專利名稱：苯乙烯降解菌mj001及其分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其一種苯乙烯降解菌MJ001及其分離方法。
背景技術(shù)：
苯乙烯是用來制造塑料、樹脂、橡膠等由單分子體構(gòu)成的大分子物質(zhì)的原料，同時(shí) 也可用于制造聚脂和乳膠漆，具有易燃性、刺激性以及可疑致癌物。在苯乙烯的生產(chǎn)、使 用、運(yùn)輸以及貯藏過程中會(huì)發(fā)生較大量苯乙烯進(jìn)入大氣及水體的問題，且苯乙烯自身具有 較強(qiáng)揮發(fā)性，在大氣中很容易被光解，能被空氣中的氧所氧化成苯甲醚、苯乙醛及少量苯 乙醇。因此，苯乙烯可污染地表水、土壤、大氣和飲用水，對環(huán)境乃至人體健康危害嚴(yán)重。 土壤中的苯乙烯可以被微生物尤其是特異菌叢降解破壞，也可被其他化學(xué)試劑降解，而采 用微生物降解苯乙烯是最為環(huán)保、安全的一種方式。
通過專利檢索，尚未發(fā)現(xiàn)對苯乙烯有很強(qiáng)的降解能力的菌株
發(fā)明內(nèi)容
-
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種以苯乙烯作為唯一碳源生長，對 苯乙烯有很強(qiáng)地降解能力的苯乙烯降解菌MJ001及其分離方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種苯乙烯降解菌MJ001，其特征在于革蘭氏染色陰性、兼性需氧、最適生長溫度 37°C、最適pH6.4-7.4、三糖鐵實(shí)驗(yàn)陰性、氧化酶反應(yīng)陽性，16S rDNA序列與綠膿桿菌 P. aeruginosa有100%同源性，該菌種保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心，保藏編號為3042，保藏日期為2009年4月28日。
一種苯乙烯降解菌MJ001的分離方法，分離的步驟是-
① 將活性污泥放入無菌水中，振蕩，然后放于25-35'C培養(yǎng)箱中活化25-35min;
② 將從污泥上洗脫下來的菌液接種到苯乙烯唯一碳源液體培養(yǎng)基中，25-35。C振蕩培 養(yǎng)1.5-2.5d，得到液體培養(yǎng)液；
③ 將液體培養(yǎng)液在苯乙烯唯一碳源固體培養(yǎng)基上涂布，25-35。C培養(yǎng)1.5-2.5d，挑 取較大的單菌落進(jìn)行鏡檢；
④ 將上步驟挑取的單菌落重復(fù)2-4輪步驟②、③的培養(yǎng)過程，最后分離得到以苯乙 烯為唯一碳源生長的菌株，命名為MJ001。
而且，所述活性污泥來自天津塘沽聚苯乙烯生產(chǎn)廠家處理污水的活性污泥，由塘沽 區(qū)環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站采樣。
而且，所述苯乙烯唯一碳源液體培養(yǎng)基的組成及制備方法是
硫酸銨2g/L、磷酸二氫鉀2g/L、磷酸氫二鈉1. 3g/L、硫酸鎂0. 2g/L、 PH7. 0、 121°C滅菌20min,接種前加入配制好的苯乙烯瓊脂小塊。 而且，所述苯乙烯瓊脂塊的制備方法是
瓊脂20 g/L、 pH自然、12rC滅菌20min，待冷卻到50-6(TC時(shí)加入1%體積的苯乙 烯，混勻后倒平皿，用刀切成苯乙烯瓊脂小塊備用，放置時(shí)間少于l小時(shí)。
而且，所述苯乙烯唯一碳源固體培養(yǎng)基的組成及制備方法是
硫酸銨2g/L、磷酸二氫鉀2g/L、磷酸氫二鈉1. 3g/L、硫酸鎂0. 2g/L、瓊脂粉20g/L、 PH7.0、 121。C滅菌20min，倒平皿前加入1%體積的苯乙烯。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是
1、 本發(fā)明的苯乙烯降解菌MJ001以苯乙烯作為唯一碳源生長，在苯乙烯濃度較低時(shí)， 隨著苯乙烯濃度的增加，菌的生物量也在增加，菌株生長加快；當(dāng)苯乙烯濃度達(dá)到40mg/mL 時(shí)生長最快，當(dāng)苯乙烯濃度超過40mg/mL時(shí)生長變緩，直到苯乙烯濃度達(dá)到55mg/mL以后 菌株幾乎不生長，由此可表明該菌株對苯乙烯有很強(qiáng)的降解能力。
