專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴(kuò)增引物及其檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
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本發(fā)明主要涉及動(dòng)物生物技術(shù)領(lǐng)域中的綿羊分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，具體涉及到藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
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綿羊腐蹄病是由節(jié)瘤擬桿菌引起高度接觸性傳染病，其特征是蹄局部組織發(fā)炎、壞死。綿羊患病后生長(zhǎng)不良、掉膘、羊毛品質(zhì)下降，病情嚴(yán)重且得不到及時(shí)治療時(shí)會(huì)引起羊只死亡。藏綿羊易患腐蹄病，于每年7-9月份的多雨季節(jié)爆發(fā)，如在甘肅和青海境內(nèi)的藏綿羊發(fā)病率高達(dá)30%以上，死亡率最高可達(dá)10%，嚴(yán)重影響牧區(qū)養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展。
動(dòng)物主要組織相容性(基因)復(fù)合體(major histocompatibility complex ,MHC)與多種疾病有密切關(guān)系，是目前開(kāi)展抗病育種的首選基因座或候選基因。綿羊主要組織相容性(基因)復(fù)合體也稱(chēng)為OLA (ovine lymphocyte antigen) ， OLA II區(qū)與人的相似，區(qū)域內(nèi)的￡ 2和Di 2個(gè)基因家族表現(xiàn)豐富的多態(tài)性，但綿羊的多態(tài)性更集中在DQ家族。OLA-DQ基因家族有2個(gè)DQA基因座位，即DQA1和DQA2基因，都具有多態(tài)性。
目前國(guó)內(nèi)綿羊腐蹄病主要采用藥物防治措施，較難控制病情且有藥物殘留風(fēng)險(xiǎn)。在國(guó)外OLA-DQA2基因已經(jīng)作為抗腐蹄病的遺傳標(biāo)記加以應(yīng)用，并且該檢測(cè)已商業(yè)化并用來(lái)開(kāi)展抗病選育。藏綿羊腐蹄病抗性分子選種技術(shù)主要利用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)待測(cè)綿羊的DQA2基因第2外顯子進(jìn)行多態(tài)性分析，然后根據(jù)檢測(cè)結(jié)果確定攜帶不同等位基因的羊只對(duì)腐蹄病的抗性強(qiáng)弱，從而判斷是否可以留作種用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴(kuò)增弓l物及其引物的擴(kuò)增條件。
本發(fā)明的另一 目的是提供一種檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測(cè)試劑盒的使用方法。
以解決快速、敏感性高、成本低用于藏綿羊腐蹄病抗性分子選種技術(shù)。本發(fā)明利用PCR-SSCP對(duì)表型正常和患腐蹄病藏綿羊OLA-DQA2基因第2外顯子進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，并克隆、測(cè)序群體內(nèi)變異產(chǎn)生的各等位基因序列，結(jié)合表型觀(guān)測(cè)資料，確定易感等位基因和抗性等位基因，并指導(dǎo)藏綿羊沒(méi)有感染時(shí)的抗病選育。
本發(fā)明涉及一種藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒。通過(guò)PCR-SSCP對(duì)藏綿羊基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)，分析羊只是否攜帶腐蹄病抗性等位基因，從而判斷是否可以留作種用。
本發(fā)明的目的可以通過(guò)采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn) 一種檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴(kuò)增引物，其主要特點(diǎn)是第一組引物上游長(zhǎng)度為24bp的核苷酸，下游長(zhǎng)度為22bp的核苷酸，第二組引物上游長(zhǎng)度為23bp的核苷酸，下游長(zhǎng)度為24bp的核苷酸，包括用于擴(kuò)增OLA-DQA2基因第2外顯子的特異性引物，序列如下上游弓I物24bp: DQA2-up: CACATGTTACAGTGCAAAARCAGC;下游引物22bp: DQA2-dn: CCCTCYCACCAACGTTTCCCAG;上游弓I物23bp: DQA2s-up: ACTACCAATCTCATGGTCCCTCT;下游弓l物24bp: DQA2s-dn: GGAGTAGAATGGTG GACACTTACC;其中I^A或G， Y-C或T。
所述的檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴(kuò)增引物，是所述的PCR-SSCP擴(kuò)增引物的擴(kuò)增條件為
第一次第一組引物PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94t:2 min ，變性94。C30s ，退火64。C30s，延伸72。C50s，共32個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸5 min;
第二次第二組引物PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94'C2 min ，變性94'C30s ，退火67'C30s，延伸72'C30s，共32個(gè)循環(huán),最后72'C延伸5 min。
所述的檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測(cè)試劑盒，組成成分用量及濃度為四種引物各為0.5nL/10pmo1， dNTP為1.2nL/2.5mm， Taq DNA聚合酶為0.2pL/2.5U4iL，10xbuffer為2.0pL含Mg2+15nM，雙純水為14.6pL。
