專利名稱：一種秸稈原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以農(nóng)業(yè)廢棄物秸稈為原料，用微生物同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
丁二酸，又稱琥珀酸，是工業(yè)上一種重要的C4平臺化合物，是合成1，4丁二醇、四氫呋喃、己二酸、γ-丁內(nèi)酯、N-甲基吡咯烷酮等大宗化學(xué)品、專業(yè)化學(xué)制品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)等可降解塑料的基本原料。作為有機化工的基本原材料，丁二酸廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、表面活性劑、清潔劑、綠色溶劑、生物可降解塑料等領(lǐng)域。目前商業(yè)上主要通過馬來酸酐催化加氫后水解的化學(xué)方法制備丁二酸?；瘜W(xué)方法生產(chǎn)丁二酸，不可避免地消耗大量不可再生的化石原料。以可再生資源和二氧化碳作為主要原料微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，不但可以避免傳統(tǒng)化學(xué)方法中對化石原料的依賴，生產(chǎn)過程環(huán)境友好，并且還能固定CO2，緩解溫室效應(yīng)。因此，開發(fā)基于可再生資源生產(chǎn)丁二酸的方法已成為當(dāng)今研究的熱點。
秸稈是一種重要的木質(zhì)纖維素類可再生資源，年產(chǎn)量約占生物質(zhì)年產(chǎn)量的一半以上。在我國秸稈類資源非常豐富，每年產(chǎn)量約達7億多噸，其中玉米秸稈(35％)、小麥秸桿(21％)和稻草(19％)是我國的三大秸稈(http://www.efst.sh.cn/showKnowledge)。秸稈由于其含有大量纖維素營養(yǎng)價值較低，難于被畜禽利用，過多飼喂反而降低畜禽對其他營養(yǎng)物質(zhì)的利用，因此僅少量作填充飼料在草食動物中利用外，大量的秸稈就地?zé)?，造成環(huán)境的污染和對資源的浪費。
農(nóng)業(yè)廢棄物秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，纖維素是由β-1，4-糖苷鍵連接而成的多糖，半纖維素是由帶支鏈的多聚糖(主要是己聚糖和戊聚糖)組成的雜多糖，木質(zhì)素是一種酚醛聚合物。三者組成的木質(zhì)纖維素具有很強的抗水解和酶解特性，因此木質(zhì)纖維素作為發(fā)酵原料時必須經(jīng)過預(yù)處理才能使用。
以木質(zhì)纖維素為原料發(fā)酵，通常的方法是先將纖維類物質(zhì)進行水解，釋放出含葡萄糖、木糖等六碳糖和五碳糖的水解糖漿，水解糖漿再用于發(fā)酵，稱為分步糖化發(fā)酵方法。本發(fā)明人曾從牛瘤胃中篩選的琥珀酸放線桿菌Actinobacillussuccinogenes CGMCC1593，它能夠發(fā)酵葡萄糖、果糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖等糖類的糖質(zhì)原料(中國專利ZL200610038113.6)，并且進行了以秸稈等木質(zhì)纖維物的水解糖漿為原料，用琥珀酸放線桿菌CGMCC1593發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸(中國專利CN101215582A)。該發(fā)明采用的是分步糖化發(fā)酵方法即對秸稈纖維物原料的水解，采用稀酸或稀堿或汽爆的方法預(yù)處理，處理后秸稈用纖維素酶水解，得到六碳和五碳混合糖液，經(jīng)NaOH調(diào)pH后直接用于發(fā)酵配料使用。最近有報道玉米秸稈用汽爆預(yù)處理后，再用稀硫酸高壓水解，水解后固體部分用纖維素酶和半纖維素酶酶解，合并兩部分水解液，用于發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的分步糖化發(fā)酵方法(World J Microbiol Biotechnol，2009，25667-677)。雖然秸稈水解的方法較多，但需要有水解的設(shè)備和技術(shù)條件。并且由于維素酶水解反應(yīng)時，存在水解產(chǎn)物的反饋抑制，水解液糖濃度的積累受到限制。
