專利名稱：：預(yù)測(cè)糖尿病腎病危險(xiǎn)的遺傳標(biāo)記和芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及4吏用一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記來(lái)檢測(cè)中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成或者疑似患有腎病的一種方法和芯片，特別是使用選自基因ACE,AGT，ALR2和TNF-a的一個(gè)或多個(gè)遺傳多態(tài)性標(biāo)記檢測(cè)中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的一種方法和芯片，條件是不單獨(dú)使用ALR2的基因型。
背景技術(shù)：
：糖尿病腎病是糖尿病患者的主要致病、致死原因。隨著糖尿病在發(fā)達(dá)國(guó)家與發(fā)展中國(guó)家的流行，糖尿病目前已成為晚期腎病(ESRD)的最主要的病因，占所有4吏用腎臟替換治療的新患者的40-50%(RitzE，RychlikI,LocatelliF,HalimiS，End-stagerenalfailureintype2diabetes:amedicalcatastropheofworldwidedimensions,」wJiT油eyi^,1999;34:795-808》中國(guó)是擁有最多糖尿病患者的三個(gè)國(guó)家之一，估計(jì)到2025年，糖尿病患者將增加到4000萬(wàn)人且該增長(zhǎng)主要發(fā)生在中年人群中(ChanJ.C.N,NgM.C.Y，CritchleyJ.A.J.H，LeeS.C，CockramC.S，Diabetesmellitus-aspecialmedicalchallengefromaChineseperspective,D/a6e^siese<arc/zC7/m'ca/iVac"ce,2001;54:S19-27)，年輕型糖尿病與幼年肥胖癥以及新陳代謝綜合癥發(fā)病率的增高是導(dǎo)致這種狀況的出現(xiàn)主要原因(ChanJ.C.N，NgM.C.Y,LessonslearnedfromyoungonsetdiabetesinChina,Cwrewf他Z)ete/epoM，2003;3:101-107;ChanJ.C.N，CheungC.K，CheungM.Y.F，SwaminathanR，CritchleyJ.A.J,H，CockramC.S,AbnormalalbuminuriaasapredictorofmortalityandrenalimpairmentinChinesepatientswithNID畫(huà)，C，1995;18:1013-1014;ChanJ.C.N,KoG.T.C，LeungD,CheungR.C.K,CheungM，SoW.Y等，ThelongtermeffectsofangiotensinconvertingenzymeinhibitionandmetaboliccontroloncardiovascularandrenaloutcomesinhypertensiveType2diabeticpatients,超，她陋"o"fl/,2000;57:590-600)。在世界衛(wèi)生組織多國(guó)糖尿病心血管病(WHO-MSVDD)的研究中發(fā)現(xiàn)，亞洲，特別是中國(guó)、日本患者比白人II型糖尿病患者有更高的ESRD發(fā)病率(MorrishN.J,WangS，StevensL.K,FullerJ.H,KeenH,MortalityandcausesofdeathintheWHOMultinationalSurveyofVascularDiseasesinDiabetes,Z)/a6efo/og7'(2，2001;44:S14國(guó)21)。與白人糖尿患者群中大多數(shù)患者死于心血管疾病形成對(duì)照的是，中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者致死的主要原因是晚期腎病(ESRD)(ChanJ.C.N，CheungC.K,CheungMYF，SwaminathanR，CritchleyJ.A.J.H，CockramC.S，AbnormalalbuminuriaasapredictorofmortalityandrenalimpairmentinChinesepatientswithNIDDM，飾6由C歸，1995;18:1013-1014)。這些發(fā)現(xiàn)最近已被WHO-MSVDD證實(shí)(MorrishN.J,WangS,StevensL.K,FullerJ.H,KeenH，MortalityandcausesofdeathintheWHOMultinationalSurveyofVascularDiseasesinDiabetes,Z)/a6加/og/a，2001;44:S14-21)。與這些發(fā)現(xiàn)一致，現(xiàn)已經(jīng)證實(shí)疾病相關(guān)基因的等位基因頻率和單元型具有種族間差別，這可能導(dǎo)致了疾病形成敏感性方面出現(xiàn)種族差異(NgM,WangY，SoW,ChengS，VisvikisS，ZeeR等，Ethnicdifferencesinthelinkagedisequilibriumanddistributionofsinglenucleotidepolymorphismsin35candidategenesforcardiovasculardiseases,Gewow/cs,2003:inpress;YoungRP，ThomasG.N,CritchleyJ.A.J.H，TomlisnonB，WooK.S,SandersonJ.E,Interethnicdifferencesincoronaryheartdiseaesmortalityin25populations:associationswiththeangiotensinconvertingenzymeDDgenotypefrequency,/owma/o/CaWomycw/ar7M，1998;5:303-7)?？紤]到疾病的持續(xù)時(shí)間對(duì)并發(fā)疾病的影響、年青與中年糖尿患者人群發(fā)病率的升高和發(fā)生糖尿病腎病的種族偏好，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，腎功能衰竭與心血管疾病將在我們?cè)絹?lái)越多的年青人群中流行(ChanJ.C.N，NgM.C.Y，CritchleyJ.A.J.H,LeeS.C，CockramC.S,Diabetesmellitus-aspecialmedicalchallengefromaChineseperspective,D/a6efesie5^arc/zC7/w/ca/尸nafcf/ce，2001;54:S19-27)。以前我們凈艮道過(guò)腎病有30%到50%的高發(fā)病率和中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者腎功能死亡與退化的尿標(biāo)記的預(yù)測(cè)值(ChanJ.C.N,CheungJ.C.K，LauE.M.C,WooJ,SwaminathanR,CockramC.S，TheMetabolicSyndromeinHongKongChinese-theinter-relationshipsamongstitscomponentsanalysedbystructuralequationmodeling，Dfa6eto;,1996;19:953-9》我們已報(bào)道了在排除高血壓與高血脂的情況下中國(guó)血統(tǒng)患者胰島素抗性與糖尿病腎病之間的獨(dú)立關(guān)系(ChanJ.C.N，TomlinsonB，NichollsM.G,SwaminathanR,CheungC.K，CockramCS,Albuminuria,insulinresistanceanddyslipidaemiainChinesepatientswithnon-insulin-dependentdiabetes(NIDDM),D&6WcM^/zW"e,1996;13:150-55)以及其分別與肥胖癥、白蛋白尿癥、血糖代謝異常之間的密切關(guān)系(LeeZ,CritchleyJ,KoG.T,AndersonP，ThomasN，YoungR，etal，ObesityandcardiovascularriskfactorsinHongKongChinese,O&wXyievz'ews，2002;3:178-182)。