專利名稱：Sars流行性肺組織胞漿菌純化精制系列疫苗及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
屬生物技術(shù)領(lǐng)域背景技術(shù)：
對(duì)所檢索綱上全部資料，均未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明相關(guān)技術(shù)內(nèi)容。
流行性肺組織胞漿菌是SARS肺流行性肺組織胞漿菌病的病原體，是最新發(fā)現(xiàn)的烈性傳染病，本病對(duì)人群呼吸系統(tǒng)高度易感，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)燒、咳嗽、氣促、呼吸困難、軟弱、白細(xì)胞減少，X光診斷為非典型性肺炎。本病原體屬于真菌屬，是一種雙相真菌，在血瓊脂和沙保羅氏瓊脂培養(yǎng)生長緩慢，約2-3周才長出肉眼可見的白色小菌落，在動(dòng)物模型病理組織切片中，肺、脾、肝、腦等組織可見大量園形、橢園形、周圍有一光亮帶的厚壁酵母樣組織胞漿菌，在液體純培養(yǎng)中可形成較大的孢子體，在顯微鏡下所見形態(tài)和冠狀病毒相似(見附圖)。
組織胞漿菌病(Histoplasmosis)是一種罕見的真菌性傳染病，本病分布地區(qū)以非洲和美洲特別以北美為最多，在我國自1955年廣州中山醫(yī)學(xué)院李瑛首先報(bào)告一例(系新加波歸國華僑，1973年江蘇常州報(bào)告一例兒童解剖材料證實(shí)為本病感染，1975年北京發(fā)現(xiàn)一例(馬來西業(yè)歸國華僑)，1982年廣西南部報(bào)告五例(但未經(jīng)培養(yǎng)證實(shí))，1989年安徽收治一例屬非洲型組織胞漿菌病，還有1991年南京發(fā)現(xiàn)一例組織胞漿菌病。筆者于今年3月在廣州從某醫(yī)院icu診斷為“非典型性肺炎”的患者血清中，分離獲得本病原體為流行性肺組織胞漿菌新種。
3、發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明SARS流行性肺組織胞漿菌純化、精制系列預(yù)防疫苗，用于預(yù)防SARS肺組織胞漿菌病感染。
(1)技術(shù)關(guān)鍵①應(yīng)用本發(fā)明生產(chǎn)SARS肺組織胞漿菌系列預(yù)防疫苗，主要通過菌種培養(yǎng)、擴(kuò)增、物理、化學(xué)或凍溶，酶解、分離菌體的免疫原組分，用高科技手段，提取純化和精制。使組織胞漿菌保持其中特異免疫成份，用細(xì)胞破碎器或用其他特殊的處理方法將細(xì)胞解體然后分離，提取、純化、精制成高純度的系列特異性流行性肺組織胞漿菌疫苗。

圖1是制造SARS流行性肺組織胞漿菌系列疫苗的菌種圖。
圖2是制SARS流行性肺組織胞漿菌疫苗(核酸疫苗)發(fā)酵工藝流程圖。
②技術(shù)方案用細(xì)菌破碎器破碎菌體，除去細(xì)胞碎片，硅膠吸附粗提糖蛋白、核酸、亞單位、細(xì)胞壁、毒素，然后用疏水層析法精提，經(jīng)硫氰酸鹽或其他沉淀劑處理后，獲取目的產(chǎn)品，稀釋和除菌，然后進(jìn)行純化，產(chǎn)品檢定。通過聚丙烯酸胺凝膠電泳、免疫印染、高壓液相等程序，使制品達(dá)到所需要求，進(jìn)入疫苗半成品生產(chǎn)成注射液和噴喉氣霧劑以及滴鼻的粘膜免疫滴劑。成品檢定合格后分裝、包裝、商品化進(jìn)入市場(chǎng)。
為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)具體方法如下《SARS流行性肺組織胞漿菌多糖疫苗生產(chǎn)方法》1.定義、組織及用途本品系用流行性肺組織漿菌培養(yǎng)液，經(jīng)提純獲得多糖抗原，并加入適宜穩(wěn)定劑后凍干制成，供預(yù)防流行性肺組織胞漿菌引起的SARS流行性肺組織胞漿菌感染之用。
2制造2.1基本要求2.1.1設(shè)施與生產(chǎn)質(zhì)量管理按中國《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求實(shí)施。同時(shí)還必須具備三級(jí)安全實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)工作(P3)條件，并須在二級(jí)以上生物安全匱中操作；動(dòng)物模型須在P3和P3級(jí)以上實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。
