專利名稱：常溫核酸擴(kuò)增鏈替換反應(yīng)試劑及常溫核酸擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子診斷與分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體闡述了一種利用酵母Rad51蛋白和 大腸桿菌RecA蛋白的鏈替換作用，在常溫條件下可實現(xiàn)非儀器依賴性的高靈敏度核酸擴(kuò) 增鏈替換反應(yīng)試劑及常溫核酸擴(kuò)增方法。本發(fā)明可以用于基礎(chǔ)分子生物學(xué)研究，疾病病原 的快速診斷，遺傳病以及腫瘤標(biāo)志物的篩查等任何需要用到核酸擴(kuò)增技術(shù)的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
核酸擴(kuò)增技術(shù)被廣泛應(yīng)用于疾病檢測等各個領(lǐng)域。通過這一技術(shù)，可以實現(xiàn)微量 核酸的高效擴(kuò)增，將極少量的特異核酸序列分子擴(kuò)增到儀器可以檢測到的水平。目前已有 的核酸擴(kuò)增技術(shù)主要為PCR技術(shù)，這一技術(shù)的實現(xiàn)需要在三個溫度之間進(jìn)行反應(yīng)體系的熱 循環(huán)，即變性，退火以及延伸。通過重復(fù)這一過程，使得特定序列的DNA分子實現(xiàn)指數(shù)級別 的擴(kuò)增，從原來病理組織，掩飾子樣品或者體液樣品上的少量疾病病原體的特異DNA分子 擴(kuò)增到可以用儀器檢測的水平。利用這個技術(shù)，可以對一些疾病的病原微生物進(jìn)行快速準(zhǔn) 確的分子診斷通過對各種微生物的特有片段的擴(kuò)增，可以判斷被診斷樣品組織中是否有 特定的病原微生物，是否被該微生物所感染，以及是否帶有耐藥性的質(zhì)粒等消息，從而進(jìn)行 更好更有針對性的治療。然而，上述技術(shù)目前仍然完全依賴于昂貴而且高耗電的PCR儀，紫 外凝膠成像系統(tǒng)以及受過嚴(yán)格訓(xùn)練的數(shù)量技術(shù)人員，這一缺陷限制了這一技術(shù)在實驗室之 外的廣泛應(yīng)用。 核酸擴(kuò)增技術(shù)有著極高的靈敏度，將這一技術(shù)應(yīng)用到分子診斷以及醫(yī)療領(lǐng)域可以 給我國的疾病診斷帶來革命性的變化。以艾滋病HIV病毒為例子，HIV-1病毒是危害嚴(yán)重的 血液/性傳播疾病病原體，占我國HIV感染的約60% (另外40%為HIV-2感染)。傳統(tǒng)的 臨床檢測方法是使用基于抗原抗體的ELISA和westernblot方法，或者是基于相同原理的 簡化的膠體金試紙條。但是由于抗體的產(chǎn)生需要一定的時間，不可避免的存著有窗口期的 缺點，也即是在高危性行為或者是懷疑感染的情況下，仍然需要一個足夠長的時間(22天， 也即是窗口期)之后才能用免疫學(xué)的方法檢測出來。這一缺點，一方面給懷疑患者造成巨 大的心理負(fù)擔(dān)，另一方面得我國目前的血站檢測以及輸血獻(xiàn)血，仍然不可避免的存著漏診 的可能和危險性。相比免疫學(xué)技術(shù)檢測，核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)具有更高的靈敏度，可以在病毒 感染的初期就有效檢測到病毒特異的核酸序列。常規(guī)的PCR檢測方法已經(jīng)被報道過利用于 HIV的早期感染篩查，并已有一些利用核酸擴(kuò)增的方法檢測HIV的商業(yè)試劑盒，但是這些試 劑盒都需要使用特定的專業(yè)儀器，需要在專業(yè)的實驗室內(nèi)完成檢測。另外最重要的是常規(guī) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR技術(shù))難以完全摒除假陽性的問題。這是由于PCR結(jié)束電泳需 要人工開關(guān)PCR管并使用移液器吸取樣品，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳對結(jié)果進(jìn)行判斷。由于PCR 產(chǎn)物的高濃度，使得在開管閉管以及對產(chǎn)物的處理等步驟對操作人員的要求極高，稍不小 心則極為容易使實驗室和試驗儀器受到含有高濃度目標(biāo)DNA氣凝膠的污染，從而導(dǎo)致后續(xù) 的假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。此外，使用這一技術(shù)進(jìn)行核酸擴(kuò)增放大需要使用到離心機，PCR儀， 電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)等一系列專業(yè)分子生物學(xué)儀器。這些儀器都非常昂貴，并且需要受過訓(xùn)練的專業(yè)人員來操作。不僅如此，對使用瓊脂糖凝膠對電泳結(jié)果的進(jìn)行檢測確定不僅耗 時長，工序復(fù)雜難以實現(xiàn)大樣本操作，而且需要操作人員具有非常熟練的分子生物學(xué)操作 技術(shù)，還需要操作人員長時間接觸致癌物溴化乙錠等對健康有嚴(yán)重影響的有毒有害化學(xué)物 質(zhì)。另一種后來發(fā)展的技術(shù)，熒光定量PCR技術(shù)，通過使用PCR反應(yīng)的同時測定PCR管內(nèi)熒 光值的變化來對結(jié)果進(jìn)行判讀。由于不需要開管取出PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳判斷結(jié)果，可以在 一定程度上避免PCR產(chǎn)物氣凝膠交叉污染的假陽性問題。然而熒光定量PCR技術(shù)需要使用 昂貴的熒光定量PCR儀，這限制了這個技術(shù)的廣泛使用，只有少數(shù)專業(yè)的實驗室才能進(jìn)行 相應(yīng)的檢測。 —重或者單重核酸擴(kuò)增技術(shù)可以用于特定的疾病的快速診斷。然而，一種特定的 疾病癥狀，如感冒，腹瀉等，有著相似的癥狀，卻可能由多種病源微生物單獨或者混合感染 所造成。那么準(zhǔn)確判斷是何種微生物感染，對何種抗生素敏感等信息，對于設(shè)計有效的治療 方案，引導(dǎo)醫(yī)生有針對性的用藥等有著極高的指導(dǎo)價值。然而使用傳統(tǒng)PCR方法需要進(jìn)行 多管反應(yīng)，進(jìn)行多次PCR反應(yīng)進(jìn)行篩查，才有可能找到可能的致病病原微生物。這一過程不 僅需要制備大量的樣品模板，還增加了檢測人員的工作量與出錯的機會。針對這種情況，可 以使用多重的PCR技術(shù)來避免這個問題。多重的PCR技術(shù)指的是在一個PCR反應(yīng)體系之內(nèi) 同時加入多個引物，針對多個目標(biāo)片段，在同一反應(yīng)管內(nèi)同時進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)。多重PCR的 主要用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定和病原微生物，某些遺傳病及癌基因的分型鑒 定。