專利名稱：一種融合蛋白及其用于檢測(cè)莢膜組織胞漿菌的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及融合蛋白及莢膜組織胞漿菌的檢測(cè)，特別涉及用酶聯(lián)免疫吸附 試驗(yàn)檢測(cè)莢膜組織胞漿菌的方法。
背景技術(shù)：
莢膜組織胞漿菌病(Histoplasmosis, HP)由雙相型真菌莢膜組織胞漿菌 (Histoplasma capsulatum, HC)引起。我國(guó)自1958年報(bào)道首例HP以來(lái)，陸續(xù)有 該病的臨床報(bào)道。但由于莢膜組織胞漿菌病的臨床癥狀與肺結(jié)核、黑熱病相似； 病理形態(tài)又極易與馬爾尼菲青酶菌、杜氏利什曼原蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、新型隱球菌等 相混淆，而國(guó)內(nèi)臨床醫(yī)務(wù)工作者又對(duì)該病的認(rèn)識(shí)普遍不足，故存在高漏診率和 高誤診率現(xiàn)象，播散型HP常因未得到及時(shí)正確的治療而死亡。因此加強(qiáng)對(duì)HP
快速診斷的研究成為必要，以期能盡量減少國(guó)內(nèi)較高的漏診誤診現(xiàn)狀，降低該 病的病死率。
目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于HP的診斷有如下幾種方法
1. 真菌培養(yǎng)取臨床標(biāo)本接種固體或液體培養(yǎng)基，觀察菌落特征與鏡下形 態(tài)、霉菌相與酵母相的轉(zhuǎn)化；尿素酶反應(yīng)等。該方法特異性好，為判斷HP的金 標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，不便于早期快速篩査。
2. 病理學(xué)檢査取病變組織涂片、固定、染色，鏡下觀察莢膜組織胞漿菌 形態(tài)特征。但由于組織胞漿菌病理形態(tài)與杜氏利什曼原蟲(chóng)等相似，故該方法難 以大規(guī)模推廣。
3. 變態(tài)反應(yīng)接種莢膜組織胞漿菌于葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)一段時(shí) 間后，轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清，經(jīng)純化處理后，制得莢膜 組織胞漿菌素。使用時(shí)，疑似患者前臂屈肌表面皮內(nèi)注射該莢膜組織胞漿菌素， 注射后48小時(shí)觀察紅腫及結(jié)塊大小，以5毫米作為陽(yáng)性片段標(biāo)準(zhǔn)。皮試陽(yáng)性揭示 曾受過(guò)或正在受莢膜組織胞漿菌感染，有一定的診斷價(jià)值。但由于莢膜組織胞 漿菌素組成成份復(fù)雜，與其它病菌的組成成份相互交叉，所以可能存在一定程 度上的假陽(yáng)性。
4. 血清學(xué)診斷以往莢膜組織胞漿菌血清學(xué)檢査常用到的方法有免疫雙擴(kuò)
法、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)等。近年來(lái)血清學(xué)診斷有所發(fā)展，通過(guò)檢測(cè)血液、腦脊液和 尿液中的莢膜組織胞漿菌抗原成份以判斷感染莢膜組織胞漿菌與否。此方法靈 敏度高、操作簡(jiǎn)便，可提供早期診斷依據(jù)。必須指出的是，血清學(xué)診斷的敏感 性和特異性與用于檢測(cè)的抗原/抗體的活性及其特異性密切相關(guān)。目前用于檢測(cè)莢膜組織胞漿菌抗體的抗原來(lái)源于莢膜組織胞漿菌蛋白提取物，其制備工藝復(fù) 雜，并且耗時(shí)、耗力，更為嚴(yán)重的是其成份復(fù)雜，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果靈敏度高但特 異性差。
5.基因診斷:通過(guò)PCR方法擴(kuò)增莢膜組織胞漿菌的特異性基因片段以用于該 菌的鑒定、分型及流行病學(xué)調(diào)查。該方法敏感性好、特異性高，但由于儀器的 限制，該方法無(wú)法在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)大規(guī)模推廣。
因此，建立一種快速、簡(jiǎn)單，特異性好的莢膜組織胞漿菌的檢測(cè)方法，將 對(duì)莢膜組織胞漿菌病的大規(guī)模臨床鑒別診斷及快速診斷具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種莢膜組織胞槳菌融合蛋白M-GH17及編碼 該融合蛋白的DNA，以及該融合蛋白在檢測(cè)莢膜組織胞漿菌中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種將莢膜組織胞漿菌融合蛋白M-GH17基因 轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并通過(guò)載體特異性表達(dá)莢膜組織胞漿菌融合蛋白M-GH17的方法。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種包含莢膜組織胞漿菌融合蛋白M-GH17的 ELISA試劑盒及其用于檢測(cè)莢膜組織胞漿菌的用途。