2.1.2原料及輔料應(yīng)符合現(xiàn)行《中國藥典》或《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》的要求。未納入上述標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)試劑，應(yīng)不低于化學(xué)純。
2.1.3生產(chǎn)用水生產(chǎn)用水源水應(yīng)符合國家飲用水標(biāo)準(zhǔn)；純化水及注射用水應(yīng)符合現(xiàn)行《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。
2.1.4生產(chǎn)用器直接用于生產(chǎn)的金屬或玻璃等器具，必須嚴(yán)格清洗及去熱原質(zhì)處理或滅菌處理。
2.1.5生產(chǎn)及檢定用動(dòng)物小鼠、豚鼠應(yīng)符合清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。
2.2菌種2.2.1菌種名稱及來源制造用疫區(qū)新分離的SARS流行性肺組織胞漿菌應(yīng)經(jīng)國家藥品管理當(dāng)局批準(zhǔn)，并由國家藥品檢定機(jī)構(gòu)或國家指定的單位保管和分發(fā)。
2.2.2種子批的建立生產(chǎn)用菌種應(yīng)采用種子批系統(tǒng)。原始種子批應(yīng)驗(yàn)明其記錄、歷史、來源和生物學(xué)特性。從原始種子批傳代、擴(kuò)增后凍干保存為主種子批。從主種子批制備工作種子批。主種子批和工作種子批的各種特性應(yīng)與原始種子批一致。工作種子批用于生產(chǎn)。
2.2.3種子批的檢定菌種接種在含10％羊血普通瓊脂培養(yǎng)基上流行性肺組織胞漿菌緩慢，2周后生長出細(xì)小白色棉花樣菌落，在GH改良液體培養(yǎng)24-48小時(shí)培養(yǎng)，涂片鏡檢應(yīng)為純的園形大小不等的孢子體。
2.2.3.1生化反應(yīng)接種葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、果糖及蔗糖，于35～37℃培養(yǎng)5-7日，發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。
2.2.3.3血清凝集試驗(yàn)將在25℃-37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)培養(yǎng)懸液于0.5％甲醛生理氯化鈉溶液或60℃加熱60分鐘殺菌以后，使每1ml含菌1.0×109-2.0×109，與特異血清定量凝集反應(yīng)，應(yīng)置35-37℃過夜，次日再放置室溫2小時(shí)觀察結(jié)果，以肉眼可見清晰凝集現(xiàn)象之血清最高稀釋度(+)為凝集效價(jià)，必須達(dá)到原血清效價(jià)之半。參考血清由國家藥品檢定機(jī)構(gòu)分發(fā)或同意。
2.2.4菌種傳代及保存2.2.4.1菌種應(yīng)凍干保存于2～8℃。主種子批自啟開后傳代最多不能超過5代。
2.2.4.2工作種子批生產(chǎn)前應(yīng)檢查菌種的全部特性，合格后方可用于生產(chǎn)。
2.3原液制備2.3.1生產(chǎn)用種子將工作種子批菌種啟開后，接種在GH改良液體培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基上，放25～37℃培養(yǎng)一般不超過48小時(shí)，第2-4代菌種可用適宜的液體培養(yǎng)基，25-37℃。由此制備適宜數(shù)量的生產(chǎn)用工作種子，工作種子批開啟后至接種培養(yǎng)不得超過5代。
2.3.2生產(chǎn)用培養(yǎng)基生產(chǎn)多糖疫苗可選用適宜培養(yǎng)基。生產(chǎn)用的液體培養(yǎng)基不應(yīng)含有能與加入的十六烷基三甲基溴化銨形成沉淀的成分。培養(yǎng)基中不應(yīng)含有對(duì)人體有害或其他過敏原物質(zhì)。
2.3.3菌種接種和培養(yǎng)采用密封培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)。于培養(yǎng)基中接種生產(chǎn)用工作種子后。在培養(yǎng)過程中和殺菌前取樣進(jìn)行純菌試驗(yàn)，涂片做美蘭染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應(yīng)去棄。