多種病原微生物的同時檢測或鑒定，是在同一PCR反應(yīng)管中同時加上多種病原微生物 的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增?？捎糜谕瑫r檢測多種病原體或鑒定出是那一型病原體感染。 如肝炎病毒的分型，腸道致病性細(xì)菌的檢測，性病的檢測，乳頭瘤病毒的分型，單純皰疹病 毒的分型及癌基因的檢測等。 多重PCR主要有如下的特點高效系統(tǒng)，在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時檢出多種病原 微生物或者同時進(jìn)行基因分型，從而實現(xiàn)用一滴血檢測多種病原體而進(jìn)行診斷。多重PCR 很適宜于成組病原體的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細(xì)菌，性病的同時診斷。同時經(jīng)濟(jì)簡 便，多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢出，可以節(jié)省時間，試劑，開支，為臨床提供更多更準(zhǔn) 確的診斷信息。盡管有著巨大的市場應(yīng)用潛力和前景，多重PCR尚未真正得到廣泛使用，這 主要是因為其反應(yīng)體系存在眾多引物，為了保證其中某一片段的擴(kuò)增效率，這些引物需要 以較高的濃度存在，這將不可避免的產(chǎn)生非特異性PCR產(chǎn)物，使得結(jié)果判斷困難。這個問題 是多重PCR難以突破的技術(shù)瓶頸。在2005年，Shigemori等證明將熱穩(wěn)定的TthRecA蛋白 加入到常規(guī)PCR反應(yīng)體系中，可以極為有效的防止引物的錯配與極大的提高PCR的特異性， 從而發(fā)展了新的高效特異的多重PCR(Shigemori， Y. et al. (2005)Nucleic Acids Res. ， e 126.)。 常規(guī)的單重和多重PCR技術(shù)由于熱循環(huán)的需要完全依賴于電源和昂貴的PCR儀 器，從而限制了這一技術(shù)在實驗室之外的廣泛應(yīng)用。由于上述缺點，科學(xué)界一直在試圖發(fā)展 不需要使用PCR儀器的核酸擴(kuò)增方法以及可以不需要對產(chǎn)物進(jìn)行開蓋凝膠電泳的檢測技 術(shù)。正是基于這種需要，恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展將是一個不可逆轉(zhuǎn)的趨勢。在過去的十 年當(dāng)中，一些等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)得到快速發(fā)展。如TMA技術(shù)(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的核酸擴(kuò)增技術(shù))， SDA技術(shù)(鏈置換核酸擴(kuò)增技術(shù))，LAMP (環(huán)介導(dǎo)核酸擴(kuò)增技術(shù))，HDA (解旋酶依賴等溫核酸 擴(kuò)增技術(shù))等等都可以用于DNA在等溫條件下擴(kuò)增。這些技術(shù)只需要一個反應(yīng)溫度(60-65度)就可以實現(xiàn)高效的核酸擴(kuò)增，從而使得整個反應(yīng)擺脫了對精密溫度循環(huán)控制的PCR儀的依賴。然而這一技術(shù)仍然需要溫度控制裝置來保持反應(yīng)溫度(60-65度)，這種依賴性在某種程度上仍然限制了等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種常溫核酸擴(kuò)增鏈替換反應(yīng)試劑及常溫核酸擴(kuò)增方法，主要利用
了Bsu DNA聚合酶在另外幾個重組酶蛋白存著的條件下能將新生成的核酸單鏈從新合成的
DNA雙鏈上置換下來的機理，在常溫下實現(xiàn)對特定核酸序列進(jìn)行高效指數(shù)擴(kuò)增。這使得核酸
擴(kuò)增的過程可以直接在無需儀器的室溫條件下完成反應(yīng)，不需要進(jìn)行傳統(tǒng)的熱循環(huán)。 —種常溫核酸擴(kuò)增鏈替換反應(yīng)試劑，其特征在于包括以下組分Tricine緩沖液、
氯化鉀、氯化鎂、二硫蘇糖醇、聚乙二醇(PEG)、 ATP、 dNTPs、磷酸肌酸(Phosphocreatine)、
引物組、SSB蛋白、大腸桿菌RecA蛋白、酵母Rad51蛋白、Bsu DNA聚合酶。 大腸桿菌RecA蛋白和Rad51蛋白均為來自大腸桿菌的重組表達(dá)蛋白。這兩個蛋
白的功能負(fù)責(zé)介導(dǎo)模板的解鏈以及實現(xiàn)模板和引物之間的鏈替換，這一替換過程需要ATP
來提供能量。在SSB蛋白的輔助下，Bsu DNA聚合酶可以對鏈替換后的DNA實現(xiàn)特異的延
伸。由于ATP在Phosphocreatine催化下實現(xiàn)再生，這一反應(yīng)過程中的化學(xué)平衡傾向于產(chǎn)
物的合成，并且可以不斷重復(fù)這一過程，從而最終實現(xiàn)核酸的高效擴(kuò)增。 本發(fā)明利用酵母Rad51蛋白和大腸桿菌RecA蛋白兩個蛋白實現(xiàn)常溫下的蛋白介
導(dǎo)的引物/模板間的鏈替換，替代傳統(tǒng)PCR的變性(94度)和退火(50-60度)步驟，并在
Bsu DNA聚合酶的催化下進(jìn)行核酸合成。由于大腸桿菌RecA蛋白在進(jìn)行鏈替換的時候?qū)μ?br> 換序列一致性的高特異性，使得在復(fù)雜基因組DNA的反應(yīng)體系中，只有引物和模版序列完
全一致的位置才會出現(xiàn)擴(kuò)增，避免了常規(guī)PCR反應(yīng)中常見的非特異背景(常規(guī)PCR在引物
中間有若干堿基不一致的情況下仍可出現(xiàn)非特異的擴(kuò)增)。 鏈替換反應(yīng)試劑中的Tricine為高效的緩沖劑，用于維持反應(yīng)體系的pH值，
Tricine緩沖液的pH值優(yōu)選為8 ;適當(dāng)濃度的氯化鉀和氯化鎂為反應(yīng)進(jìn)行所必需。酵母
Rad51蛋白和大腸桿菌RecA蛋白也可以是其它具有相同作用的類似重組蛋白。 為了直接判斷擴(kuò)增結(jié)果，本發(fā)明的鏈替換反應(yīng)試劑還可以包括熒光染料。所述的
熒光染料可以是SYBR green I， SYT0-13或SYT0-82中的一種。利用肉眼可見的熒光染料
直接判斷擴(kuò)增結(jié)果，不僅可避免開蓋造成的交叉污染問題，而且無需昂貴的凝膠成像系統(tǒng)，
實現(xiàn)非實驗室依賴的高效核酸擴(kuò)增以及結(jié)果解讀，使整個反應(yīng)更為簡便和快捷，適用于在
非實驗室的條件下進(jìn)行大規(guī)模疾病的篩查。如果需要進(jìn)一步的檢測可以通過凝膠電泳來判
斷是何種核酸分子得到擴(kuò)增。 本發(fā)明鏈替換反應(yīng)試劑中的聚乙二醇(PEG)的分子量為3350-50000，優(yōu)選為20000-35000。 本發(fā)明鏈替換反應(yīng)試劑中的引物個數(shù)可以隨檢測目的基因的數(shù)目增加而增加，可用于單重核酸擴(kuò)增和多重核酸擴(kuò)增。 進(jìn)一步地，本發(fā)明的常溫核酸擴(kuò)增鏈替換反應(yīng)試劑，其配比優(yōu)選如下