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，發(fā)明人以分離的莢膜組織胞漿菌基因組DNA為模板， 通過(guò)PCR方法擴(kuò)增得到M基因(GenBank登錄號(hào)為AF026268)的特異性片段 和GH17基因(GenBank登錄號(hào)為ACU27588)的特異性片段；所說(shuō)的M基因 片段和GH17基因片段的核苷酸序列分別如序列表SEQIDNo: 1和SEQIDNo: 2所示。在原核表達(dá)載體中定向插入莢膜組織胞漿菌M基因片段，構(gòu)建得到M 基因片段的重組原核表達(dá)載體；在該重組原核表達(dá)載體中再定向插入莢膜組織 胞漿菌GH17基因片段，構(gòu)建得到M-GH17基因片段重組原核表達(dá)載體；將 M-GH17重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，篩選重組單克隆，誘導(dǎo)后特異性表達(dá)， 得到融合蛋白M-GH17。
本發(fā)明中，原核表達(dá)載體最好選用PET-28a(+)。 M-GH17重組原核表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞時(shí)，宿主細(xì)胞選用大腸桿菌。采用卡那青霉素抗性篩選重組菌單 克隆，以丙基硫代-P-D-半乳糖苷誘導(dǎo)后特異性表達(dá)，分離純化后得到。
本發(fā)明制備融合蛋白M-GH17的更進(jìn)一步的詳細(xì)步驟為
1) 以分離的莢膜組織胞漿菌基因組DNA為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增得到 莢膜組織胞漿菌M基因片段和GH17基因片段。
2) 在原核表達(dá)載體PET-28a(+)的多克隆位點(diǎn)Ndel和BamHI之間定向插 入莢膜組織胞漿菌M基因片段，構(gòu)建得到重組原核表達(dá)載體PET-28a(+)-M。
3) 在重組原核表達(dá)載體PET-28a(+)-M的多克隆位點(diǎn)EcoRI和Xhol之間
4定向插入莢膜組織胞漿菌GH17基因片段，構(gòu)建得到重組原核表達(dá)載體 PET-28a(+)-M-GH17。
4)重組原核表達(dá)載體PET-28a(+)-M-GH17轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài) 細(xì)胞，用卡那青霉素抗性篩選重組菌單克隆，重組表達(dá)菌株接種LB液體培養(yǎng)基 培養(yǎng)，異丙基硫代-P-D-半乳糖苷誘導(dǎo)，Western-blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)該重組表達(dá)菌株能 夠特異性表達(dá)莢膜組織胞漿菌融合蛋白M-GH17，以包涵體形式存在，分離純化 得到融合蛋白M-GH17。
利用上述制得的融合蛋白M-GH17，發(fā)明人還制備出用于莢膜組織胞漿菌鑒 別診斷的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒將純化得到的M-GH17融合蛋白、 莢膜組織胞漿菌感染標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、包被液、封閉液、洗滌液、 顯色液A、顯色液B、終止液組裝成莢膜組織胞漿菌鑒別診斷試劑盒。具體溶液 配方如下
包被液Na2C031.5g， NaHC032.9g,加雙蒸水定容至1000mL(pH9.6)。 封閉液Na2HP04.12H20 2.68g， NaH2P04.2H20 0.39g, NaCl 8.5g， 20g牛血
清白蛋白，加雙蒸水定容至1000mL(pH7.4)。 洗滌液Na2HPO4.12H2O2.68g，NaH2PO4.2H2O0.39g,NaCl 8.5g， Tween-20
0.5mL，加雙蒸水定容至1000mL(pH7.4)。 顯色液A: 200mgTMB溶于100mL無(wú)水乙醇，加雙蒸水定容至1000mL。 顯色液B:檸檬酸2.1g，Na2HP04.12H20 71g，加雙蒸水定容至1000mL。使用
時(shí)lmL顯色液A+ lmL顯色液B+0.4pL 30%H2O2 終止液2M H2S04， 21.7mL濃H2S04加雙蒸水定容至lOOOmL。 用本發(fā)明的包含融合蛋白M-GH17的ELISA試劑盒，按照普通ELISA方法檢 測(cè)待測(cè)血清，根據(jù)終止后的吸光值確定陽(yáng)性、陰性、可疑的判斷臨界值，即可 對(duì)待測(cè)血清樣本進(jìn)行莢膜組織胞漿菌檢測(cè)。