以家族為基礎(chǔ)的研究與隔離分析(TheDiabetesControlandComplicationsTrialResearchGroup,Clusteringoflongtermcomplicationsinfamilieswithdiabetesinthediabetescontrolandcomplicationtrial,D/a6efes，1997;46:1829-1839)和基因組掃描已經(jīng)證實(shí)了遺傳因素在糖尿病腎病形成過(guò)程中起到了4艮強(qiáng)的作用(ImperatoreG，HansonRL，PettittD,KobesS,BennettP,KnowlerW,SibpairlinkageanalysisforsusceptibilitygenesformicrovascularcomplicationsamongPimaIndianswithtype2diabetes.PimaDiabetesGeneGroup,D/a6eto，1998;47:821-30;ImperatoreG,KnowlerW，PettittD,KobesS，BennettP，HansonR,SegregationanalysisofdiabeticnephropathyinPimaIndians,飾6由，2000;49:1049-56)。血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在調(diào)節(jié)系統(tǒng)與腎臟血流動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞組織生長(zhǎng)方面起關(guān)鍵作用(CooperM,Pathogenesis，preventionandtreatmentofdiabeticnephropathy,La"ce"1998;352:213-9)。AGTM235T多態(tài)性TT基因型、ACEI/D多態(tài)性D等位基因與白種人血統(tǒng)、日本人血統(tǒng)和中國(guó)人血統(tǒng)糖尿病患者患腎病有關(guān)系(FujisawaT，IkegamiH,KawaguchhiY，HamadaY，UedaH,ShintaniM,etal,Metaanalysisofassociationofinsertion/deletionpolymorphismofangiotensinIconvertingenzymegene7withdiabeticnephropathyandretinopathy,D/a6"o/og/a,1998;41:47-53;YoungR.P，ChanJ.C.N,PoonE，CritchleyJ.A.J.H，CockramC.S,AssociationsbetweenalbuminuriaandangiotensinogenT235andangiotensinconvertingenzymeinsertion/deletionpolymorphimsinChineseNIDDMpatients,他6"asC，1997;21:431-7;RingelJ，BeigeJ，K籠R,DistlerA,SharmaA,Geneticvariantsofthereninangiotensinsystem,diabeticnephropathyandhypertension,Dz'aZ^o/ogzVa,1997;40:193-9》由脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，即腫瘤壞死因子a(TNF-a)是肥胖癥與胰島素4元'f生的關(guān)耳關(guān)因子(HotamisligilGS,SpiegelmanBM，Tumornecrosisfactor:akeycomponentoftheobesity-diabeteslink,DWeto,1994;43:1271-8)，而胰島素抗性是包括中國(guó)糖尿病患者在內(nèi)的腎病患者的一個(gè)重要特征(ChanJ.C.N,TomlinsonB,NichollsM.G，SwaminathanR，CheungC.K，CockramC.S，Albuminuria,insulinresistanceanddyslipidaemiainChinesepatientswithnon-insulin-dependentdiabetes(NIDDM),D!'"6e"cMe(^c/"e，1996;13:150-55)。最近日本的研究表明血清TNF-a水平的升高與II型糖尿病患者的腎病有確定的關(guān)系(MoriwakiY,YamamotoT，ShibutaniY,AokiE,TsutsumiZ，TakahashiS，etal,Elevatedlevelsofinterleukin18andtumornecrosisfactoralphainserumofpatientswithtype2diabetesmellitus:relationshipwithdiabeticnephropathy,Meto6o/z'>S7W..C7/m'ca/Expen>ewto/，2003;52:605-8)。關(guān)于這一點(diǎn)，已有報(bào)道TNF-a基因啟動(dòng)子區(qū)域的G-308A多態(tài)性與肥胖癥、胰島素抗性(DalzielB，GoskbyA,RichmanR,BrysonJ,CatersonI,AssociationofTNFalpha-308G/Apromoterpolymorphismwithinsulinresistanceinobesity,C^ew々及esem"c/2,2002;10:401畫(huà)7)及TNF-a基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)有關(guān)(KroegerK,CarvilleK,AbrahamL，The-308tumornecrosisfactoralphapromoterpolymorphismeffectstranscription,Mo/eci//"r7/wmwo/gF,1997;34:391-99)。醛糖還原酶(ALR2)是多醇路徑最關(guān)鍵的酶，多醇路徑可以導(dǎo)致氧化壓力增加和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變，從而引起糖尿病微血管病(HodgkinsonA,SondergaardK，YangB，CrossD,MillwardB，DemaineA,Aldosereductaseexpressionisinducedbyhyperglycemiaindiabeticnephropathy，/w^77a"0脂/,2001;60:211-8)。已經(jīng)表明ALR2基因5'-(CA)的z-2等位基因、C-106T多態(tài)性T等位基因使包括中國(guó)血統(tǒng)患者在內(nèi)的I,II型糖尿病患者患腎病的危險(xiǎn)性增加(WangY，NgM,LeeS,SoW，TongC,CockramC，etal,PhenotypicheterogeneityassociationsoftwoaldosereductasegenepolymorphismswithnephropathyandretinopathyinType2diabetes,Z)勵(lì)etoCare,2003;26:2410-5)。上述公開(kāi)的遺傳因子進(jìn)一步地與代謝的、血液動(dòng)力學(xué)的和生長(zhǎng)因子作用，致使腎功能蛋白尿和逐漸衰竭(ParvingH.H,TarnowL,RossingP，Geneticsofdiabeticnephropathy，Jowwa/o/^4膨n'cawSoc/外o/辟W，，1996;7:2509-17)。盡管已經(jīng)有關(guān)于這5個(gè)遺傳標(biāo)記與白種人和日本人糖尿病并發(fā)癥的關(guān)系的報(bào)道，但對(duì)于中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者群還沒(méi)有相一致的報(bào)道。到目前為止，還沒(méi)有報(bào)道表明這些遺傳因子對(duì)糖尿病并發(fā)癥，包括糖尿病腎病的形成產(chǎn)生交互作用效應(yīng)。應(yīng)用基因組學(xué)的前景在于它的潛在用途，它可以用來(lái)鑒別危險(xiǎn)性患者以期較早地和有目地干預(yù)，從而確保身體健康和減少諸如糖尿病之類至丈死'l"生疾病的#》響(CollinsF，GreenE,GuttmacherA,GuyerMobotuNHGRI，Avisionforthefutureofgenomicsresearch.Ablueprintforthegenomicem,iVa^re,2003;422:835-47)。在鑒定中國(guó)糖尿病患者并發(fā)癥高?