2、 本發(fā)明通過研究分離得到的一株苯乙烯降解菌MJOOl的特性，認(rèn)知該菌的降解機(jī) 理，有利于改進(jìn)微生物的凈化能力，有效解決苯乙烯的環(huán)境污染問題，對凈化含苯乙烯的 工業(yè)廢水有重要意義。


圖1為本發(fā)明中苯乙烯降解菌MJOOl菌落形態(tài)；
圖2為本發(fā)明中苯乙烯降解菌MJ001個(gè)體形態(tài)；
圖3為本發(fā)明中苯乙烯濃度對苯乙烯降解菌MJOOl生長的影響；
圖4為本發(fā)明中苯乙烯降解菌MJ001代謝曲線。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
一種苯乙烯降解菌MJOOl，革蘭氏染色陰性，兼性需氧，最適生長溫度37'C，最適 pH6.4-7.4，三糖鐵實(shí)驗(yàn)陰性，氧化酶反應(yīng)陽性，16S rDNA序列與綠膿桿菌P. aeruginosa 有100%同源性，該菌種保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏 編號為3042，保藏日期為2009年4月28日。該菌種的生物學(xué)分類命名為 /^ei/ab歷o"as朋r柳'"osa/^綠假單胞菌。
一種苯乙烯降解菌MJ001的分離方法，步驟是
(l)苯乙烯降解菌MJOOl的分離
① 將一定量的活性污泥放入100mL無菌水中，輕微振蕩，然后放于3(TC培養(yǎng)箱中活 化30min，使菌體盡可能多的從污泥上洗脫下來；
本步驟中活性污泥來自天津塘沽聚苯乙烯生產(chǎn)廠家處理污水的活性污泥，由塘沽區(qū) 環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站采樣。
② 將一定量的從污泥上洗脫下來的菌液接種到苯乙唯一碳源烯液體培養(yǎng)基中，30'C 振蕩培養(yǎng)2d，得到液體培養(yǎng)液；苯乙烯液體培養(yǎng)基硫酸銨2g/L、磷酸二氫鉀2g/L、磷酸氫二鈉1.3g/L、硫酸鎂 0.2g/L、 PH7.0、 12rC滅菌20min。接種前加入配制好的一定量的苯乙烯瓊脂塊。
苯乙烯瓊脂塊瓊脂20g/L、 pH自然、12rC滅菌20min，待冷卻到50-6(TC時(shí)加入 1%體積的苯乙烯，混勻后倒平皿(稍厚)，用刀切成小塊備用，放置時(shí)間不要超過一小時(shí)。
③ 將液體培養(yǎng)液在苯乙烯唯一碳源固體培養(yǎng)基上涂布，3CTC培養(yǎng)2d，挑取較大的單 菌落進(jìn)行鏡檢；
苯乙烯固體培養(yǎng)基硫酸銨2g/L、磷酸二氫鉀2g/L、磷酸氫二鈉1.3g/L、硫酸鎂 0.2g/L、瓊脂粉20g/L、 PH7.0、 121。C滅菌20min，倒平皿前加入1%體積的苯乙烯。
④ 將上步驟挑取的單菌落重復(fù)步驟②、③的培養(yǎng)過程，經(jīng)2-4輪篩選，最后分離出 一株以苯乙烯為唯一碳源生長且具有高效降解能力的菌株，命名為MJOOl，保存在唯一碳 源固體培養(yǎng)基中。
(2)菌株MJ001的鑒定
① Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)的快速鑒定
對菌株MJOOl進(jìn)行革蘭氏陰陽性鑒別、氧化酶實(shí)驗(yàn)和三糖鐵高層瓊脂斜面培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 初步確定菌株的微生物類型，然后在BUG+B培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，接著接種到Biolog 專用接種液中制備成均一的菌懸液，轉(zhuǎn)接到微孔板上進(jìn)行培養(yǎng)，把培養(yǎng)結(jié)果與Biolog系 統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，找到最接近的結(jié)果。