Tricine緩沖液 50-500mM
氯化鉀 0-200mM
氯化鎂5-30mM二硫蘇糖醇1-lOmM聚乙二醇3-16%ATPl-15mMd證s0. 2-3mM磷酸肌酸20-100mM引物組每種引物50pmolSSB蛋白500_1500ng/ii 1大腸桿菌RecA蛋白50-300ng/ ii 1酵母Rad51蛋白10_100ng/ii 1Bsu DNA聚合酶5_100ng/ii 1本發(fā)明還公開了一種常溫核酸擴(kuò)增方法，包括以下步驟提取DNA和RNA，20
45t:下反轉(zhuǎn)錄得cDNA，加入以上所述常溫核酸擴(kuò)增鏈替換反應(yīng)試劑，25 45。C下反應(yīng)10 60分鐘，完成核酸擴(kuò)增。 進(jìn)一步地，本方法中的反轉(zhuǎn)錄溫度為30 45t:，優(yōu)選為42°C。鏈替換反應(yīng)溫度為30 40。C，優(yōu)選為37°C。 本方法可在常溫(20-45度)條件下進(jìn)行，無需PCR儀進(jìn)行傳統(tǒng)的熱循環(huán)即可實現(xiàn)高效的鏈替換核酸擴(kuò)增。本方法利用鏈替換反應(yīng)試劑中酵母Rad51蛋白和大腸桿菌RecA蛋白兩個蛋白實現(xiàn)常溫下的蛋白介導(dǎo)的引物/模板間的鏈替換，替代傳統(tǒng)PCR的變性(94度)和退火(50-60度)步驟，并在Bsu DNA聚合酶的催化下進(jìn)行核酸合成。在單鏈結(jié)合蛋白SSB以及縮合劑聚乙二醇的存在下，這一反應(yīng)過程中的化學(xué)平衡傾向于產(chǎn)物的合成，并且可以不斷重復(fù)這一過程，從而最終實現(xiàn)核酸的高效擴(kuò)增。本發(fā)明常溫核酸擴(kuò)增方法的原理圖如圖l所示。 由于酵母Rad51蛋白和大腸桿菌RecA蛋白在鏈置換過程中對目標(biāo)序列的高度特
異性，使得擴(kuò)增結(jié)果的特異性大為提高，從而實現(xiàn)無本底背景的高效等溫核酸擴(kuò)增。相比PCR技術(shù)，本方法更適合于應(yīng)用到有大量樣品的，非實驗室的檢測場所。使用本方法擴(kuò)增
核酸幾乎不需要專業(yè)儀器，操作上更為簡單，對操作人員技術(shù)要求更低，反應(yīng)時間最快僅需10-60分鐘。本方法同時還可以利用熒光染料直接判斷擴(kuò)增結(jié)果，避免了傳統(tǒng)PCR開蓋造成的交叉污染問題，無需昂貴的凝膠成像系統(tǒng)。同時，應(yīng)用肉眼可見的核酸熒光染料來進(jìn)行初步結(jié)果判斷，可使整個反應(yīng)更為簡便和快捷。 本發(fā)明還涉及Rad51蛋白和大腸桿菌RecA蛋白在常溫核酸擴(kuò)增中的應(yīng)用。
大腸桿菌RecA蛋白和Rad51蛋白均為來自大腸桿菌的重組表達(dá)蛋白。這兩個蛋白的功能負(fù)責(zé)介導(dǎo)模板的解鏈以及實現(xiàn)模板和引物之間的鏈替換，這一替換過程需要ATP來提供能量。在SSB蛋白的輔助下，Bsu DNA聚合酶可以對鏈替換后的DNA實現(xiàn)特異的延伸。由于ATP在Phosphocreatine催化下實現(xiàn)再生，這一反應(yīng)過程中的化學(xué)平衡傾向于產(chǎn)物的合成，并且可以不斷重復(fù)這一過程，從而最終實現(xiàn)核酸的高效擴(kuò)增。


圖1是本發(fā)明常溫核酸擴(kuò)增方法的原理示意 圖2是使用本發(fā)明常溫核酸擴(kuò)增試劑及擴(kuò)增方法得到的可直觀判斷的結(jié)果示意圖。
具體實施方式
實施例1
單重核酸擴(kuò)增 本實施例以對血液中HIV病毒進(jìn)行血液檢測篩查為例子，具體闡述傳統(tǒng)PCR以及本發(fā)明的單重常溫核酸擴(kuò)增的實現(xiàn)過程。本發(fā)明可以但不限于HIV病毒核酸分子的檢測。其他的病毒性疾病也可以以相似的方法進(jìn)行檢測。針對不同的病原微生物，只需要對引物序列重新進(jìn)行設(shè)計即可。本實施例中引物均由申請人設(shè)計，并委托上海生工公司合成。
具體通過如下步驟來實現(xiàn)選擇HIV-1的全序列，將其分段提交至美國國家生物中心網(wǎng)站上的數(shù)據(jù)庫(http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/)進(jìn)行Blast檢索(點擊網(wǎng)頁左上角Blast按鈕，并以fasta格式提交序列，選擇nt選項)，通過BLAST程序分析尋找HIV特有的，和其他病毒沒有高同源性的DNA片段。在本發(fā)明中，發(fā)明人根據(jù)Blast結(jié)果選擇HIV聚合酶整合酶(pol-integrase)蛋白編碼序列自行進(jìn)行引物設(shè)計。本方案中提供了一套可以用于該位置特異擴(kuò)增的引物。這套引物均可以對上述病毒的特定位置進(jìn)行有效鏈替換擴(kuò)增。 1 、傳統(tǒng)PCR核酸擴(kuò)增制備HIV-1陽性模板正對照
設(shè)計并合成以下引物 5' GAAGTTATTCCAGCAGAAACAGGGC 3' SEQ ID NO :1
5' TAAAATTGTGGATGAATACTGCCAT 3' SEQ ID NO :2
使用PCR技術(shù)制備陽性模板，選擇模板序列如下 首先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備HIV-1病毒cDNA。在生物安全柜中，使用QIAampviralRNA Mini Kit(QIAGEN公司)對病人血液樣品提取高純度RNA，具體操作嚴(yán)格按照其說明書完成。使用上述試劑盒回收得到HIV感染者RNA樣品50iU，標(biāo)記為樣品1。從樣品1取出2 ii 1到一新的小PCR管，使用Superscript VILO cDNA Synthesis kit(購買自Invitrogen公司，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄在42。C金屬浴裝置內(nèi)完成。得到產(chǎn)物cDNA。 PCR體系如下
cDNA 1 u 1 d證 0. 5 ii 1
7
正向引物 2 ill 反向引物 2 illPCR反應(yīng)緩沖液(Takara公司) 5 去離子水 40 ii 1 Ex Taq酶(Takara公司) 0. 5 ii 1 將上述所有成分加好至一小PCR管，放入PCR儀，PCR儀器設(shè)置反應(yīng)條件如下 步驟一 94 °C 2分鐘 步驟 94。Cl分鐘，然后 54。Cl分鐘，然后 72 °C 1分鐘 步驟三 重復(fù)步驟二 32次。 將所得PCR產(chǎn)物電泳之后使用QIAquick gel extraction kit試劑盒(購自 Qiagen公司)進(jìn)行膠回收。步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。將得到的回收產(chǎn)物和pGEM-T easy連接(購買自promega公司，連接步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)，4"C過夜連接之 后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞One ShotT0P10(購買自Invitrogen公司，步驟 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)。根據(jù)說明書操作挑選陽性克隆，委托北京華大公司測序確 認(rèn)。測序確認(rèn)正確的菌株使用LB進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后QIApr印spin minipr印kit(購自 Qiagen公司，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)提取質(zhì)粒，制備得到HIV-1陽性對照。