相對(duì)于現(xiàn)有的莢膜組織胞漿菌檢測(cè)方法，本發(fā)明具有以下的優(yōu)點(diǎn)和有益效 果本發(fā)明通過(guò)查找目前已知的莢膜組織胞漿菌基因序列，比對(duì)其它病原微生 物相關(guān)序列，計(jì)算機(jī)模擬該抗原優(yōu)勢(shì)表位，兼顧敏感性和特異性，最終確定選 取莢膜組織胞漿菌M基因片段和GH17基因片段作為目的序列，并采用分子生物 學(xué)技術(shù)創(chuàng)造性的將此兩個(gè)基因片段融合表達(dá)，得到莢膜組織胞漿菌融合蛋白 M-GH17，并利用此融合蛋白建立酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)方法，用于莢膜組 織胞漿菌的血清學(xué)診斷。本發(fā)明與現(xiàn)有血清學(xué)方法檢測(cè)莢膜組織胞槳菌相比， 由于抗原特異性得到了極大提高，所以檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，極大程度得降低了 誤診率；同時(shí)由于抗原是由莢膜組織胞漿菌優(yōu)勢(shì)抗原表位融合表達(dá)制得，所以其檢測(cè)敏感性并沒(méi)有降低。此外，該融合抗原制備方法簡(jiǎn)單易行，純化工藝成
熟，適合工業(yè)化大量生產(chǎn)。利用該融合蛋白作為包被抗原組裝成ELISA試劑盒， 操作簡(jiǎn)單易行，使用準(zhǔn)確、快速，相對(duì)于目前培養(yǎng)增殖莢膜組織胞漿菌，以莢 膜組織胞漿菌素為檢測(cè)試劑的檢測(cè)方法，本檢測(cè)方法生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單實(shí)用、生產(chǎn) 成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)和大規(guī)模臨床診斷所需，本發(fā)明的ELISA試劑盒將為莢 膜組織胞漿菌的防治提供強(qiáng)有力的工具。
本發(fā)明所涉及到的原核表達(dá)載體PET-28a(+)是基因工程領(lǐng)域最常用的原核 表達(dá)載體之一，沒(méi)有生物危險(xiǎn)性。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建得到的重組原核表達(dá)載體 PET-28a(+)-M-GH17也不具有任何生物危險(xiǎn)性。構(gòu)建融合蛋白M-GH17所用的大 腸桿菌菌株為BL21(DE3)，該菌株為分子生物學(xué)領(lǐng)域最常用的表達(dá)菌株之一，也 不具有生物危險(xiǎn)性。整個(gè)制備過(guò)程安全性高，不存在莢膜組織胞槳菌污染、擴(kuò) 散的潛在風(fēng)險(xiǎn)。


圖1顯示的是原核表達(dá)載體PET-28a(+)-M-GH17構(gòu)建流程圖； 圖2顯示的是誘導(dǎo)表達(dá)并純化后的融合蛋白M-GH17的SDS-PAGE電泳圖； 圖3顯示的是融合蛋白M-GH17的Western-blot檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
以下用具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
一、 莢膜組織胞漿菌M基因片段的克隆
如附圖1所示，將莢膜組織胞漿菌接種于葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25。C培 養(yǎng)3周后收集并提取其基因組DNA。以所提取的莢膜組織胞漿菌基因組DNA為模 板，通過(guò)PCR方法得到莢膜組織胞漿菌M基因片段，引物序列如下 Fl: 5' GCCATATGCCTCTAAACACGGCCGC 3'(上游引物) Rl: 5'GCGGATCCTTTGTTGTTGGCGCTGTTAA 3'(下游引物) PCR反應(yīng)條件為9《C變性1分鐘，55。C退火15秒，72"C延伸40秒，總共30個(gè) 循環(huán)，最后再72'C延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物行1X瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收并連接 pMD19-T載體(命名為T-M)，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒， 經(jīng)酶切及測(cè)序得到M基因片段的序列(如序列表SEQIDNo: l所示)。
二、 莢膜組織胞漿菌GH17基因片段的克隆
