專利名稱：：一種檢測馬凡綜合癥的試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種產(chǎn)前診斷馬凡綜合癥的方法，特別是一種利用多重聚合酶鏈式反應(PCR)和單堿基延伸反應的馬凡綜合癥的產(chǎn)前診斷方法，還涉及一種用于本發(fā)明診斷方法的試劑盒。
背景技術：
：馬凡綜合癥(Marfansyndrome;MFS)是最常見的遺傳性結(jié)締組織疾病之一，主要累及骨骼、眼部和心血管系統(tǒng)。其臨床特征為軀體異常，如體格細高，四肢及指(趾)細長，被稱為蜘蛛樣指(趾)；眼部晶狀體脫位；關節(jié)松弛；心臟大血管病變，如主動脈根及升主動脈瘤樣擴張以及急性或慢性主動脈內(nèi)膜破裂，形成夾層動脈瘤。另外，還有硬腦脊膜擴張、高腭弓、漏斗胸或雞胸以及肺和神經(jīng)系統(tǒng)畸形等一系列綜合征象。但是，這一綜合癥的臨床表現(xiàn)也可以是不完全顯性的，如缺少心臟大血管的典型表現(xiàn)者，常被稱為隱性馬凡綜合癥。馬凡綜合癥是一種常染色體顯性遺傳性疾病，人群發(fā)病率大約為1/10000，按此比例推算，中國有馬凡綜合癥病例13萬之多。馬凡綜合癥多有家族史，約15%25%為散發(fā)病例，在種族和性別上，發(fā)病沒有明顯差異。馬凡綜合癥患者的父母中有75%可診斷出患有該病，馬凡綜合癥患者子女的發(fā)生率約為50%。當父母均不是患者的情況下，如果第一個子女是馬凡綜合癥患者，那么他們再生育一小孩時，由于存在種群鑲嵌現(xiàn)象，該小孩的發(fā)病率會高于人群的平均水平。據(jù)報道，有1/3的馬凡綜合癥患者死于32歲以前，2/3死于50歲左右，其平均年齡僅40歲；其死亡的主要原因絕大多數(shù)是心血管病變造成的。最常見的癥狀是主動脈瘤破裂、心包壓塞或主動脈瓣關閉不全和二尖瓣脫垂而致的心力衰竭或心肌缺血。為了能在孕早期或孕中期對異常兒做出診斷，及時治療或處理。目前，可以進行產(chǎn)前診斷的疾病類型主要有染色體病(300多種)，X連鎖遺傳病(70余種)，先天性代謝缺陷病(新生兒先天性代謝病的發(fā)生率約8%。)和先天畸形。其中，染色體異常的遺傳病，比如唐氏綜合癥，特納綜合癥等，一般表現(xiàn)為染色體片段的重復和缺失，以及染色體的非整倍性(如多一條額外的染色體，如唐氏綜合癥者多一條額外的21號染色體，故亦稱為21三體綜合癥)。通過多種方法對染色體染色，可以檢測出以上染色體缺陷。目前這些方法已經(jīng)應用于臨床，通過檢測胎兒是否帶有異常染色體來迸行優(yōu)生，為患染色體遺傳病的家系帶去了福音，也大大減輕了社會的經(jīng)濟負擔。然而，對于馬凡綜合癥，其基因缺陷是在堿基水平的，表現(xiàn)為堿基的點突變，無義突變，剪接位點突變，終止密碼子的突變等，用染色體的方法是無法達到檢測目的的。而常規(guī)的產(chǎn)前B超檢査也難以發(fā)現(xiàn)胎兒的異常，這給優(yōu)生帶來了很大的挑戰(zhàn)。一個患兒的出生不僅給家庭，還給社會帶來了沉重的負擔。因此，尋找一種檢測馬凡綜合癥的試劑盒具有重要的意義。國內(nèi)外目前也還未見切實有效制備該試劑盒的方法的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術問題是克服上述
背景技術：
的不足，提供一種操作簡便、設備簡單、結(jié)果準確度高的檢測馬凡綜合癥的試劑盒；同時，本發(fā)明還提供一種利用多重聚合酶鏈式反應(PCR)和單堿基延伸反應制備該試劑盒的方法。本發(fā)明采用的技術方案是-一種檢測馬凡綜合癥的試劑盒，其特征在于包括特異性引物、多重PCR反應擴增液、潔凈液、單堿基延伸反應液，所述的特異性引物包括每條含18-25個堿基的六對或六對以上多重PCR擴增引物和與檢測位點相匹配的含40—45個堿基的突變檢測引物，其中突變檢測引物由5'端的地址序列和3'端的突變檢測區(qū)組所述的多重PCR引物序列如下1、TTTTTGTTTTAGACCCAATGTCT，GACAATACACTGATTTCCGCC;2、AAATAACTACAGATCMCTCCTGTGAG，TTTCTGGCATAGACACTGATCG;3、TGGCTGTCTCAATGGAGG，ATTTTAAAMCCATTACCTCTTTCAC;4、TTGATTTTAGACATTGATGAGTGTT，CGCATTACACACGCMTGAAA;5、TMTAAGTGCCTTTCTCTGCCA，GGGAAGCATTCACATCTGTAG;6、AAGATTCTGCCTGATGCTTTT，TATCTCCATTGTCTCCTCGAG。