針HBV-M204I-m1或HBV-M204I-m2的MFI值大于100時(shí),判定該樣品存在M204I突變; (9)當(dāng)突變型探針HBV-M204S-m1或HBV-M204S-m2的MFI值大于100時(shí),判定該樣品存在M204S突變; (10)當(dāng)突變型探針HBV-N236T-m1或HBV-N236T-m2的MFI值大于100時(shí),判定該樣品存在N236T突變; (11)如不存在以上幾種突變,則判定該樣品為YMDD野生型。
以測序法檢測與液相芯片結(jié)果作對照,計(jì)算本發(fā)明所提供的檢測方法檢測結(jié)果的吻合率。本方法檢測15份樣本(接受拉米夫定治療約1年)的乙型肝炎病毒YMDD基序突變檢測結(jié)果與測序結(jié)果吻合率達(dá)到93.3%(不吻合的一例可能是因?yàn)闇y序法的靈敏度不足)??梢姳景l(fā)明所提供的乙型肝炎病毒YMDD基序突變檢測液相芯片能夠準(zhǔn)確地檢測出rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S和rtN236T六個位點(diǎn)的突變,且結(jié)果穩(wěn)定可靠。
表5乙型肝炎病毒YMDD基序突變檢測分析結(jié)果
實(shí)施例3 Tag序列及Anti-Tag序列的選擇 一、液相芯片制備的設(shè)計(jì) 以rtL180M突變的檢測液相芯片為例,針對rtL180M的野生型和突變型設(shè)計(jì)的ASPE引物3’端的特異性引物,而ASPE引物5’端的Tag序列則選自SEQ ID NO.33-SEQ ID NO.66中的3條,相應(yīng)的,包被于微球上的與對應(yīng)tag序列互補(bǔ)配對的anti-tag序列選擇SEQ ID NO.67-SEQID NO.99。具體設(shè)計(jì)如下表(表5)所示。ASPE引物的合成、Anti-tag序列包被微球、擴(kuò)增引物等如實(shí)施例1所述。
表7
二、樣品檢測 采用上述設(shè)計(jì)制備的液相芯片,按實(shí)施例2所述檢測過程和方法對血清樣品1-10進(jìn)行檢測,檢測結(jié)果如下(表中數(shù)據(jù)為檢測熒光值)
三、數(shù)據(jù)分析 根據(jù)上述檢測的熒光值,可以看出Group1、Group2和Group3這三組的液相芯片對相同樣品的檢測結(jié)果一致。因此,ASPE引物中,ASPE特異性引物5’端的Tag序列并不是唯一的,而是可以在本發(fā)明SEQ ID NO.33-SEQ ID NO.66中進(jìn)行選擇,相應(yīng)的,包被于微球上的Anti-tag序列須根據(jù)互補(bǔ)配對的原則,從SEQ ID NO.67-SEQ ID NO.99中選擇對應(yīng)的序列。
其它針對不同的基序突變位點(diǎn)的液相芯片,ASPE引物運(yùn)用不同的Tag序列,其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠,具體數(shù)據(jù)省略。
以上是針對本發(fā)明的可行實(shí)施例的具體說明,但該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍,凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為的等效實(shí)施或變更,均應(yīng)包含于本發(fā)明的專利范圍中。
序列表
<110>廣州益善生物技術(shù)有限公司
<120>乙型肝炎病毒YMDD基序突變檢測特異性引物、液相芯片及方法
<160>103
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cagacacatc cagcgataa 19
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cagacacatc cagcgatag 19
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
cagacacatc cagcgatat 19
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cagacacatc cagcgatac 19
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
aaacggactg aggcccac 18
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
aaacggactg aggcccag 18
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
aaacggactg aggcccaa 18
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
gcctcagtcc gtttctct 18
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
gcctcagtcc gtttctcc 18
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
gcctcagtcc gtttctca 18
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
tcagtccgtt tctcttggc 19
<210>12
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
tcagtccgtt tctcctggc 19
<210>13
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
tcagtccgtt tctcatggc 19
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
ctcagtccgt ttctcttga 19
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
ctcagtccgt ttctcctga 19
<210>16
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
ctcagtccgt ttctcatga 19
<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
tcagtccgtt tctcttggt 19
<210>18
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
tcagtccgtt tctcctggt 19
<210>19
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
tcagtccgtt tctcatggt 19
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
cactgtctgg ctttcagtta ta 22
<210>21
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
cactgtttgg ctttcagtta ta 22
<210>22
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
ctgtctggct ttcagttata tg 22
<210>23
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
ctgtttggct ttcagttata tg 22
<210>24
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
cactgtctgg ctttcagtta tg 22
<210>25
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
cactgtttgg ctttcagtta tg 22
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
ctgtctggct ttcagttata tt 22
<210>27
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