SSCP檢測(cè)試劑去離子水，10%過(guò)硫酸銨，變性緩沖液，TEMED(四甲基乙二胺)，聚丙烯酰胺(Acr: Bis = 39:1)， OLA-DQA2*L的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣。
所述的檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測(cè)方法，是藏綿羊易感等位基因和抗性較強(qiáng)等位基因的確定步驟為
(1)收集表型正常和患腐蹄病藏綿羊基因組DNA;(2) 用上述特異性引物DQA2-up和DQA2-dn擴(kuò)增步驟(1 )中的DNA特異性片 段；
(3) 用上述特異性引物DQA2s-up和DQA2s-dn擴(kuò)增步驟(2)中的的PCR產(chǎn)物；
(4) 用步驟(3)中的的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測(cè)；
(5) 克隆、測(cè)序步驟(4)中產(chǎn)生的各等位基因序列；
(6) 根據(jù)(4)的基因型判別結(jié)果，結(jié)合表型觀(guān)測(cè)資料，確定藏綿羊腐蹄病易感等 位基因和抗性等位基因；
(7)確定藏綿羊腐蹄病易感等位基因?yàn)镺LA-DQA2*H，抗性等位基因?yàn)?br> OLA-DQA2*L。
所述的檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測(cè)方法，具體的檢測(cè)步驟如下
(1 )樣品采集采集表型正常和患腐啼病的藏綿羊，頸靜脈采血10ml， ACD抗凝-20
'C凍存；
(2) 基因組DNA的提取用常規(guī)的酚-氯仿抽提法從凍存血樣中提取基因組DNA;
(3) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
20pL的反應(yīng)體系，其成分用量及濃度為四種引物各為0.5pL/10pmol， dNTP為 1.2nL/2.5腿，TaqDNA聚合酶為0.2nL/2.5U/pL， 10xbuffer為2.0^iL含Mg2+15pM，模 板DNA為ljiL/50ng，雙純水為14.6pL;
第一次第一組引物PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94。C2min ，變性94。C30s ，退火64。C30s， 延伸72'C50s，共32個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸5 min;
第二次第二組引物PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94。C2min ，變性94。C30s ，退火67。C30s， 延伸72'C30s，共32個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸5min;
DQA2-up和DQA2也的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為828bp， DQA2s-up和DQA2s-dn以DQA2-up 和DQA2-dn的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為242bp。
(4) PCR產(chǎn)物的SSCP檢測(cè)
取2^d的PCR產(chǎn)物加入^l的上樣變性緩沖液,包括98。/。去離子甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、 0.025%二甲苯青、10mmol/LEDTApH8.0 ， 98 。C變性10min ，立即冰浴10min; 12% 的非變性聚丙烯酰胺凝膠，140V電壓條件下，4'C電泳19h ，銀染法顯色后拍照；
(5) 結(jié)果判斷
在藏綿羊DQA2基因第2外顯子上共發(fā)現(xiàn)16個(gè)(OLA-DQA2*A-OLA-DQA2*P) 等位基因，藏綿羊腐蹄病易感等位基因?yàn)镺LA-DQA2*H，抗性等位基因?yàn)?OLA-DQA2*L。所述的檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測(cè)試劑盒的使用方法，具體的步驟為
(1) 試劑盒中各組分與待檢測(cè)基因組DNAlnL/50ng混合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 所述的PCR-SSCP擴(kuò)增引物的擴(kuò)增條件為
第一次第一組引物PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94'C2 min ，變性94'C30s ，退火 64'C30s，延伸72'C50s，共32個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸5 min;
第二次第二組引物PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94'C2 min ，變性94'C30s ，退火 67。C30s，延伸72'C30s，共32個(gè)循環(huán),最后72。C延伸5 min。
(2) 用步驟(1)中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和OLA-DQA2化標(biāo)準(zhǔn)樣與試劑盒中SCCP檢 測(cè)試劑各組分混合進(jìn)行SSCP檢測(cè)；