所述的突變檢測引物如下1、GGATCATGTTATAATGCTTACTGTT;2、TTTTCAAGTACMCACTGCMTATT;3、GTGTGTGGCCCCAAATCGATGTGCA;4、GAATGGCCGGATATGCAATMTGGA;5、AACCCCTGGGATCTGCATGAATGGG;6、TGTTTGTATATGGTAAATAGATACC。所述的多重PCR反應擴增液由lx的多重PCR緩沖液，5mM的氯化鎂溶液，75uM的單脫氧核苷三磷酸(其中dATP、dGTP、dCTP、dTTP的濃度均為75uM)，每種多重PCR引物各50nM，胎兒基因組DNA2ng/5ul，金牌DNA聚合酶0.1U/ixl構(gòu)成，最后用分子生物學級別的水配至5ul體系；所述的潔凈液由單堿基延伸反應的潔凈酶和與其配套lx的工作液組成(為美國GEHealthcare公司產(chǎn)品，貨號78260);所述的單堿基延伸反應液包括單堿基延伸反應緩沖液3.76u1,5uM的突變檢測引物0.06n1，2.5mM的熒光標記的雙脫氧核苷三磷酸對(ddATP和ddGTP;ddATP和ddCTP;ddATP和ddTTP;ddGTP和ddCTP;ddGTP和ddTTP;ddCTP和ddTTP)0.2yl，分子生物學級別水2.96ul和單堿基延伸反應的DNA聚合酶O.02ti1。所述的檢測馬凡綜合癥的試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)從有胎細胞的樣品中分離胎細胞并提取胎細胞的基因組DNA;2)設計六對或六對以上多重PCR引物和突變檢測引物；3)先用六對或六對以上多重PCR引物，以胎細胞DNA為模板，多重PCR擴增得到六組或六組以上的待檢測序列，再用已設計好的突變檢測引物對待檢測序列進行單堿基延伸反應，使突變檢測引物的末端加入一個用于檢測的熒光標記堿基；4)將單堿基延伸反應產(chǎn)物雜交至芯片后，進行雙通道掃描檢測分析，檢測單堿基延伸反應延伸的堿基。所述的多重PCR擴增反應是用六對或六對以上PCR引物配成多重PCR反應擴增液后在PCR儀上進行的，其中擴增反應液包括由lx的多重PCR緩沖液，5mM的氯化鎂溶液，75uM的單脫氧核苷三磷酸(其中dATP、dGTP、dCTP、dTTP的濃度均為75uM)，每種多重PCR引物各50nM,胎兒基因組DNA2ng/5u1，金牌■聚合酶0.1U/p1構(gòu)成，最后用分子生物學級別的水配至5y1體系。所述的多重PCR反應，由下列步驟構(gòu)成9步驟溫度時間第一步94。C1min第二步94。C30s第三步55°C30s第四步72°C1min第五步返回第二步，重復39次第六步保持反應溫度為4°C所述的擴增后的待檢測序列還需進行潔凈反應，該潔凈反應是將單堿基延伸反應的潔凈酶加入多重PCR的擴增產(chǎn)物中。所述的單堿基延伸反應是用突變檢測引物配成單堿基延伸反應液后在PCR儀上進行，其中單堿基延伸反應液包括單堿基延伸反應緩沖液3.76u1，5uM的突變檢測引物0.06ul，2.5mM的熒光標記的雙脫氧核苷三磷酸對(ddATP和ddGTP;ddATP和ddCTP;ddATP和ddTTP;ddGTP和ddCTP;ddGTP和ddTTP;ddCTP和ddTTP)0.2ii1，分子生物學級別水2.96iU和單堿基延伸反應的DNA聚合酶0.02n1，最后得到15u1的單堿基延伸反應體系。