專利名稱：魔芋中芋花葉病毒分子快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物病蟲害檢疫領(lǐng)域，更具體涉及一種魔芋中芋花葉病毒(DsMV) 分子快速檢測(cè)方法，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)魔 芋中DsMV進(jìn)行快速檢測(cè)。
背景技術(shù)：
魔芋(^rarp力叩/ a7hs)屬天南星科魔芋屬多年生草本植物，也是我國(guó)貧困 山區(qū)重要經(jīng)濟(jì)作物之一。我國(guó)主要分布于湖北、云南、四川等長(zhǎng)江流域。因魔芋 地下球莖中含有葡甘露聚糖，目前廣泛用于食品、紡織印染、石油鉆探、制藥、 日用化工等領(lǐng)域，有很好的經(jīng)濟(jì)效益。但因常年無性繁殖，使病毒積累，種性退 化，豐產(chǎn)性和品質(zhì)無法保證。芋花葉病毒(dasheen mosaic virus, Ds匿)是確定 在天南星科植物上發(fā)生最普遍和危害最嚴(yán)重的病毒病原。Zettler等(1987)指 出芋花葉病毒(DsMV)使天南星科Ca7st/Zt朋、Z ieiTey 力ac力ia、 /%j7oote77rfrOT和 Zs/7"eofe"力^等屬作物減產(chǎn)約60%。雖然相繼有多位學(xué)者對(duì)天南星科植物病毒 病害進(jìn)行了探索性研究，但由于該科植物本身材料的特點(diǎn)使研究相對(duì)難以深入。 到目前為止，天南星科植物上鑒定和分離的病毒相對(duì)較少，而且該科植物侵染的 病毒研究方法還局限于傳統(tǒng)生物學(xué)方法。近年來發(fā)展的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)方法因其具有靈敏、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在植物病毒的檢測(cè)上顯示 出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。自1990年起，國(guó)內(nèi)外已相繼用RT-PCR方法檢測(cè)了多種病毒，如 馬鈴薯Y病毒(PVY)，馬鈴薯巻葉病毒(PLRV)，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd) 等，但至今國(guó)內(nèi)外至今未見有關(guān)魔芋中芋花葉病毒的報(bào)道。本發(fā)明通過合成一對(duì) 擴(kuò)增DsMV特異性外殼蛋白(")基因中間部分核心序列的寡核苷酸引物，利用 RT-PCR技術(shù)建立了一種經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便檢測(cè)魔芋中芋花葉病毒的方法。此方法將對(duì)魔 芋脫毒苗的檢測(cè)和DsMV的控制起到重要作用。200910060893.8
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是在于提供一種魔芋中芋花葉病毒分子快速檢測(cè)方法。該方法操 作方便，經(jīng)濟(jì)快速，且可10(m檢測(cè)魔芋是否帶DsMV，從而為魔芋中DsMV的防治、 脫毒苗的檢測(cè)提供有效手段。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施-
根據(jù)已報(bào)道的DsMV—對(duì)特異性外殼蛋白(cp)基因序列，首先合成l對(duì)擴(kuò)增 DsMV的c/7基因中間部分核心序列的寡核苷酸引物；然后將提取的魔芋葉片的總 RNA反轉(zhuǎn)成complement DNA，再以complement DNA為模板，結(jié)果擴(kuò)增得到了與預(yù) 期大小一致的O. 35kb片段，接種DsMV后感病的魔芋也擴(kuò)增到了此片段，而對(duì)照(清 水和健康魔芋)中未擴(kuò)增到任何產(chǎn)物。 一種魔芋中芋花葉病毒分子快速檢測(cè)方法，其步驟是
A、依據(jù)陳集雙主編的《天南星科植物病毒的分子診斷和半夏研究》合成DsMV 檢測(cè)的特異性引物DF: 5 ' -GGG CTT GGG TGA TGA TGG A - 3 ' ， DR: 5 ' -GCC TTT CAG TGT TCT CGC TTG -3.'，目的片段長(zhǎng)度O. 35kb;
B、 用RNApr印pure植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取帶 芋花葉病毒的魔芋(dasheen mosaic virus, DsMV)葉片總RNA;