；颊叩倪z傳因子的研究中，我們第一個(gè)報(bào)道AGTTT基因型與糖尿病有關(guān)以及其與ACED等位基因一起對(duì)糖尿病的形成產(chǎn)生協(xié)同作用(YoungRP，ChanJ.C.N,PoonE,CritchleyJ.A.J.H,CockramC.S,AssociationsbetweenalbuminuriaandangiotensinogenT235andangiotensinconvertingenzymeinsertion/deletionpolymorphimsinChineseNIDDMpatients,C，1997;21:431-7)。同樣，我們第一個(gè)報(bào)道了ALR2TT基因型與中國(guó)血統(tǒng)患者患糖尿病患腎病的危險(xiǎn)性有關(guān)(WangY，NgM，LeeS,SoW，TongC，CockramC，etal,PhenotypicheterogeneityassociationsoftwoaldosereductasegenepolymorphismswithnephropathyandretinopathyinType2diabetes,D/"6etoCare,2003;26:2410-5)。發(fā)明概要因此，本發(fā)明涉及到一種檢測(cè)中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的方法，該方法包括如下步驟檢測(cè)來(lái)自糖尿病患者的樣品中是否含有下列多態(tài)性序列中的至少一種ACE基因的1/D基因型，AGT基因的M235T基因型，ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型，ALR2基因啟動(dòng)子區(qū)的C106T基因型，TNF-a基因的G-308A基因型，以及其互補(bǔ)序列，條件是不單獨(dú)使用ALR2的基因型，其中多態(tài)性序列的存在表明該糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，上述方法還包括從患者中取樣的步驟。該患者優(yōu)選患有II型糖尿病，取得的樣品優(yōu)選為血液。本發(fā)明還涉及到用來(lái)檢測(cè)中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的芯片，該芯片包括下列多態(tài)性序列中的至少一種ACE基因的1/D基因型，AGT基因的M235T基因型，ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型，ALR2基因啟動(dòng)子區(qū)的C106T基因型，TNF-a基因的G-308A基因型，以及其互補(bǔ)序列，條件是不單獨(dú)使用ALR2的基因型。在本發(fā)明中，I/D多態(tài)性優(yōu)選含有DD基因型，G-308A多態(tài)性優(yōu)選含有GG基因型。本發(fā)明還涉及到用于檢測(cè)中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的試劑盒。試劑盒一般包括本發(fā)明所定義的芯片和指導(dǎo)用此芯片處理樣品的指導(dǎo)性材料。優(yōu)選地，該試劑盒含有從患者中采取樣品的裝置。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1顯示了711例具有不同數(shù)目危險(xiǎn)基因型的中國(guó)血統(tǒng)II型糖尿病患者患腎病的幾率，這些基因型包括AGT基因的TT基因型，ACE基因的DD/DI基因型，TNF-a基因的GG基因型，AGT基因的TT基因型，ALR2基因的x/z-2o或z-2/z-2基因型，ALR2基因的CT/TT基因型。圖2顯示了947例中國(guó)血統(tǒng)II型糖尿患者中ACE基因1/D基因型攜帶者發(fā)生腎病終點(diǎn)事件的Kaplan-Meier曲線圖。圖3顯示了患者初級(jí)復(fù)合終點(diǎn)事件(PanelA)或晚期腎病終點(diǎn)事件(PanelB)和全致死(PanelC)的Kaplan-Meier曲線圖。依托多學(xué)科團(tuán)隊(duì)，按照注重對(duì)目標(biāo)實(shí)施定期監(jiān)控、治療和增強(qiáng)患者依從性的方案(干擾組)與基于通常的臨床護(hù)理的方案(對(duì)照組)處理上述患者，其中干擾組的患者一直在醫(yī)生的指導(dǎo)下治療，而對(duì)照組的患者依從性不穩(wěn)定。發(fā)明的詳細(xì)描述遺傳學(xué)、流行病學(xué)與試驗(yàn)研究支持了這樣一種主張?zhí)悄虿∧I病涉及到多種生物化學(xué)途徑(CooperM，Pathogenesis,preventionandtreatmentofdiabeticnephropathy,Z薩"，1998;352:213-9)?；趪?guó)際和地區(qū)的、臨床與實(shí)驗(yàn)的證據(jù)，我們認(rèn)為AGT基因M235T的TT基因型，ACE基因I/D的DD/ID基因型，TNF-ot基因G-308A的GG基因型，ALR2基因x/z-2或z-2/z-2(z=z-2之外的任何等位基因)和CT/TT基因型都是中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者患腎病的潛在危險(xiǎn)基因型。定義除非在發(fā)明中特別指出，術(shù)語(yǔ)"AGT基因M235T"或"AGTM235T"是指"AGT基因的M235T基因型"；術(shù)語(yǔ)"ACE基因1/D"或者"ACEI/D多態(tài)性"與"ACE基因的I/D基因"含意相同；術(shù)語(yǔ)"TNF-ot基因GG"等同于"TNF-a基因G-308A的GG基因型"；術(shù)語(yǔ)"TNF-a基因G-308A"或"TNF-oc基因啟動(dòng)子區(qū)域的G-308A多態(tài)性"或"TNF-aG-308A"或"TNFaG308A多態(tài)性"是指"TNF-a基因的G-308A遺傳型"；術(shù)語(yǔ)"醛醣還原酶5，-(CA)n的z-2等位基因"或者"ALR2(CA)n-5，(z-2)"等同于"ALR2基因5'-(CA)重復(fù)序列的(z-2)基因型"；術(shù)語(yǔ)"醛醣還原酶(ALR2)的C-106T多態(tài)性的T等位基因"等同于"ALR2TT基因型，ALR2基因TT"或者"ALR2基因CT/TT基因型"；術(shù)語(yǔ)"一個(gè)ALR2的C-106T多態(tài)性"是指"啟動(dòng)子區(qū)域的ALR2基因的一個(gè)C-106基因型"。本發(fā)明用來(lái)檢測(cè)中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的方法包括如下步驟檢測(cè)來(lái)自糖尿病患者的樣品中是否含有下列多態(tài)性序列中的至少一種ACE基因的1/D基因型，AGT基ii基因的(CA)n-5，(z-2)基因型，ALR2基因啟動(dòng)子區(qū)的C106T基因型，TNF-a基因的G-308A基因型，以及其互補(bǔ)序列，條件是不單獨(dú)使用ALR2的基因型，其中多態(tài)性序列的存在表明該糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病。在上述方法中用作遺傳標(biāo)記的多態(tài)性可以通過(guò)以下步驟予以鑒別(a)從患者中提取基因組DNA(b)以基因組DNA為模板用PCR方法擴(kuò)增基因組DNA中的ACE基因，AGT，TNF-aG-308A多態(tài)性基因，醛醣還原酶(ALR2)CA重復(fù)序列，ALR2基因的C106T啟動(dòng)子；和(c)應(yīng)用凝膠分離或測(cè)序鑒別(b)步驟中的產(chǎn)物。在本發(fā)明中，基因組DNA可以從患者的體液中抽提，如血液和尿液，優(yōu)選為血液。盡管本發(fā)明的4全測(cè)方法可以應(yīng)用于任何一糖尿病患者，但是該方法優(yōu)選用于II型糖尿病患者。中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者特別適合于本發(fā)明。本研究的四個(gè)候選基因均可通過(guò)可能的代謝途徑51起糖尿病腎病的形成。AGT與ACE是導(dǎo)致高血壓和組織異常生長(zhǎng)的RAS的重要組成元件(CooperM,Pathogenesis,preventionandtreatmentofdiabeticnephropathy,丄a"cef，1998;352:213-9;RingelJ，BeigeJ,KunzR，DistlerA,SharmaA,Geneticvariantsofthereninangiotensinsystem,diabeticnephropathyandhypertension,D/a6"o/og7'a，1997;40:193-9)。