所述的單堿基延伸反應，由下列步驟構(gòu)成:步驟溫度時間第一步96°C3min第二步94°C20s第三步40°Clis第四步返回第二步，重復45次第五步保持反應溫度為4°C所述的多重PCR的擴增產(chǎn)物在用突變檢測引物単堿基延伸反應后雜交至芯片，包括-a、芯片雜交前洗板用稀釋好的1號雜交洗液(美國BeckmanCoulter公司試劑盒，貨號A16997)清洗384孔的芯片板孔2次；b、芯片雜交將雜交液(美國BeckmanCoulter公司試劑盒，貨號A16997)和雜交添加劑(美國BeckmanCoulter公司試劑盒，貨號A16997)溶液以18:l混合配制成雜交液后，與單堿基延伸反應體系混合，混勻后取10pl加入已預洗的384孔芯片板相應的孔中，將板置于保濕環(huán)境中42r雜交2小時；c、芯片雜交后洗板用稀釋好的2號雜交洗液(美國BeckmanCoulter公司試劑盒，貨號A16997)清洗384孔的芯片板孔。所述的含有胎細胞的樣品選自血液、尿液、組織樣品和羊水。本實用新型的有益效果是該檢測馬凡綜合癥的試劑盒具有操作簡便、結(jié)果準確度高的特點，能在孕早期或孕中期對患有馬凡綜合癥的異常兒做出診斷，從而達到及時治療或處理。該試劑盒應用于臨床，通過檢測胎兒是否帶有基因突變來進行優(yōu)生，減輕了社會的經(jīng)濟負擔。同時，本發(fā)明所提供一種利用多重聚合酶鏈式反應(PCR)和單堿基延伸反應制備該試劑盒的方法，該方法具高通量和操作簡單的特點。圖1為本發(fā)明中從有胎細胞的樣品中分離胎細胞并提取胎細胞的基因組DNA的方法。圖2為本發(fā)明利用雙通道熒光掃描顯色及計算機整合來檢查基因突變的原理圖。圖3為本發(fā)明通過雙通道掃描熒光顯色及計算機整合來檢測待檢測樣本實例圖。具體實施例方式下述具體實施例用于說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的范圍。本實施例中使用了下列試劑1、胎兒基因組DNA提取通用基因組DNA提取試劑盒(由寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)提供，貨號DV811A)。2、PCR試劑引物(由上海英駿生物工程有限公司合成)含六對擴增引物(序列見序列表)，擴增出待測序列；金牌DNA聚合酶(為美國AppliedBiosystem公司產(chǎn)品)；10xPCR緩沖液(為美國AppliedBiosystem公司產(chǎn)品)；氯化鎂(為美國AppliedBiosystem公司產(chǎn)品)；分子生物學級別水(為美國Invitrogen公司產(chǎn)品)；96孔PCR反應板(為美國Corning公司產(chǎn)品)。3、PCR產(chǎn)物潔凈單堿基延伸反應的潔凈酶(為美國GEHealthcare公司產(chǎn)品，貨號78260);4、單堿基延伸反應試劑引物(由上海英駿生物工程有限公司合成)六條突變檢測引物(序列見序列表)；單堿基延伸反應的DNA聚合酶(為美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品，貨號A16997);帶有不同熒光基團的雙脫氧核苷三磷酸對(ddATP和ddGTP(為美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品，貨號10104400);ddATP和ddCTP(為美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品，貨號10104600);ddATP和ddTTP(為美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品，貨號:10104800);ddGTP和ddCTP(為美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品，貨號10106600);ddGTP和ddTTP(為美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品，貨號10106500);ddCTP和ddTTP(為美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品，貨號10104500);緩沖液(為美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品，貨號A16997);分子生物學級別水(為美國Invitrogen公司產(chǎn)品)。