2、常溫核酸擴(kuò)增
鏈替換反應(yīng)引物設(shè)計如下 正向引物5' CACAGTAATTGGAGAGCAATGGCTAGTGATTTTAAC 3' SEQ ID NO :4
反向引物5' ATGTCTGTTGCTATTATGTCTACTATTCTTTCCCCT 3' SEQ ID NO :5
在生物安全柜中，使用4M異硫氰酸胍溶液對病人血液樣品提取高純度DNA及RNA， 得到包含有DNA和RNA的總核酸樣品50 ill ，標(biāo)記為樣品2 ;及健康人血液包含有DNA和RNA 的總核酸樣品樣品50 1標(biāo)記為樣品1。從樣品1和樣品2中各取出2 1到一新的小PCR 管，使用Superscript VIL0 cDNASynthesis kit(購買自Invitrogen公司，步驟嚴(yán)格按 照試劑盒說明書進(jìn)行)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄在42t:金屬浴裝置內(nèi)完成。得到產(chǎn)物cDNA， 分別標(biāo)記為樣品3和樣品4。從樣品3和樣品4中各取出2 到一新的小PCR管，再加入 50 1常溫核酸擴(kuò)增鏈替換反應(yīng)試劑(保存于_201:冰箱)，其成分如下Tricine(pH 8. 0)lOOmM氯化鉀lOOmM氯化鎂14mM二硫蘇糖醇2. 5mMPEG 200008%ATP5mMd證sImMPhosphocreatine50mM引物A(SEQ ID NO:4)50pmol引物B(SEQ ID NO:5)50pmol
8
SSB蛋白 大腸桿菌RecA蛋白 Rad51蛋白 Bsu DNA聚合酶 SYBR green
900ng/ ii 1 120ng/ii 1 30ng/ ii 1 30ng/ ii 1 關(guān)上PCR管蓋。將管子放入37度恒溫金屬浴保溫1小時。隨后將管子取出，肉眼 觀察管內(nèi)液體顏色。如果管子內(nèi)液體變?yōu)榫G色(參見附圖2)，則說明HIV病毒核酸序列得 到有效擴(kuò)增，如果液體顏色不變，則說明樣品內(nèi)不含有HIV病毒的核糖核酸或者脫氧核糖 核酸。將陽性結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可見根一 600bp擴(kuò)增條帶。
實施例2
多重核酸擴(kuò)增 本實施例以對血液中HIV， HBV和HCV三種常見病毒進(jìn)行血液檢測篩查為例子，具 體闡述多重鏈替換核酸擴(kuò)增的實現(xiàn)過程。本發(fā)明可以但不限于這三種病毒核酸分子的檢 測。其他的病毒性疾病也可以相似的方法進(jìn)行檢測。在實施例中，即包括了 RNA病毒HIV， HCV，也包括了 DNA病毒HBV。針對不同的病原微生物，只需要對引物序列重新進(jìn)行設(shè)計即 可。本實施例中引物均由申請人設(shè)計，并委托上海生工公司合成。 具體通過如下步驟來實現(xiàn)選擇HIV-1， HBV以及HCV genotype 1-6的全序列，將 其分段提交至美國國家生物技術(shù)中心網(wǎng)站上的數(shù)據(jù)庫(http:〃麗w. ncbi. nlm. nih. gov/) 進(jìn)行Blast檢索(點擊網(wǎng)頁左上角Blast按鈕，并以fasta格式提交序列，選擇nt選項)， 通過BLAST程序分析尋找HIV， HBV以及HCV特有的，和其他病毒沒有高同源性的DNA片段。 在本發(fā)明中，發(fā)明人根據(jù)Blast結(jié)果選擇HIV聚合酶整合酶(pol-integrase)蛋白編碼序 列，HBVgp2以及HCV的polyprotein的3末端自行進(jìn)行引物設(shè)計。本方案中提供了一套可 以用于該位置特異擴(kuò)增的引物。這套引物均可以對上述病毒的特定位置進(jìn)行有效鏈替換擴(kuò) 1、傳統(tǒng)PCR核酸擴(kuò)增 1)制備HIV-1陽性模板正對照 設(shè)計并合成以下引物 5' GAAGTTATTCCAGCAGAAACAGGGC 3' SEQ ID NO :1 5' TAAAATTGTGGATGAATACTGCCAT 3' SEQ ID NO :2 使用PCR技術(shù)制備陽性模板，選擇模板序列如下 AGGCCCAAGATGAACATGAGAAATATCACAGTAATTGGAGAGCA
首先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備HIV-1病毒cDNA。在生物安全柜中，使用QIAampviral RNA Mini Kit(QIAGEN公司)對病人血液樣品提取高純度RNA，具體操作嚴(yán)格按照其說明 書完成。使用上述試劑盒回收得到HIV感染者RNA樣品50iU，標(biāo)記為樣品1。從樣品1 取出2 ii 1到一新的小PCR管，使用Superscript VILO cDNA Synthesis kit(購買自 Invitrogen公司，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄在42。C金屬浴裝 置內(nèi)完成。得到產(chǎn)物cDNA。 PCR體系如下
cDNA 1 u 1 d證 0. 5 ii 1 正向引物 2 ill 反向引物 2 ill PCR反應(yīng)緩沖液(Takara公司) 5 ii 1
去離子水 40 ill Ex Taq酶(Takara公司) 0. 5 ii 1 將上述所有成分加好至一小PCR管，放入PCR儀，PCR儀器設(shè)置反應(yīng)條件如下 步驟一 94t:2分鐘步驟二 94t:i分鐘，然后 54t:i分鐘，然后 72 °C 1分鐘 步驟三 重復(fù)步驟二32次。 將所得PCR產(chǎn)物電泳之后使用QIAquick gel extraction kit試劑盒(購自 Qiagen公司)進(jìn)行膠回收。步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。將得到的回收產(chǎn)物和pGEM-T easy連接(購買自promega公司，連接步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，4"C過夜連接之后， 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞One ShotTOPIO (購買自Invitrogen公司，步驟嚴(yán)格 按照試劑盒說明書進(jìn)行)。根據(jù)說明書操作挑選陽性克隆，委托北京華大公司測序確認(rèn)。測 序確認(rèn)正確的菌株使用LB進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后QIApr印spin minipr印kit(購自Qiagen 公司，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)提取質(zhì)粒，制備得到HIV-1陽性對照。