2.3.4收獲和殺菌培養(yǎng)物于對(duì)數(shù)生長期后或靜止期前期收獲。一般培養(yǎng)24-48小時(shí)為宜。將培養(yǎng)物加入甲醛溶液殺菌，或加熱殺菌，以確保殺菌安全并不損傷菌體多糖為宜。
2.3.5提純和精制
2.3.5.1去核酸(保留用于生產(chǎn)核酸)將已殺菌的單一收獲物(或合并收獲物)離心去菌體，收集上清液，于其中加入十六烷基三甲溴化銨混勻，離心收集沉淀物。沉淀物中加入氯化鈣溶液，使最終濃度為1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至最終濃度為25％(ml/ml)。冷庫靜置3小時(shí)或過夜，離心去沉淀，收集澄清的上清液。
2.3.5.2沉淀多糖于上述上清液中加入冷卻乙醇至最終濃度80％(ml/ml)，充分振搖。離心收集沉淀多糖，然后用無水乙醇及丙酮各洗2次以上，將沉淀物(多糖粗制品)保存在-20℃以下待進(jìn)一步提取。
2.3.5.3多糖精制將粗制品溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)10-20mg/ml，然后按1∶2容量用冷酚(100g結(jié)晶酚溶40ml1/10飽和醋酸鈉溶液)提取2-3次，離心收集上清液，并用0.1mol/L氯化鈣溶液或適宜溶液透析。必要時(shí)可用其他方法去除內(nèi)毒素。再加乙醇至最終濃度為75％-80％(ml/ml)。離心收集沉淀物，用無水乙醇及丙酮各洗2次以上。離心后傾去上清液，用注射用水溶解沉淀的多糖，所得溶液即為提取的多糖原液。原液經(jīng)除菌過濾后，取樣進(jìn)行無菌試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)及各項(xiàng)生化測(cè)定。提取過程應(yīng)在15℃以下進(jìn)行。提純多糖應(yīng)保存在-20℃或以下。
2.3.5.4再制若提純多糖的蛋白質(zhì)、核酸及內(nèi)毒素含量達(dá)不到要求時(shí)，可再制一次。
2.4原液檢定按3.1項(xiàng)進(jìn)行。
2.5半成品檢定可將單批或多批檢定合格的多糖原液合并，然后加入無菌無熱原質(zhì)乳糖和注射用水稀釋，使每人用劑量疫苗含多糖30μg，乳糖2.5-3.0mg。
2.6半成品檢定按3.2項(xiàng)進(jìn)行。
2.7分批按本版規(guī)程通則《生物制品分批規(guī)程》進(jìn)行。
2.8分裝及凍干按本版規(guī)程通則《生物制品分裝規(guī)程》進(jìn)行。采用適宜條件凍干，凍干過程制品溫度不應(yīng)高于30℃，真空或充氮封口。
2.9規(guī)格本品規(guī)格為每安瓿150μg或300μg多糖。每人和劑量含多糖30μg。
2.10包裝按本版規(guī)程通則《生物制品包裝規(guī)格》進(jìn)行。
3檢定3.1原液檢定3.1.1固體總量測(cè)定每批提純多糖抗原的蛋白質(zhì)含量應(yīng)小于10mg/g，按Lowry法測(cè)定。
3.1.3.核酸含量每批提純多糖的核酸含量應(yīng)小于10mg/g。按分光光度法，核酸在260nm波長處的吸收系數(shù)(E1％cm)為200。
3.1.4 O-Z?；繙y(cè)定每批提純多糖的O-Z酰基含量應(yīng)不低于2mmol/g，按Herstrin法測(cè)定。
3.1.5磷含量每批提純多糖的磷含量應(yīng)不低于80mg/g，用鉬酸銨法測(cè)定。
3.1.6分子大小測(cè)定每批提純多糖的分子大小應(yīng)用瓊脂糖-4B或CL-4B凝膠層析法測(cè)定。KD值應(yīng)不高于0.40。KD值在0.5以前的洗脫液多糖回收率應(yīng)在65％以上。按附錄方法進(jìn)行。
3.1.7特異性試驗(yàn)每批提純多糖應(yīng)用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(或國家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他適宜免疫學(xué)方法)進(jìn)行特異性試驗(yàn)。多糖抗原在流行性肺組織胞漿菌抗體存在下，應(yīng)產(chǎn)生明顯的沉淀線。
3.1.8細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定每批提純多糖可用常規(guī)鱟試驗(yàn)(半定量凝膠法)檢測(cè)內(nèi)毒素含量。一般控制每1μg多糖內(nèi)毒素含量應(yīng)不高于100EU(如超過，可按3.3.7項(xiàng)家兔法確證)。