5、基因芯片雜交雜交試劑盒(為美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品，貨號A16997);384孔的芯片板(為美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品)?！N檢測馬凡綜合癥的試劑盒，包括特異性引物、多重PCR反應擴增液、潔凈液、單堿基延伸反應液、雜交緩沖液，所述的特異性引物包括每條含18-25個堿基的六對或六對以上PCR擴增引物和與檢測位點相匹配的含40—45個堿基的突變檢測引物，其中突變檢測引物由5'端的地址序列和3'端的突變檢測區(qū)組成。12所述的PCR引物序列如下-1、TTTTTGTTTTAGACCCAATGTCT，GACMTACACTGATTTCCGCC;2、AAATAACTACAGATCAACTCCTGTGAG，TTTCTGGCATAGACACTGATCG;3、TGGCTGTCTCAATGGAGG，ATTTT楊AACCATTACCTCTTTCAC;4、TTGATTTTAGACATTGATGAGTGTT，CGCATTACACACGCAATGMA;5、TAATAAGTGCCTTTCTCTGCCA，GGGAAGCATTCACATCTGTAG;6、AAGATTCTGCCTGATGCTTTT,TATCTCCATTGTCTCCTCGAG。所述的突變檢測引物如下-1、GGATCATGTTATAATGCTTACTGTT;2、TTTTCAAGTACAACACTGCAATATT;3、GTGTGTGGCCCCAAATCGATGTGCA;4、GAATGGCCGGATATGCAATMTGGA;5、AACCCCTGGGATCTGCATGAATGGG;6、TGTTTGTATATGGTAMTAGATACC。上述的用于檢測馬凡綜合癥的試劑盒的制備方法，包括以下步驟1、從有胎細胞的樣品中分離胎細胞并提取胎細胞的基因組DNA;(1)用常規(guī)腹壁穿刺的方法獲取羊水5—10ml(—般選擇在孕滿15周以后實施穿刺)；(2)取2ml羊水放入容量為2ml的離心管內(nèi)，離心(轉(zhuǎn)速為10，000rpm)20秒。倒掉上清液；(3)用Takara公司的通用基因組DNA提取試劑盒(UniversalGenomicDNAExtractionKit貨號DV811A)從離心沉淀出來的胎兒脫落細胞內(nèi)提取胎兒DNA;具體步驟如下a.在2ml離心管內(nèi)加入150ix1的滅菌蒸餾水懸浮細胞；b.加入500n1溶液A和0.8nl的RNA酶A1，激烈振蕩15秒鐘，然后室溫靜置1分鐘；c.加入4001的溶液B，振蕩混合；cl.加入lml的4"預冷的溶液C，充分混勻后，12000rpm離心2分鐘；e.棄去上層有機相，再加入lml的4'C預冷的溶液C，充分混勻后，12000rpm離心2分鐘；f.棄去上層有機相，然后將水相溶液(無色下層)轉(zhuǎn)移至收集管上的濾過杯中，12000rpm離心1分鐘；(注有機相(上層)帶有顏色，務必除盡，否則會阻礙DNA結(jié)合到DNA制備膜上，上下層間的沉淀不必考慮，在過濾時將被除去)g.棄濾過杯，在濾液中加入400lU的DB緩沖液，混合均勻；h.將試劑盒中的旋轉(zhuǎn)柱安置在收集管上，將上述操作g混合液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)柱中，12000rpm離心1分鐘，棄濾液；i.將500Pl沖洗液A加入至旋轉(zhuǎn)柱中，12000rpm離心30秒鐘，棄濾液；j.將700ul沖洗液B加入至旋轉(zhuǎn)柱中，12000rpm離心30秒鐘，棄濾液；(注沿管壁四周加入沖洗液B，這樣有助于完全沖洗粘附于管壁上的鹽分)k.