(3) 步驟(2)中檢測(cè)到的帶型與試劑盒中OLA-DQA2*L的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣帶型一致 的樣品為攜帶腐蹄病抗性等位基因的個(gè)體。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明利用PCR-SSCP對(duì)表型正常和患腐蹄病藏綿羊的 OLA-DQA2基因第2外顯子進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，并克隆、測(cè)序群體內(nèi)變異產(chǎn)生的各等 位基因序列，結(jié)合表型觀(guān)測(cè)資料，確定易感等位基因和抗性較強(qiáng)的等位基因，為藏綿羊 沒(méi)有感染時(shí)的抗病選育進(jìn)行指導(dǎo)。本發(fā)明通過(guò)對(duì)試驗(yàn)羊只OLA-DQA2基因第2外顯子的 SSCP檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了16個(gè)等位基因，其中14個(gè)等位基因(OLA-DQA2*A、 OLA-DQA2*B、 OLA-DQA2*C、 OLA-DQA2*D 、 OLA-DQA2*E 、 OLA-DQA2*F 、 OLA-DQA2*G 、 OLA-DQA2*I、 OLA-DQA2*J、 OLA-DQA2*K 、 OLA-DQA2*M 、 OLA-DQA2*N 、 OLA-DQA2*0、 OLA-DQA2*P )在正常和患病群體中都存在，l個(gè)等位基因 (OLA-DQA2*L)只在正常群體中存在，另有l(wèi)個(gè)等位基因(OLA-DQA2*H)只在患病 群體中存在。將等位基因OLA-DQA2+L作為藏綿羊腐蹄病抗病相關(guān)MHC基因標(biāo)記，建立 了抗病相關(guān)基因標(biāo)記輔助選種技術(shù)。本發(fā)明對(duì)藏綿羊抗腐蹄病的分子標(biāo)記選種具有快速、 敏感性高、成本低等特點(diǎn)。


圖i是藏綿羊OLA-DQA2基因第2外顯子PCR-SSCP檢測(cè)凝膠圖。
具體實(shí)施例方式
以下對(duì)所示之最佳實(shí)施例作進(jìn)一步詳述
下面以藏綿羊腐蹄病抗性分子選種技術(shù)的建立為例，對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。
實(shí)施例h 試驗(yàn)材料
藏綿羊選自甘肅省甘南藏族自治州大水種畜場(chǎng)104只，甘南州碌曲縣牧民羊群羊791 只(患腐蹄病223只)，青海省海晏縣哈里鄉(xiāng)哈里村牧民羊群72只(患腐蹄病22只)，頸 靜脈采血10ml， ACD抗凝,-20 。C凍存。用酚-氯仿抽提法從凍存血樣中提取基因組DNA， 溶于TE， 4'C保存。 試驗(yàn)方法
l.引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增
采用巢式PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增。DQA2-up和DQA2-dn的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為828bp ， DQA2s-up和DQA2s-dn以DQA2-up和DQA2-dn的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 242bp，引物序列為
上游弓I物24bp: DQA2-up. CACATGTTACAGTGCAAAARCAGC;
下游引物22bp: DQA2-dn: CCCTCYCACCAACGTTTCCCAG;
上游引物23bp: DQA2s-up: ACTACCAATCTCATGGTCCCTCT;
下游弓I物24bp: DQA2s-dn: GGAGTAGAATGGTGGACACTTACC;
其中R=A,Y=C。
PCR反應(yīng)體系2(HiL的反應(yīng)體系，其成分用量及濃度為四種引物各為0.5pL/10pmd， dNTP為1.2)^L/2.5mm， TaqDNA聚合酶為0.2^iL/2.5U/pL， 10xbuffer為2.0ijL含Mg2+15pM， 模板DNA為lpL/50ng，雙純水為14.6pL。
PCR反應(yīng)條件第一次第一組引物PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94'C2 min ，變性94'C 30s ，退火64。C30s，延伸72。C50s，共32個(gè)循環(huán),最后72'C延伸5 min。
第二次第二組引物PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94'C2 min ，變性94'C30s ，退火67'C 30s，延伸72。C30s，共32個(gè)循環(huán),最后72。C延伸5min。
DQA2-up和DQA2-dn的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為828bp， DQA2s-up和DQA2s-dn以DQA2-up 和DQA2-dn的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為242bp。
得到242bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，可直接進(jìn)行SSCP檢測(cè)。
2.SSCP檢測(cè)
取步驟l中2nl的PCR產(chǎn)物加入8til的變性上樣緩沖液[包括98。/。去離子甲酰胺、0. 025% 溴酚藍(lán)、0. 025%二甲苯青、10mmol/LEDTA (pH 8. 0) ]， 98 。C變性10min ,立即冰浴10min。 12 。/。的非變性聚丙烯酰胺凝膠(Arc: Bis = 39:1)140V電壓條件下,4 。C電泳19h ，銀染法顯色后拍照。
其中，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析，在所檢測(cè)的967只藏綿羊中共發(fā)現(xiàn)16個(gè)等位 基因，分別指定為01^-0(5^*八、*B、 ......*0和叩。各等位基因的電泳條帶從1條到4
條不等，結(jié)果見(jiàn)圖l。
3. 不同等位基因的克隆測(cè)序
經(jīng)SSCP分析后,利用瓊脂糖凝膠純化試劑盒回收不同等位基因的PCR產(chǎn)物。回收后 的片段用載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株，菌落PCR鑒定后送上海 桑尼生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。
4. 藏綿羊DQA2基因第2外顯子等位基因頻率
表1藏綿羊DQA2基因第2外顯子的等位基因頻率
￥^""" 觀(guān)察值 等位基因頻率 一
基因 ~~~患病羊 健康羊 患病羊 健康羊
合計(jì) 245 722
5.結(jié)果分析