將莢膜組織胞漿菌接種于葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25。C培養(yǎng)3周后收集并 提取其基因組DNA。以所提取的莢膜組織胞漿菌基因組DNA為模板，通過(guò)PCR 方法得到莢膜組織胞漿菌GH17基因片段，引物序列如下
Fl:5' GCGAATTCGGCCAGGTTTGGGCG 3'(上游引物)<formula>formula see original document page 7</formula>
PCR反應(yīng)條件為94'C變性1分鐘，55'C退火15秒，72。C延伸30秒，總共30個(gè) 循環(huán)，最后再72'C延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物行1X瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收并連接 pMD19-T載體(命名為T-GH17)，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì) 粒，經(jīng)酶切及測(cè)序得到GH17基因片段的序列(如序列表SEQIDNo:2所示)。
三、 重組原核表達(dá)載體PET-28a(+)-M的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶Ndel和BamHI于37'C分別雙酶切T-M載體和PET-28a(+) 載體12小時(shí)，酶切產(chǎn)物分別行1%瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收M基因片段和 PET-28a(+)載體。使用T4連接酶將回收的M基因片段和PET-28a(+)載體于4°C 過(guò)夜連接后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50 ug/mL)的LB平板，于37。C過(guò)夜培養(yǎng)。第二日，挑取平板上單克隆菌株至含卡 那青霉素抗性(50ug/mL)的LB液體培養(yǎng)基，37"C恒溫?fù)u床培養(yǎng)12小時(shí)后，堿 裂解纟去提取質(zhì)粒，經(jīng)Ndel和BamHI雙酶切鑒定后得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為 PET-28a(+)-M。
四、 重組原核表達(dá)載體PET-28a(+)-M-GH17的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xhol于37t:分別雙分別酶切T-GH17載體和 PET-28a(+)-M載體12小時(shí)，酶切產(chǎn)物分別行1%瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收 GH17基因片段和PET-28a(+)-M載體。使用T4連接酶將回收的GH17基因片段 和PET-28a(+)-M載體于4'C過(guò)夜連接后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，并 涂布于含卡那青霉素抗性(50ug/mL)的LB平板，于37"C過(guò)夜培養(yǎng)。第二日，挑 取平板上單克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50 u g/mL)的LB液體培養(yǎng)基，37'C恒 溫?fù)u床培養(yǎng)12小時(shí)后，堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI和Xhol雙酶切鑒定后得 到陽(yáng)'性重組質(zhì)粒，命名為PET-28a(+)-M-GH17。
五、 融合蛋白M-GH17表達(dá)菌株的構(gòu)建
將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體PET-28a(+)-M-GH17轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞， 并涂布于含卡那青霉素抗性(50yg/mL)的LB平板，于37。C過(guò)夜培養(yǎng)。第二曰， 挑取數(shù)個(gè)平板上單克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50 u g/mL)的LB液體培養(yǎng)基， 37'Ct亙 顯搖床培養(yǎng)12小時(shí)后，分別取部分菌液保存并制備蛋白電泳樣品，剩余 菌液i勾加誘導(dǎo)劑異丙基硫代-e-D-半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)4個(gè)小時(shí)后制備蛋白電泳 樣品。纟各誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的蛋白電泳樣品于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，并使用 考馬斯亮藍(lán)溶液染色。染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)前樣品無(wú)融合蛋白M-GH17表達(dá)， 而誘導(dǎo)后樣品明顯表達(dá)融合蛋白M-GH17。以上結(jié)果說(shuō)明制備得到融合蛋白
