一種液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)樺褐孔菌木質(zhì)纖維素降解酶的工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)樺褐孔菌木質(zhì)纖維素降解酶的工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]木質(zhì)纖維素是植物通過光合作用產(chǎn)生的主要生物質(zhì)，它占總生物產(chǎn)量的60%以上。是自然界中含量最多的可用于食品、能源、醫(yī)藥的有機(jī)可再生資源。木質(zhì)纖維素大量存在于各種農(nóng)作物廢棄物、紙肩、木肩和果殼中，是一種價格低廉可循環(huán)利用、來源豐富的資源。有效的利用這些資源是將碳轉(zhuǎn)化為能源、食物和其他化學(xué)品的良好方式。
[0003]木質(zhì)纖維素是生物圈最為豐富的天然高分子化合物，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。纖維素是由13-1O4個β-D-吡喃型葡萄糖單體通過β_1，4糖苷鍵聯(lián)接而成的鏈狀高分子聚合物。半纖維素是由高度分枝的雜多糖鏈組成，以木聚糖和葡聚糖為主。木質(zhì)素是由多個苯丙烷單體組成的高分子芳香族類聚合物，它們相互之間通過C-O-C鍵和C-C鍵連接而成，苯丙烷單體的結(jié)構(gòu)和連接鍵非常復(fù)雜，這使得木質(zhì)素結(jié)構(gòu)不容易被破壞，木質(zhì)素在纖維素的降解中起到天然的屏障作用。木質(zhì)素和半纖維素通過共價鍵的形式連接，而纖維素被木質(zhì)素和半纖維素屏蔽在里面，因此，要想利用纖維素必須先破壞木質(zhì)素，也就是預(yù)處理。對木質(zhì)纖維素進(jìn)行預(yù)處理必須滿足以下要求:去除或改變木質(zhì)素，降低纖維素結(jié)晶度，增加纖維素的可及表面積，提高纖維素的利用率;促進(jìn)糖的形成，避免糖降解或損失；降低能量需求和成本投入。
[0004]在木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理中，對木腐菌木質(zhì)纖維素降解酶的研究是目前國際熱點。木腐菌包含三大類即軟腐菌、褐腐菌、白腐菌，褐腐菌主要攻擊對象是纖維素，而白腐菌和軟腐菌攻擊纖維素和木質(zhì)素。白腐菌(white rot fungi)是指著生在木材上，菌絲穿入木質(zhì)，侵入木質(zhì)細(xì)胞腔內(nèi)，能釋放降解木質(zhì)素和其他木質(zhì)組分的酶，以降解木材中的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素，引起木質(zhì)白色腐爛的絲狀真菌的集合。白腐菌的種類很多，絕大多數(shù)為擔(dān)子菌，少數(shù)為子囊菌。屬于擔(dān)子菌門(Basid1mycota)，包括非裙菌(Aphy I 1phorales)、傘菌(Agaricales)等200多個品系。白腐菌是目前已知的自然界中唯一能徹底降解木質(zhì)纖維素的微生物。
[0005]利用白腐菌專一性地降解木質(zhì)素，以去除木質(zhì)素和半纖維素(木質(zhì)纖維素中最易被降解的成分)對纖維素的包裹，達(dá)到提高纖維素或半纖維素的可及度，并在纖維素酶和半纖維素酶的作用下降解纖維素和半纖維素，是目前木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化和利用的最有潛力的途徑之一。在自然界中，白腐菌能夠產(chǎn)生木質(zhì)素水解酶系，將木質(zhì)素降解為C02，并在木質(zhì)纖維素的結(jié)晶區(qū)暴露出纖維素和半纖維素，再由多糖(纖維素、半纖維素)水解酶系降解纖維素和半纖維素。纖維素降解酶是一個復(fù)雜的酶系統(tǒng)，主要包括三類酶:內(nèi)切β-l，4-葡聚糖酶;外切葡聚糖酶;葡萄糖苷酶。半纖維素可以被降解為單糖和乙酸。半纖維素降解酶是內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶和β-1，4-木糖苷酶，此外，半纖維素的降解還需要木聚糖酯酶、葡糖醛酸酶、阿拉伯呋喃糖酶和乙酰酯酶等輔助酶的作用。木質(zhì)素降解酶主要有三類，即:木質(zhì)素過氧化物酶(Lip)、錳過氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)，此外，還包括乙二醛氧化酶和芳基醇氧化酶等。
[0006]黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)是最早被發(fā)現(xiàn)、其木質(zhì)纖維素降解酶被研究最多的木質(zhì)素降解白腐菌，大部分的固態(tài)發(fā)酵研究集中在黃孢原毛平革菌的降解作用和應(yīng)用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)其他白腐菌如Lentinus edodes(香燕),Pycnoporuscinnabarinus,Crinipellis sp.RCK-1,Ceripor1psis subvermispora,PhIebiabrevispora,Pleurotus ostreatus在培養(yǎng)中產(chǎn)生木質(zhì)纖維素降解酶，并對木質(zhì)素的降解具有選擇性。