重復操作步驟j;1、將旋轉(zhuǎn)柱安置于新的1.5ml的離心管上，在旋轉(zhuǎn)柱膜的中央加入50200Ul的滅菌蒸餾水或者洗脫液，室溫靜置l分鐘；(注把滅菌蒸餾水或者洗脫液加熱至65。C使用時有利于提高洗脫效率)12000rpm離心1分鐘洗脫DNA即可得到胎兒的DNA溶液。(4)如果標本不馬上使用，放置在一2(TC冰箱中保存。2、設計六對多重PCR引物和相應的突變檢測引物；根據(jù)待檢測突變位點及其相關序列，用Autoprimer軟件(http:〃www.autoprimer.com/)設計相關的六對多重PCR引物及其相應的突變檢測引物，該引物的合成由上海英駿生物工程有限公司完成，需要時可按需求情況進行購買。3、用上述設計好的六對多重PCR引物，以胎細胞DNA為模板，多重PCR擴增得到六組待檢測序列，具體步驟為用六對或六對以上PCR引物配成多重PCR反應擴增液后在PCR儀上進行的，其中擴增反應液包括由1x的多重PCR緩沖液，5mM的氯化鎂溶液，75uM的單脫氧核苷三磷酸(其中dATP、dGTP、dCTP、dTTP的濃度均為75uM)，每種多重PCR引物各50nM，胎兒基因組DNA2ng/5u1，金牌DNA聚合酶0.1U/nl構(gòu)成，最后用分子生物學級別的水配至5ul體系。分別加至96孔板的反應樣孔中。多重PCR引物擴增反應，包括以下6步第一步將PCR儀的溫度調(diào)至94匸，反應l分鐘；第二步保持PCR儀內(nèi)溫度為94'C，再反應30秒；第三步將PCR儀的溫度調(diào)至55'C，反應30秒；第四步將PCR儀的溫度調(diào)至72t:，反應l分鐘；第五步返回到第二步，重復進行39次；第六步保持PCR儀內(nèi)溫度為4"C。反應結(jié)束后，取出PCR產(chǎn)物板，離心(1000rpmlmin)，至于冰上。4、擴增后的待檢測序列進行潔凈反應，該潔凈反應是將單堿基延伸反應的潔凈酶加入六組或六組以上經(jīng)擴增的PCR產(chǎn)物中。具體操作方法是將美國GEHealthcare公司出售的SBE酶試劑用配套的稀釋液稀釋成1x的工作液，在每個5n1的96孔板的反應樣孔中加3u1工作液，混勻，重新封膜，在MJ-225PCR儀上執(zhí)行下述程序第一步將MJ-225PCR儀的溫度調(diào)至37r，反應30分鐘；第二步將MJ-225PCR儀的溫度調(diào)至96。C，再反應10分鐘；第三步保持MJ-225PCR儀內(nèi)溫度為4°C。5、用已設計好的突變檢測引物對待檢測序列進行單堿基延伸反應，使突變檢測引物的末端加入一個熒光標記的堿基。該單堿基延伸反應的具體操作方法是用分子生物學級別水溶解突變檢測引物，配成每種突變檢測引物各5uM濃度的混合液。按照反應的樣本數(shù)配制下述反應體系(為美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品，貨號A16997):在上述每孔8u1的體系中加入每孔7n1的單堿基延伸反應液，混勻。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>單堿基延伸的DNA聚合酶0.02U1總和7li1按照下述步驟在MJ—225PCR儀上進行延伸反應:第一步將MJ—225PCR儀的溫度調(diào)至96。C，反應3分鐘；第二步保持MJ—225PCR儀內(nèi)溫度為94t:，再反應20秒；第三步將MJ—225PCR儀的溫度調(diào)至40。C，反應11秒；第四步返回到第二步，重復進行45次；第五步保持PCR儀內(nèi)溫度為4"C。5、將上述的六組待檢測序列在用突變檢測引物単堿基延伸后雜交至芯片，該芯片雜交反應包括如下步驟a、芯片雜交前洗板用雙蒸水將l號雜交洗液(為美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品，貨號A16997)稀釋成lx的工作液，倒入加樣槽，用排槍從加樣槽中取10ul加入384孔的芯片板孔中，手指輕輕叩打板的邊緣，使洗液充分覆蓋整個孔底面積。板上覆蓋一張無塵紙巾，倒置放入離心機中，1000rpm離心l分鐘去除洗液。此步驟再重復兩次。