7M-GH17表達(dá)菌株。
六、 最佳誘導(dǎo)物濃度的確定
將融合蛋白M-GH17表達(dá)菌株在LB平板上劃線，37'C過(guò)夜培養(yǎng)后挑取挑取 單個(gè)菌落接種于5mL LB液體培養(yǎng)基，加卡那青霉素至終濃度為50pg/mL， 37°C 搖床培養(yǎng)12小時(shí)后，用卡那青霉素濃度為50pg/mL的LB液體培養(yǎng)基將該菌液 按l:100稀釋，分裝至5支試管(每管5mL),置37°。直溫?fù)u床培養(yǎng)至00600=0.7， 分別加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度分別為0丄Ommol/L、 0.2mmol/L、 0.5mmol/L、 0.8mmol/L、 1.0mmol/L、 1.5mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí) 后取等量菌液進(jìn)行聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，根據(jù)融合蛋白M-GH17 表達(dá)量確定最佳異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)濃度為1.0mmol/L。
七、 最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定
將融合蛋白M-GH17表達(dá)菌株在LB平板上劃線，37。C過(guò)夜培養(yǎng)后挑取挑取 單個(gè)菌落接種于5mL LB液體培養(yǎng)基，加卡那青霉素至終濃度為50|ig/mL, 37°C 搖床培養(yǎng)12小時(shí)后，用卡那青霉素濃度為50pg/mL的LB液體培養(yǎng)基將該菌液 按1:100稀釋，分裝至5支試管(每管5mL)，置37"C恒溫?fù)u床培養(yǎng)至OD600=0.7， 加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為最佳誘導(dǎo)濃度 1.0mmol/L，分別誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時(shí)、3.5小時(shí)、4小時(shí)、4.5小時(shí)、5小時(shí)后取等 量菌液進(jìn)行聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)， SDS-PAGE電泳圖參見(jiàn)附圖2， 圖中1、 2為純化M-GH17融合蛋白，3為蛋白Marker。根據(jù)融合蛋白M-GH17 表達(dá)量確定最佳異丙基硫代-卩-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)時(shí)間為4小時(shí)。
八、 莢膜組織胞漿菌融合蛋白M-GH17的大量表達(dá)及純化 從含卡那青霉素抗性的LB平板上挑取PET-28a(+)-M-GH17重組菌單克隆至
LB液體培養(yǎng)基，加卡那青霉素至終濃度為50ug/mL， 37。C恒溫?fù)u床培養(yǎng)12小 時(shí)后，用含50ug/mL卡那青霉素的LB液體培養(yǎng)基將該菌按1: 100比例稀釋 后，分裝至細(xì)菌培養(yǎng)瓶中，置37。C恒溫?fù)u床培養(yǎng)至OD600=0.7，加誘導(dǎo)劑異丙 基硫代-P-D-半乳糖苷至終濃度為1.0mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)4小時(shí)。離心收集 菌體后，用細(xì)菌裂解液重懸，-7(TC冷凍30分鐘，超聲破碎3分鐘，4'C離心取 沉淀，棄上清。取10mL包涵體變性溶液攪拌溶解沉淀，4'C離心后，取上清加 PEG4000至0.2%(W/V)、氧化型谷胱苷肽至lmmol/L、還原型谷胱苷肽至 2mmol/L， 4。C靜置30分鐘后轉(zhuǎn)至截留分子量為10kD-12kD的透析袋中，于PBS (10mmol/L，pH7.4)中過(guò)夜透析。透析后立即取出并分裝，于-7(TC保存?zhèn)溆谩?細(xì)菌裂解液配方Tris-Cl 50mmol/L， pH8.0 EDTA lmmol/L
8NaCl 100mmol/L 包涵體變性溶液細(xì)菌裂解液+SKL0.3。/。(W/V) 九、Western Blot檢測(cè)