禾,PCR-SSCP方法檢測(cè)了967只表型正常和患病藏綿羊OLA-DQA2基因第2外顯子 的多態(tài)性后，發(fā)現(xiàn)了16個(gè)等位基因，其中14個(gè)等位基因(OLA-DQA2*A、 OLA-DQA2*B、 OLA-DQA2*C、 OLA-DQA2*D 、 OLA-DQA2*E 、 OLA-DQA2*F 、 OLA-DQA2*G、 OLA-DQA2*I、 OLA-DQA2*J、 OLA-DQA2*K 、 OLA-DQA2*M 、 OLA-DQA2*N 、 OLA-DQA2*0、 OLA-DQA2*P )在正常和患病群體中都存在，l個(gè)等位基因 (OLA-DQA2*L)只在正常群體中存在，另有l(wèi)個(gè)等位基因(OLA-DQA2*H)只在患病 群體中存在。
94 0.1673 0.1302
79 0.0653 O.麵
23 0.0245 0.0319
26 0.0204 0.0360
27 0.0245 0,0374 87 0.1469 0.1205 56 0.0857 0.0776 0 0.0204 0.0000 58 0.0898 0.0803 48 0.0653 0.0665 54 0.0857 0.0748 7 O遍O 0.0097 56 0.0571 0,0776 18 0.0490 0.0249 36 0.0163 0.0499 53 0.0816 0.0734
6 1 2 6 1: >
3 2 5 2 1 2 o
o
2
ABCDEFGHIJKLMN9T實(shí)施例2:所述的檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測(cè)方法，是藏綿羊易感等位基 因和抗性較強(qiáng)等位基因的確定步驟為
(1) 收集表型正常和患腐蹄病藏綿羊基因組DNA;
(2) 用上述特異性引物DQA2-up和DQA2-dn擴(kuò)增步驟(1)中的DNA特異性片 段；
(3) 用上述特異性引物DQA2s-up和DQA2s-dn擴(kuò)增步驟(2)中的的PCR產(chǎn)物；
(4) 用步驟(3)中的的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測(cè)；
(5) 克隆、測(cè)序步驟(4)中產(chǎn)生的各等位基因序列；
(6) 根據(jù)(4)的基因型判別結(jié)果，結(jié)合表型觀(guān)測(cè)資料，確定藏綿羊腐蹄病易感等 位基因和抗性等位基因；
(7)確定藏綿羊腐蹄病易感等位基因?yàn)镺LA-DQA2*H，抗性等位基因?yàn)?br> OLA-DQA2*L。
實(shí)施例3:所述的檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測(cè)方法，具體的檢測(cè)步驟如下
(1) 樣品采集:采集表型正常和患腐啼病的藏綿羊，頸靜脈采血10ml， ACD抗凝,-20
'C凍存；
(2) 基因組DNA的提取用常規(guī)的酚-氯仿抽提法從凍存血樣中提取基因組DNA;
(3) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
20pL的反應(yīng)體系，其成分用量及濃度為四種引物各為0.5pL/10pmol， dNTP為 1.2pL/2.5mm， Taq DNA聚合酶為0.2mL/2.5U/mL， 10xbuffer為2.0pL含Mg2+15jiM，模 板DNA為lnL/50ng，雙純水為14.6pL;
第一次第一組引物PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94。C2min ，變性94。C30s ，退火64。C30s， 延伸72。C50s，共32個(gè)循環(huán),最后72。C延伸5 min;
第二次第二組引物PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94'C2min ，變性94'C30s ，退火67'C30s， 延伸72。C30s，共32個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸5 min;
DQA2-up和DQA2-dn的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為828bp， DQA2s-up和DQA2s-dn以DQA2-up 和DQA2-dn的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為242bp。
(4) PCR產(chǎn)物的SSCP檢測(cè)
取2pl的PCR產(chǎn)物加入^l的上樣變性緩沖液,包括98。/。去離子甲酰胺、0. 025%溴酚藍(lán)、 0.025。/。二甲苯青、10醒ol/LEDTApH8.0 ， 98 。C變性10min ，立即冰浴10min; 12% 的非變性聚丙烯酰胺凝膠，140V電壓條件下，4'C電泳19h ，銀染法顯色后拍照；
(5) 結(jié)果判斷在藏綿羊DQA2基因第2外顯子上共發(fā)現(xiàn)16個(gè)(OLA-DQA2*A-OLA-DQA2*P) 等位基因，藏綿羊腐蹄病易感等位基因?yàn)镺LA-DQA2*H，抗性等位基因?yàn)?OLA-DQA2*L。
實(shí)施例4:試劑準(zhǔn)備
(1) 基因組DNA提取所必需的試劑蛋白酶K(20mg/ml)， PBS (8gNaCl、 0.2gKCl、 1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4用HCl調(diào)節(jié)pH值至7.4，加水定容至1L)，苯酚，氯仿，異 戊醇，DNA提取液(10mMTris.Cl(pH 8.0)， 0.1 MEDTA(pH=8.0)， 0.5%SDS，調(diào)節(jié)pH二8.0， 定容到100ml)，無(wú)水乙醇，TE (lOmMTris'Cl (pH8.0)， lmMEDTA (pH8.0))。
(2) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增所必須的試劑20pL的反應(yīng)體系，其成分用量及濃度為四種引 物各為0.5pL/10pmo1， dNTP為1.2^L/2.5腿，Taq DNA聚合酶為0.2nL/2.5U/pL， 10xbuffer 為2.(^L含Mg2+15pM,模板DNA為lnL/50ng，雙純水為14.6pL。。
(3) SSCP檢測(cè)所必須的試齊U:上樣變性緩沖液[包括98%去離子甲酰胺、0. 025% 溴酚藍(lán)、0.025%二甲苯青、10mmol/LEDTA(pH8.0)]， 10%過(guò)硫酸銨，TEMED (四甲 基乙二胺)，12。/。的非變性聚丙烯酰胺凝膠(Arc:Bis-39:l)， OLA-DQA2^的DNA標(biāo)準(zhǔn) 樣、去離子水。