ctgtttggct ttcagttata tt 22
<210>28
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
ctgtctggct ttcagttata gt 22
<210>29
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
ctgtttggct ttcagttata gt 22
<210>30
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
tgtctttggg tatacattta aa 22
<210>31
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
tgtctttggg tatacatttg aa 22
<210>32
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
tgtctttggg tatacattta ac 22
<210>33
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
tgtctttggg tatacatttg ac 22
<210>34
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>34
tcaatcaatt acttactcaa atac 24
<210>35
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
tcaattacct tttcaataca atac 24
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
aatcttacta caaatccttt cttt 24
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
ttcacttttc aatcaacttt aatc 24
<210>38
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
cttttacaat acttcaatac aatc 24
<210>39
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
cttttcaatt acttcaaatc ttca 24
<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
cttttcaaat caatactcaa cttt 24
<210>41
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
tcatttcaca attcaattac tcaa 24
<210>42
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
tacatcaaca attcattcaa taca 24
<210>43
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
tatatacact tctcaataac taac 24
<210>44
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
tcaattactt cactttaatc cttt 24
<210>45
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>45
tcattcatat acataccaat tcat 24
<210>46
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
caattcattt cattcacaat caat 24
<210>47
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
tcatttcaat caatcatcaa caat 24
<210>48
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>48
tcaatcatct ttatacttca caat 24
<210>49
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>49
taattataca tctcatcttc taca 24
<210>50
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>50
tcaatcatta cacttttcaa caat 24
<210>51
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>51
tacacaatct tttcattaca tcat 24
<210>52
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
cttctcatta acttacttca taat 24
<210>53
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>53
cttttcatca ataatcttac cttt 24
<210>54
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>54
ttcaatcatt caaatctcaa cttt 24
<210>55
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>55
caatatcatc atctttatca ttac 24
<210>56
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>56
ctactaattc attaacatta ctac 24
<210>57
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>57
ttactacaca atatactcat caat 24
<210>58
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>58
ctttctacat tattcacaac atta 24
<210>59
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>59
taacattaca actatactat ctac 24
<210>60
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>60
tcatttactc aacaattaca aatc 24
<210>61
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>61
tcatttacct ttaatccaat aatc 24
<210>62
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>62
atcaaatctc atcaattcaa caat 24
<210>63
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>63
aatcctttct ttaatctcaa atca 24
<210>64
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>64
ctttaatcct ttatcacttt atca 24
<210>65
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>65
tacacatctt acaaactaat ttca 24
<210>66
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>66
aatcaatctt cattcaaatc atca 24
<210>67
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>67
gtatttgagt aagtaattga ttga 24
<210>68
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>68