2)制備HBV陽性模板正對照
設(shè)計并合成以下引物5' CTCCACAACATTCCACCAAGCTCTG 3' SEQ ID NO :6
5' ACATACTTTCCAATCAATAGGTCTA 3' SEQ ID NO :7
使用PCR技術(shù)制備陽性模板，選擇模板序列如下
SEQ ID NO:8 首先制備HBV病毒DNA。在生物安全柜中，使用QIAamp DNA blood Kit(QIAGEN公 司)對病人血液樣品提取高純度DNA，具體操作嚴(yán)格按照其說明書完成。使用上述試劑盒回 收得到HBV感染者DNA樣品50 ill ，標(biāo)記為樣品1 。 PCR體系如下
0116] DNA liil
0117] d證 0. 5 ii 1
0118] 正向引物 2iU
0119] 反向引物 2iU
0120] PCR反應(yīng)緩沖液(Takara公司)5
0121] 去離子水 40 ill
0122] Ex Taq酶(Takara公司) 0. 5 ii 1
0123] 將上述所有成分加好至一小PCR管，放入PCR儀，PCR儀器設(shè)置反應(yīng)條件如下 步驟一 94 °C 2分鐘
步驟二 94t:i分鐘，然后 54 °C 1分鐘，然后 72 °C 1分鐘
步驟三 重復(fù)步驟二32次。
將所得PCR產(chǎn)物電泳之后使用QIAquick gel extraction kit試劑盒(購自 Qiagen公司)進(jìn)行膠回收。步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。將得到的回收產(chǎn)物和pGEM-T easy連接(購買自promega公司，連接步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)，4"C過夜連接之 后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞0ne ShotT0P10(購買自Invitrogen公司，步驟 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)。根據(jù)說明書操作挑選陽性克隆，委托北京華大公司測序確 認(rèn)。測序確認(rèn)正確的菌株使用LB進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后QIApr印spin minipr印kit(購自 Qiagen公司，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)提取質(zhì)粒，制備得到HBV陽性對照。
3)制備HCV陽性模板正對照
設(shè)計并合成以下引物 5' TATGGAGACAGTGCATGGGAGGCAA 3' SEQ ID NO :11
5' CACAGTACAGGCGTTGGGTGAGTGA 3' SEQ ID NO :12
使用PCR技術(shù)制備陽性模板，選擇模板序列如下
0124] 0125] 0126] 0127] 0128] 0129]
11ID NO :13 首先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備HCV病毒cDNA。在生物安全柜中，使用QIAampviral RNA Mini Kit (QIAGEN公司)對病人血液樣品提取高純度RNA，具體操作嚴(yán)格按照其說明書完 成。使用上述試劑盒回收得到HCV感染者RNA樣品50 iU，標(biāo)記為樣品1 。從樣品1取出2 ill 到一新的小PCR管，使用Superscript VIL0 cDNA Synthesis kit(購買自Invitrogen 公司，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄在42t:金屬浴裝置內(nèi)完成。 得到產(chǎn)物cDNA。 PCR體系如下
1 ii 1 0. 5ii 1 2ii 1 2ii 1
5ii 1 40 ii 1 0. 5ii 1












cDNA d證
正向引物 反向引物
PCR反應(yīng)緩沖液(Takara公司) 去離子水
Ex Taq酶(Takara公司)
將上述所有成分加好至一小PCR管，放入PCR儀，PCR儀器設(shè)置反應(yīng)條件如下
步驟一 步驟二
步驟三
94 °C 2分鐘 94 °C 1分鐘，然后 54 °C 1分鐘，然后 72°C 1. 5分鐘 重復(fù)步驟二 32次。
將所得PCR產(chǎn)物電泳之后使用QIAquick gel extraction kit試劑盒(購自
將得到的回收產(chǎn)物和pGEM-T
Qiagen公司)進(jìn)行膠回收。步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行c easy連接(購買自promega公司，連接步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)，4"C過夜連接之 后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞One ShotT0P10(購買自Invitrogen公司，步驟 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)。根據(jù)說明書操作挑選陽性克隆，委托北京華大公司測序確 認(rèn)。測序確認(rèn)正確的菌株使用LB進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后QIApr印spin minipr印kit(購自 Qiagen公司，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)提取質(zhì)粒，制備得到HCV陽性對照。