實(shí)施例5:所述的檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測(cè)方法，所述的待檢物DNA的 提取有如下步驟
(1) 冷凍血液在室溫融化以后，取500^1移至1.5ml離心管中，加入等體積PBS緩 沖液，混合，充分搖動(dòng)，12000rpm離心10min，棄上清液。
(2) 再取500^il血液移至離心管中，加入等體積PBS緩沖液，混合，充分搖動(dòng)， 12000rpm離心10min，棄上清液。
(3) 加入500(^1 DNA抽提緩沖液，重懸沉淀物。
(4) 加入蛋白酶K至終濃度為100pg/ml，混勻，用封口膜封住，55'C水浴過(guò)夜。
(5) 將溶液冷卻至室溫，加入等體積苯酚，緩慢的顛倒離心管10分鐘，直至兩相 混合形成乳濁液，12000rpm離心10min。
(6) 取上清，再加入等體積苯酚氯仿異戊醇(25: 24: 1)，緩慢的顛倒離心管 10min， 12000rpm離心10min。
(7) 取上清，加入等體積氯仿異戊醇(24: 1)，緩慢的顛倒離心管10min， 12000rpm 離心10min。
(8) 取上清，加入2倍體積的無(wú)水冰乙醇沉淀DNA，緩慢的轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，可見(jiàn)白色DNA沉淀。
(9) 12000rpm離心10min;棄上清，然后加4'C預(yù)冷的70%乙醇洗兩次，12000rpm 離心10min，棄上清。
(10) 將DNA干燥(室溫放置2h)。
(11) 加5(^LTE溶解，-20°。冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例6:所述的檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測(cè)試劑盒，包括
組成成分用量及濃度為四種引物各為0.5^171 Opmol， dNTP為1.2nL/2.5mm， Taq DNA聚合酶為0.2pL/2.5U/nL， 10xbuffer為2,0pL含Mg2+15nM，雙純水為14.6^L。
SSCP檢測(cè)試劑去離子水，10%過(guò)硫酸銨，變性緩沖液，TEMED(四甲基乙二胺)， 聚丙烯酰胺(Acr: Bis = 39:1) ， 0LA-DQA2*L的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣。
實(shí)施例7:所述的檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測(cè)試劑盒的使用方法，其步驟
為
(1)試劑盒中各組分與待檢測(cè)基因組DNAlnL/50ng混合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 所述的PCR-SSCP擴(kuò)增引物的擴(kuò)增條件為
第一次第一組引物PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94。C2 min ，變性94'C30s ，退火 64。C30s，延伸72。C50s，共32個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸5 min;
第二次第二組引物PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94。C2 min ,變性94。C30s ，退火 67。C30s，延伸72。C30s，共32個(gè)循環(huán),最后72。C延伸5 min。
(2) 用步驟(1)中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和OLA-DQA2化標(biāo)準(zhǔn)樣與試劑盒中SCCP檢 測(cè)試劑各組分混合進(jìn)行SSCP檢測(cè)；
(3) 步驟(2)中檢測(cè)到的帶型與試劑盒中OLA-DQA2化的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣帶型一致
的樣品為攜帶腐蹄病抗性等位基因的個(gè)體。 實(shí)施例8:
一種檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的擴(kuò)增引物，第一組引物上游長(zhǎng)度為24bp的 核苷酸，下游長(zhǎng)度為22bp的核苷酸，第二組引物上游長(zhǎng)度為23bp的核苷酸，下游長(zhǎng)度 為24bp的核苷酸，包括用于擴(kuò)增OLA-DQA2基因第2外顯子的特異性引物，序列如下: 上游引物24bp: DQA2-up: CACATGTTACAGTGCAAAARCAGC 下游引物22bp: DQA2-dn CCCTCYCACCAACGTTTCCCAG 上游引物23bp: DQA2s陽(yáng)up: ACTACCAATCTCATGGTCCCTCT 下游引物24bp: DQA2s-dn: GGAGTAGAATGGTG GACACTTACC 其中R=G，Y=T。其余步驟與實(shí)施例l相同。
序 歹U 表 SEQUENCE LISTING
<110>甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴(kuò)增引物及其檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法
<130>
<160> 16
< 170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*A
<400> 1
actaccaatc tcatggtccc tctagcgagt acacccagga atttgacgaa gacgagctgc 60
tttatgtgga cctggagaag aaagagactg tctggcggct gcctatgttt ggccagtttg 120
caggttttca cattcaagtt gcactgagta acatagctac agagaaacac aacttggatg 180
tcatgactaa atggtacaac tttaccccag ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact 240
cc 242
<210> 2
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*B