本發(fā)明采用秸稈的水解和微生物發(fā)酵在同一反應(yīng)器內(nèi)同時進行的同步糖化發(fā)酵方法，即將預(yù)處理后的秸稈作為微生物發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，在加入纖維素酶液的同時接種發(fā)酵微生物的菌種，纖維素水解產(chǎn)生的還原糖可以立即被微生物消耗掉，轉(zhuǎn)化為最終發(fā)酵產(chǎn)物。采用同步糖化發(fā)酵可以有效地避免纖維素酶水解反應(yīng)過程中的反饋抑制作用，同時由于水解產(chǎn)生的還原糖馬上被微生物利用，發(fā)酵應(yīng)過程中還原糖濃度較低，不易造成高糖濃度對發(fā)酵的抑制。并且還簡化了整個發(fā)酵工藝，降低了對設(shè)備投資費用和操作費。目前還沒有利用秸稈原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的研究實例。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用廉價秸稈原料同步發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種以秸稈為原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，秸稈經(jīng)切割粉碎、稀堿預(yù)處理后，在纖維素酶和琥珀酸放線桿菌共同作用下生成丁二酸；步驟為 (1)秸稈原料與預(yù)處理 以農(nóng)業(yè)廢棄物秸稈為原料，將收割的秸稈烘干后，粉碎成20-60目的秸稈顆粒，秸稈顆粒和質(zhì)量濃度1％-8％稀NaOH堿液，按固液質(zhì)量比1∶5～1∶15的比例混合，在80-130℃下處理0.5-2h，過濾或離心分離固體，固體水洗至中性，烘干得到處理后的秸稈顆粒； (2)纖維素酶液的制備 里氏綠色木霉CICC40359或其突變株經(jīng)種子培養(yǎng)，以5％-10％的接種量接入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)，發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為質(zhì)量濃度含蛋白胨0.1％-0.6％，硫酸銨0.1％-0.5％，酵母膏0.01％-0.05％，KH2PO4 0.2％-0.5％，CaCl2·2H20 0.01％-0.05％、MgSO4·7H2O 0.01％-0.05％、Tween-80 0.01％-0.06％，微晶纖維素0.5％-2.5％，麩皮2％-8％，pH 5.0-6.0；28-30℃震蕩培養(yǎng)4-8天，得到含纖維素酶的發(fā)酵液；發(fā)酵液過濾除菌得到纖維素酶液，并于4℃保存； (3)同步糖化發(fā)酵 菌株琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC1593，為從牛的瘤胃中分離獲得，保藏在中國北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，中國專利ZL200610038113.6已公開。里氏綠色木霉TrichodermareeseiCICC40359，保藏在中國北京朝陽區(qū)霄云路32號中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。突變株的獲得用紫外線(UV)、γ-射線和X-射線物理誘變方法，或采用羥胺、亞硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯等化學(xué)誘變劑誘變的方法，或者采用或重組DNA技術(shù)、基因組改組技術(shù)等分子工程育種手段，選育產(chǎn)酶能力提高的里氏綠色木霉菌株；以及耐低pH、或耐溫性能改進，丁二酸產(chǎn)率提高的琥珀酸放線桿菌菌株。