3.1.9原液應(yīng)保存于-20℃或以下，自收菌之日起有效期為5年。
3.2半成品檢定無菌試驗(yàn)按本版規(guī)程通則《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》A項(xiàng)進(jìn)行。
3.3成品檢定3.3.1鑒別試驗(yàn)按3.1.7項(xiàng)方法進(jìn)行。
3.3.2外觀凍干成品應(yīng)為白色疏松體，加入所附PBS后迅速溶解。溶液應(yīng)澄明無異物。
3.3.3化學(xué)檢定按本版規(guī)程附錄《生物制品化學(xué)及其他檢定方法》進(jìn)行。
3.3.3.1水分不高于3.0％。
3.3.3.2多糖含量每劑量多糖含量應(yīng)不低30μg。磷含量應(yīng)不低于2.25μg。
3.3.4分子大小測(cè)定分裝的疫苗至少5批抽一批測(cè)多糖分子大小，用瓊脂糖-4B或CL-4B凝膠過濾法測(cè)定，KD值應(yīng)不高于0.40。KD值小于0.5的洗脫多糖加回收率應(yīng)在65％以上。方法見附錄。
3.3.5無菌試驗(yàn)按本版規(guī)程通則《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》A項(xiàng)進(jìn)行。
3.3.6異常毒性試驗(yàn)每批疫苗應(yīng)按本版規(guī)程通則《生物制品異常毒性試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行，豚鼠注射劑量為500μg多糖(1ml)，小鼠注射劑量為100μg多糖(0.5ml)。
3.3.7熱原質(zhì)試驗(yàn)按本版規(guī)程通則《生物制品熱原質(zhì)試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行，家兔注射劑量為0.025μg/kg體重。
3.4 疫苗稀釋液檢定稀釋疫苗用的pH6.8-7.2PBS應(yīng)經(jīng)過下列檢定。
3.4.1 無菌試驗(yàn)每批稀釋液應(yīng)按本版規(guī)程通則《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》A項(xiàng)進(jìn)行。
3.4.2 異常毒性試驗(yàn)按本版規(guī)程通則《生物制品異常毒性試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
3.4.3 熱原質(zhì)試驗(yàn)按本版規(guī)程通則《生物制品熱原質(zhì)試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
3.4.3 熱原質(zhì)試驗(yàn)按本版規(guī)程通則《生物制品熱朱質(zhì)試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
4 保存、運(yùn)輸及有效期于2-8℃避光保存和運(yùn)輸，自凍干之日起有效期為2年。
5 使用說明組成和性狀本品系用流行性肺組織胞漿菌培養(yǎng)液，經(jīng)提純獲得多糖抗原并加入適宜穩(wěn)定劑后凍干制成的多糖疫苗。成品外觀為白色疏松體，加入所附PBS后可迅速溶解，溶液澄明無異物。
規(guī)格本品規(guī)格為注射用安瓿150μg或300μg多糖。每人用劑量含多糖30μg。氣霧劑和滴鼻劑疫苗含多糖1.5-3mg/瓶。
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)本品依據(jù)《中國生物制品規(guī)程》2000年版生產(chǎn)和檢定，質(zhì)量符合要求。
作用和用途本疫苗接種后，可使機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，用于預(yù)防SARS流行性肺組織胞漿菌感染。
接種對(duì)象SARS流行性肺組織胞漿菌病疫區(qū)人群，易感人群，對(duì)本病醫(yī)護(hù)人、實(shí)驗(yàn)室研究人員和與患者近距離接的各類人員的預(yù)防。
用法與劑量(1)啟開疫苗瓶后，按瓶簽或盒簽標(biāo)含量，加入所附PBS溶解，搖勻立即使用。
(2)將上臂外側(cè)三角肌附著處消毒后，皮下注射30μg(0.2ml或0.5ml)。
禁忌有下列情況者，不得使用本疫苗。
(1)嚴(yán)重心血管、高血壓、腦部疾患及有過敏史者。
(2)心臟病(3)急性傳染病及發(fā)熱者。