b、芯片雜交將雜交液(為美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品，貨號A16997)和雜交添加劑(為美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品，貨號A16997)溶液以18:l混合配制成雜交液后，在上述15ul的單堿基延伸反應體系混合，混勻后取10y1加入已預洗的384孔芯片板相應的孔中，將板置于保濕環(huán)境中42。C雜交2小時；C、芯片雜交后洗板雜交好的芯片板上覆蓋一張無塵紙巾，倒置放入離心機中，1000rpm1分鐘離心去除雜交反應溶液。將2號雜交洗液(為美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品，貨號A16997)稀釋成lx的工作液，倒入加樣槽，用排槍從加樣槽中取10til加入384孔的芯片板孔中，手指輕輕叩打板的邊緣，使洗液充分覆蓋整個孔底面積。板上覆蓋一張無塵紙巾，倒置放入離心機中，1000rpm離心1分鐘去除洗液。此步驟再重復兩次。6、數(shù)據(jù)掃描及分析(1)用甲醇潔凈384芯片板的背面玻璃。將板放入SNPstream儀器(為美國BeckmanCoulter公司產(chǎn)品)進行數(shù)據(jù)雙通道掃描及分析，檢測單堿基延伸反應延伸的熒光標記堿基。雙通道掃描的機理是將12框的384芯片置于SNPstream儀器上，分別用兩種不同的熒光進行掃描，得到兩個顯色結(jié)果。再用計算機對兩個通道的掃描結(jié)果進行整合，得到一個最終的顯色圖。其中若待測標本在兩個通道的熒光掃描中出現(xiàn)兩種不同的顏色，便可判斷待測標本的單堿基延伸產(chǎn)物為雜合子，即待檢測標本存在基因突變。(2)芯片驗證我們選用了6個病人樣本和6個正常人的標本，對基因芯片進行了驗證。經(jīng)過圖紙分析純合子只在單個通道(通道1)顯色；而雜合子可在兩個通道顯色。1號位置為雙通道均顯色的雙陽性對照(雜合子)，4號位置為通道1顯色的單陽性對照(純合子)；13號位置為通道2顯色的陽性對照(純合子)，16號位為雙通道均不顯色的陰性對照。2號位、5號位，7號位，9號位，ll號位，14號位均為檢出突變的雜合子樣本；3號位，6號位，8號位，IO號位，12號位，15號位均為正常個體對照，顯示純合子。用基因芯片的方法，6個突變樣本在雙通道均有不同顯色，提示為雜合子。樣本全部被檢出(檢出率為6/6);而正常的樣本均只在單通道顯色，也全部被檢出(檢出率為6/6)。序列表SEQUENCELISTING<110><120><130><160><170><210><211><212><213>浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院一種檢測馬凡綜合癥的試劑盒及其制備方法18Patentlnversion3.323DNAHomosapiens<400>1tttttgttttagaccca3tgtct23<210>2<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>2ggatc3tgttataatgcttsctgtt25<210>3<211>21<212>DNA<213>Homosapiens<400>3gacaatacactgatttccgcc21<210>4<211>27<212>DNA<213>Homosapiens<400>4ssiataactacagatcaatctcctgtgag27<210>5<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>5ttttcasgtaicsacsctgcaatatt<210>6<211>22<212>DNA<213>Homosapiens<400>6tttctggcatagacactgateg<210>7<211>18<212>DNA<213>Homosapiens<400>7tggctgtctcaatggagg<210〉8<211〉25<212〉DNA<213>Homosapiens<400>8gtgtgtggccccaaatcgatgtgca<210>9<211>26<212>DNA<213>Homosapiens<400>9attttaasasccattscctctttcsc<210>10<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>10ttgattttagacattgatgagtgtt<210>11<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>11gastggccggststgcsatastgga25<210>12<211>21<212>DNA<213>Homosapiens<400>12cgcsttac3cacgcaatgss321<210>13<211>22<212>DNA<213>Homosapiens<400>13taataagtgcctttctctgcca22<210>14<211>25<212>DNA<213>Homosapiens<400>14aacccctgggstctgcatgaatggg25<210>15<211>21<212>DNA<213>Homosapiens<400>15ggg3sgcsttC3cstctgt3g21<210>16<211>21<212>DNA<213>Homosapiens21<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>權利要求1、一種檢測馬凡綜合癥的試劑盒，其特征在于包括特異性引物、多重PCR反應擴增液、潔凈液、單堿基延伸反應液，所述的特異性引物包括每條含18-25個堿基的六對或六對以上多重PCR擴增引物和與檢測位點相匹配的含40—45個堿基的突變檢測引物，其中突變檢測引物由5’端的地址序列和3’端的突變檢測區(qū)組成。2、根據(jù)權利要求1所述的檢測馬凡綜合癥的試劑盒，其特征在于所述的多重PCR引物序列如下-1、TTTTTGTTTTAGACCCAATGTCT，GACAATACACTGATTTCCGCC;2、AAATAACTACAGATCMCTCCTGTGAG，TTTCTGGCATAGACACTGATCG;3、TGGCTGTCTCAATGGAGG，ATTTTAAAAACCATTACCTCTTTCAC;4、TTGATTTTAGACATTGATGAGTGTT，CGCATTACACACGCAATGAAA;5、TAATAAGTGCCTTTCTCTGCCA，GGGAAGCATTCACATCTGTAG;6、AAGATTCTGCCTGATGCTTTT，TATCTCCATTGTCTCCTCGAG;所述的突變檢測引物如下1、GGATCATGTTATAATGCTTACTGTT;2、TTTTCAAGTACMCACTGCMTATT;3、GTGTGTGGCCCCAAATCGATGTGCA;4、GAATGGCCGGATATGCMTAATGGA;5、AACCCCTGGGATCTGCATGAATGGG;6、TGTTTGTATATGGTAAATAGATACC。3、根據(jù)權利要求2所述的檢測馬凡綜合癥的試劑盒，其特征在于所述的多重PCR反應擴增液由lx的多重PCR緩沖液，5mM的氯化鎂溶液，75uM的單脫氧核苷三磷酸，其中dATP、dGTP、dCTP、dTTP的濃度均為75uM，每種多重PCR引物各50nM，胎兒基因組DNA2ng/5ti1，金牌DNA聚合酶0.1U/ul構(gòu)成，最后用分子生物學級別的水配至5Pl體系；所述的潔凈液由單堿基延伸反應的潔凈酶和與其配套lx的工作液組成；所述的單堿基延伸反應液包括單堿基延伸反應緩沖液3.76"1，5uM的突變檢測引物0.06ul，2.5mM的熒光標記的雙脫氧核苷三磷酸對，其中ddATP和ddGTP;ddATP和ddCTP;ddATP和ddTTP;ddGTP和ddCTP;ddGTP和ddTTP;ddCTP和ddTTP各0.2ixl，分子生物學級別水2.96ixl和單堿基延伸反應的DNA聚合酶O.02u1。