2、常溫核酸擴(kuò)增l)HIV-l鏈替換反應(yīng)引物設(shè)計如下正向引物5' CACAGTAATTGGAGAGCAATGGCTAGTGATTTTAAC 3'SEQ ID NO:4反向引物5' ATGTCTGTTGCTATTATGTCTACTATTCTTTCCCCT 3'SEQ ID NO:52)HBV鏈替換反應(yīng)引物設(shè)計如下正向引物5' TTCCACCAAGCTCTGCTAGATCCCAGAGTGAGGGG 3'SEQ ID NO :9反向引物5' ATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAGCC 3'SEQ ID NO :103)HCV鏈替換反應(yīng)引物設(shè)計如下正向引物5' AATGGAACTATCTGATTCTACCGTGTCCCAAGTCA 3'SEQ ID NO :14反向引物5' CTTAGATTTCCACGCCTTCAGTAAGAAGTCAACCC 3'SEQ ID NO :15在生物安全柜中，使用4M異硫氰酸胍溶液對病人血液樣品提取高純度DNA及RNA，得到包含有DNA和RNA的總核酸樣品50 ill ，標(biāo)記為樣品2 ;及健康人血液包含有DNA和RNA 的總核酸樣品樣品50 1標(biāo)記為樣品1。從樣品1和樣品2中各取出2 1到一新的小PCR 管，使用Superscript VILO cDNASynthesis kit(購買自Invitrogen公司，步驟嚴(yán)格按 照試劑盒說明書進(jìn)行)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄在42t:金屬浴裝置內(nèi)完成。得到產(chǎn)物cDNA， 分別標(biāo)記為樣品3和樣品4。從樣品3和樣品4中各取出2 到一新的小PCR管，再加入 50 1鏈替換反應(yīng)試劑(保存于-2(TC冰箱)，其成分如下
0162]Tricine(pH 8. 0)lOOmM
0163]氯化鉀lOOmM
0164]氯化鎂14mM
0165]二硫蘇糖醇2. 5mM
0166]PEG 200008%
0167]ATP5mM
0168]d證sImM
0169]Phosphocreatine50mM
0170]引物A (SEQ ID NO :4)50pmol
0171]引物B(SEQ ID NO :5)50pmol
0172]引物C(SEQ ID NO :9)50pmol
0173]引物D(SEQ ID NO :10)50pmol
0174]引物E(SEQ ID NO :14)50pmol
0175]引物F(SEQ ID NO :15)50pmol
0176]SSB蛋白900ng/ ii 1
0177]大腸桿菌RecA蛋白120ng/ii 1
0178]Rad51蛋白30ng/ ii 1
0179]Bsu DNA聚合酶30ng/ ii 1
0180]SYBR green0. 5mM
0181]關(guān)上PCR管蓋。將管子放入37度恒溫金屬浴保溫1小時。隨后將管子取出，肉眼觀察管內(nèi)液體顏色。如果管子內(nèi)液體變?yōu)榫G色(參見附圖2)，則說明特異的病毒核酸序列 得到有效擴(kuò)增，如果液體顏色不變，則說明樣品內(nèi)不含有上述三種病毒的核糖核酸或者脫氧核糖核酸。在本實驗中，樣品l管內(nèi)液體仍然為橙紅色(以SYBR green作為顯色劑)，說 明初始檢測樣品中不含有病毒的脫氧核糖核酸，即該樣品提供者未被上述三種病毒感染。 而樣品2中的液體變?yōu)榫G色，說明其中含有含有病毒的脫氧核糖核酸，即該樣品提供者已 被上述三種病毒中的一種或者多種感染。 為進(jìn)一步判斷是何種病毒感染，將陽性結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)電 泳結(jié)果，如果出現(xiàn)一條600bp大小的擴(kuò)增條帶，則說明該樣品被HIV-1感染。出現(xiàn)400bp條 帶，則為HBV感染。出現(xiàn)900bp條帶，則為HCV感染。若出現(xiàn)2-3個條帶，則說明是2-3個 病毒的混合感染。
實施例3 本實施例以HCV病毒為例，具體闡述本發(fā)明的常溫核酸擴(kuò)增方法中鏈替換反應(yīng)溫
度分別為25，30，4(TC實現(xiàn)高效核酸擴(kuò)增過程的例子。本實施例中引物由申請人設(shè)計，并委
托上海生工公司合成。 鏈替換反應(yīng)引物設(shè)計如下 正向引物5' AATGGAACTATCTGATTCTACCGTGTCCCAAGTCA 3' SEQ ID NO : 14
反向引物5' CTTAGATTTCCACGCCTTCAGTAAGAAGTCAACCC 3' SEQ ID NO :15
在生物安全柜中，使用4M異硫氰酸胍溶液對病人血液樣品提取高純度DNA及RNA， 得到包含有DNA和RNA的總核酸樣品50 y 1，標(biāo)記為樣品1 ;從樣品1中取出2 y 1到一新的 小PCR管，使用Superscript VILO cDNA Synthesiskit (購買自Invitrogen公司，步驟 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄在42t:金屬浴裝置內(nèi)完成。得到產(chǎn)物 cDNA，分別標(biāo)記為樣品2。從上述制備得到的樣品2中分別取出2iU到三個新的小PCR管， 再加入50iU鏈替換反應(yīng)試劑，其成分如下
0189] Tricine(pH 8. 0)
0190] 氯化鉀
0191] 氯化鎂
0192] 二硫蘇糖醇
0193] PEG 20000
0194] ATP
0195] d證s
0196] Phosphocreatine
0197] 引物E(SEQ ID NO :14)
0198] 引物F(SEQ ID NO :15)
0199] SSB蛋白
0200] 大腸桿菌RecA蛋白
0201] Rad51蛋白
0202] Bsu DNA聚合酶
0203] SYBR green
0204] 關(guān)上PCR管蓋。將上述」
lOOmM lOOmM 14mM 2. 5mM 16% 5mM ImM 50mM 50pmol 50pmol 900ng/ ii 1 120ng/ii 1 30ng/ ii 1 30ng/ ii 1 0. 5mM
個管子分別放入25， 37， 40度恒溫金屬浴保溫20分鐘進(jìn) 行反應(yīng)。反應(yīng)完畢之后觀察反應(yīng)管顏色和進(jìn)行凝膠電泳判斷反應(yīng)是否成功完成。結(jié)果顯色， 在25，30，40度恒溫金屬浴保溫20分鐘進(jìn)行反應(yīng)，均可以得到成功的結(jié)果。將上述片段進(jìn)
14行膠回收DNA測序并對序列進(jìn)行分析，結(jié)果確認(rèn)目的片段得到有效擴(kuò)增。
實施例4 本是實施例以HCV病毒為例，具體闡述本發(fā)明的常溫核酸擴(kuò)增方法在37t:下， 10-60分鐘范圍內(nèi)實現(xiàn)高效核酸擴(kuò)增過程的例子。本實施例中引物由申請人設(shè)計，并委托上 海生工公司合成。 鏈替換反應(yīng)引物設(shè)計如下 正向引物5' AATGGAACTATCTGATTCTACCGTGTCCCAAGTCA 3' SEQ ID NO : 14
反向引物5' CTTAGATTTCCACGCCTTCAGTAAGAAGTCAACCC 3' SEQ ID NO :15