細(xì)胞因子TNF-ot使肥胖癥與胰島素抗性間產(chǎn)生關(guān)聯(lián)(HotamisligilGS，SpiegelmanBM，Tumornecrosisfactor:akeycomponentoftheobesity-diabeteslink,D/a^^s,1994;43:1271-8),有才艮道表明其血清水平確定地與沖唐尿病腎病相關(guān)(MoriwakiY，YamamotoT，ShibutaniY，AokiE,TsutsumiZ,TakahashiS，etal,Elevatedlevelsofinterleukin18andtumornecrosisfactoralphainserumofpatientswithtype2diabetesmellitus:relationshipwithdiabeticnephropathy,Meto6o/z'sm..C7/m,ca/朋d￡x/7en'wewto/,2003;52:605-8)。通過(guò)山梨醇酯的細(xì)月包間積累和高血糖條件下的氧化壓力增加，ALR2引起微血管疾病的發(fā)生(ChungS，HoE，LamK,ChungS，Contributionofpolyolpathwaytodiabetes-inducedoxidativestress,Jbwwa/o/^wen'caw5"oc/e/y0/iVie//2ro/ogy，2003;14:S233-6).在中國(guó)血統(tǒng)人群中這些基因型的發(fā)現(xiàn)是基于一系列橫向的、預(yù)期的和病例對(duì)照研究，結(jié)果與糖尿病腎病患者的表型特征一致，其中的糖尿病腎病患者比未患糖尿病腎病的患者更肥胖、血壓更高，具有更多不良的脂和血糖調(diào)控。大規(guī)模隨機(jī)臨床研究已經(jīng)證實(shí)抑制RASD,加強(qiáng)血糖和血壓調(diào)控對(duì)治療糖尿病蛋白尿病和ESRD形成具有有益效果(BrennerB.M,CooperM.E,DeZeeuwD,KeaneW.F,MitchW.E，ParvingH.H等,EffectsofLosartanonrenalandcardiovascularoutcomesinpatientswithtype2diabetesandnephropathy,iVew￡>2g7aw<i0/MW"'we,2001;345:861-9;UKPDS，Intensivebloodglucosecontrolwithsulphonylureasorinsulincomparedwithconventionaltreatmentandriskofcomplicationsinpatientswithtype2diabetes(UKPDS33),丄禱W，1998;352:837-53;AdlerA.I，StrattonI.M,NeilH.A,YudkinJ.S,MatthewsD.R，CullC.A等,Associationofsystolicbloodpressurewithmacrovascularandmicrovascularcomplicationsoftype2diabetes(UKPDS36):prospectiveobservationalstudy,5r他/zMed/ca/Jowr"a/，2000;321:412-9)。最近的研究表明，組合使用ACE、ALR2抑制劑治療能產(chǎn)生協(xié)同作用從而改善糖尿病大鼠的神經(jīng)功能(CotterM,MirrleesD，CameronN,Neurovascularinteractionsbetweenaldosereductaseandangiotensinconvertingenzymeinhibitionindiabeticrats,Jtww"/0/7Va，"co/ogy，2001;417:223-30)?？傊瑢?duì)這些遺傳因子及其交互作用的鑒定(和提高對(duì)同一患者危險(xiǎn)基因型的同時(shí)篩選效率的相關(guān)微芯片技術(shù))可篩選出高危個(gè)體以對(duì)其進(jìn)行強(qiáng)化與有目的治療從而減少并發(fā)癥危險(xiǎn)。關(guān)于這一點(diǎn)，依賴多學(xué)科團(tuán)隊(duì)，我們已經(jīng)證實(shí)注重對(duì)目標(biāo)實(shí)施定期監(jiān)控、治療和增強(qiáng)患者的依從性的多重方法可以使中國(guó)血統(tǒng)糖尿患者死亡和患晚期腎病(ESRD)的危險(xiǎn)減少40-70%。(圖3)。由于攜帶這些基因型的患者的危險(xiǎn)性不斷地增加，該疾病調(diào)控方案及其花費(fèi)有效性的優(yōu)點(diǎn)應(yīng)該還會(huì)得到進(jìn)一步的提南。在對(duì)年齡與性別進(jìn)行調(diào)整后，我們發(fā)現(xiàn)患腎病的危險(xiǎn)性隨著危險(xiǎn)基因型數(shù)目的增加而漸進(jìn)式地顯著增加。攜帶有3種或者更多危險(xiǎn)基因型的患者占總患者的66%，與攜帶有O種或者l種危險(xiǎn)基因型的那些患者相比，這些患者患糖尿病腎病的危險(xiǎn)性增加了1.8-2.0倍。我們提供了原始數(shù)據(jù)證實(shí)了DD基因型對(duì)ESRD形成、TNF-a對(duì)糖尿病腎病，特別是對(duì)肥胖性糖尿患者的糖尿病腎病的前兆性作用。更重要的是這些數(shù)據(jù)證實(shí)了這5種基因型間的交互作用對(duì)糖尿病腎病形成具有前兆性作用。能夠理解以上所提到的一種或者多種基因型可以用于制備芯片，該芯片可以與其它已知的臨床的、生物化學(xué)的與遺傳學(xué)的芯片一起用來(lái)預(yù)測(cè)中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者中糖尿病并發(fā)癥，包括腎病發(fā)生的危險(xiǎn)性。這些基因型或其等效芯片可以用于檢測(cè)患者患糖尿病和/或糖尿病腎病的危險(xiǎn)性，從而使用包括強(qiáng)度監(jiān)測(cè)、藥理學(xué)與非藥理學(xué)療法在內(nèi)的多重方法來(lái)改變危險(xiǎn)性。為了實(shí)施本發(fā)明，使用本發(fā)明定義的芯片作為試劑盒來(lái)檢測(cè)中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展或疑似患有腎病是方便的。該試劑盒包括上述芯片和擴(kuò)增基因ACE、AGT、ALR2或TNF-a的一對(duì)引物。在本發(fā)明試劑盒的一個(gè)實(shí)施方案中，該引物選自從SEQIDNO:l到SEQIDNO:10。此發(fā)明還提供了含有一種芯片的試劑盒，該芯片含有下列多態(tài)性序列中的至少一種和根據(jù)該序列設(shè)計(jì)的作為對(duì)照的任意探針ACE基因的1/D基因型，AGT基因的M235T基因型，ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型，ALR2基因啟動(dòng)子區(qū)的C106T基因型，TNF-a基因的G-308A基因型，以及其互補(bǔ)序列。本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例作進(jìn)行進(jìn)一步的描述。實(shí)施例1五個(gè)多態(tài)性序列基因型的鑒定人類基因組的制備從每個(gè)患者中收集大約10mlEDTA血樣，用SDS和蛋白酶K過(guò)夜裂解細(xì)胞后，用苯和氯仿抽提得到基因組DNA。然后將DNA顆粒溶解到IXTE緩沖液中。通過(guò)檢測(cè)260nm和280nm處的光密度測(cè)定抽提的DNA數(shù)量和質(zhì)量。將抽提的DNA在4。C下貯藏以備下次基因型分析。ACE基因的PCR條件反應(yīng)依據(jù)改進(jìn)的Rigat的方法進(jìn)4亍(RigatB，HubertC，Alhenc-GelasF,CambienF,CorvolP,SoubrierF,AninsertiondeletionpolymorphisminangiotensinIconvertingenzymegeneaccountingforhalfthevarianceofserumenzymelevels,c/owrwa/C7/m'c"http://"ve幼'g加'o",1990;86:1343-1346)。使用GeneAmpPCRSystem9700(ABI)在標(biāo)準(zhǔn)PCR緩沖液(50mMKCl，lOmMTris國(guó)HCl，pH8.3,3mMMgCl2,dNTP各0.2mM)(ABI)中擴(kuò)增150ngDNA模板，引物濃度為各5pmo1,Taq聚合酶為0.6U(Amersham)，總體積為20(il。循環(huán)條件如下開(kāi)始在94°C下變性2min，94°Clmin，58。Clmin，72。C2min，共30個(gè)循環(huán)，最后在72。