C、 取一微量離心管，加入提取的RNA 8iiL， 10 uM的oligo-d(T) 4"， 72 'C下變性5min，取出置于冰上放置5 min，再依次加入反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液8yL， lOmMol的三磷酸堿基脫氧核苷酸4uL， 40U/u L的RNA酶抑制劑1 u L， 20U/uL 的反轉(zhuǎn)錄酶2yL，加入O. 1%(V/V)焦碳酸二乙酯處理過的重蒸水15yL，將反應(yīng) 混合物于42。C PCR儀中延伸lh， - 20。C保存?zhèn)溆?br> D、在12. 5wLPCR反應(yīng)體系中，取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物compleraent DNA 2 n L，加 lOuM的引物DF和DR各luL， lOraMol的三磷酸堿基脫氧核苷酸O. 8 u L，反轉(zhuǎn)錄酶 緩沖液2uL， 20mMol的氯化鎂0.7uL， 2u/nl的Taq酶O. 5nL，重蒸水4. 5uL; 反應(yīng)條件是94。C預(yù)變性3min， 94。C變性30s， 56。C退火30s, 72。C延伸30s， 30個(gè) 循環(huán)，最后再72'C延伸5min，在PCR儀上擴(kuò)增，取擴(kuò)增產(chǎn)物2.5ixL進(jìn)行瓊脂糖 凝膠電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)到0.35kb片段長(zhǎng)度條帶的為帶病毒植株，無條 帶的為健康植株。
上述用RT-PCR技術(shù)快速檢測(cè)魔芋中芋花葉病毒的方法，所用試劑為副Apr印pure植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，5XM-MuLV反 轉(zhuǎn)錄酶緩沖溶液(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)，三磷酸堿基脫氧核苷 酸(dNTPs)(鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司生物技術(shù)有限公司)，RNA酶抑制劑(RNasin) (普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(普洛麥格(北京) 生物技術(shù)有限公司)，10XTaq Reaction buffer(鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)，Taq DNA Polymerase (鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)，6XLoading Buffer (大連寶生物工程 有限公司)，DL2000 Marker(鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)。
本發(fā)明與常規(guī)生物學(xué)方法測(cè)定芋花葉病毒(DsMV),具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果。 首先，將反應(yīng)循環(huán)中的變性時(shí)間和退火時(shí)間縮短為30 s ,并將循環(huán)次數(shù)減為30 次，此改進(jìn)措施可節(jié)省PCR反應(yīng)時(shí)間40min;其次，PCR總反應(yīng)體積由通常的25 y L 降至12.5uL，反轉(zhuǎn)錄酶只用2nL，試劑用量少，成本大幅度降低；最后，在提 取植物總RNA同時(shí)，也含有芋花葉病毒，從而避免了分離病毒的繁瑣過程，使操 作方便，快速，重復(fù)性好，克服了ELISA法需制備抗血清的限制且靈敏度不高， 易出現(xiàn)假陽(yáng)性的缺點(diǎn)。另外，本方法通過特異片段的有無，能100%判斷魔芋是否 帶芋花葉病毒。本方法在分子水平上為魔芋中DsMV的檢測(cè)提供了一種快速、靈敏、 簡(jiǎn)便的新方法，為魔芋中DsMV的防治、脫毒苗的檢測(cè)提供了有效手段。
具體實(shí)施例方式
一種魔芋中芋花葉病毒分子快速檢測(cè)方法，其步驟是
1、依據(jù)陳集雙主編的《天南星科植物病毒的分子診斷和半夏研究》合成DsMV 檢測(cè)的特異性引物DF: 5 ' -GGG CTT GGG TGA TGA TGG A - 3 ' ， DR: 5 ' -GCC TTT CAG TGT TCT CGC TTG -3 '，目的片段長(zhǎng)度O. 35kb;
2、 用RNApr印pure植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取帶 芋花葉病毒的魔芋(dasheen mosaic virus, DsMV)葉片總RNA;
3、 取一微量離心管，加入提取的RNA 8uL， 10uM的oligo-d(T) 4uL， 72 'C下變性5min，立即取出置于冰上放置5min。再依次加入反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(5 XM-MuLV)8uL， lOmMol的三磷酸堿基脫氧核苷酸(dNTPs) 4uL， 40U/uL的RNA 酶抑制劑(RNasin) 1 u L， 20U/y L的反轉(zhuǎn)錄酶(M-MuLV) 2"，加入O. 1% (V/V) 焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的重蒸水(ddH20) 15uL。將反應(yīng)混合物于42'C PCR
5存?zhèn)溆茫?br> 4、在12. 5li LPCR反應(yīng)體系中，取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物complement廳(c腿)2 uL，加10iiM的引物DF和DR各luL， lO慮ol的三磷酸堿基脫氧核苷酸(dNTPs) 0.8pL，反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(10Xbuffer) 2uL， 20慮ol的氯化鎂(MgCl2) 0. L, 2u/yl的Taq酶O. 5uL，重蒸水(ddH20) 4.5uL;反應(yīng)條件是94t:預(yù)變性 3rain， 94。C變性30s， 56。C退火30s， 72。C延伸30s， 30個(gè)循環(huán)，最后再72。C延伸 5min，在PCR儀上擴(kuò)增。