純化后的融合蛋白M-GH17行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移到PVDF 膜， 一抗分別為人莢膜組織胞漿菌陰性血清和人莢膜組織胞漿菌陽(yáng)性性血清， 二抗為HRP標(biāo)記的羊抗人IgG抗體，底物為Western Blot常用的魯咪諾熒光底 物。X光底片曝光、顯影、定影。免疫印跡檢測(cè)的結(jié)果參見(jiàn)附圖3，圖中l(wèi)為莢 膜組織胞漿菌陰性血清，2、 3是莢膜組織胞漿菌陽(yáng)性血清。
相關(guān)溶液配方
1. 電泳緩沖液
Glyl 8.8g,Tris3.03g，SDS lg，加雙蒸水定容至lOOOml。
2. 轉(zhuǎn)膜緩沖液
Gly2,9g， Tris5.8g， SDS 0.37g，甲醇200ml，加雙蒸水定容至 1000ml。
3. 洗滌液
Tris 3g， NaCl 8g， KC1 0.2g， Tween-20 lml，定容至1000ml (pH7.8)。
4. 熒光底物
Pierce公司產(chǎn)品(貨號(hào)Prod#34075)。
十、莢膜組織胞漿菌診斷試劑盒的制備
1. 試劑盒組成抗原包被酶標(biāo)板1塊、洗滌液50mL、陰性對(duì)照樣品 500|iL、陽(yáng)性對(duì)照樣品50(VL、顯色液A、 B各50mL、終止液25mL、 二抗工作 液50mL。
2. 相關(guān)溶液配方
包被液Na2C031.5g， NaHC032.9g，加雙蒸水定容至1000mL(pH9.6)。 封閉液Na2HP04.12H20 2.68g, NaH2P04.2H20 0.39g, NaCl 8.5g， 20g
牛血清白蛋白，加雙蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
洗滌液Na2HP04.12H20 2.68g, NaH2P04.2H20 0.39g， NaCl 8.5g，
Tween-20 0.5mL，加雙蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
顯色液A:200mgTMB溶于lOOmL無(wú)水乙醇，加雙蒸水定容至1000mL。 顯色液B:檸檬酸2.1g,Na2HP04.12H20 71g,加雙蒸水定容至1000mL。使
用時(shí)lmL顯色液A+ lmL顯色液B+0.4|iL 30%H2O2
終止液2M H2S04， 21.7mL濃&804加雙蒸水定容至1000mL。
3. 抗原包被酶標(biāo)板的制備將上述實(shí)施例8中制備得到的莢膜組織胞漿菌融合蛋白M-GH17用包被液 稀釋至終濃度l|ig/mL，按100(iL/孔加入到酶標(biāo)板中，37。C靜置2小時(shí)后于4。C 過(guò)夜。棄包被液，加封閉液200nL/孔，37°C1小時(shí)后棄封閉液，于37"烘干。 將酶標(biāo)板放入專用錫箔袋，加一小袋干燥劑，抽真空，封口。
十一、莢膜組織胞漿菌診斷試劑盒操作步驟及片段標(biāo)準(zhǔn)
莢膜組織胞漿菌診斷試劑盒中的各個(gè)組成成份平衡至室溫后，將待測(cè)血清、 陰性對(duì)照血清和陽(yáng)性對(duì)照血清加入到酶標(biāo)板中(100mL/孔)，37'c溫育1小時(shí)， 甩干，洗滌液洗滌5次，拍干。每孔加酶標(biāo)二抗(羊抗人IgG)100[iL， 37'C溫育 30分鐘，甩干，洗滌液洗滌5次，拍干。每孔加入已混好的顯色液100pL， 37°C 溫育IO分鐘。沒(méi)孔加入終止液50pL，輕輕振蕩后置于酶標(biāo)儀，OD450測(cè)吸光 值。判斷標(biāo)準(zhǔn)OD45020.2為陽(yáng)性，疑為莢膜組織胞漿菌感染；0D450O.2為 陰性，未感染莢膜組織胞漿菌。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明利用莢膜組織胞漿菌M基因片段和GH17基因片段 所制備得到的融合蛋白M-GH17，并用其所建立的ELISA方法可快速有效鑒別 診斷莢膜組織胞漿菌感染。
10SEQIDNOl:莢膜組織胞漿菌M基因片段的核苷酸序列；
SEQ ID N02:莢膜組織胞漿菌H17基因片段的核苷酸序列; SEQIDN03:莢膜組織胞漿菌M蛋白的氨基酸序列； SEQIDN04:莢膜組織胞漿菌H17蛋白的氨基酸序列。
SEQUENCE LISTING
<110> 中南大學(xué)
<120> —種融合蛋白及其用于檢測(cè)莢膜組織胞漿菌的用途
<130> 0
<160> 2
< 170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 510
<212> DNA
<213〉 Histoplasma capsulatum
<400> 1
cctctaaacacggccgcatata^C2LCCC犯Ctcaatgagcaacggattccc3ceLac3agcc60
aaccggacccattcttcaccgcacctgggcgta/tggta犯tggaccacta120