C下延伸5min。引物的序列如下5'CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT3'SEQIDNO.15，GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT3'SEQIDNO.2PCR產(chǎn)物是190bp和490bp的片斷，前者不含有插入等位(insertionallele)基因，后者含有插入等位基因。血管緊張素基因的PCR條件反應(yīng)依照Russ的方法進(jìn)4亍(RussA,MaerzW，RuzickaV，SteinU，GrossW,RapiddetectionofthehypertensionassociatedMet235—Thralleleofthehumanangiotensinogengene,T/畫(huà)awMo/ecw/wGWe"cs,1994;2:609-10)。使用GeneAmpPCRSystem9700(ABI)在標(biāo)準(zhǔn)PCR緩沖液(50mMKCl，10mMTris-HCl,pH8.3,，1.5mMMgCl2,dNTP各50uM)(ABI)中擴(kuò)增200ngDNA才莫板，引物濃度為各0.3uM,Taq聚合酶為0.75U(Amersham)。引物的序歹'J如下5,-CAGGGTGCTGTCCACACTGGACCCC-3'SEQIDNO.35，-CCGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTCT-3,SEQIDNO.4循環(huán)條件如下卯。C變性3min;94°C1min68。Clmin.,72。Clmin.,IO個(gè)循環(huán)；之后為90°C30sec，68。Clmin.，72。C30sec.,30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min。PCR產(chǎn)物用5UTth111I(P匪ega)酶在65。C消化過(guò)夜。消化片段在3%的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳進(jìn)行分離。純的蛋氨酸等位基因表現(xiàn)為未消化的165bp單帶帶型，蘇氨酸呈現(xiàn)為141bp與24bp帶型。TNF-aG-308A多態(tài)性的PCR條件依據(jù)Wilson等描述的方法進(jìn)行反應(yīng)(WilsonA,diGiovineF,BlakemoreA,DuffG，SinglebasepolymorphisminthehumantumornecrosisfactoralphagenedetectablebyNcolrestrictionofPCRproduct,//wwwMo/ecw/arG^"e""，1992;1:535)。使用GeneAmpPCRSystem9700(ABI)進(jìn)行反應(yīng)，終體積為20|il,包含100ngDNA模板，50mMKCl，10mMTris-HCl，pH8.3，2.5mMMgCl2，0.2mM每種dNTP(Boehringer-Mannheim，Germany)。引物濃度為各0.5mM，Taq聚合酶為0.05U(Boehringer-Mannheim，Germany)。引物的序歹'J如下5，-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT國(guó)3'SEQIDNO.55，-TCCTCCCTGCTGCTCCGATTCCG-3'SEQIDNO.6循環(huán)條件如下開(kāi)始在95。C變性3min，95。Clmin,58。C1min,72°Clmin，共35個(gè)循環(huán)。最后在72°C延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10UNcol酶(Promega)在37°C消化過(guò)夜。消化片段在3%的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳進(jìn)行分離。A等位基因表現(xiàn)為未消化的165bp帶型，G等位基因呈現(xiàn)為87bp與20bp帶型。醛醣還原酶(ALR2)CA重復(fù)序列PCR條件含有二核芬酸CA重復(fù)序列的區(qū)域通過(guò)用Ko等所描述的PCR方法(KoB.C.B,LamK.S.L,WatN.M.S，ChungS.S.M，An(A畫(huà)C)ndinucleotiderepeatpolymorphicmarkeratthe5'endofthealdosereductasegeneisassociatedwithearlyonsetdiabeticretinopathyinNIDDMpatients,Z)/a6w^，1995;44:727-32)進(jìn)行擴(kuò)增，所使用的引物側(cè)翼與138bp的區(qū)域連接。反應(yīng)所用的有義鏈的序列是5,-GAATCTTAACATGCTCTGAACC國(guó)3'SEQIDNO.7反義鏈序列是Arpr25，-GCCCAGCCCTATACCTAGT-3'.SEQIDNO.8將1個(gè)M13尾(5，-CACGACGTTGTAAAACGAC-3，)加到有意義鏈引物5'末端用來(lái)標(biāo)記紅外熒光PCR在按照提供的配方制備的緩沖液中進(jìn)行，總體積為4pl，包含lngDNA模板，2.5mMMgCl2,dNTP各0.2mM,引物各0.1pmol/|al,0.15pmol4UIRD800標(biāo)記的M13正向(-29)引物，0.15UTaq聚合酶(Amplitaq,Perkin-Elmer/Cetus,Norwalk,CT)。循環(huán)條件為初始94°C變性3min，94°Clmin.，57。Clmin，72。Clmin，共35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸lOmin。擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物在95。C加熱5min，然后上樣到5.5°/。的聚丙烯酰胺凝膠上，在0.8XTBE電泳液中用Li-CORDNAAnalyser(Li-COR，Lincoln,NE)電泳分離，功率恒定為75W，溫度為55°C。通過(guò)與攜帶有ALR2基因的23(CA)重復(fù)序列比較的得到等位基因的大小，其中的ALR2基因的23(CA)重復(fù)序列由ShigaUniversityofMedicalScienceofJapan的Dr.ShiroMaeda贈(zèng)送。ALR2基因C106T啟動(dòng)子的PCR條件反應(yīng)依據(jù)KaoYL等描述的方法進(jìn)行(KaoY，DonaghueK，ChanA，KnightJ，SilinkM,Anovelpolymorphisminthealdosereductasegenepromoterregionisstronglyassociatedwithdiabeticretinopathyinadolescentswithtype1diabetes,1999;48:1338-40)。使用GeneAmpPCRSystem9700(ABI)進(jìn)行反應(yīng)，最終體積為20fil，包含100ngDNA模板，50mMKCl，1OmMTris-HCl,pH8.3,2mMMgCl2,dNTP各0.2mM)(Boehringer-Mannheim,Germany)。引物濃度為各0,5pmol/|il，Taq聚合酶為0.5U(Boehringer-Mannheim，Germany)。引物的序歹'J如下5，-CCTTTCTGCCACGCGGGGCGCGGG-3'SEQIDNO.95'-CATGGCTGCTGCGCTCCCCAG-3'SEQIDNO.10循環(huán)條4牛如下初始94°C變性3min.,94°Clmin.,57°Clmin.,72°Clmin，共35個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用5UBfaI(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)酶在37。C消化過(guò)夜。消化片段在3.5%的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳進(jìn)行分離。C等位基因表現(xiàn)為206bp與57bp的片斷，206bp片段進(jìn)一步切割成147bp與59bp片段而得到T等位基因。實(shí)施例2腎病與基因間交互作用的關(guān)系我們才企測(cè)了711例(303男，408女，年齡63.1±11.1歲)中國(guó)血統(tǒng)II型糖尿病患者的AGT基因M235T，ACE(I/D),TNF-a基因G-308A，ALR2基因5，-(CA)n和啟動(dòng)子C-106T多態(tài)性的交互作用情況。