gtattgtatt gaaaaggtaa ttga 24
<210>69
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>69
aaagaaagga tttgtagtaa gatt 24
<210>70
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>70
gattaaagtt gattgaaaag tgaa 24
<210>71
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>71
gattgtattg aagtattgta aaag 24
<210>72
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>72
tgaagatttg aagtaattga aaag 24
<210>73
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>73
aaagttgagt attgatttga aaag 24
<210>74
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>74
ttgagtaatt gaattgtgaa atga 24
<210>75
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>75
tgtattgaat gaattgttga tgta 24
<210>76
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>76
gttagttatt gagaagtgta tata 24
<210>77
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>77
aaaggattaa agtgaagtaa ttga 24
<210>78
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>78
atgaattggt atgtatatga atga 24
<210>79
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>79
attgattgtg aatgaaatga attg 24
<210>80
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>80
attgttgatg attgattgaa atga 24
<210>81
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>81
attgtgaagt ataaagatga ttga 24
<210>82
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>82
tgtagaagat gagatgtata atta 24
<210>83
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>83
attgttgaaa agtgtaatga ttga 24
<210>84
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>84
atgatgtaat gaaaagattg tgta 24
<210>85
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>85
attatgaagt aagttaatga gaag 24
<210>86
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>86
aaagg taaga ttattgatga aaag 24
<210>87
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>87
aaagttgaga tttgaatgat tgaa 24
<210>88
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>88
gtaatgataa agatgatgat attg 24
<210>89
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>89
gtagtaatgt taatgaatta gtag 24
<210>90
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>90
attgatgagt atattgtgta gtaa 24
<210>91
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>91
taatgttgtg aataatgtag aaag 24
<210>92
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>92
gtagatagta tagttgtaat gtta 24
<210>93
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>93
gatttgtaat tgttgagtaa atga 24
<210>94
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>94
gattattgga ttaaaggtaa atga 24
<210>95
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>95
attgttgaat tgatgagatt tgat 24
<210>96
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>96
tgatttgaga ttaaagaaag gatt 24
<210>97
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>97
tgataaagtg ataaaggatt aaag 24
<210>98
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>98
tgaaattagt ttgtaagatg tgta 24
<210>99
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>99
tgatgatttg aatgaagatt gatt 24
<210>100
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>100
gagtctagac tcgtggtgga ct 22
<210>101
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>101
ggacaaacgg gcaacatacc20
<210>102
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>102
cacttgtatt cccatcccat c 21
<210>103
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>103
gcgtcagcaa acacttggca20
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎病毒YMDD基序突變檢測液相芯片,其特征是,主要包括有
(1).ASPE引物每種ASPE引物由3’端的針對目的基序突變的特異性引物序列和5’端的tag序列組成,所述針對目的基序突變的特異性引物序列包括有分別針對rtL80I/V的SEQID NO.1-4;分別針對rtV173L的SEQ ID NO.5-7;分別針對rtL180M的SEQ ID NO.8-10;分別針對rtA181V/T的SEQ ID NO.11-19;分別針對rtM204V/I/S的SEQ ID NO.20-29;和/或分別針對rtN236T的SEQ ID NO.30-33;所述對應(yīng)的tag序列選自SEQ ID NO.34-66;
(2).分別包被有特異的anti-tag序列的微球,所述anti-tag序列與(1)中所選的tag序列互補(bǔ)配對,所述anti-tag序列選自SEQ ID NO.67-99,上述每種微球具有不同顏色編碼;