其結(jié)果為苯乙烯降解菌MJ001在固體培養(yǎng)基上，菌落形態(tài)及個(gè)體形態(tài)分別見圖1、 圖2，其生理特性為革蘭氏染色陰性、兼性需氧、最適生長溫度37。C、最適pH6.4-7.4、 三糖鐵實(shí)驗(yàn)陰性、氧化酶反應(yīng)陽性。Biolog鑒定結(jié)果與綠膿桿菌P. aeruginosa最接近， 有99%的相似性。
② 菌株MJ001的16S rDNA序列分析
菌株的DNA提取把分離得到的菌株接種到滅菌的2mLLB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16小 時(shí)，10000轉(zhuǎn)離心10min棄上清，無菌水洗三遍，沸水浴中煮沸裂解7min，冰浴冷卻，12000 轉(zhuǎn)離心5min取上清作為PCR模板備用。
16S rDNA序列擴(kuò)增16S rDNA序列擴(kuò)增用的是一對引物如下
正向引物Fl: 5' —AGAGTTTGATCC TGGCTCAG—3 ，
反向引物Rl: 5 ， —AAGGAGGTGATC CAGCCGCA—3 ，
PCR反應(yīng)體系:模板lixL，正向引物(25pmol/L)luL，反向引物(25pmol/L) 1 y L， 2 XPCRmix25nL ，用水補(bǔ)足到50nL。 PCR擴(kuò)增條件95。C5min， 94。C3min， 55。C30s， 72。C90s， 30cycles， 72。C5min， 4。C保存。
PCR產(chǎn)物切膠后用回收試劑盒回收，連接到pUCT載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 中。測序工作由北京華大基因完成。測序結(jié)果在NCBI的Blast上進(jìn)行序列相似性比對。
序列測定及同源性比較以菌株的總DNA為模板，利用細(xì)菌16SrDNA通用引物進(jìn)行 擴(kuò)增，得到長度約1. 5kb的DNA，測定其基因序列，將測序結(jié)果輸入GenBank，用Blast軟件與已知的16S rDNA序列進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該序列與綠膿桿菌(P. aeruginosa)有100%同源性。
(3)菌株MJ001的性能研究
① 菌株MJ001的耐受性研究
把菌株MJ001接種在含有不同濃度苯乙烯的唯一碳源培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時(shí)后取樣，用0D600檢測菌懸液的吸光度值，比較不同苯乙烯濃度對菌株生長的影響。
從圖3可以看出菌株MJ001在苯乙烯濃度較低時(shí)，隨著苯乙烯濃度的增加生物量增加，證明菌株生長加快，當(dāng)苯乙烯濃度達(dá)到40mg/raL時(shí)生長最快，而苯乙烯濃度超過40mg/mL時(shí)生長變緩，直到苯乙烯濃度達(dá)到55mg/mL以后菌株幾乎不生長。
② 菌株MJ001的代謝性能研究
把菌株MJ001接種到苯乙烯濃度40mg/mL的唯一碳源培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，考察菌株對苯乙烯的代謝情況。
由圖4可以看出菌株MJ001在培養(yǎng)時(shí)間10h內(nèi)代謝較緩慢，處于延滯期，苯乙烯消耗速率緩慢，這是由于菌株需要一段時(shí)間來適應(yīng)新環(huán)境。而在10-20h之間菌體快速生長，以最大的速率來降解苯乙烯，代謝旺盛。20h以后代謝變緩，苯乙烯濃度很低不足以維持菌體的正常代謝活動(dòng)，菌體逐步由穩(wěn)定生長走向衰亡。<110〉天津市天人合環(huán)保技術(shù)研發(fā)中心〈120〉苯乙烯降解菌MJ001及其分離方法
〈130〉 20090618
〈160> 3
〈170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 20
〈212> DNA
〈213〉 正向引物F1
<400〉 1
agagtttgat cctggctcag 20