副反應(yīng)及處理本疫苗反應(yīng)輕微，偶有短暫低熱，局部稍有壓痛感，可自行緩解。
注意事項(xiàng)(1)使用前應(yīng)檢查安瓿，如安瓿有裂紋、瓶塞松動(dòng)或瓶?jī)?nèi)有異物者，不得使用。
(2)每一安瓿制品溶解后，應(yīng)按規(guī)定人份(劑量)一次用完，不得分多次使用。
保存、運(yùn)輸及使用期限于2-8℃避光保存和運(yùn)輸。在盒簽(或瓶簽)標(biāo)明的失效期前使用。
生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)生產(chǎn)單位及地址6 附錄流行性肺組織胞漿菌多糖疫苗莢膜多糖抗原分子大小測(cè)定(瓊脂糖4B層析法)附錄 流行性肺組織胞漿菌多糖疫苗抗原分子大小測(cè)定(瓊脂糖4B層析法)1 試驗(yàn)材料1.1 試劑1.1.1 瓊脂糖4B凝膠1.1.2 0.2mol/L醋酸胺(pH7.0)1.1.3 藍(lán)色葡聚糖2000(2mg/ml)1.1.4 鉻酸鉀或維生素B12溶液(1mg/ml)1.2 儀器1.2.1 層析柱(1.5cm×90cm)1.2.2 組分收集器及試管1.2.3 凝膠及洗脫液貯瓶1.2.4 適宜監(jiān)測(cè)裝置及記錄器2 試驗(yàn)步驟2.1 裝柱及層析柱的標(biāo)定2.1.1 瓊脂糖4B凝膠的漂洗取瓊脂糖4B凝膠約200ml，加0.2mol/L醋酸胺400ml，充分?jǐn)嚢璨⒎胖眉s1小時(shí)使其沉淀，傾去混懸有顆粒的上層懸液。如此反復(fù)數(shù)次后，加200ml0.2mol/L醋酸胺溶液，置真空罐內(nèi)抽去凝膠中的空氣。
2.1.2 裝柱于1.5cm×90cm層析柱中，將瓊脂糖4B凝膠裝約87cm高，操作壓70-75cm，用0.2mol/L醋酸胺流洗，流速為15-20ml/h，以2-3倍量柱床體積的流洗液流洗，使柱床平衡。
2.1.3 柱的標(biāo)定
2.1.3.1 空流體積V取2mg/ml藍(lán)色葡聚糖2000(用0.2mol/L醋酸胺溶解)1ml，加于已平衡的柱上，用0.2mol/L醋酸胺流洗，用組分收集器收集流洗液，于260nm波長測(cè)定各管的A值。以A值為縱坐標(biāo)，ml數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，第一個(gè)峰頂洗脫體積，即為V0。
2.1.3.2 柱床體積V1取鉻酸鉀或維生素B12溶液(1mg/ml，用0.2mol/L醋酸胺溶解)1ml，加于已平衡的柱上，用0.2mol/L醋酸胺流洗，用收集器收集流洗液，于37onm波長測(cè)定各管A值。以A值為縱坐標(biāo)，ml數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，計(jì)算峰頂流洗體積，即為V1。
2.2 多糖抗原KD的測(cè)定取約1ml樣品(含A群抗原3-5mg，如為固體可用0.2mol/L醋酸胺溶解)，加于已標(biāo)定的瓊脂糖4B凝膠柱上，用0.2mol/L醋酸胺洗脫，以收集器收集，測(cè)定每管的磷含量(參看磷含量測(cè)定，但以流洗液作為對(duì)照)，以每管磷含量(或A值)為縱坐標(biāo)、體積為橫坐標(biāo)作圖。也可用紫外分光光度計(jì)206nm下檢測(cè)，測(cè)磷法為仲裁法。按下述公式(1)以多糖主峰峰頂洗脫體積(V0)計(jì)算分配系數(shù)(KD)；公式(2)計(jì)算KD0.5的多糖抗原回收率。
3 結(jié)果計(jì)算按下列公式計(jì)算KD值及KD值在0.5以前的多糖回收率。KD=Ve-VoVi-Vo]]>
《亞單位抗獨(dú)特型流行性肺組織胞漿菌疫苗制造方法》1 定義、組成與用途本品系由SARS流行性肺組織胞漿菌經(jīng)擴(kuò)增、分離、提取、純化，加佐劑吸附后制成，用于預(yù)防流行性肺組織胞漿菌病感染。
2 制造2.1 基本要求2.1.1 設(shè)施與生產(chǎn)質(zhì)量管理按中國《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求實(shí)施。同時(shí)還必須具備三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)工作(P3)條件，并二級(jí)以上生物安全柜中操作動(dòng)物模型須在P3和P3級(jí)以上實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。