5、取擴(kuò)增產(chǎn)物2.5nL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)到 0.35kb片段長(zhǎng)度條帶的為帶病毒植株，無條帶的為健康植株。
上述的用RT-PCR技術(shù)快速檢測(cè)魔芋中芋花葉病毒的方法，所用試劑為 RNApr印pure植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，5XM-MuLV反 轉(zhuǎn)錄酶緩沖溶液(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)，三磷酸堿基脫氧核苷 酸(dNTPs)(鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司生物技術(shù)有限公司)，RNA酶抑制劑(RNasin) (普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(普洛麥格(北京) 生物技術(shù)有限公司)，10XTaq Reaction buffer (鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)，Taq DNA Polymerase(鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)，6XLoading Buffer(大連寶生物工程 有限公司)，DUOOO Marker(鼎.國(guó)生物技術(shù)有限公司)。
權(quán)利要求
1、一種魔芋中芋花葉病毒分子快速檢測(cè)方法，其步驟是A、合成DsMV檢測(cè)的特異性引物DF5′-GGG CTT GGG TGA TGA TGG A-3′，DR5′-GCC TTT CAG TGT TCT CGC TTG-3′，目的片段長(zhǎng)度0.35kb；B、用RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒提取帶芋花葉病毒的魔芋葉片總RNA；C、取一微量離心管，加入提取的RNA 8μL，10μM的oligo-d(T)4μL，72℃下變性5min，取出置于冰上放置5min，再依次加入反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液8μL，10mMol的三磷酸堿基脫氧核苷酸4μL，40U/μL的RNA酶抑制劑1μL，20U/μL的反轉(zhuǎn)錄酶2μL，0.1％(V/V)焦碳酸二乙酯處理過的重蒸水15μL，將反應(yīng)混合物于42℃ PCR儀中延伸1h，-20℃保存?zhèn)溆?；D、在12.5μLPCR反應(yīng)體系中，取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物complement DNA 2μL，加10μM的引物DF和DR各1μL，10mMol的三磷酸堿基脫氧核苷酸0.8μL，反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液2μL，20mMol的氯化鎂0.7μL，2u/μl的Taq酶0.5μL，重蒸水4.5μL；反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，最后再72℃延伸5min，在PCR儀上擴(kuò)增；E、取擴(kuò)增產(chǎn)物2.5μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)到0.35kb片段長(zhǎng)度條帶的為帶病毒植株，無條帶的為健康植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種魔芋中芋花葉病毒分子快速檢測(cè)方法，其步驟是首先合成1對(duì)擴(kuò)增DsMV的cp基因中間部分核心序列的寡核苷酸引物；然后將提取的魔芋葉片的總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，再以cDNA為模板，結(jié)果擴(kuò)增得到了與預(yù)期大小一致的0.35kb片段，接種后感病毒的魔芋葉片也擴(kuò)增到了此片段，而對(duì)照中未擴(kuò)增到任何產(chǎn)物。本方法在分子水平上為魔芋中DsMV的檢測(cè)提供了一種快速、靈敏、簡(jiǎn)便的新方法，為魔芋中DsMV的防治、脫毒苗的檢測(cè)提供了有效手段。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101492746SQ20091006089
公開日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2009年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日
發(fā)明者英 刁, 吳金平, 曉 胡, 胡中立, 顧玉成 申請(qǐng)人:武漢大學(xué);湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所