gtgcgcgagctcagcccgagcttcaacgacgtctggtcccaaccgcgtctcttctacaac180
tcactcacggtcttcgagaagcaattcctcgtcaacgccatgcgcttcga240
gtgcgg3gtg犯accgtgcgtaagaacgtcatcatccagctgaaccgcgtcgac犯cgeic300
ctcgcccgccgcgtcgcgctagctatcggcgtcgaacccccatccccggacccaaccttc360
taccacaacaaggcaaccgtccccatcggcaccttcggcacgaatctcctgcggctcgac420
gggctg犯aatcgccctcctgac^ga^cgacggtagcttcacgatcgc卿gcagctc480
cgggccgcgtttaacagcgccaacaacaaa510
<210> 2 <211> 300 <212> DNA
<213> Histoplasma capsulatum <400> 2ggccaggttt gggcgcaaat agaggagatt gatcctgaaccatattatgtt,tgggtc60cctgatccaa cgtttgccac gcctgttgta ctgcacaataacacagatcttgtcttcatg120gatggaagca aatcttttta tctcaacttc gataacagcacctctgacacgggtatttat180tttgtgaacc ttaactccaa cgctggtatt agtcaactctataaggatagtgacascaag240ttgctctggg gtggagctca acaagagcgg gatggctggatgtggtgcttcatggtcgat300<210> 3<211> 170<212> PRT<213〉 Histoplasma capsulatum<400> 3Pro Leu Asn Thr Ala Ala Tyr Thr Pro Asn SerMet Ser AsnGly Phe1 5 1015Pro Gin Gin Ala Asn Arg Thr His Asn Arg GlyPhe Phe ThrAla Pro20 2530Gly Arg Met Val Asn Gly Pro Leu Val Arg GluLeu Ser ProSer Phe35 4045Asn Asp Val Trp Ser Gin Pro Arg Leu Phe TyrAsn Ser LeuThr Val50 5560Phe Glu Lys Gin Phe Leu Val Asn Ala Met ArgPhe Glu AsnSer His65 70 7580Val Arg Ser Glu Thr Val Arg Lys Asn Val lielie Gin LeuAsn Arg85 9095Val Asp Asn Asp Leu Ala Arg Arg Val Ala LeuAla lie GlyVal Glu100 105110Pro Pro Ser Pro Asp Pro Thr Phe Tyr His AsnLys Ala ThrVal Pro115 120125lie Gly Thr Phe Gly Thr Asn Leu Leu Arg LeuAsp Gly LeuLys lie130 135140Ala Leu Leu Thr Arg Asp Asp Gly Ser Phe Thr.lie Ala GluGin Leu一145 150 15516012Arg Ala Ala Phe Asn Ser Ala Asn Asn Lys 165 170<210> 4 <211> 100 <212> PRT<213> Histoplasma capsulatum <400> 4Gly Gin Val Trp Ala Gin lie Glu Glu lie Asp Pro Glu Pro Tyr Tyr15 10 15Val Arg Trp Val Pro Asp Pro Thr Phe Ala Thr Pro Val Val Leu His20 25 30Asn Asn Thr Asp Leu Val Phe Met Asp Gly Ser Lys Ser Phe Tyr Leu35 40 45Asn Phe Asp Asn Ser Thr Ser Asp Thr Gly lie Tyr Phe Val Asn Leu50 55 60Asn Ser Asn Ala Gly lie Ser Gin Leu Tyr Lys Asp Ser Asp Asn Lys 65 70 75 80Leu Leu Trp Gly Gly Ala Gin Gin Glu Arg Asp Gly Trp Met Trp Cys 85 90 95Phe Met Val Asp 100
權(quán)利要求
1. 一種莢膜組織胞漿菌融合蛋白M-GH17，其特征在于該融合蛋白是由如序列表SEQ ID No3的氨基酸序列和SEQ ID No4的氨基酸序列連接形成的多肽。
