專利名稱：：一種蘿卜硫素的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及天然產(chǎn)物中有效成分的提取純化工藝，具體為一種從干燥的西蘭花種子或新鮮的西蘭花球中提取蘿卜硫素的方法。目前，根據(jù)流行病學(xué)及藥理學(xué)的研究表明，癌癥發(fā)病率低的地方，人們飲食中蔬菜、水果所占比例較大。蔬菜、水果中存在一種或多種阻止或減慢癌癥發(fā)展的植物活性成分，如番茄中的番茄紅素、大豆制品中的大豆異黃酮、漿果中的鞣化酸以及十字花科蔬菜中的蘿卜硫素、吲哚類物質(zhì)，均被證實具有良好的防癌抗癌作用。在眾多含有抗癌活性成分的蔬菜中，十字花科(洋白菜、花莖甘藍(lán)、球莖甘藍(lán)青花椰菜、芥蘭、萵苣、白蘿卜和高麗菜等)中富含多種芥子苷(glucosinolates,簡稱GLs)。葡萄糖萊菔子苷(芥子苷的一種)經(jīng)黑芥子硫酸苷酶酶解(myrosinase)或酸水解后，產(chǎn)生蘿卜硫素(sulforaphen，簡稱SF)，它是迄今為止蔬菜中發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的抗癌成分之一。蘿卜硫素又稱"萊菔子素"，就其化學(xué)成分而言，為異硫代氰酸鹽衍生物，易溶于水,相對分子質(zhì)量177.3，分子式C6H11S2N0，結(jié)構(gòu)式如下蘿卜硫素是一種多功能誘導(dǎo)物，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生II型解毒酶-谷光甘肽轉(zhuǎn)移酶和醌還原酶，此酶可對許多致癌物產(chǎn)生抗性，從而起到抗癌作用。蘿卜硫素具有較強(qiáng)的抗癌作用且為植物活性物質(zhì)，無毒副作用，所以具有廣闊的市場
背景技術(shù)：
：前景。目前，有研究報道從西蘭花中提取蘿卜硫素的方法，如專利為"一種提取蘿卜硫素的方法(CN101143842)"，"一種萊菔硫垸的制備方法(CN1982294)"均涉及蘿卜硫素的提取和純化方法，但這兩種方法制備得到的蘿卜硫素的轉(zhuǎn)化率較低，只限于實驗規(guī)模制備少量產(chǎn)品，難于大規(guī)模地進(jìn)行工業(yè)化的生產(chǎn)。目前，還沒有解決上述問題更好的實施方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種蘿卜硫素的提取方法的改進(jìn)，該提取方法優(yōu)化了原有提取純化方法，提高了蘿卜硫素的轉(zhuǎn)化率，大大降低了蘿卜硫素的生產(chǎn)成本。本發(fā)明的技術(shù)方案一種蘿卜硫素的提取方法，包括以下步驟-(1)用干燥的西蘭花種子或新鮮的西蘭花球為原料，粉碎至3060目后，按重量計加入1.52倍量的水，用5%鹽酸調(diào)節(jié)pH4.14.5，每公斤原料中加入1克的粗芥子硫苷酸酶后，在3134X:的溫度下水解13h;(2)將水解后的西蘭花固液混合物冷凍干燥成含水率小于5%的粉末；(3)冷凍干燥后的粉末中，分3次共加入10倍重量的純丙酮，在室溫下共浸提48h，過濾、合并3次制備得到的丙酮浸提液，將濾液于354(TC溫度下真空濃縮得到蘿卜硫素粗品；(4)將上述制備得到的蘿卜硫素粗品采用硅膠柱層析，采用乙酸乙酯和乙醇的混合液為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，收集蘿卜硫素餾分，354(TC溫度下真空濃縮；(5)將上述經(jīng)真空濃縮的蘿卜硫素先用甲醇溶解后，經(jīng)0.2wm微孔濾膜過濾后，用2040pm的C18硅膠裝柱，采用不同濃度的甲醇水進(jìn)行梯度洗脫，收集蘿卜硫素餾分，3540'C溫度下真空干燥，得到高含量的蘿卜硫素。