<400> 2
actaccaatc tcatggtccc tctggccagt tcacccagga atttgacgga gatgagctgt 60
tttatgtgga cctggaaaag aaagagactg tctggcggct gcctatgttt agccagtttg 120
caggttttga ccctcaaggt gcactgagta acatagctgc agcgaaacac aacttggata 180
tcctgactaa acgctccaac tctaccccag ttatcaacgg taagtgtcca ccattctact 240
cc 242<210> 3
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*C
<400> 3
actaccaatc tcatggtccc tetggccagt acacccacga atttgatggg gacgagctgt tttatgtgga cctggggaag aaggagactg tctggcggct gcctatgttt ggtgaattca caagttttga cccgcaaggt gcactgagtg aaatagctaa agcaaaacaa accttggata tcatgattaa acgttccaac tttacccctg ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact cc
<210> 4
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*D
<400> 4
actaccaatc tcatggtccc tetggccagt acacccagga atttgatgga gacgagctgt tttatgtgga cctggggaag aaggagactg tctggaggct gcctatgttt agccagtttg caggttttga tccacagggt gcactgagtg aaatagctac agcaaaacaa aacttggata tcctgactaa acgctccaac tttacccctg ctatcaatgg taagtgtcca ccattctact cc
<210> 5
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*E
<400> 5
actaccaatc tcatggtccc tctagcgagt acacccagga atttgacgaa gaegagctge tttatgtgga cctggagaag aaagagactg tctggcggct gcctatgttt ggccagtttg caggttttca cattcaagtt gcactgagta acatagctac agcgaaacac aacttggatg tcatgactaa atggtacaac tttaccccag ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact<210> 6
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*F
<400> 6
actaccaatc tcatggtccc tctggccagt tcacccatga atttgatgga gacgagttgc tttatgtgga ccttgagaag aaggagactg tctggcggct gcctattttt ggtgaattaa caagttttga cccgcaaggt gcactgagta acatagctac agcgaaacac aacttggata tcctgactaa atgctccaat tgtaccccag ttatcaacgg taagtgtcca ccattctact cc
<210> 7
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*G
<400> 7
actaccaatc tcatggtccc tctagccagt acacccagga atttgatgga gacgaactgt tttatgtgga cctggagaag aaggagaccg tctggcggct gcctatgttt agccagtttg caggttttaa cattcaagat gcactgaata acatacctgc agcgaaacac aacttgggta tcctgactaa acgctccaac tttaccccag ttatcaacgg taagtgtcca ccattctact cc
<210> 8
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*H
<400> 8
actaccaatc tcatggtccc tctggccagt acacccacga atttgatggg gacgagctgt tttatgtgga cctggggaag aaggagactg tctggcggct gcctatgttt ggtgaattcacaagttttga cccgcaaggt gcactgagtg aaatagctac agcgaaacaa aacttggata 180
tcatgattaa acgttccaac tttacccctg ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 242
<210> 9 <211> 242 <212〉 DNA <213> OLA-DQA2*I <400> 9
actaccaatc tcatggtccc tctagcgagt acacccagga atttgacgaa gacgagctgc 60 tttatgtgga cctggagaag aaagagactg tctggcggct gcctatgttt ggccagtttg 120
caggttttca catccaagtt gcactgagta acatagctac agcgaaacac aacttggatg 180
tcaagactaa atggtacaac tttaccccag ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 242
<210> 10
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*J
<400> 10