(3).用于擴(kuò)增具有突變位點(diǎn)rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S、和/或rtN236T的目標(biāo)序列的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基序突變檢測液相芯片,其特征是,
所述用于擴(kuò)增目標(biāo)序列的引物包括為SEQ ID NO.100~SEQ ID NO.101;和/或SEQ IDNO.102~SEQ ID NO.103。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒YMDD基序突變檢測液相芯片,其特征是,主要包括有
(1).ASPE引物,包括有針對rtL80I/V的由SEQ ID NO.1和34組成的序列、由SEQ ID NO.2和35組成的序列、由SEQ ID NO.3和36組成的序列、和由SEQ ID NO.4和37組成的序列;分別針對rtV173L的由SEQ ID NO.5和38組成的序列、由SEQ ID NO.6和39組成的序列和由SEQ ID NO.7和40組成的序列;分別針對rtL180M的由SEQ ID NO.8和41組成的序列、由SEQ ID NO.9和42組成的序列和由SEQ ID NO.10和43組成的序列;分別針對rtA181V/T的由SEQ ID NO.11和44組成的序列、由SEQ ID NO.12和45組成的序列、由SEQ ID NO.13和46組成的序列、由SEQ ID NO.14和47組成的序列、由SEQ ID NO.1 5和48組成的序列、由SEQ ID NO.16和49組成的序列、由SEQ ID NO.17和50組成的序列、由SEQ ID NO.18和51組成的序列和由SEQ ID NO.19和52組成的序列;分別針對rtM204V/I/S的由SEQ IDNO.20和53組成的序列、由SEQ ID NO.21和54組成的序列、由SEQ ID NO.22和55組成的序列、由SEQ ID NO.23和56組成的序列、由SEQ ID NO.24和57組成的序列、由SEQ IDNO.25和58組成的序列、由SEQ ID NO.26和59組成的序列、由SEQ ID NO.27和60組成的序列、由SEQ ID NO.28和61組成的序列和由SEQ ID NO.29和62組成的序列;和/或分別針對rtN236T的由SEQ ID NO.30和63組成的序列、由SEQ ID NO.31和64組成的序列、由SEQID NO.32和65組成的序列和由SEQ ID NO.33和66組成的序列;
(2).分別包被有特異的anti-tag序列的微球,所述anti-tag序列與(1)中所選的tag序列互補(bǔ)配對,所述anti-tag序列選自SEQ ID NO.67-99,上述每種微球具有不同顏色編碼;
(3).用于擴(kuò)增具有突變位點(diǎn)rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S、和/或rtN236T的目標(biāo)序列的引物,所述引物為 SEQ ID NO.100~SEQ ID NO.101; 和/或SEQ ID NO.102~SEQ ID NO.103。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的乙型肝炎病毒YMDD基序突變檢測液相芯片,其特征是,所述anti-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的乙型肝炎病毒YMDD基序突變檢測液相芯片,其特征是,所述間隔臂序列為5-10個T。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的乙型肝炎病毒YMDD基序突變檢測液相芯片,其特征是,
所述ASPE引物包括由SEQ ID NO.1和34組成的序列、由SEQ ID NO.2和35組成的序列、由SEQ ID NO.3和36組成的序列、由SEQ ID NO.4和37組成的序列、由SEQ ID NO.5和38組成的序列、由SEQ ID NO.6和39組成的序列、由SEQ ID NO.7和40組成的序列、由SEQ ID NO.8和41組成的序列、由SEQ ID NO.9和42組成的序列、由SEQ ID NO.10和43組成的序列、由SEQID NO.11和44組成的序列、由SEQ ID NO.12和45組成的序列、由SEQ ID NO.13和46組成的序列、由SEQ ID NO.14和47組成的序列、由SEQ ID NO.15和48組成的序列、由SEQ ID NO.16和49組成的序列、由SEQ IDNO.17和50組成的序列、由SEQ ID NO.18和51組成的序列、由SEQID NO.19和52組成的序列、由SEQ ID NO.20和53組成的序列、由SEQ ID NO.21和54組成的序列、由SEQ ID NO.22和55組成的序列、由SEQ ID NO.23和56組成的序列、由SEQ ID NO.24和57組成的序列、由SEQ ID NO.25和58組成的序列、由SEQ ID NO.26和59組成的序列、由SEQID NO.27和60組成的序列、由SEQ ID NO.28和61組成的序列、由SEQ ID NO.29和62組成的序列、由SEQ ID NO.30和63組成的序列、由SEQ ID NO.31和64組成的序列、由SEQ ID NO.32和65組成的序列、和由SEQ ID NO.33和66組成的序列;
所述引物為SEQ ID NO.100~SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.102~SEQ ID NO.103。
7.一種使用權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述液相芯片對乙肝病毒YMDD基序突變檢測的方法,主要包括以下步驟
(1)PCR擴(kuò)增待測樣品DNA,得PCR反應(yīng)產(chǎn)物;
(2)PCR反應(yīng)產(chǎn)物用ExoSAP-IT試劑盒進(jìn)行酶切處理;
(3)再用所述ASPE引物進(jìn)行引物延伸反應(yīng),在反應(yīng)過程中摻入生物素標(biāo)記的dCTP,從而使反應(yīng)后的產(chǎn)物帶上多個的生物素標(biāo)記;
(4)將對應(yīng)ASPE引物的包被有特異的anti-tag序列的微球與上述延伸反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng);
(5)雜交反應(yīng)后的產(chǎn)物與鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng);
(6)通過熒光檢測儀檢測。
8.一種用于乙型肝炎病毒YMDD基序突變檢測液的特異性引物,其特征是,該引物包括分別針對rtL80I/V的SEQ ID NO.1-4;分別針對rtV173L的SEQ ID NO.5-7;分別針對rtL180M的SEQ ID NO.8-10;分別針對rtA181V/T的SEQ ID NO.11-19;分別針對rtM204V/I/S的SEQ ID NO.20-29;和/或分別針對rtN236T的SEQ ID NO.30-33。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乙型肝炎病毒YMDD基序突變檢測特異性引物、液相芯片和方法,該液相芯片主要包括有ASPE引物;包被有特異的anti-tag序列的微球;用于擴(kuò)增具有突變位點(diǎn)rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtM204V/I/S、和/或rtN236T的目標(biāo)序列的引物。本發(fā)明所述檢測液相芯片及檢測方法的檢測靈敏度高,信噪比強(qiáng),檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。并且可以將6個突變位點(diǎn)檢測可在同一個反應(yīng)中完成,操作方便,并且避免了多次操作過程中存在的諸多不確定因素,因而可大大提高檢測準(zhǔn)確率。
文檔編號C12Q1/70GK101633963SQ20091004179
公開日2010年1月27日 申請日期2009年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月11日
發(fā)明者許嘉森, 楊惠夷, 何嘉英 申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司