上述的一種蘿卜硫素的提取方法，作為優(yōu)選，所述的粗芥子硫苷酸酶為芥子硫苷酸酶的粗品，其制備方法是取新鮮甘藍(lán)，粉碎至3060目，用50目的雙層紗布過濾后得濾液，濾液在5'C溫度下加入1倍量濾液體積的純丙酮，混合均勻，用高速冷凍離心機(jī)5。C下離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為4000r/min;得沉淀物，即為芥子硫苷酸酶的粗品，將該芥子硫苷酸酶的粗品放入-20'C下進(jìn)行冷凍保存、備用。上述的一種蘿卜硫素的提取方法，作為優(yōu)選，所述蘿卜硫素粗品硅膠柱層析前，需要先在蘿卜硫素粗品中加入200目的硅膠拌樣，硅膠的加入量為蘿卜硫素粗品重量的兩倍，經(jīng)硅膠拌樣后的蘿卜硫素粗品在紅外燈下烘干直至丙酮完全揮發(fā)即可。上述的一種蘿卜硫素的提取方法，作為優(yōu)選，步驟(4)中梯度洗脫前需要先加入3倍柱體積量的乙酸乙酯進(jìn)行洗脫除雜。上述的一種蘿卜硫素的提取方法，作為優(yōu)選，步驟(4)中用于梯度洗脫的洗脫劑為乙酸乙酯與乙醇的混合溶液，該混合溶液中乙酸乙酯與乙醇的體積比為13:97。上述的一種蘿卜硫素的提取方法，作為優(yōu)選，步驟(4)中以乙酸乙酯和乙醇的混合液為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫的操作需要進(jìn)行三次，三次梯度洗脫時乙酸乙酯與乙醇的體積比分別為1:9，2:8，3:7。上述的一種蘿卜硫素的提取方法，作為優(yōu)選，步驟(5)中所述的洗脫劑是濃度為6080%的甲醇。本發(fā)明通過優(yōu)化蘿卜硫素原有的提取純化工藝(尤其是通過添加粗芥子硫苷酸酶進(jìn)行酶解)，大大地提高了蘿卜硫素的轉(zhuǎn)化率，該提取方法得到的蘿卜硫素的轉(zhuǎn)化率高達(dá)8cm以上，從而大大地降低了蘿卜硫素的生產(chǎn)成本。同時，該提取方法還可以根據(jù)市場的需要得到不同含量的蘿卜硫素產(chǎn)品，具有很好的實用性；此外，該提取方法還適用于工業(yè)化的大規(guī)模的生產(chǎn)。本發(fā)明中涉及的配比及其百分含量均以重量計。具體實施例方式以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明，但這些實施例的目的并不在于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在這些實施例中，除另有說明外，所有百分含量均以重量計。實施例1:粗芥子硫苷酸酶(即芥子硫苷酸酶的粗品)的制備稱取lkg新鮮甘藍(lán)，粉碎過30目篩，用50目的雙層紗布過濾后，得到650ml濾液；濾液在5'C下加入1倍濾液體積量的純丙酮，混合均勻，在高速冷凍離心機(jī)下離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為4000r/min，離心時的溫度為4"C;得到41.2g沉淀物，該沉淀物即為芥子硫苷酸酶的粗品，將該芥子硫苷酸酶的粗品放入-20'C下進(jìn)行冷凍保存、備用。稱取1.0kg西蘭花干燥種子，粉碎至30目，加入1.5kg水，用5%鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.1,加入粗芥子硫苷酸酶1.10g，在3rc條件下水解ih;將水解后的固液混合物冷凍干燥，得到1.05kg的粉末，所得到的粉末的含水量應(yīng)小于5%。