在生物安全柜中，使用4M異硫氰酸胍溶液結(jié)合對病人血液樣品提取高純度DNA及 RNA，得到包含有DNA和RNA的總核酸樣品50 y 1，標(biāo)記為樣品1 ;從樣品1中取出2 y 1到一 新的小PCR管，使用Superscript VIL0 cDNASynthesis kit(購買自Invitrogen公司， 步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄在42t:金屬浴裝置內(nèi)完成。得到產(chǎn) 物cDNA，分別標(biāo)記為樣品2。從上述制備得到的樣品2中分別取出2 到6個新的小PCR 管，再加入50 鏈替換反應(yīng)試劑，其成分如下Tricine(pH 8. 0)lOOmM氯化鉀lOOmM氯化鎂14mM二硫蘇糖醇2. 5mMPEG 200008%ATP5mMd證sImMPhosphocreatine50mM引物E(SEQ ID NO :14)50pmol引物F(SEQ ID NO :15)50pmolSSB蛋白900ng/ ii 1大腸桿菌RecA蛋白120ng/ii 1Rad51蛋白30ng/ ii 1Bsu DNA聚合酶30ng/ ii 1SYBR green0. 5mM關(guān)上PCR管蓋。將上述6個管子放入37"恒溫金屬浴分別保溫10， 20， 30， 40， 50，
60分鐘進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)完畢之后觀察反應(yīng)管顏色和進(jìn)行凝膠電泳判斷反應(yīng)是否成功完成。
結(jié)果顯示，20， 30， 40， 50， 60分鐘的反應(yīng)時間均可以得到成功的結(jié)果。在反應(yīng)時間為10分鐘
時，也有產(chǎn)物生成，然而產(chǎn)物產(chǎn)量相比20分鐘有較大減少。將上述片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電
泳，膠回收DNA測序并對序列進(jìn)行分析，結(jié)果確認(rèn)目的片段得到有效擴(kuò)增。 SEQUENCE LISTING 〈110〉寧波華越生物科技有限公司 〈120〉常溫核酸擴(kuò)增鏈替換反應(yīng)試劑及常溫核酸擴(kuò)增方法
〈130〉
〈160>15
〈170>PatentIn version3. 3〈210>1〈211>25〈212>DNA〈213〉引物〈400>1gaagttattcC3gC3g^3C鄉(xiāng)gc25〈210>2〈211>25〈212>DNA〈213〉引物〈400>2t朋朋ttgtggccat25〈210>3〈211>670〈212>DNA〈213>HIV-1〈400>33ggCCC33g3tg^catgagagtgatttta60acctgccacctgtegtegcatagccagctg120g3g朋gCC3tgcatggac^gtegactgtegattgtacac180attteg朋ggctggtegcagttcatgtagcateg^gcag240aagttattccgggc鄉(xiāng)a^cagcatactt300gatggccagt3tggC3gC^tttcaccagtactacggtta360aggccgcctgttggtgggcggg^tc^gc鄉(xiāng)^tttggaattccctac420gtC￡l￡lgg￡lgtcaggteag3g■3tC3ggCtg3acatcttaagattcatccac540g￡l￡l￡l￡lggggggattggggggtecagtgcagggga^g^tategc^cag600cgggtttatt6603C3ggg3C3g670〈210〉4〈211〉36〈212〉DNA〈213〉引物〈400〉4cacagtaattggctagtgattttaac36〈210〉5〈211〉36〈212〉DNA
〈213〉引物〈400>5atgtctgttgctattatgtctactattctt〈210>6〈211>25〈212>DNA〈213〉引物〈400>6CtCC3C33C3ttccaccaagctctg〈210>7〈211>25〈212>DNA〈213〉引物〈400>7acatactttcgtcta〈210>8〈211>990〈212>DNA〈213>HBV〈400>8CtCC3C33C3ttccaccaagctctgctagatggtggctccagttccgg朋cagtaaacccaatcttctcg3gg3Ctggggaccctgcaccaggacccctgctcgtgttac鄉(xiāng)cggggttgactcgtggtggacttctcttggcc朋朋ttcgcagtcccc^cctcc^tcctggctatcgctggatgtgtctgcggcgatgcctcatcttcttgttggttcttctggaacttccaggaCC3gC3Cgggaggaacctctatgtttccctcttgttgctgtattcccatcccatcatcctgggctttcgctttctcctggctcagtttactagtgccatttgtttggctttcagctatatgg3tg3tgtggagtccctttttacctctattaccaatttta a t a a a a c c a咖gttggggctactcccttggtactttacCgC3gg^C3tattgtacaactattgattg〈210>9〈211>35
tcccct 36
25
25
tcccagagtg aggggcctat attttcctgc 60 tgttccgact actgcctcac ccatatcgtc 120 gaacatggag agcacaacat caggattcct 180 tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240 caattttcta gggggagcac ccacgtgtcc 300 tcactcacca acctcttgtc ctccaacttg 360 ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct 420 ctaccaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480 accatgcaga acctgcacga ttcctgctca 540 tacaaaacct tcggacggaa actgcacttg 600 aagattccta tgggagtggg cctcagtccg 660 tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720 gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780 cttttgtctt tgggtataca tttgaaccct 840 aacttcatgg gatatgtaat tggaagttgg 900 aaactcaagc aatgttttcg aaaattgcct 960
990
17
