一種特異于禽類原始生殖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程領(lǐng)域，涉及建立一種特異于禽類原始生殖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn) 移系統(tǒng)以及基于此基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)介導(dǎo)的禽類轉(zhuǎn)基因方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)座子是一類在基因組上可以自由跳躍(復(fù)制或移位）的DNA序列，由Mc.Clintock 于1940年首先在玉米中發(fā)現(xiàn)，以后又陸續(xù)在細(xì)菌、真菌及昆蟲等各種生物中發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)， 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)已經(jīng)應(yīng)用于非病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因，尤其是轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物方面。但在轉(zhuǎn)基因禽 類制備方面，基于禽類特殊的生理生殖特點(diǎn)，即：胚胎的早期發(fā)育在母禽的生殖系統(tǒng)就已啟 動(dòng)，因而即使是剛產(chǎn)出的蛋，也已發(fā)育成具有約60000個(gè)形態(tài)上未分化的全能細(xì)胞的胚盤 (位于囊胚腔），以及禽類受精卵和早期胚胎具有碩大的卵黃、難以直接進(jìn)行基因操作等原 因，禽類轉(zhuǎn)基因技術(shù)一直落后于其它動(dòng)物。
[0003] 轉(zhuǎn)基因禽類制備具有繁殖周期短、生產(chǎn)性能高、研究成本較低等優(yōu)點(diǎn)，其輸卵管是 生產(chǎn)蛋白質(zhì)的天然"發(fā)酵罐"。近年來(lái)禽蛋生物反應(yīng)器以其自身的優(yōu)勢(shì)和不可限量的前景漸 漸成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。其中，轉(zhuǎn)基因雞制備主要集中于病毒侵染X期胚盤、體外或體內(nèi) 轉(zhuǎn)染PGCs等方法。這些方法雖然取得了一定成果，但仍然存在轉(zhuǎn)基因效率不高、基因表達(dá)抑 制和基因沉默現(xiàn)象以及生物安全性等問(wèn)題，所以轉(zhuǎn)基因禽類的制備一直以來(lái)都缺少一種有 效的、非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)技術(shù)的使用，提高了外源基因在雞基因組的 整合效率，展示了制備轉(zhuǎn)基因禽類的前景。常用的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)有鮭魚SB( Sleeping beauty)、PB(PiggyBac)、Tol2等，都是根據(jù)"切割-黏貼"的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座，可以有效地提高 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備效率，但轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)不具有生殖細(xì)胞特異性，其在體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中基 因轉(zhuǎn)移率相當(dāng)，所以轉(zhuǎn)基因后代仍存在嵌合體多、性腺基因轉(zhuǎn)移效率低下等問(wèn)題。
[0004] 原始生殖細(xì)胞(PGCs)是精子和卵子的前體細(xì)胞，在PGCs生殖質(zhì)中含有線粒體16S rRNA和Vasa、0ska、Tudor基因蛋白。Vasa是生殖發(fā)育調(diào)控重要的基因之一，在胚胎發(fā)育過(guò)程 中只在性腺組織中表達(dá)，具有組織特異性。Vasa的同源物也在包括雞在內(nèi)的很多物種中證 實(shí)：Naoki Tsunekawa等（Naoki Tsunekawa,Mitsuru Naito,Yasuhiro Sakai ,Takao Nishida and Toshiaki Noce,Isolation of chicken vasa homolog gene and tracing the origin of primordial germ cells.Development,2000,127:2741-2750)發(fā)現(xiàn)了生殖 系特異表達(dá)的雞的vasa同源基因 CVH(chicken vasa homologue)蛋白貫徹整個(gè)雞胚發(fā)育期 及成年睪丸和卵巢中，表明了CVH與雞胚生殖系的發(fā)育相關(guān)；同時(shí)Minematsu等（ΤΑΚΕ0 MINEMATSU,TAKASHI HARUMI,AND MITSURU NAITO,Germ Cell-Specific Expression of GFP Gene Induced by Chicken vasa Homologue(Cvh)Promoter in Early Chicken Embryos.MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT,2008,75:1515-1522)也通過(guò)直接將 不同長(zhǎng)度CVH啟動(dòng)子體內(nèi)、體外轉(zhuǎn)染雞胚生殖細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了該vasa同源基因 CVH的生 殖細(xì)胞特異性，且得出了 "增強(qiáng)基因表達(dá)需要CVH基因5'側(cè)翼區(qū)序列長(zhǎng)度至少為1555bp"的 結(jié)論。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強(qiáng)、基因轉(zhuǎn)移效率高的特異于禽類原始生殖細(xì) 胞(PGCs)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)及方法。本發(fā)明的發(fā)明理念是:構(gòu)建特異于禽類PGCs的基因轉(zhuǎn)移 系統(tǒng)，該基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒含有vasa啟動(dòng)子，由vasa啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)座酶，利用 vasa啟動(dòng)子能夠在PGCs中特異表達(dá)的特性，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座酶在PGCs中的特異性表達(dá)，從而使得 該基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒所攜帶的目的基因表達(dá)盒在PGCs特異性切割整合，由此 提高轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)目的基因（如：報(bào)告基因或者外源基因等）在PGCs的基因轉(zhuǎn)移特異性和效 率;此外，可以在該基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的啟動(dòng)子前增加通用增強(qiáng)子元件（即無(wú)組織特異性的增強(qiáng) 子元件，如SV40 )，進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)座酶在PGCs中高效特異表達(dá)；轉(zhuǎn)染禽類早期胚胎血液中 PGCs細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外源基因在禽類胚胎PGCs基因組中高效特異整合，從而提高轉(zhuǎn)基因禽的制 備效率，推動(dòng)轉(zhuǎn)基因禽研究進(jìn)展。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明提供了一種特異于禽類原始生殖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，包括 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，所述轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒，其中，所述轉(zhuǎn)座酶輔 助質(zhì)粒含有具有如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的vasa啟動(dòng)子。