同步糖化培養(yǎng)基組成質(zhì)量濃度為處理后秸稈顆粒2％-10％，酵母膏0.3％-1％，K2HPO4·12H2O 0.1％-0.2％，NaH2PO4·2H2O 0.1％-0.2％，MgCl20.01％-0.03％，CaCl2 0.01％-0.03％，乙酸鈉0.05％-0.2％，pH5.0-7.5； 同步糖化培養(yǎng)基滅菌后，加入里氏綠色木霉發(fā)酵生產(chǎn)的纖維素酶液或市售的纖維素酶，添加量為5-35IU濾紙酶活/g處理秸稈顆粒，和添加纖維二糖酶，添加量為1-15IU/g處理后的秸稈顆粒；并同時按5％-10％的接種量接入琥珀酸放線桿菌CGMCC1593或其突變株，于30-45℃在充滿CO2的環(huán)境中，靜止或震蕩培養(yǎng)20-72h；并用碳酸鹽或堿溶液調(diào)節(jié)維持發(fā)酵液pH 5.0-7.5； 發(fā)酵過程中，分次補加處理后的秸稈顆粒5-40g/L； 琥珀酸放線桿菌CGMCC1593或其突變株的種子培養(yǎng)基的組成為葡萄糖0.5％-1.5％，酵母膏0.1％-1.0％，K2HPO4·3H2O 0.05％-0.2％，NaH2PO4·2H2O0.02％-2.0％，混合維生素溶液0.1-1mL/100mL，pH 5.0-7.5； 混合維生素溶液組成為B12 5mg，B6 100mg，葉酸20mg，核黃素20mg，硫胺素20mg，煙酸20mg，泛酸50mg，對氨基苯甲酸50mg，去離子水定容至1000mL； 種子培養(yǎng)基配制后用0.2μm微孔濾膜過濾除菌，熱敏性的混合維生素液于接種前加入。
里氏綠色木霉CICC40359的突變株是通過傳統(tǒng)或分子育種手段，產(chǎn)酶能力提高的菌株。
琥珀酸放線桿菌CGMCC1593的突變株是用傳統(tǒng)或分子育種手段，得到的耐低pH或耐溫性能改善或丁二酸產(chǎn)率提高的菌株。
農(nóng)業(yè)廢棄物秸稈原料為玉米秸稈以及麥草、稻草、玉米芯、甘蔗渣。
分析方法 將發(fā)酵培養(yǎng)液離心，采用高效液相色譜法分析上清液中的琥珀酸等代謝產(chǎn)物及糖類物質(zhì)。采用美國Waters高效液相色譜儀，Waters RI檢測器，Breeze色譜工作站。其中，琥珀酸，乙酸，乳酸和甲酸等有機酸的測定使用Aminex HPX-87H離子色譜柱(300mm×7.8mm，9μm；Bio-Rad Chemical Division，Richmond，Calif.)，流動相8mM硫酸；柱溫55℃；流速0.5mL/min；進樣量10μL。葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖等糖類含量的測定采用Zobax NH2氨基柱(250mm×4.6mm，5μm；Agilent，USA)，流動相75％乙腈；流速1mL/min進樣量10μL。
以濾紙酶活(filter paper activity，F(xiàn)PA)表示纖維素酶的總活力，按照國際理論和應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(IUPAC)推薦的國際標(biāo)準(zhǔn)方法(Pure Appl Chem，1987，59(2)257-268)進行測定。取適當(dāng)稀釋的酶液0.5mL，加入1mL 0.1M的pH 4.8的醋酸緩沖液和一條16cm Whatman NO.1濾紙(約50mg)，在50℃下恒溫水浴中振蕩反應(yīng)1h，反應(yīng)完后加入3mL DNS試劑，沸水浴5min，迅速冷卻后定容到25mL，于540nm處測定OD值。濾紙酶活定義在酶促反應(yīng)中每min生成1.0μmol葡萄糖所需的酶量為一個國際酶活單位(IU/mL)。
纖維二糖酶活力(cellobiase activity，CBA)按照IUPAC推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法測定(Pure Appl Chem，1987，59(2)257-268)。取1.0mL的纖維二糖底物(15mmol/L、pH4.8)于比色管中，加入1mL適當(dāng)稀釋的酶液，在50℃下恒溫反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后使用SBA生物傳感分析儀測定葡萄糖含量。定義一個纖維二糖酶活力國際單位(CBIU)等于標(biāo)準(zhǔn)酶促反應(yīng)條件下每分鐘生成2.0μmol葡萄糖的酶量。