2. —種編碼如權(quán)利要求1所述的融合蛋白M-GH17的DNA，其特征在于該DNA 包含莢膜組織胞漿菌M基因片段和GH17基因片段，所述莢膜組織胞漿菌M 基因片段的核苷酸序列如SEQIDNo: 1所示，所述GH17基因片段如SEQ ID No: 2所示。
3. —種包含莢膜組織胞漿菌M基因片段和GH17基因片段并能融合表達(dá)如權(quán)利 要求1所述蛋白M-GH17的重組大腸桿菌菌株。
4. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白M-GH17的制備方法，其特征在于包含以下步 驟以分離的莢膜組織胞漿菌基因組DNA為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增得到 M基因的特異性片段和GH17基因的特異性片段；在原核表達(dá)載體中定向插 入莢膜組織胞漿菌M基因片段，構(gòu)建得到M基因片段的重組原核表達(dá)載體； 在該重組原核表達(dá)載體中再定向插入莢膜組織胞漿菌GH17基因片段，構(gòu)建 得到M-GH17基因片段重組原核表達(dá)載體；將M-GH17重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn) 化宿主細(xì)胞，篩選重組單克隆，誘導(dǎo)后特異性表達(dá)，得到融合蛋白M-GH17。
5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述原核表達(dá)載體為PET-28a(+); M-GH17重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞時(shí)，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。
6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于從所述莢膜組織胞漿菌PCR擴(kuò)增M 基因片段所用的上游引物為5'GCCATATGCCTCTAAACACGGCCGC 3'; 下游引物為5' GCGGATCCTTTGTTGTTGGCGCTGTTAA3'。
7. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于從所述莢膜組織胞漿菌PCR擴(kuò)增 GH17基因片段所用上游引物為5' GCGAATTCGGCCAGGTTTGGGCG 3'; 下游引物為5' GCCTCGAGTTAATCGACCATGAAGCACCAC 3'。
8. —種用于莢膜組織胞漿菌鑒別診斷的ELISA試劑盒，包含常規(guī)ELISA試劑 盒所用的包被液、封閉液、洗滌液、，顯色液A、顯色液B、終止液，其特征 在于還包含如權(quán)利要求1所述的莢膜組織胞漿菌融合蛋白M-GH17，以及 莢膜組織胞漿菌感染標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。
9. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白M-GH17在檢測(cè)莢膜組織胞漿菌中的應(yīng)用。
10. 如權(quán)利要求3所述的重組大腸桿菌菌株在檢測(cè)莢膜組織胞漿菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種融合蛋白、包含該蛋白的ELISA試劑盒及其用于檢測(cè)莢膜組織胞漿菌的用途，以分離的莢膜組織胞漿菌基因組DNA為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增得到M基因片段和GH17基因片段；在原核表達(dá)載體中定向插入莢膜組織胞漿菌M基因片段和GH17基因片段，構(gòu)建得到M-GH17基因片段重組原核表達(dá)載體；將M-GH17重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，篩選重組單克隆，誘導(dǎo)后特異性表達(dá)，得到融合蛋白M-GH17；用該融合蛋白再進(jìn)一步制備用于的檢測(cè)莢膜組織胞漿菌的ELISA試劑盒。用本發(fā)明的包含融合蛋白M-GH17的ELISA試劑盒，按照普通ELISA方法檢測(cè)待測(cè)血清，根據(jù)終止后的吸光值確定陽(yáng)性、陰性、可疑的判斷臨界值，即可對(duì)待測(cè)血清樣本進(jìn)行莢膜組織胞漿菌檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12R1/19GK101519450SQ20091004286
公開(kāi)日2009年9月2日 申請(qǐng)日期2009年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日
發(fā)明者余銘恩, 馮俊濤, 李曉照, 胡成平, 顧其華 申請(qǐng)人:中南大學(xué)