只有很少的白腐菌種類能同時產(chǎn)生三種酶，一些僅產(chǎn)生兩種甚至一種，根據(jù)文獻(xiàn)3對87種白腐菌的列表顯示，大部分的白腐菌都能產(chǎn)生漆酶Lac(E.C.1.10.3.2)，其次是錳過氧化物酶MnP(E.C.1.11.1.1 3 )，例如作為選擇性降解木質(zhì)素的模型白腐真菌Ceripor1psis subvermispora、Dichomitus squalens、Pleurotus ostreatus都只產(chǎn)生Lac和Mn P，而不產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶Lip，只有很少的白腐菌能產(chǎn)生LiP(E.C.1.11.1.14)，實際上，在天然木質(zhì)纖維素上白腐菌LiP的表達(dá)很難檢測。研究表明不同來源植物的木質(zhì)素需要不同比例的三種酶來提高降解效率。盡管漆酶是研究最多的木質(zhì)素降解酶，但是漆酶僅能直接氧化酚型木質(zhì)素單體，這類木質(zhì)素單體僅構(gòu)成少于10%的天然木質(zhì)素聚合物。相反，木質(zhì)素過氧化物酶是迄今為止最有效的氧化劑木質(zhì)素降解酶，能夠催化酚型或非酚型化合物、芳香氨、芳香酯和多環(huán)芳香碳?xì)浠衔锏难趸到?。因此，新發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生Lip的白腐菌、以及促進(jìn)白腐菌兩種或以上木質(zhì)素降解酶的同時產(chǎn)生和酶活力的方法是研究方向之一。
[0007]目前對一些白腐菌(不包括樺褐孔菌)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化包括(I)木質(zhì)纖維素基質(zhì)類型:不同木質(zhì)纖維素材料的木質(zhì)素、半纖維素、纖維素三個組分的比例和物理、化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同會造成白腐菌降解不同類型木質(zhì)纖維素效率上的差異。(2)碳氮源:它們影響白腐菌的生長和降解酶的產(chǎn)生和分泌，而且為了提高性價比，應(yīng)盡可能選擇價格便宜的碳氮源。(3)營養(yǎng)限制:有研究認(rèn)為限制碳氮源能促進(jìn)降解酶的產(chǎn)生，有的研究結(jié)論是營養(yǎng)限制不起作用，矛盾的結(jié)果可能源于不同的木質(zhì)纖維素材料和白腐菌。(4)誘導(dǎo)劑的作用:金屬離子如銅促進(jìn)漆酶的產(chǎn)生、錳促進(jìn)錳過氧化物酶的產(chǎn)生。一些小分子化合物如酚酸類化合物，黃酮類化合物，以及作為底物的化合物能促進(jìn)木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生。
[0008]樺褐孔菌，又名白樺鸞，學(xué)名Inonotusobiiquus,Fuscoporia oblique，是一種多孔菌科褐臥孔菌屬食藥用白腐真菌。樺褐孔菌主要生長于白樺、銀樺、榆樹、赤楊等活立木的樹皮下或砍伐后樹木的枯干上，形成不育的木腐菌，其菌核可以在砍伐后的枯干上生存達(dá)6年之久。樺褐孔菌子實體一般呈瘤狀，直徑約25-40cm，外表堅硬，有深的裂痕，較硬，干時脆，顏色呈黃褐色或更深。主要分布于俄羅斯北部、北歐、中國黑龍江、吉林長白山、日本北海道等北瑋45-50°極寒地區(qū)，是極其耐寒的菌種，能在零下69°C的環(huán)境下生長，生長期達(dá)15年。
[0009]野生的樺褐孔菌成年菌會吸干樺樹等寄主的精華，導(dǎo)致樹木干枯，故而其自然資源十分稀缺，其價格在國際市場上遠(yuǎn)勝珍貴藥用真菌桑黃。而且目前尚沒有有效的方法人工培育菌核和子實體，因此采用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體獲得活性成分或酶是一個可行的代替方法。采用液體深層發(fā)酵的方法，和傳統(tǒng)的真菌培育方法相比，具有生產(chǎn)周期短、成本低、產(chǎn)量質(zhì)量穩(wěn)定、產(chǎn)品可以控制等優(yōu)越性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的在于提供一種液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)樺褐孔菌木質(zhì)纖維素降解酶的工藝，具有發(fā)酵時間短、不容易感染雜菌、木質(zhì)纖維素降解酶易于提取純化等優(yōu)點。
[0011]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
[0012]—種液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)樺褐孔菌木質(zhì)纖維素降解酶的工藝，包括如下步驟:
[0013](I)菌種活化:以樺褐孔菌為菌種，接種至斜面菌種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得活化菌種；
[0014](2)液體菌種培養(yǎng):將活化菌種轉(zhuǎn)入液體種子培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至對數(shù)期得液體菌種；
[0015](3)液體深層發(fā)酵:將液體菌種接入液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，液體菌種與液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:8-10，所述液體深層發(fā)酵