用10.5kg丙酮，分3次浸提所得粉末，第一次丙酮用量4.5kg，浸提3小時，第二次丙酮用量3kg，浸提1.5h，第三次丙酮用量3kg，浸提1.5h，合并3次浸提液，在35。C溫度下真空濃縮，得到47.71g浸膏，即得含量2.91%的蘿卜硫素粗品。在上述制備得到的蘿卜硫素中加入200目的硅膠進(jìn)行拌樣，硅膠的加入量為蘿卜硫素粗品重量的兩倍，經(jīng)硅膠拌樣后的蘿卜硫素粗品在紅外燈下烘干至丙酮完全揮發(fā)。經(jīng)烘干后的蘿卜硫素粗品裝入200目的硅膠中進(jìn)行層析，層析時采用干法上樣，梯度洗脫的方法。所述的蘿卜硫素粗品層析包括硅膠柱層析和反相硅膠柱層析兩步；其中硅膠柱層析先進(jìn)行，反相硅膠柱層析后進(jìn)行。所述的硅膠柱層析分為四步進(jìn)行1、在硅膠柱中加入3倍柱體積的乙酸乙酯進(jìn)行洗脫除雜；2、在硅膠柱中加入2倍柱體積乙酸乙酯與無水乙醇的混合液，該混合液中乙酸乙酯無水乙醇的體積比為h9，進(jìn)行洗脫，得到餾分l;3、在硅膠柱中加入2倍柱體積乙酸乙酯與無水乙醇的混合液，該混合液中乙酸乙酯無水乙醇的體積比為2:8，進(jìn)行洗脫，得到餾分2;4、在硅膠柱中加入2倍柱體積乙酸乙酯與無水乙醇的混合液，該混合液中乙酸乙酯無水乙醇的體積比為3:7，進(jìn)行洗脫，得到餾分3;合并餾分l、2、3，在35'C溫度下真空濃縮，得到4.llg含量24.30%的蘿卜硫素。所述的反相硅膠柱層析步驟如下將上述制備得到的24.30%的蘿卜硫素用10ml純甲醇溶解，經(jīng)O.lum微孔濾膜過濾后；用20nm的C18硅膠裝柱，采用不同濃度的甲醇水為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，該梯度洗脫操作重復(fù)3次，第一次洗脫劑是濃度為80%的甲醇，第二次洗脫劑是濃度為70%的甲醇，第三次洗脫劑是濃度為60%的甲醇；收集第二次洗脫得到的餾分，3(TC溫度下真空濃縮除去甲醇后，經(jīng)冷凍干燥，得到含量為95.10y。的蘿卜硫素937.5mg。實施例2:稱取1.kg西蘭花千燥種子，粉碎至60目，加入3kg水，用5%鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.5，加入粗芥子硫苷酸酶1.10g(實施例1制備得到的)，在34'C條件下水解3h;將水解后的固液混合物冷凍干燥，得到1.05kg的粉末，所得到的粉末的含水量應(yīng)小于5%。用10.5kg丙酮，分3次浸提所得粉末，第一次丙酮用量4kg，浸提2小時，第二次丙酮用量3.5kg，浸提lh，第三次丙酮用量3kg，浸提lh，合并3次浸提液，在4CTC真空濃縮，得到46.54g浸膏，即得含量2.83%的蘿卜硫素粗品；在上述制備得到的蘿卜硫素中加入300目的硅膠進(jìn)行拌樣，硅膠的加入量為蘿卜硫素粗品重量的兩倍，經(jīng)硅膠拌樣后的蘿卜硫素粗品在紅外燈下烘干直至丙酮完全揮發(fā)。經(jīng)烘干后的蘿卜硫素粗品裝入200目的硅膠中進(jìn)行層析，層析時采用干法上樣，梯度洗脫的方法。所述的蘿卜硫素粗品層析包括硅膠柱層析和反相硅膠柱層析兩步；其中硅膠柱層析先進(jìn)行，反相硅膠柱層析后進(jìn)行。所述的硅膠柱層析分為四步進(jìn)行1、在硅膠柱中加入3倍柱體積的乙酸乙酯進(jìn)行洗脫除雜；2、在硅膠柱中加入2倍柱體積乙酸乙酯與無水乙醇的混合液，該混合液中乙酸乙酯無水乙醇的體積比為l:9,進(jìn)行洗脫，得到餾分l;3、在硅膠柱中加入2倍柱體積乙酸乙酯與無水乙醇的混合液，該混合液中乙酸乙酯無水乙醇的體積比為2:8，進(jìn)行洗脫，得到餾分2;4、在硅膠柱中加入2倍柱體積乙酸乙酯與無水乙醇的混合液，該混合液中乙酸乙酯無水乙醇的體積比為3:7,進(jìn)行洗脫，得到餾分3;合并餾分l、2、3，在35。