2.1.2 原料及輔料應(yīng)符合現(xiàn)行《中國藥典》或《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》的要求。未納入上述標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)試劑，應(yīng)不低于化學(xué)純。
2.1.3 生產(chǎn)用水生產(chǎn)用水源水應(yīng)符合國家飲用水標(biāo)準(zhǔn)；純化水及注射用水符合現(xiàn)行《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。
2.1.4 生產(chǎn)用器具直接用于生產(chǎn)的金屬或玻璃等器具，必須嚴(yán)格清洗及滅菌處理。
2.1.5 檢定用動(dòng)物小鼠、豚鼠應(yīng)符合清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。
2.2 菌種2.2.1 菌種名稱及來源使用經(jīng)國家藥品管理當(dāng)局批準(zhǔn)的，來自SARS疫區(qū)新分離的流行性肺組織漿菌凍干保存菌種，也可用國家藥品管理當(dāng)局批推的其他流行性肺組織胞漿菌標(biāo)準(zhǔn)菌種。
2.2.2 種子批的建立疫苗生產(chǎn)用菌種以菌種種子批系統(tǒng)為基礎(chǔ)進(jìn)行三級(jí)管理，即原始種子批、主種子批和工作種子批。原始種子批應(yīng)驗(yàn)明其記錄、歷史、來源和生物學(xué)特性。從原始種子批傳出、擴(kuò)增后凍存的為主種子批。從主種子制備工作種子批。主種子批和工作種子批在規(guī)定代次內(nèi)的生物學(xué)特性應(yīng)與原始種子批一致。工作種子批用于生產(chǎn)。
2.2.3 種子批菌種檢定2.2.3.1 培養(yǎng)物純度試驗(yàn)培養(yǎng)物接種于血瓊脂平板和沙保羅瓊脂平板，分別于20-25℃和30-35℃培養(yǎng)2-3周，應(yīng)無細(xì)菌和其他真菌被檢出。
2.2.3.2 純菌試驗(yàn)菌種接種于10％ 血瓊脂平板2周后可見長出細(xì)小白色樣花樣菌落。
2.2.4 菌種傳代主種子批經(jīng)一代擴(kuò)增制成工作種子批，工作種子批經(jīng)檢定合格后用于生產(chǎn)。
2.2.5 菌種保存主菌種及工作菌種保存于液氮中，為方便生產(chǎn)，小部分工作菌種短期內(nèi)(6個(gè)月內(nèi))可保存于-70℃冰箱中。
2.3 發(fā)酵2.3.1 發(fā)酵工藝將工作菌種在適宜溫度和時(shí)間條件下進(jìn)行三角瓶、種子罐和生產(chǎn)罐三級(jí)發(fā)酵，收獲孢子體細(xì)胞冷凍保存。
2.3.2 發(fā)酵產(chǎn)物檢定2.3.2.1 培養(yǎng)物純度按2.2.3.1 項(xiàng)進(jìn)行。
2.3.2.2 菌種純度流行性肺組織胞漿菌純度100％。
2.4 純化2.4.1 純化工藝用細(xì)胞破碎器破碎孢子體細(xì)胞，除去細(xì)胞碎片，硅膠吸附法粗提亞單位疫苗，抗獨(dú)特疫苗，疏水層析法精提抗獨(dú)特疫苗亞單位疫苗，經(jīng)硫氰酸鹽處理后，稀釋和除菌過濾。
2.4.2 純化產(chǎn)物檢定2.4.2.1 無菌試驗(yàn)按本版規(guī)程通則《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》A項(xiàng)進(jìn)行。
2.4.2.2 蛋白質(zhì)濃度用lowry法測(cè)試，蛋白質(zhì)濃度應(yīng)在20.0-27.0μg/ml之間。
2.4.2.3 純度(1)免疫印染法 所測(cè)樣品不得出現(xiàn)國家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可以外的孢子體雜蛋白。
(2)高壓液相色譜法雜蛋白應(yīng)不高于1.0％。
2.4.2.5 細(xì)菌內(nèi)毒素按本版規(guī)程通則《生物制品細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行，應(yīng)小于10EU/ml。
2.5 疫苗原液配制及檢定2.5.1 配制加入甲醛，37℃保溫適宜時(shí)間，氫氧化鋁吸附后，加入硫柳汞作為防腐劑，即為疫苗原液。
2.5.2 原液檢定按3.1項(xiàng)進(jìn)行。
2.6 半成品配制、分批及檢定2.6.1 配制滅活吸附后與鋁稀釋劑等量混合，即為半成品。
2.6.2 分批按本版規(guī)程通則《生物制品分批規(guī)程》進(jìn)行。