選擇有超過(guò)十年糖尿病病史，血漿肌氨酸酐小于lOOjimol/1以及即時(shí)尿清蛋白肌氨酸酐比率(spoturinealbumicreatinineratio)(ACR)小于3.5mg/mmol的患者作為對(duì)照(11=388)。血漿月幾氨酸酐大于150|iimol/l或者ACR不小于25mg/mmol的患者認(rèn)為患有腎病(11=323)。將包括甘油三酸酯、ACR在內(nèi)的不規(guī)則凝據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，用社會(huì)學(xué)統(tǒng)計(jì)包(Version10.0，SPSSInc,Chicago)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。如果合適，連續(xù)變量用平均值士SD或者幾何學(xué)平均值(x/+反對(duì)數(shù))SD表示。應(yīng)用IndependenceSampleT-測(cè)試與共變異數(shù)分析進(jìn)4亍群體間的比較分析。用卡方測(cè)定來(lái)分析等位基因與基因型頻率以及不同類型糖尿病患者相關(guān)的代謝異常與并發(fā)癥的百分率。計(jì)算置信區(qū)間(CI)為95%的具有不同數(shù)目危險(xiǎn)基因型的患者可能患糖尿病腎病的幾率(OR),P值小于0.05(2-尾)可認(rèn)為幾率很大?；加心I病的患者與未患腎病的患者相比，年紀(jì)大的男性居多。校正年齡和性別后，患有腎病的患者比未患腎病的患者更肥胖和有更高的體重指數(shù)(BMI)、腰-臀比(WHR)和更高的血壓。他們還具有更不良的脂肪分布，更高的血清總膽固醇(TC)、甘油三酸酯(TG),更低的HDL-C和更容易患感官神經(jīng)疾病、視網(wǎng)膜病，周邊血管病變、心血管疾病。表1顯示了711例中國(guó)血統(tǒng)II型糖尿病患者中患腎病者與未患腎病的臨床與生物化學(xué)參數(shù)比較。數(shù)據(jù)表示為平均值士SD或者幾何平均值(x—反對(duì)數(shù))SD，患腎病的患者和未患腎病的患者的數(shù)據(jù)用IndependentSampleT-測(cè)試值進(jìn)行比4交，兩研究組的糖尿病并發(fā)癥的百分率用卡方測(cè)定值比較。表1研究組校正后未患腎病(N=323)患腎病(N=388)P值的p值*性別(％男性)30.053.1<0.001-年齡(年)60.6±10.165.1±11.6<0.001-糖尿病發(fā)病時(shí)間(年)16.0±1.68.2±5.4<0.001-體重指數(shù)(kg/m2)23.9±3.225.5±4.0<0.001<0.001腰高比0.87±0.060.91±0.07<0.001<0.001收縮壓(mmHg)131±18153±23<0.001<0.001舒張壓(mmHg)72±1083±12<0.001<0.001糖化血紅蛋白(％)7.6±1.38.1±2.1<0.001<0.001禁食血漿葡萄糖(mmo1/1)8.3±2.89.5±4.4<0.001<0.001總膽固醇(mmo1/1)5.2±1.05.9±1.5<0.001<0.001甘油三酸酉旨(mmol/l)a1.W+1.71.9x/+1.9<0.001<0.001高密度脂蛋白-C(mmo1/1)1.4±0.41.2±0.3<0.001<0.001低密度脂蛋白-C(mmo1/1)3.20±0.843.73±1.21<0.001<0.001血漿肌氨酸酐(pmo1/1)72.4±14.3152.6±105.4<0.001<0.001清蛋白肌氨酸酐比率(mg/mmol)al.lx/+2.0128.8x/+2.9<0.001<0.001肥胖(％)34.547.9<0.001<0.001高血壓(％)46.781.2<0.001<0.001血脂異常(％)52.083.0<0.001<0.001視網(wǎng)膜病(％)25.154.6<0.001<0.001神經(jīng)病(％)18.643.8<0.001<0.001周邊血管病變(％)2.813.4<0.001<0.001缺血性心臟病(％)5.912.40.0030.019腦血管疾病(％)3.78.50.0090.098RAS抑止劑的應(yīng)用(0/0)26.979.9<0.001-*校正年齡與性別后，應(yīng)用共變異數(shù)分析得到的p值表2總結(jié)了這5種類型基因型在患有或未患有腎病的患者中的分布情況。通過(guò)卡方測(cè)定對(duì)患有或未患有腎病的患者的基因型或者等位基因頻率進(jìn)行比較，患腎病的患者比未患腎病的患者具有更高頻率的ALR2基因5'-(CA)n的z-2(24.1%vs.18.6%,P-0.01)和ALR2基因C-106T的T等位基因(25.8%vs.21.4%，P=0.05)。ALR25，-(CA)nz-2等位基因攜帶者比非z-2等位基因攜帶者具有更高的ACR水平(17.8xZ+12.3vs.12.6x/+12.9mg/mmol,P-0.062)和視網(wǎng)膜病百分率(47.4%vs.37.4%，P=0.009)。ACEI/D的DD/DI基因型攜帶者比II基因型攜帶者具有更高水平的TC水平(5.7土1.4vs5.5士1.3mmo1/1,P=0.047)。在對(duì)年齡與性別進(jìn)行校正后，TNF-a基因G-308A的肥胖性GG基因型攜帶者比非肥胖性患者具有更高水平的ACR(22.9x/+11.5vs10.7x/+13.2mg/mmol，PO.OOl)和血漿月幾氨酸酐水平(125士95vs.108±75|amol/l，P=0.005)表2基因多態(tài)性基因型頻率(％)基因多態(tài)性等位基因頻率(％)的基因型未患腎病患腎病的等位基因未患腎病患腎病(N=323)(N=388)(N=646)(N=776)AGT基因AGT基因M235TM235TTT70.972.9T84.485.7TM26.925.5MM2.21.5M15.614.3ACE基因I/DACE基因I/DII45.846.4I66.667.3DI41.541.8DD12.711.9D33.432.7TNF-a基因TNF-oc基G-308AG-308AGG80.884.0G89.991.8GA18.315.5AA0.90.5A10.18.2ALR2基因ALR2基因5，-(CA)n5，-(CA)nx/x67.257.7X81.475.9x/z-228.536.3z-2/z-24.35.9*z-218.624.1+ALR2基因ALR2基因5，-(CA)n5，-(CA)ny/y89.993.3y94.496.6y/z+69.36.7z+6/z+60.9o承承z+65.63.4++ALR2基因ALR2基因C-106TC-106TCC63.556.7C78.674.2CT30.335.1TT6.28.2*"T21.425.8+++p除了z-2等位基因以外的任何(CA)n等位基因；y-除了z+6等位基因以外的任何(CA)n等位基因；*P=0.01,**P=0.09，***P=0.07,當(dāng)分別比較腎病患者與非腎病患者ALR2基因x/z-2o或z-2/z-2,y/z+6or或z+6/z+6與CT/TT的組合基因型頻率時(shí)；+P=0.01,++P=0.04,+++P=0.05,,當(dāng)當(dāng)分別比較腎病患者與非腎病患者ALR2基因z-2,z+6與T等位基因頻率時(shí)。表3總結(jié)了患者群中基因型數(shù)目的分布。在7u個(gè)中國(guó)血統(tǒng)n型糖尿病患者中，64(9.0%)有0或1個(gè)危險(xiǎn)基因型，176(24.8%)有2個(gè)危險(xiǎn)基因型，290(40.8%)有3個(gè)危險(xiǎn)基因型，181(25.5%)有4或5個(gè)危險(xiǎn)基因型。與不多于1個(gè)危險(xiǎn)基因型的患者相比，有2、3和大于4個(gè)危險(xiǎn)基因型腎病的幾率分別/人1.4(95%CI0.8-2.4,P=0.3)增加到1.8(95%CI1.1-1.3，P-0.03)和2.0(95%CI1.1-3.6，P=0.02)(圖2)。表3危險(xiǎn)基因型的數(shù)目未患腎病患腎病總?cè)篘(%)0危險(xiǎn)基因型628(1.1)1危險(xiǎn)基因型312556(7.9)2危險(xiǎn)基因型8888176(24.8)3危險(xiǎn)基因型1251652卯(40,8)4危險(xiǎn)基因型5887145(20.4)5危險(xiǎn)基因型152136(5.1)總計(jì)323388711實(shí)施例3TNF-aGG基因型與腎病的關(guān)系表4顯示了在中國(guó)血統(tǒng)II型糖尿病患者中TNF-a基因的G-308A多態(tài)性與肥胖間的交互作用對(duì)腎病形成的影響，其中"Ref，代表參考組，該組是非肥胖GA/AA攜帶者。