C溫度下真空濃縮，得到3.98g含量23.30%的蘿卜硫素。所述的反相硅膠柱層析步驟如下將上述制備得到的23.30%的蘿卜硫素用10ml純甲醇溶解，經(jīng)0.3um微孔濾膜過濾后；用40um的C18硅膠裝柱，采用不同濃度的甲醇水為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，該梯度洗脫操作重復(fù)3次，第一次洗脫劑是濃度為80%的甲醇，第二次洗脫劑是濃度為70%的甲醇，第三次洗脫劑是濃度為60%的甲醇；收集第二次洗脫得到的餾分，40'C溫度下真空濃縮除去甲醇后，經(jīng)冷凍干燥，得到含量為95.20%的蘿卜硫素870.5mg。實施例3:稱取lkg新鮮西蘭花花球，粉碎至30目，加入1.5kg水，用5%鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.3，加入粗芥子硫苷酸酶1.10g(實施例l制備得到的)，在3rC條件下水解2h;將水解后的固液混合物冷凍干燥，得到157.32g的粉末；用1.7kg丙酮，分3次浸提所得粉末，第一次丙酮用量0.7kg，浸提3小時，第二次丙酮用量0.5kg，浸提1.5h，第三次丙酮用量0.5kg，浸提1.5h，合并3次浸提液，在35。C真空濃縮，得到11.05g浸膏，即得含量2.53%的蘿卜硫素粗品；在上述制備得到的蘿卜硫素粗品中加入200目的硅膠進(jìn)行拌樣，硅膠的加入量為蘿卜硫素粗品重量的兩倍，經(jīng)硅膠拌樣后的蘿卜硫素粗品在紅外燈下烘干直至丙酮完全揮發(fā)。經(jīng)烘干后的蘿卜硫素粗品裝入200目的硅膠中進(jìn)行層析，層析時采用干法上樣，梯度洗脫的方法。所述的蘿卜硫素粗品層析包括硅膠柱層析和反相硅膠柱層析兩步；其中硅膠柱層析先進(jìn)行，反相硅膠柱層析后進(jìn)行。所述的硅膠柱層析分為四步進(jìn)行1、在硅膠柱中加入3倍柱體積的乙酸乙酯進(jìn)行洗脫除雜；2、在硅膠柱中加入2倍柱體積乙酸乙酯與無水乙醇的混合液，該混合液中乙酸乙酯無水乙醇的體積比為l:9，進(jìn)行洗脫，得到餾分l;3、在硅膠柱中加入2倍柱體積乙酸乙酯與無水乙醇的混合液，該混合液中乙酸乙酯無水乙醇的體積比為2:8，進(jìn)行洗脫，得到餾分2;4、在硅膠柱中加入2倍柱體積乙酸乙酯與無水乙醇的混合液，該混合液中乙酸乙酯無水乙醇的體積比為3:7，進(jìn)行洗脫，得到餾分3;合并餾分1、2、3，在35。C溫度下真空濃縮，得到0.96g含量20.21%的蘿卜硫素。所述的反相硅膠柱層析步驟如下將上述制備得到的20.21%的蘿卜硫素用2ml純甲醇溶解，經(jīng)0.2um微孔濾膜過濾后；用30um的C18硅膠裝柱，采用不同濃度的甲醇水為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，該梯度洗脫操作重復(fù)3次，第一次洗脫第二次洗脫劑是濃度為70%的甲醇，第三次洗脫劑是濃度為60%的甲醇；收集第二次洗脫得到的餾分，4(TC溫度下真空濃縮除去甲醇后，經(jīng)冷凍千燥，得到含量為94.70%的蘿卜硫素147.6mg。本發(fā)明提供的蘿卜硫素提取方法具有很高的轉(zhuǎn)化率，不僅適用于工業(yè)化生產(chǎn)，而且降低了生產(chǎn)成本。以下通過具體實驗數(shù)據(jù)來比較說明本發(fā)明提供的蘿卜硫素提取方法與現(xiàn)有方法之間的區(qū)別。