2..6.3 半成品檢定按3.2項(xiàng)進(jìn)行。
2.7 分裝按本版規(guī)程通則《生物制品分裝規(guī)程》進(jìn)行。
2.8 規(guī)格本品規(guī)格為每安瓿0.5ml及1.0ml。每次人用劑量0.5ml。
2.9 包裝按本版規(guī)程通則《生物制品包裝規(guī)程》進(jìn)行。
3 檢定3.1 原液檢定3.1.1 吸附完全性試驗(yàn)吸附率應(yīng)不低于80％。
3.1.2 硫氰酸鹽含量應(yīng)小于1.0μg/ml。
3.1.3 TritonX-100含量應(yīng)小于15.0μg/ml。
3.2 半成品檢定3.2.1 無菌試驗(yàn)按本版規(guī)程通則《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》A項(xiàng)進(jìn)行。
3.2.2.化學(xué)檢定按本版規(guī)程附錄《生物制品化學(xué)及其他檢定方法》進(jìn)行。
3.2.2.1 游離甲醛含量應(yīng)小于20.0μg/ml。
3.2.2.2 pH值為5.5～7.2。
3.2.2.4 鋁含量為0.35～10.62mg/ml。
3.2.2.5 細(xì)菌內(nèi)毒素應(yīng)小于10EU/ml。
3.2.2.6 冰用冰點(diǎn)儀測(cè)定，應(yīng)為-0.52℃±0.12℃。
3.3 成品檢定3.3.1 鑒別試驗(yàn)以免疫法測(cè)試，證明為流行性肺組織胞漿菌。
3.3.2 物理檢查應(yīng)為乳白色混懸液體，可因沉淀而分層，易搖散，不應(yīng)有搖不散的塊狀物。
3.3.3 化學(xué)檢定按本版規(guī)程附錄《生物制品化學(xué)及其他檢定方法》進(jìn)行。
3.3.3.1 鋁含量同3.2.2.3.項(xiàng)。
3.3.3.2 硫柳汞含量同3.2.2.4項(xiàng)。
3.3.3.3 pH值為5.5～7.2。
3.3.4 效力測(cè)定將疫苗連續(xù)稀釋，每個(gè)稀釋度接種MIH 16-18克小鼠10只，每只腹腔注射1.0ml。4～6周后采血，用MIH小時(shí)測(cè)抗流行性肺組織胞漿抗體。
3.3.5 無菌試驗(yàn)按本版規(guī)程通則《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
3.3.6 無菌試驗(yàn)按本版規(guī)程通則《生物制品異常毒性試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
3.3.7 細(xì)菌內(nèi)毒素同2.3.2.5項(xiàng)。
4 保存、運(yùn)輸及有效期于2～8℃避光保存和運(yùn)輸，疫苗自效力檢定合格之日起有效期為2年。
5 使用說明組成和性狀本品系由SARS流行性肺組織胞漿菌經(jīng)純化、加佑劑吸附后制成。注射劑、氣霧劑、滴鼻劑疫苗為白色混懸液體，可因沉淀而分層，易搖散，不應(yīng)有搖不散的塊狀物。
規(guī)格本品規(guī)格為每安瓿節(jié)0.5ml及1.0ml或5～10ml/瓶。每次人用劑量0.5ml含5μg，氣霧和滴鼻5～10ml/瓶，50-100μg。
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)本品依據(jù)《中國生物制品規(guī)程》2000年版標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)和檢定，符合質(zhì)量要求。
作用和用途本疫苗接種后，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗流行性肺組織胞漿菌免疫力，用于預(yù)防SARS流行性肺組織胞漿菌感染。
接種對(duì)象(1)SARS流行性組織胞漿菌病疫區(qū)人群，易感人群和患者近距離接觸的種類人員的預(yù)防。
(2)從事醫(yī)療工作的醫(yī)護(hù)人員及接觸實(shí)驗(yàn)人員。
用法和劑量(1)本疫苗注射時(shí)要充分搖勻。
(2)注射部位為上臂三角肌內(nèi)。
禁忌患有急性嚴(yán)重疾病患者及對(duì)酵母成分過敏者禁止使用。
副反應(yīng)處理本品很少有不良反應(yīng)，個(gè)別人可能有中、低度發(fā)熱或注射局部微痛，24小時(shí)內(nèi)即自行消失。
注意事項(xiàng)
(1)用前搖勻。
(2)安瓿破裂、有搖不散塊狀物時(shí)不得使用。