4、制備權利要求1所述的檢測馬凡綜合癥的試劑盒的方法，包括以下步驟:1)從有胎細胞的樣品中分離胎細胞并提取胎細胞的基因組DNA;2)設計六對或六對以上多重PCR引物和突變檢測引物；3)先用六對或六對以上多重PCR引物，以胎細胞DNA為模板，多重PCR擴增得到六組或六組以上的待檢測序列，再用已設計好的突變檢測引物對待檢測序列進行單堿基延伸反應，使突變檢測引物的末端加入一個用于檢測的熒光標記堿基；4)將單堿基延伸反應產(chǎn)物雜交至芯片后，進行雙通道掃描檢測分析，檢測單堿基延伸反應延伸的堿基。5、制備權利要求4所述的檢測馬凡綜合癥的試劑盒的方法，包括以下步驟:所述的多重PCR擴增反應是用六對或六對以上PCR引物配成多重PCR反應擴增液后在PCR儀上進行的，其中擴增反應液包括由lx的多重PCR緩沖液，5mM的氯化鎂溶液，75uM的單脫氧核苷三磷酸，其中dATP、dGTP、dCTP、dTTP的濃度均為75uM，每種多重PCR引物各50nM，胎兒基因組DNA2ng/5u1，金牌DNA聚合酶0.1U/u1構(gòu)成，最后用分子生物學級別的水配至5y1體系。6、制備權利要求5所述的檢測馬凡綜合癥的試劑盒的方法，包括以下步驟:所述的多重PCR反應，由下列步驟構(gòu)成步驟溫度時間第一步94。C1min第二步94°C30s第三步55。C30s第四步72。C1min第五步返回第二步，重復39次第六步保持反應溫度為4°C7、制備權利要求6所述的檢測馬凡綜合癥的試劑盒的方法，包括以下步驟:所述的擴增后的待檢測序列還需進行潔凈反應，該潔凈反應是將單堿基延伸反應的潔凈酶加入多重PCR的擴增產(chǎn)物中。8、制備權利要求7所述的檢測馬凡綜合癥的試劑盒的方法，包括以下步驟:所述的單堿基延伸反應是用突變檢測引物配成單堿基延伸反應液后在PCR儀上進行，其中單堿基延伸反應液包括單堿基延伸反應緩沖液3.76yl，5uM的突變檢測引物0.06iU，2.5mM的熒光標記的雙脫氧核苷三磷酸對，其中ddATP和ddGTP;ddATP和ddCTP;ddATP和ddTTP;ddGTP和ddCTP;ddGTP和ddTTP;ddCTP和ddTTP各0.2tU，分子生物學級別水2.96ii1和單堿基延伸反應的DNA聚合酶0.02iU，最后得到15iil的單堿基延伸反應體系。9、制備權利要求8所述的檢測馬凡綜合癥的試劑盒的方法，包括以下步驟:所述的單堿基延伸反應，由下列步驟構(gòu)成:<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>10、制備權利要求9所述的檢測馬凡綜合癥的試劑盒的方法，包括以下步驟所述的多重PCR的擴增產(chǎn)物在用突變檢測引物単堿基延伸反應后雜交至芯片，包括-a、芯片雜交前洗板用稀釋好的1號雜交洗液清洗384孔的芯片板孔2次;b、芯片雜交將雜交液和雜交添加劑溶液以18:1混合配制成雜交液后，與單堿基延伸反應體系混合，混勻后取10u1加入已預洗的384孔芯片板相應的孔中，將板置于保濕環(huán)境中42'C雜交2小時；c、芯片雜交后洗板用稀釋好的2號雜交洗液清洗384孔的芯片板孔。全文摘要本發(fā)明涉及一種產(chǎn)前診斷馬凡綜合癥的方法，具體是利用多重聚合酶鏈式反應(PCR)和單堿基延伸反應的馬凡綜合癥的產(chǎn)前診斷方法，還涉及一種用于本發(fā)明診斷方法的試劑盒。本發(fā)明提供一種操作簡便、設備簡單、結(jié)果準確度高的檢測馬凡綜合癥的試劑盒和制備該試劑盒的方法。技術方案是一種檢測馬凡綜合癥的試劑盒，其特征在于包括特異性引物、多重PCR反應擴增液、潔凈液、單堿基延伸反應液，所述的特異性引物包括每條含18-25個堿基的六對或六對以上多重PCR擴增引物和與檢測位點相匹配的含40-45個堿基的突變檢測引物，其中突變檢測引物由5’端的地址序列和3’端的突變檢測區(qū)組成。文檔編號C12Q1/68GK101481743SQ20091009556公開日2009年7月15日申請日期2009年1月22日優(yōu)先權日2009年1月22日發(fā)明者克姚,孫朝暉,金沖飛申請人:浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院