由于蘿卜硫素是以前體葡萄糖萊菔子苷的形式存在的，葡萄糖萊菔子經(jīng)過水解后才能轉(zhuǎn)化為苷蘿卜硫素，水解過程的轉(zhuǎn)化率直接決定了所采用提取工藝的收率。通常采用的水解方法有二種，一是僅控制水解過程的pH值(專利CN1982294采用此法)；二是在控制pH值得同時，加入抗壞血酸(CN101143842)。本發(fā)明采用了加入粗芥子硫苷酸酶和調(diào)節(jié)PH值的方法，使水解轉(zhuǎn)化率得到了很大提高。以下進(jìn)行了三種轉(zhuǎn)化方法的對比試驗。1、采用專利一種萊菔硫垸的制備方法(CN1982294)的方法迸行蘿卜硫素的轉(zhuǎn)化稱取100g西蘭花干燥種子，粉碎至50目，加入180g水，用5%鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.2，在28。C條件下水解2h;將水解后的固液混合物冷凍干燥，得到101.llg的粉末；用l.lkg丙酮，分3次浸提所得粉末，第一次丙酮用量0.5kg，浸提3小時，第二次丙酮用量0,3kg，浸提1.5h，第三次丙酮用量0.3kg，浸提1.5h，合并3次浸提液，在35。C真空濃縮，得到3.52g浸膏，即得含量2.11%的蘿卜硫素粗品；2、采用專利一種提取蘿卜硫素的方法(CN101143842)"進(jìn)行蘿卜硫素的轉(zhuǎn)化稱取100g西蘭花干燥種子，粉碎至3060目，加入180g水，用5%鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.0，在28'C條件下水解2h;將水解后的固液混合物冷凍干燥，得到106.llg的粉末；用1.lkg丙酮，分3次浸提所得粉末，第一次丙酮用量0.5kg，浸提3小時，第二次丙酮用量0.3kg，浸提1.5h，第三次丙酮用量0.3kg，浸提1.5h，合并3次浸提液，在35。C真空濃縮，得到3.82g浸膏，即得含量2.31%的蘿卜硫素粗品；3、稱取100g西蘭花千燥種子，粉碎至40目，加入180g水，用5%鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.5，加入粗芥子硫苷酸酶O.11g在31'C條件下水解2h;將水解后的固液混合物冷凍干燥，得到108.53g的粉末；用1.lkg丙酮，分3次浸提所得粉末，第一次丙酮用量0.5kg，浸提3小時，第二次丙酮用量0.3kg，浸提1.5h，第三次丙酮用量0.3kg，浸提1.5h，合并3次浸提液，在35"C真空濃縮，得到4.51g浸膏，即得含量2.93%的蘿卜硫素粗品；三種方法蘿卜硫素的轉(zhuǎn)化率見表1。表1三種轉(zhuǎn)化方法比較<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從對比實施例可知，本發(fā)明提供的蘿卜硫素提取方法將葡萄糖萊菔子轉(zhuǎn)化為蘿卜硫素的轉(zhuǎn)化率大大提高，從而大大地降低了蘿卜硫素的生產(chǎn)成本。