<212>DNA〈213〉引物〈400>9ttccaccaagctctgctagatcccagagtg鄉(xiāng)gg35〈210>10〈211>35〈212>DNA〈213〉引物〈400>10gCCgC3g3C3catccagcgatagcc35〈210>11〈211>25〈212>DNA<213>引物〈400>11tetggagacagtgcatgggaggC3325〈210>12〈211>25〈212>DNA〈213〉引物〈400〉12cac3gtecaggcgttgggtgagtga25〈210>13〈211>1358〈212>DNA〈213>HCV<400>13tetggagacagtgcatgggaggc肌ttitcacgcgagtega■ggtcgaga^60tccttgactgcttcaagccg■g^gatgacagagtigatctccgtgtccg120ccgactgcttt朋g朋ggg3ccggcgtttccccccgctctgccagtgtgggc卿gccgg180ggtatgacccgcccctcttgg卿Cttgg33gCg3CCgg3ttatgacccccctcaggtgt240ggggctgcccgataccacctgcgggccccccgcctgtcccgcttccgcggagg^^gga3003gCC33tgg3actatctgattctaccgtgtcccaagtcatggccgacttgg'Cgg3CgCC3360ggttc朋ggtCg3C3C3CC3tccattgaaggccaggattctgcgttgggtactagcagcc420aacacgattcggggCCtg3gg卿agcgtgatgacaactcggacgcggcttcatattctt■ccatgcctccgct卿gggcg咖ctggggaccctgacctttcgtcagggtcatggtcaa540ccgtcagcggtg3gg3C33Cgtggtgtgttgctccatgtcatacacctggactggggcgc600tcatcaccccttgctctgctg^gagg3肌aattacccatcaatcccttaagcaacacct660tattacgccaccacaatcttgtgtactccacctcctctcggagtgcgggtCtg3ggC3g3720
朋33ggtC3Cttttgacagg ctacaagtcc tcgacgacca ctacagagag gttgtggacg7803g3tg朋gCgattegcctcc朋ggtt朋gg cc3gactect gcccctegag g朋gcctgtg840ggttaacaccaccccactcc gcccgttcca agtacggata cggcgcgaag gaagttcgct900ctctcgacaaga朋gccctt朋gc3categ agggtgtgtg gc朋gactte ttggatgact960ctgatecccc3ttgCCg3C3 3CC3tC3tgg C朋朋朋Cg3 3gtgttCgC3 gtggagccgt1020ct朋gggggggaagaagcct gcacggctga tegtcteccc cgaccttgga gtccgcgtct1080gcg卿3gcgggctttgtec gacgtegctc aaaaactgcc gacagccctt atggggccct1140cgtetgggtttcagtectcc ccagcgcagc gggttgactt cttectgaag gcgtggaaat1200cteag朋gatccccatggct ttctcctetg acacccgctg ctttgactcg accatteccg1260朋C3tg3C3t朋tgactg朋gagtccattt 3CC朋tC3tg tgacttgcag cctgaggcgc1320gcgtggc朋tacggtcactc acccaacgcc tgtactgt1358〈210>14〈211>35〈212>DNA〈213〉引物〈400>14tctgattcta ccgtgtccca agtca35〈210>15〈211>35〈212>DNA〈213〉引物〈400>15cttagatttccacgccttca gtaagaagtc aaccc35
19
權(quán)利要求
一種常溫核酸擴(kuò)增鏈替換反應(yīng)試劑，其特征在于包括以下組分Tricine緩沖液、氯化鉀、氯化鎂、二硫蘇糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、引物組、SSB蛋白、大腸桿菌RecA蛋白、酵母Rad51蛋白、Bsu DNA聚合酶。
2. 如權(quán)利要求1所述的常溫核酸擴(kuò)增鏈替換反應(yīng)試劑，其特征在于還包括熒光染料。
3. 如權(quán)利要求2所述的常溫核酸擴(kuò)增鏈替換反應(yīng)試劑，其特征在于所述的熒光染料為SYBR green I， SYT0-13或者SYT0-82中的一種。
4. 如權(quán)利要求2所述的常溫核酸擴(kuò)增鏈替換反應(yīng)試劑，其特征在于所述的聚乙二醇的分子量為3350-50000。
5. 如權(quán)利要求2所述的常溫核酸擴(kuò)增鏈替換反應(yīng)試劑，其特征在于所述的引物組至少包括兩種引物。
6.如權(quán)利要求1所述的常溫核酸擴(kuò)增鏈替換反應(yīng)試劑，其特征在于其配比如下Tricine緩沖液50-500mM氯化鉀0-200mM氯化鎂5-30mM二硫蘇糖醇l-10mM聚乙二醇3-16%ATPl-15mMd證s0. 2-3mM磷酸肌酸20-100mM引物組每種引物50pmolSSB蛋白500_1500ng/ii 1大腸桿菌RecA蛋白50-300ng/ ii 1酵母Rad51蛋白10_100ng/ii 1Bsu DNA聚合酶5_100ng/ii 1
7. —種常溫核酸擴(kuò)增方法，其特征在于包括以下步驟提取DNA和RNA， 20 45。C下反轉(zhuǎn)錄得cDNA，加入權(quán)利要求1-6中任一項所述常溫核酸擴(kuò)增鏈替換反應(yīng)試劑，25 45°CT反應(yīng)10 60分鐘，完成核酸擴(kuò)增。
8. 如權(quán)利要求7所述的常溫核酸擴(kuò)增方法，其特征在于反轉(zhuǎn)錄溫度為30 45°C。
9. 如權(quán)利要求8所述的常溫核酸擴(kuò)增方法，其特征在于反轉(zhuǎn)錄溫度為42t:。
10. 如權(quán)利要求7所述的常溫核酸擴(kuò)增方法，其特征在于鏈替換反應(yīng)溫度為25 40°C。
11. 如權(quán)利要求10所述的常溫核酸擴(kuò)增方法，其特征在于鏈替換反應(yīng)溫度為37°C。
12. 酵母Rad51蛋白和大腸桿菌RecA蛋白在常溫核酸擴(kuò)增中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體公開了一種常溫核酸擴(kuò)增鏈替換反應(yīng)試劑，包括以下組分Tricine緩沖液、氯化鉀、氯化鎂、二硫蘇糖醇、聚乙二醇(PEG)、ATP、dNTPs、磷酸肌酸(Phosphocreatine)、引物組、SSB蛋白、大腸桿菌RecA蛋白、酵母Rad51蛋白、Bsu DNA聚合酶。本發(fā)明還公開了常溫核酸擴(kuò)增方法，利用酵母Rad51蛋白和大腸桿菌RecA蛋白的鏈替換作用，在常溫條件下實現(xiàn)非儀器依賴性的、單重或者多重序列一管式同時進(jìn)行擴(kuò)增的高靈敏度核酸擴(kuò)增。本方法可在常溫條件下實現(xiàn)高效的鏈替換核酸擴(kuò)增，用時少，操作簡單，無需PCR儀進(jìn)行傳統(tǒng)的的熱循環(huán)。本技術(shù)也適合于應(yīng)用到有大量樣品的非實驗室的檢測場所。
文檔編號C12Q1/68GK101712973SQ200910153518
公開日2010年5月26日 申請日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者丁凌文, 嚴(yán)慶豐, 方國偉, 程奇, 程海榮, 黃震巨 申請人:寧波華越生物科技有限公司