擁有GG基因型的肥胖患者患腎病的危險(xiǎn)性升高了1.9倍(95。/oCI:1.1-3.2，P=0.012)。表4頻率數(shù).(％)糖尿病腎病的危險(xiǎn)性組未患腎病患腎病OR95%CIP值GG-/非肥胖40(12.4)38(9.8)1(Ref.)GGV肥胖22(6.8)24(6.2)1.20.55-2.380.710GG十/非肥胖172(53.1)164(42.3)1.00.62-1.650.970GG十/肥胖89(27.6)162(41.8)1.91.15-3.200.012表5顯示了在校正干擾因素如年齡、性別、微血管血糖、高血壓、高血脂、視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病與周邊血管病變后用來(lái)沖全測(cè)TNF-a基因G-308A與肥胖間的交互作用對(duì)腎病的影響的多元邏輯斯蒂回歸分析。在表5中，校正的總百分率為75.2%,依變量腎病的code=l;自變量包括年齡、性別(男性的code-l)、HbAlc、FPG和存在的高血糖、高血壓及視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病與周邊血管病變、缺血性心臟病與腦血管疾病(code=l)。肥胖與TNF-a基因G-308A多態(tài)性間的交互作用為GG-/肥胖-(code=0)，GG畫(huà)/月巴胖十(code=l),GG十/月巴胖畫(huà)(code=2),。0+/月巴胖+(code=3)。_患糖尿病腎病的危險(xiǎn)性獨(dú)立預(yù)測(cè)因子幾率95%CIP值年齡(年)1.021.002-1.040.033雄性2.61.78-3.71<0細(xì)禁食血漿葡萄糖(mmo1/1)1.11.03-1.160.002高血脂2.81.86-4.18<0細(xì)高血壓3.22.19-4.81<0細(xì)視網(wǎng)膜病2.41.62-3.51<0.001神經(jīng)病2.11.36-3.220細(xì)周邊血管病變2.81.21-6.590.017GG-/肥胖十vsGG國(guó)/肥胖-1.40.57-3.260.482GG十Z肥胖-vsGG-Z肥胖-1.20.64-2.150.614實(shí)施例4ACEII/DD基因型與糖尿病腎病的關(guān)系在病史平均為4.0土1.4年的947名中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者的擴(kuò)增組中，我們檢測(cè)了ACE11/DD基因型對(duì)定義為腎臟死亡的ESRD或腎臟事件(需要透析或血漿肌氨酸酐〉50(^mo1/1或血漿肌氨酸酐基準(zhǔn)值的兩倍>150nmol/l)形成的影響。在947名患者中，62名患者發(fā)生了腎臟終點(diǎn)事件。表6顯示了在947名中國(guó)糖尿病患者中的ACEI/D多態(tài)性基因型和等位基因的頻率，這些患者有或沒(méi)有發(fā)生腎臟終點(diǎn)事件，此終點(diǎn)事件定義為血漿肌氨酸酐基準(zhǔn)值的兩倍或者在4.0年的平均期限后仍需要腎透析。我們應(yīng)用卡方對(duì)發(fā)生和未發(fā)生腎病終點(diǎn)事件的基因型和等位基因頻率進(jìn)行了比較。從表6可以看出，前一組患者比沒(méi)有發(fā)生腎病終點(diǎn)事件的患者具有更高的DD基因型(19.40/。vs.9.8%,P-0.031)和D等位基因頻率(41.2%vs.30.2%,P-O.Oll)。Kaplan-Meier分析表明了在攜帶II(460中23個(gè)患者發(fā)生腎臟終點(diǎn)事件)，DI(388中27個(gè)患者演化出腎臟終點(diǎn)事件)，DD(99中12個(gè)患者發(fā)生腎臟終點(diǎn)事件)基因型的患者中累積性腎臟存活率(cumulativerenalsurvivalrate)有明顯的不同。(log-rankP=0.019)(圖2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>卞P=0.031,JPvalue=0.011當(dāng)分別在發(fā)生和沒(méi)有發(fā)生腎病終點(diǎn)事件的患者間進(jìn)行基因型和等位基因頻率比較時(shí)。表7顯示了用來(lái)檢測(cè)947名中國(guó)血統(tǒng)II型糖尿病患者中的腎臟終點(diǎn)事件的前兆因子的多元Cox-回歸分析，在其中，"a"代表在初始時(shí)出現(xiàn)微量或巨量蛋白尿的患者；"b"代表與II基因型攜帶者相應(yīng)的DI基因型攜帶者，"c"代表與II基因型攜帶者相應(yīng)的DD基因型攜帶者。依變量包括:腎臟死亡或腎臟事件(code^);自變量包括年齡，性別(對(duì)男性，code=l)，糖尿病發(fā)病時(shí)間，SBP,DBP，TC，TG、HDL-C、LDL-C的對(duì)數(shù)值，并發(fā)癥的出現(xiàn)(code-l)，如在基線處出現(xiàn)的腎病、視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病與周邊血管病變，以及ACE基因1/D多態(tài)性(對(duì)于DI，code=lvs.II,對(duì)于DD，code=2vs.11)。在多元Cox-回歸分析中，腎病終點(diǎn)事件的出現(xiàn)一直顯著地受到I/D多態(tài)性的影響，該I/D基因型含有一個(gè)具有明顯有害效果的DD基因型(DDvs.II，校正的危險(xiǎn)比率為3.4，95%CI1.6-7.3,P=0.002)。其它獨(dú)立的前兆因子包括長(zhǎng)期患糖尿病、高收縮血壓、甘油三酸酯、在初始時(shí)發(fā)生腎病和視網(wǎng)膜病。表7獨(dú)立變量(基線值)|3相關(guān)系危險(xiǎn)比率*95%CIP值數(shù)糖尿病發(fā)病時(shí)間(年)0.0501.051.01-1.090.013血收縮壓(mmHg)0.0141.011.00-1.030.012甘油三酸酯對(duì)數(shù)值(mmo1/1)2.0637.872.24-27.70.001糖尿病腎病的出現(xiàn)a3.57935.84.84-265.2<0.001視網(wǎng)膜病的出現(xiàn)0.8502.341.27-4.30O馬ACE基因I/DbDI基因型攜帶0.5951.810.99-3.310.053者基因I/DeDD基因型攜帶者基1.2233.401.59-7.270.002因I/Dc實(shí)施例5ALR2的基因型與糖尿病腎病的關(guān)系在有738個(gè)中國(guó)血統(tǒng)II型糖尿病患者的另一組中[年齡55.5士13歲，確診病史為5.7±5.7年，平均值土SD],僅有21.5。/?；寄I病(DN)，僅有8%患有視網(wǎng)膜病(DR)，53.1。/o未患并發(fā)癥(UC)。CT/TT基因型攜帶者(N-267)25的尿AER比CC基因型攜帶者高。(N=471)(30.2x/+7.2vs.21.9x/+6.9(ig/min，P=0.03)。在校正干擾變量，如年齡、糖尿病持續(xù)時(shí)間、血壓和血紅蛋白Alc后，該差異還是很明顯(P:0.04)。因?yàn)榧膊〉某掷m(xù)期是糖尿病微血管并發(fā)癥的主要決定因素(RogusJ.J,WarramJ.H，KrolewskiA.S，Geneticstudiesoflatediabeticcomplications.Theoverlookedimportanceofdiabetesdurationbeforecomplicationonset,Z)/"Z^es，2002;51:1655-1662)，因此患糖尿病時(shí)間不足5年的患者(n-300)在接下來(lái)的分析中被排除，將剩余的患者(11=438)分成四個(gè)亞組159名患者(36.3%)僅具有DN,66名患者(15.1%)僅具有DR,121名患者(27.6%)具有DN和DR,92名患者(21%)沒(méi)有并發(fā)癥。單變量分析表明相對(duì)于UC組，DN和DR組的z-2等位基因(25.7%vs.16.9%，OR1.7，95%CI1.0-2.8，P=0.03)、T等位基因(26.4%vs.18.5%，OR1.6，95%CI1.0-2.7，P=0.04)的頻率較高。采用年齡、性別、疾病發(fā)病時(shí)間、BP、代謝指數(shù)和三個(gè)ALR2的基因型(攜帶的z+6,攜帶的z-2和攜帶的CT/TT)作為自變量，UC組作為對(duì)照(code-0)，攜帶的z-2(OR2.64,95%CI1.02-5.83)和CT/TT基因型(OR2.48，95%CI1.19-5.19)以及年齡(OR1.06，95%CI1.02-1.10),BP(OR1.04，95%CI1.02-1.06)，HbAlc(OR1.23,95%CI雄性(OR2.25,95%CI1.10-4.61)都是預(yù)測(cè)DN、DR的獨(dú)立的危險(xiǎn)因子，該預(yù)測(cè)正確率達(dá)76.9%。