權(quán)利要求1、一種蘿卜硫素的提取方法，包括以下步驟(1)用干燥的西蘭花種子或新鮮的西蘭花球為原料，粉碎至30～60目后，按重量計加入1.5～2倍量的水，用5％鹽酸調(diào)節(jié)pH4.1～4.5，每公斤原料中加入1克的粗芥子硫苷酸酶后，在31～34℃的溫度下水解1～3h；(2)將水解后的西蘭花固液混合物冷凍干燥成含水率小于5％的粉末；(3)冷凍干燥后的粉末中，分3次共加入10倍重量的純丙酮，在室溫下共浸提4～8h，過濾、合并3次制備得到的丙酮浸提液，將濾液于35～40℃溫度下真空濃縮得到蘿卜硫素粗品；(4)將上述制備得到的蘿卜硫素粗品采用硅膠柱層析，采用乙酸乙酯和乙醇的混合液為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，收集蘿卜硫素餾分，35～40℃溫度下真空濃縮；(5)將上述經(jīng)真空濃縮的蘿卜硫素先用甲醇溶解后，經(jīng)0.2μm微孔濾膜過濾后，用20～40μm的C18硅膠裝柱，采用不同濃度的甲醇水進(jìn)行梯度洗脫，收集蘿卜硫素餾分，35～40℃溫度下真空干燥，得到高含量的蘿卜硫素。2、如權(quán)利要求1所述的一種蘿卜硫素的提取方法，其特征在于所述的粗芥子硫苷酸酶為芥子硫苷酸酶的粗品，其制備方法是取新鮮甘藍(lán)，粉碎至3060目，用so目的雙層紗布過濾后得濾液，濾液在5'c溫度下加入r倍量濾液體積的純丙酮，混合均勻，在高速冷凍離心機(jī)下離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為4000r/min,離心時的溫度為46t:;得沉淀物，即為芥子硫苷酸酶的粗品，將該芥子硫苷酸酶的粗品放入-2(TC下進(jìn)行冷凍保存、備用。3、如權(quán)利要求1所述的一種蘿卜硫素的提取方法，其特征在于所述蘿卜硫素粗品硅膠柱層析前，需要先在蘿卜硫素粗品中加入200目的硅膠拌樣，硅膠的加入量為蘿卜硫素粗品重量的兩倍，經(jīng)硅膠拌樣后的蘿卜硫素粗品在紅外燈下烘干直至丙酮完全揮發(fā)即可。4、如權(quán)利要求1所述的一種蘿卜硫素的提取方法，其特征在于步驟(4)中梯度洗脫前需要先加入3倍柱體積量的乙酸乙酯進(jìn)行洗脫除雜。5、如權(quán)利要求1所述的一種蘿卜硫素的提取方法，其特征在于步驟(4)中用于梯度洗脫的洗脫劑為乙酸乙酯與乙醇的混合溶液，該混合溶液中乙酸乙酯與乙醇的體積比為13:97。6、如權(quán)利要求1所述的一種蘿卜硫素的提取方法，其特征在于步驟(4)中以乙酸乙酯和乙醇的混合液為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫的操作需要進(jìn)行三次，三次梯度洗脫時乙酸乙酯與乙醇的體積比分別為h9，2:8，3:7。7、如權(quán)利要求1所述的一種蘿卜硫素的提取方法，其特征在于步驟(5)中所述的洗脫劑是濃度為6080%的甲醇。全文摘要本發(fā)明屬于生物化學(xué)
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。目的是提供一種蘿卜硫素的提取方法的改進(jìn)，該提取方法優(yōu)化了原有提取純化方法，提高了蘿卜硫素的轉(zhuǎn)化率，大大降低了蘿卜硫素的生產(chǎn)成本。一種蘿卜硫素的提取方法，包括以下步驟1.用干燥的西蘭花種子或新鮮的西蘭花球為原料，粉碎后，加入水，調(diào)節(jié)pH4.1～4.5，加入粗芥子硫苷酸酶后，水解；2.將水解后的西蘭花冷凍干燥成粉末；3.在粉末中，加入純丙酮，浸提，過濾、合并丙酮浸提液，將濾液真空濃縮成蘿卜硫素粗品；4.該蘿卜硫素粗品梯度洗脫，收集餾分，真空濃縮；5.將蘿卜硫素先用甲醇溶解后，經(jīng)微孔濾膜過濾后，用C18硅膠裝柱，采用甲醇水梯度洗脫，收集蘿卜硫素餾分，真空干燥，得蘿卜硫素。文檔編號C12P11/00GK101544995SQ20091009819公開日2009年9月30日申請日期2009年5月7日優(yōu)先權(quán)日2009年5月7日發(fā)明者刑健彬,童云標(biāo),陳安良,陳張金申請人:杭州臨安天鴻生物科技有限公司