〈210〉 2
〈211〉 20
〈212〉 腿
〈213〉反向引物R1
〈400〉 2
aaggaggtga tccagccgca 20
<210〉 3
〈211〉 1475
<212〉 ■
〈213> 菌株MJ001的16S rDNA序列
<400> 3
tggtctcgttgttacgacttcaccccagtc atgaatcaca ccgtggtaac cgtcctcccg60
aaggttagactagctacttctggtgcaacc cactcccatg gtgtgacggg cggtgtgtac120
aaggcccggg^Cgt3ttC8ccgcgacatt ctgattcgcg attactagcg attccgactt180
cacgcagtcgagttgcagactgegatcegg actacgatcg gttttgtgag attagctcca240
cctcgcggcttggcaaccctctgtaccgac cattgtagca cgtgtgtagc ccaggccgta300
agggccatgatgacttgacgtcatccccac cttcctccgg tttgtcaccg gcagtctcct360
tagagtgcccaccattacgtgctggtaact aaggacaagg gttgcgctcg ttaegggact420
taacccaacatctcacgacacgagctgacg acagccatgc agcacctgtg tcagsgttcc■
cgaaggcaccaatccatctctggaaagttc tctgcatgtc aaggcctggt aaggttcttc540
gcgttgcttcg^tta a^ccacatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattcattt600
gagttttaaccttgcggccgtactccccag geggtcaact taatgcgtta gctgcgccac660
t aaaat c teaaggattccaacggctagttg acategttta cggcgtggac taccagggta720
tctaatcctgtttgctccccacgctttcgc acctcagtgt cagtatcagt ccaggtggtc780gccttcgccactggtgttccttcctatatctacgcatttcaccgctacacaggaaattcc840
accaccctctaccgtactctagcttgccagttttggstgcagttcccaggttgagcccgg900
ggctttcacatccaacttaacaaetccscctacgcgcgctttacgcccagtaattccgatt960
aacgcttgcaccctctgtattaccgcggctgctggcacag agttsgccggtgcttattct1020
gtcggt雄gtca犯3C3gcaaggtattaacttactgcccttcctcccaa cttaaagtgc1080
tttacaatccgaagaccttcttcac3cacgcggcatggctggatcaggctttcgcccatt1140
gtcc犯tattccccactgctgcctcccgtaggagtctgga ccgtgtctca gttccagtgt1200
gactgatcatcctctcagaccagttacggatcgtcgccttggtgagccattaccccacca1260
actagctaatccgeiccteLggctcatctgatagcgcaaggcccgaaggtcccctgctttct1320
cccgtaggscgtatgcggtattagcgttcctttcg犯acgttgtccccca ctaccaggca1380
gattcctaggcattactcacccgtccgccgctgaMcaag gagc犯gctcccgtcatccg1440
ctcgacttgcatgtgttaggccttccgcattggct147權(quán)利要求