權(quán)利要求1.檢測(cè)中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的芯片，該芯片包括多態(tài)性序列AGT基因的M235T基因型，ALR2基因的(CA)n-5’(z-2)基因型和ALR2基因啟動(dòng)子區(qū)的C106T基因型，或其互補(bǔ)序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芯片，其還包括至少一種選自ACE基因的1/D基因型，TNF-a基因的G-308A基因型，以及其互補(bǔ)序列的多態(tài)性序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的芯片，其中所述的1/D基因型含有DD基因型。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的芯片，其中所述的G-308A基因型含有GG基因型。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的芯片，其中所述的患者是已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有II型糖尿病的患者。6.檢測(cè)中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的芯片，該芯片包括多態(tài)性序列TNF-a基因的G-308A基因型，ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型和ALR2基因啟動(dòng)子區(qū)的C106T基因型，或其互補(bǔ)序列。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的芯片，其還包括至少一種選自ACE基因的1/D基因型，AGT基因的M235T基因型，以及其互補(bǔ)序列的多態(tài)性序列。8.檢測(cè)中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的芯片，該芯片包括多態(tài)性序列ACE基因的I/D基因型，AGT基因的M235T基因型和TNF-a基因的G-308A基因型，或其互補(bǔ)序列。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的芯片，其還包括至少一種選自ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型，ALR2基因啟動(dòng)子區(qū)的C106T基因型，以及其互補(bǔ)序列的多態(tài)性序列。10.檢測(cè)中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的試劑盒，包括擴(kuò)增基因AGT的M235T基因型、ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型和ALR2基因啟動(dòng)子區(qū)的C106T基因型的引物；以及指導(dǎo)如何檢測(cè)確定糖尿病患者正已患有、或有可能危險(xiǎn)發(fā)展成或疑似患有腎病的指導(dǎo)性材料。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其還包括擴(kuò)增基因ACE的I/D基因型或TNF-a基因的G-308A基因型的引物。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑盒，其中擴(kuò)增所用的引物為擴(kuò)增ACE基因的I/D基因型使用的SEQIDNO.1與SEQIDNO.2;擴(kuò)增AGT基因的M235T基因型使用的SEQIDNO.3與SEQIDNO.4;擴(kuò)增TNF-a基因的G-308A基因型使用的SEQIDNO.5與SEQIDNO.6;擴(kuò)增ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型使用的SEQIDNO.7與SEQIDNO.8;或擴(kuò)增ALR2基因啟動(dòng)子區(qū)的C106T基因型使用的SEQIDNO.9與SEQIDNO.10。13.檢測(cè)中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的試劑盒，包括擴(kuò)增基因TNF-a基因的G-308A基因型、ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型和ALR2基因啟動(dòng)子區(qū)的C106T基因型的引物；以及指導(dǎo)如何檢測(cè)確定糖尿病患者正已患有、或有可能危險(xiǎn)發(fā)展成或疑似患有腎病的指導(dǎo)性材料。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其還包括擴(kuò)增基因ACE的I/D基因型或AGT的M235T基因型的引物。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中擴(kuò)增所用的引物為擴(kuò)增ACE基因的I/D基因型l吏用的SEQIDNO.1與SEQIDNO.2;擴(kuò)增AGT基因的M235T基因型使用的SEQIDNO.3與SEQIDNO.4;擴(kuò)增TNF-a基因的G-308A基因型使用的SEQIDNO.5與SEQIDNO.6;擴(kuò)增ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型使用的SEQIDNO.7與SEQIDNO.8;或擴(kuò)增ALR2基因啟動(dòng)子區(qū)的C106T基因型使用的SEQIDNO.9與SEQIDNO.10。16.檢測(cè)中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的試劑盒，包括擴(kuò)增基因ACE的1/D基因型、AGT的M235T基因型和TNF-a基因的G-308A基因型的引物；以及指導(dǎo)如何檢測(cè)確定糖尿病患者正已患有、或有可能危險(xiǎn)發(fā)展成或疑似患有腎病的指導(dǎo)性材料。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其還包括擴(kuò)增基因ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型和ALR2基因啟動(dòng)子區(qū)的C106T基因型。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中擴(kuò)增所用的引物為擴(kuò)增ACE基因的I/D基因型使用的SEQIDNO.1與SEQIDNO.2;擴(kuò)增AGT基因的M235T基因型使用的SEQIDNO.3與SEQIDNO.4;擴(kuò)增TNF-a基因的G-308A基因型使用的SEQIDNO.5與SEQIDNO.6;擴(kuò)增ALR2基因的(CA)n-5，(z-2)基因型使用的SEQIDNO.7與SEQIDNO.8;或擴(kuò)增ALR2基因啟動(dòng)子區(qū)的C106T基因型使用的SEQIDNO.9與SEQIDNO.10。全文摘要公開(kāi)了檢測(cè)中國(guó)血統(tǒng)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成或疑似患有腎病的方法。該方法包括檢測(cè)來(lái)自糖尿病患者的樣品中是否含有選自ACE基因的I/D基因型，AGT基因的M235T基因型，ALR2基因的(CA)n-5’(z-2)基因型，ALR2基因啟動(dòng)子區(qū)的C106T基因型，TNF-a基因的G-308A基因型，以及其互補(bǔ)序列多態(tài)性序列的至少一個(gè)多態(tài)性序列，條件是ALR2的基因型不單獨(dú)使用，其中多態(tài)性序列的存在表明該糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病。本發(fā)明還提供了可用來(lái)檢測(cè)中國(guó)糖尿病患者已患有、將有可能發(fā)展成、或者疑似患有腎病的芯片。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101624630SQ20091016009公開(kāi)日2010年1月13日申請(qǐng)日期2004年4月15日優(yōu)先權(quán)日2004年4月15日發(fā)明者伍楚賢,蘇詠儀,陳重娥申請(qǐng)人:香港中文大學(xué)