actaccaatc tcatggtccc tctagcgagt acacccagga atttgacgaa gacgagctgc 60 tttatgtgga cctggagaag aaagaggctg tctggcggct gcctatgttt ggccagtttg 120
caggttttca cattcaagtt gcactgagta acatagctac agcgaaacac aacttggatg 180
tcatgactaa atggtacaac tttaccccag ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 242
<210〉 11
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*K
<400> 11<image>image see original document page 18</image><212〉 DNA
<213〉 OLA-DQA2*N
<400〉 14
actaccaatc tcatggtccc tctggccagt atatccactt atttgatgga gacgagcggt 60 tttatgtgga cctggagaag aaggagactg tctggcggct gcccatgtct ggtgaattaa 120
taagttttga cccacaaggt gcactgagta acgtagctgc atcgaaacac aacttggata 180
tcctgactaa acgctccaac tctaccccag ttatcaacgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 242
<210> 15
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2+0
<400> 15
actaccaatc tcatggtccc tctggccagt acacccacga atttgatggg gacgagctgt 60 tttatgtgga cctggggaag aaggggactg tctggcggct gccaatgtct ggtgaattca120 caagttttga cccgcaaggt gcactgagtg aaatagctac agcgaaacaa aacttggata180 tcatgattaa acgttccaac tttacccctg ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 242
<210> 16
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*P
<400> 16
actaccaatc tcatggtccc tctggccagt tcacccagga atttgacgga gatgagctgt 60 tttatgtgga cctggaaaag aaagagactg tctgtcggct gcctatgttt agccagtttg 120
caggttttga ccctcaaggt gcactgagta acatagctgc agcgaaacac aacttggata 180
tcctgactaa acgctccaac tctaccccag ttaccaacgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 24權(quán)利要求
1. 一種檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴(kuò)增引物，其特征是第一組引物上游長(zhǎng)度為24bp的核苷酸，下游長(zhǎng)度為22bp的核苷酸，第二組引物上游長(zhǎng)度為23bp的核苷酸，下游長(zhǎng)度為24bp的核苷酸，包括用于擴(kuò)增OLA-DQA2基因第2外顯子的特異性引物，序列如下上游引物24bpDQA2-upCACATGTTACAGTGCAAAARCAGC；下游引物22bpDQA2-dnCCCTCYCACCAACGTTTCCCAG；上游引物23bpDQA2s-upACTACCAATCTCATGGTCCCTCT；下游引物24bpDQA2s-dnGGAGTAGAATGGTGGACACTTACC；其中R＝A或G，Y＝C或T。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴(kuò)增引物，其特征是 所述的PCR-SSCP擴(kuò)增引物的擴(kuò)增條件為第一次第一組引物PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94"C2 min ，變性94'C30s ，退火 64°C30s，延伸72。C50s,共32個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸5 min;第二次第二組引物PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94'C2 min ，變性94'C30s ，退火 67°C30s，延伸72。C30s，共32個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸5 min。
3. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測(cè)試劑盒，其特征是組成成分用量及濃度為四種引物各為0.5tiL/10pmo1， dNTP為1.2pL/2.5mm， T叫 DNA聚合酶為0.2nL/2.5U^iL， 10xbuffer為2.0^L含Mg2+15pM，雙純水為14.6pL。SSCP檢測(cè)試劑去離子水，10%過(guò)硫酸銨，變性緩沖液，TEMED，聚丙烯酰胺， OLA-DQA2*L的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣。
4. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測(cè)方法，其特征是藏綿羊易感等位基因和抗性較強(qiáng)等位基因的確定步驟為(1) 收集表型正常和患腐蹄病藏綿羊基因組DNA;(2) 用上述特異性引物DQA2-up和DQA2-dn擴(kuò)增步驟(1)中的DNA特異性片 段；(3) 用上述特異性引物DQA2s-up和DQA2s-dn擴(kuò)增步驟(2)中的的PCR產(chǎn)物；(4) 用步驟(3)中的的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測(cè)；(5) 克隆、測(cè)序步驟(4)中產(chǎn)生的各等位基因序列；(6) 根據(jù)(4)的基因型判別結(jié)果，結(jié)合表型觀(guān)測(cè)資料，確定藏綿羊腐蹄病易感等位基因和抗性等位基因； (7)確定藏綿羊腐蹄病易感等位基因?yàn)镺LA-DQA2*H，抗性等位基因?yàn)镺LA-DQA2*L。
5. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測(cè)方法，其特征在于，具體的 檢測(cè)步驟如下.-(1) 樣品采集采集表型正常和患腐啼病的藏綿羊，頸靜脈采血10ml， ACD抗凝，-20 'C凍存；(2) 基因組DNA的提取用常規(guī)的酚-氯仿抽提法從凍存血樣中提取基因組DNA;(3) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)20^L的反應(yīng)體系，其成分用量及濃度為四種引物各為0.5^171 Opmol， dNTP為 1.2pL/2.5mm， TaqDNA聚合酶為0.2pL/2.5U4iL， 10xbuffer為2.0pL含Mg2+15nM，模 板DNA為lpL/50ng，雙純水為14.6pL;第一次第一組引物PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94。C2min ，變性94。C30s ，退火64。C30s， 延伸72。C50s，共32個(gè)循環(huán),最后72'C延伸5 min;第二次第二組引物PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94'C2min ，變性94。C30s ，退火67。C30s， 延伸72'C30s，共32個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸5min;DQA2-up和DQA2-dn的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為828bp， DQA2s-up和DQA2s-dn以DQA2-up 和DQA2-dn的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為242bp。(4) PCR產(chǎn)物的SSCP檢測(cè) 取2^il的PCR產(chǎn)物加入8nI的上樣變性緩沖液，包括98。/。去離子甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、0.025%二甲苯青、10mmol/LEDTApH8.0 ， 98 。C變性10min ，立即冰浴10min; 12% 的非變性聚丙烯酰胺凝膠，140V電壓條件下，4'C電泳19h ，銀染法顯色后拍照；(5) 結(jié)果判斷在藏綿羊DQA2基因第2外顯子上共發(fā)現(xiàn)16個(gè)(OLA-DQA2*A-OLA-DQA2*P) 等位基因，藏綿羊腐蹄病易感等位基因?yàn)?LA-DQA2*H，抗性等位基因?yàn)?0LA-DQA2*L。
6. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征是具體的步驟為(1)試劑盒中各組分與待檢測(cè)基因組DNAl^L/50ng混合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 所述的PCR-SSCP擴(kuò)增引物的擴(kuò)增條件為.-第一次第一組引物PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94'C2 min ，變性94'C30s ，退火64'C30s，延伸72'C50s，共32個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸5 min;第二次第二組引物PCR反應(yīng)條件預(yù)變性94。C2 min ，變性94i:30s ，退火67。C30s，延伸72。C30s，共32個(gè)循環(huán),最后72'C延伸5 min。(2) 用步驟(1)中擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和OLA-DQA2*L標(biāo)準(zhǔn)樣與試劑盒中SCCP檢測(cè)試劑各組分混合進(jìn)行SSCP檢測(cè)；(3) 步驟(2)中檢測(cè)到的帶型與試劑盒中OLA-DQA2*L的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣帶型一致的樣品為攜帶腐蹄病抗性等位基因的個(gè)體。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及動(dòng)物生物技術(shù)領(lǐng)域中的綿羊分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，具體涉及到藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的檢測(cè)。一種用于檢測(cè)藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴(kuò)增引物，其特征是第一組引物上游長(zhǎng)度為24bp的核苷酸，下游長(zhǎng)度為22bp的核苷酸，第二組引物上游長(zhǎng)度為23bp的核苷酸，下游長(zhǎng)度為24bp的核苷酸，上游引物24bpDQA2-upCACATGTTACAGTGCAAAARCAGC；下游引物22bpDQA2-dnCCCTCYCACCAACGTTTCCCAG；上游引物23bpDQA2s-upACTACCAATCTCATGGTCCCTCT；下游引物24bpDQA2s-dnGGAGTAGAATGGTGGACACTTACC。本發(fā)明對(duì)藏綿羊腐蹄病的分子標(biāo)記選種具有快速、敏感性高、成本低等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101532061SQ20091013486
公開(kāi)日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2009年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月10日
發(fā)明者秀 劉, 王繼卿, 羅玉柱, 江 胡, 馬小軍 申請(qǐng)人:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)