保存、運(yùn)輸及使用期限于2～8℃下避光保存和運(yùn)輸，嚴(yán)防凍結(jié)。在盒簽或瓶簽標(biāo)明的失效期前使用。
生產(chǎn)批準(zhǔn)文號(hào)生產(chǎn)單位及地址《SARS流行性肺組織胞漿菌核酸疫苗生產(chǎn)工藝》工業(yè)生產(chǎn)過程如下菌種→孢子制備→種子制備→發(fā)酵→發(fā)酵液預(yù)處理→提取及精制→成品包裝菌種菌種用冷凍干燥法制備后，以超低溫，即在液氮冰箱(-190℃～-196℃)內(nèi)保存。冷凍干燥是用脫脂牛奶或葡萄液等和孢子混在一起，經(jīng)真空冷凍、升華干燥后，在真空下保存。
制備孢子通過嚴(yán)格的無菌手續(xù)，將其接種到經(jīng)滅菌過的固體斜培養(yǎng)上，在一定溫度下培養(yǎng)5-7日或7日以上。
種子制備其目的是使孢子發(fā)芽、繁殖以獲得足夠數(shù)量的菌絲，并接種到發(fā)酵罐中，種子制備用搖瓶培養(yǎng)后再接入種子罐進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)。或直接將孢子接入種子罐后逐級(jí)放大培養(yǎng)。種子擴(kuò)大培養(yǎng)級(jí)數(shù)的多少，決定于菌種的性質(zhì)、生產(chǎn)規(guī)模的大小和生產(chǎn)工藝的特點(diǎn)。擴(kuò)大培養(yǎng)級(jí)數(shù)通常為二級(jí)。搖瓶培養(yǎng)是在錐形瓶?jī)?nèi)裝入一定數(shù)量的液體培養(yǎng)基，滅菌后以無菌操作接入孢子，放在搖床上恒溫培養(yǎng)。在種子罐中培養(yǎng)時(shí)，在接種前有關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基都必須經(jīng)過滅菌。接種材料為孢子懸浮液或來自搖瓶的菌絲，以微孔差壓法或打開接種口在火焰保護(hù)下接種。接種量視需要而定。如用菌絲，接種量一般相當(dāng)于0.1％-2％。從一級(jí)種子罐接入二級(jí)種子罐接種量一般為5％-20％，培養(yǎng)溫度一般在25-30℃。在罐內(nèi)培養(yǎng)過程中，需要攪拌和通入無菌空氣?？刂乒逌亍⒐迚?，并定時(shí)取樣作無菌試驗(yàn)，觀察菌絲形態(tài)，測(cè)定種子液中發(fā)酵單位和進(jìn)行生化分析等，并觀察無雜菌情況。種子質(zhì)量如合格方可移種到發(fā)酵罐中。
權(quán)利要求
1.SARS流行性肺組織胞漿菌純化精制系列疫苗，其特征是由SARS流行性肺組織胞漿菌生產(chǎn)制成系列疫苗，用于SARS流行性肺組織胞漿菌病特異性預(yù)防。
2.如權(quán)利要求1所述SARS流行性肺組織胞漿菌純化、精制系列疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是由SARS流行性肺組織胞漿菌為原料，用細(xì)胞破碎器或其他高科技方法將上述肺組織胞漿菌細(xì)胞破碎(溶解)然后分離、提取、純化、精制成系列疫苗
3.如權(quán)利要求1、2所述的SARS流行性肺組織胞漿菌系列疫苗，其特征是包括流行性肺組織胞漿菌多糖(糖蛋白)疫苗、核酸疫苗、亞單位疫苗、細(xì)胞壁(壁酸)疫苗、毒素、類毒素疫苗、合成疫苗和半合成疫苗、基因重組疫苗，抗獨(dú)特型疫苗和特異性免疫球蛋白。
4.如權(quán)利要求1或由SARS流行性肺組織胞漿菌生產(chǎn)出注射液、噴喉氣霧劑和滴鼻制劑，以及有關(guān)的其他新生物制品。
全文摘要
本發(fā)明提供一種采用SARS流行性肺組織胞漿菌作原料，以現(xiàn)代分子生物學(xué)方法或其他高科技方法，通過培養(yǎng)、發(fā)酵、擴(kuò)增、分離、提取、純化、精制生產(chǎn)流行性肺組織胞漿菌系列特異性預(yù)防疫苗，其中包括SARS流行性肺組織胞漿菌多糖疫苗(糖蛋白)，核酸度苗、亞單位疫苗、細(xì)胞壁疫苗、毒素、類毒素疫苗、合成和半合成疫苗、基因重組疫苗、抗獨(dú)特型疫苗和生產(chǎn)特異性免疫球蛋白，供流行疫區(qū)人群和本病醫(yī)護(hù)人員、實(shí)驗(yàn)室研究人員以及各類易感人群特異性預(yù)防SARS流行性肺組織胞漿菌病之用。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1476894SQ0312670
公開日2004年2月25日 申請(qǐng)日期2003年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月30日
發(fā)明者余國華 申請(qǐng)人:余國華