1、一種苯乙烯降解菌MJ001，其特征在于革蘭氏染色陰性、兼性需氧、最適生長溫度37℃、最適pH6.4-7.4、三糖鐵實(shí)驗(yàn)陰性、氧化酶反應(yīng)陽性，16S rDNA序列與綠膿桿菌P.aeruginosa有100％同源性，該菌種保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為3042，保藏日期為2009年4月28日。
2、 一種如權(quán)利要求l所述苯乙烯降解菌MJOOl的分離方法，其特征在于分離的步驟是① 將活性污泥放入無菌水中，振蕩，然后放于25-35'C培養(yǎng)箱中活化25-35min;② 將從污泥上洗脫下來的菌液接種到苯乙烯唯一碳源液體培養(yǎng)基中，25-35'C振蕩培 養(yǎng)1.5-2.5d，得到液體培養(yǎng)液；③ 將液體培養(yǎng)液在苯乙烯唯一碳源固體培養(yǎng)基上涂布，25-35'C培養(yǎng)1.5-2.5d，挑 取較大的單菌落進(jìn)行鏡檢；④ 將上步驟挑取的單菌落重復(fù)2-4輪步驟②、③的培養(yǎng)過程，最后分離得到以苯乙 烯為唯一碳源生長的菌株，命名為MJOOl。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的苯乙烯降解菌MJ001的分離方法，其特征在于所述活性 污泥來自天津塘沽聚苯乙烯生產(chǎn)廠家處理污水的活性污泥，由塘沽區(qū)環(huán)保局環(huán)境保護(hù)監(jiān)測 站采樣。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的苯乙烯降解菌MJ001的分離方法，其特征在于所述苯乙 烯唯一碳源液體培養(yǎng)基的組成及制備方法是硫酸銨2g/L、磷酸二氫鉀2g/L、磷酸氫二鈉1. 3g/L、硫酸鎂0. 2g/L、 PH7. 0、 121°C 滅菌20min，接種前加入配制好的苯乙烯瓊脂小塊。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的苯乙烯降解菌MJ001的分離方法，其特征在于所述苯乙 烯瓊脂塊的制備方法是瓊脂20 g/L、 pH自然、12rC滅菌20min，待冷卻到50-6(TC時(shí)加入1%體積的苯乙 烯，混勻后倒平皿，用刀切成苯乙烯瓊脂小塊備用，放置時(shí)間少于l小時(shí)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的苯乙烯降解菌MJ001的分離方法，其特征在于所述苯乙 烯唯一碳源固體培養(yǎng)基的組成及制備方法是硫酸銨2g/L、磷酸二氫鉀2g/L、磷酸氫二鈉1. 3g/L、硫酸鎂0. 2g/L、瓊脂粉20g/L、 PH7.0、 12rC滅菌20min，倒平皿前加入1%體積的苯乙烯。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種苯乙烯降解菌MJ001及其分離方法，苯乙烯降解菌MJ001特征為革蘭氏染色陰性、兼性需氧、最適生長溫度37℃、最適pH6.4-7.4、三糖鐵實(shí)驗(yàn)陰性、氧化酶反應(yīng)陽性，16S rDNA序列與綠膿桿菌(P.aeruginosa)有100％同源性，其分離的方法是①活化活性污泥；②菌液接種到苯乙烯唯一碳源液體培養(yǎng)基中；③培養(yǎng)液在苯乙烯唯一碳源固體培養(yǎng)基上涂布，挑取較大的單菌落進(jìn)行鏡檢，并保存；④重復(fù)2-4輪步驟②、③的培養(yǎng)過程，最后分離得到以苯乙烯為唯一碳源生長的菌株。本發(fā)明通過研究得到苯乙烯降解菌MJ001的特性，認(rèn)知該菌的降解機(jī)理，有利于改進(jìn)微生物的凈化能力，有效解決苯乙烯的環(huán)境污染問題，對凈化含苯乙烯的工業(yè)廢水有重要意義。
文檔編號C12N1/20GK101638630SQ20091006929
公開日2010年2月3日 申請日期2009年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月17日
發(fā)明者孔大為, 舫 李, 娟 門 申請人:天津市天人合環(huán)保技術(shù)研發(fā)中心