[0008] 為了達(dá)到更高的基因轉(zhuǎn)移效率，所述轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒還含有通用增強(qiáng)子元件（即 無(wú)組織特異性的增強(qiáng)子元件）；優(yōu)選地，所述通用增強(qiáng)子元件為具有如SEQ ID No.2核苷酸 序列所示的SV40增強(qiáng)子元件。
[0009] 所述轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可以為SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，也可以是PB、Tol2和ZB等常用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。 [0010]所述轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)?？梢允荘T3-PST，包括ro、SB、Tol2轉(zhuǎn)座子兩側(cè)末端重復(fù)序列 和Mscl克隆位點(diǎn)，克隆位點(diǎn)可插入需要轉(zhuǎn)移的目的基因表達(dá)盒。
[0011] 所述目的基因盒可以是報(bào)告基因表達(dá)盒，或者其它外源基因表達(dá)盒。
[0012] 優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)為SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)時(shí)，轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒包括SB100X轉(zhuǎn)座酶cDNA 序列。
[0013] 優(yōu)選地，在轉(zhuǎn)染上述特異于禽類原始生殖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)時(shí)，使用可調(diào)節(jié)氣 體壓力的玻璃毛細(xì)管細(xì)針進(jìn)行顯微注射。該方法操作簡(jiǎn)單快捷、效率高、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。相 比之下，禽胚注射通常采用口吸管注射法或顯微操作儀，這兩者對(duì)操作者技術(shù)水平要求較 高?？谖芊@微注射劑量受人為因素影響較大，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差;顯微操作儀價(jià)格昂 貴，操作難度較大。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種特異于禽類原始生殖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移方法，其特征在于，包 括以下步驟：
[0015] (1)使用生物工程方法，構(gòu)建如上所述的含有vasa啟動(dòng)子或者含有vasa啟動(dòng)子和 通用增強(qiáng)子元件的轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒；
[0016] (2)使用生物工程方法，構(gòu)建含有需要轉(zhuǎn)移的目的基因表達(dá)盒的轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒；
[0017] ⑶提取質(zhì)粒后，將步驟⑵中所得的轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒和步驟⑴中所得的轉(zhuǎn)座酶 質(zhì)粒按1:2比例混合均勻，調(diào)整其終濃度為500ng-1.5ygAiL;
[0018] (4)將步驟(3)中所得的混合質(zhì)粒使用包埋劑包裹后，轉(zhuǎn)染禽類早期胚胎血液中 PGCs細(xì)胞，從而使得轉(zhuǎn)座酶僅在PGCs細(xì)胞特異表達(dá)，提高嵌合體禽類生殖系轉(zhuǎn)基因效率。
[0019] 優(yōu)選地，步驟(4)中所述的包埋劑為多聚乙烯亞胺(PEI)。
[0020] 本發(fā)明所達(dá)到的技術(shù)效果是：
[0021 ] 1)本發(fā)明構(gòu)建了具有PGCs特異表達(dá)特性的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括含有vasa啟 動(dòng)子的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，vasa啟動(dòng)子是生殖細(xì)胞特異啟動(dòng)子，能夠指導(dǎo)下游基因在生殖細(xì)胞特 異的表達(dá);此外，在啟動(dòng)子前增加的通用增強(qiáng)子元件，可以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座酶在PGCs中高效 特異表達(dá)；
[0022] 2)本發(fā)明所提供的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，特異于禽類PGCs，可以從基因表達(dá)特異性和強(qiáng) 度方面有效地提高轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)外源基因在PGCs的基因轉(zhuǎn)移效率，從而更有效地提高轉(zhuǎn)基因 禽類制備效率；
[0023] 3)本發(fā)明提供的基于轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移方法，操作簡(jiǎn)單快捷、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好， PGCs特異性強(qiáng)，生殖系基因轉(zhuǎn)移效率高。經(jīng)過(guò)胚胎水平驗(yàn)證，該方法能夠高效介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染 PGCs，因而可應(yīng)用于多個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域:例如，a)使用本發(fā)明中給出的方法可有效地將目的 基因盒整合到宿主PGCs基因組中，提高禽類胚胎生殖系轉(zhuǎn)基因效率，顯著提高禽類轉(zhuǎn)基因 效率;b)可以應(yīng)用于制備轉(zhuǎn)基因禽類生物反應(yīng)器，在蛋清中生產(chǎn)人源珍貴藥用蛋白。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1是PCR擴(kuò)增vasa啟動(dòng)子產(chǎn)物電泳圖。