采用Van Soest凡氏測定法分析測定秸稈原料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量(《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》，P70，北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社)。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明以農(nóng)林廢棄物秸稈原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，丁二酸對秸稈產(chǎn)率達0.245g/g秸稈，表明了良好的應(yīng)用價值。本發(fā)明突出的優(yōu)點是采用不與人爭糧的廉價秸稈為發(fā)酵原料，并且秸稈的水解和微生物發(fā)酵在同一反應(yīng)器內(nèi)同時進行，降低了整個工藝對設(shè)備的投資和操作費。對于低成本生產(chǎn)生物基丁二酸，緩解丁二酸產(chǎn)品及其衍生物對石化資源的依賴，促進農(nóng)林廢棄物資源的利用，保護環(huán)境，增加農(nóng)民收入有積極的經(jīng)濟與社會意義。

具體實施例方式 以下是琥珀酸放線桿菌CGMCC1593同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的實施例。但本發(fā)明并不限于所列出的幾個實例。
實施例1稀堿預(yù)處理玉米秸稈酶水解液發(fā)酵產(chǎn)丁二酸 取80g烘干粉碎后的玉米秸稈，用1％(w/w)的氫氧化鈉溶液1200mL混勻，于120℃下處理1h，過濾得殘渣，殘渣水洗至中性，60℃烘干，得到41.3g處理后的秸稈顆粒，重量損失48.3％，稀堿處理前后玉米秸稈成分分析如下表1。
表1稀堿處理前后玉米秸稈成分的分析
稱取其中2g處理后的秸稈顆粒，裝入150mL三角瓶，加入42mL pH4.8的檸檬酸緩沖液、6mL纖維素酶液，添加酶量在20IU/g(底物)，總裝液量50mL，在50℃下水浴搖床上進行水解36h，測定水解液中糖含量如下 表2稀堿處理后的玉米秸稈酶水解后的成分分析
將酶解后的水解液進行離心，清液中加入終濃度營養(yǎng)成分酵母膏10g/L，磷酸二氫鈉1.5g/L，磷酸氫二鉀1.5g/L，無水氯化鈣0.15g/L，MgCl2 0.15g/L，乙酸鈉0.5g/L，調(diào)節(jié)pH6.8，121℃滅菌后接入5％種量的琥珀酸放線桿菌CGMCC1593，厭氧發(fā)酵36h，結(jié)果如下表 表3稀堿預(yù)處理后的玉米秸稈酶水解液丁二酸發(fā)酵情況
實施例2稀堿預(yù)處理后的玉米秸稈同步發(fā)酵產(chǎn)丁二酸 稱取稀堿預(yù)處理后的干秸稈顆粒2g于150mL厭氧瓶中，加入50mL培養(yǎng)液，其中含酵母膏10g/L，磷酸二氫鈉1.5g/L，磷酸氫二鉀1.5g/L，無水氯化鈣0.2g/L，MgCl20.15g/L，乙酸鈉0.5g/L，調(diào)節(jié)pH 6.8，攪拌均勻后121℃滅菌15min，然后接入2.5mL種量琥珀酸放線桿菌CGMCC1593厭氧種子，加入市售的Celluclast1.5L諾維信纖維素酶，用量為20IU/g底物。搖勻，在100％CO2條件下，靜置培養(yǎng)72h，測定發(fā)酵液中含丁二酸20.8g/L。
實施例3里氏木霉搖瓶液體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶 發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨0.3％、硫酸銨0.2％、酵母膏0.05％、KH2PO4 0.4％、CaCl2·2H20 0.03％、MgSO4·7H2O 0.03％、Tween-80 0.02％，微晶纖維素(Avicel)1％-2.5％，麩皮2％-6％。發(fā)酵條件培養(yǎng)溫度28～30℃，pH 5.5，培養(yǎng)時間5～6天，搖床轉(zhuǎn)數(shù)180r·min-1，250mL三角瓶裝液50mL。
將長好的里氏綠色木霉CICC40359斜面用20mL生理鹽水沖洗，沖洗液傳入裝有玻璃珠的三角瓶中，搖勻后作為種子液按5％接種發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵6天后測定酶活結(jié)果如表4。
表4不同微晶纖維素和麩皮含量的產(chǎn)酶情況
實施例4-9不同處理玉米秸稈濃度的同步糖化發(fā)酵產(chǎn)丁二酸 分別稱取2g、2.5g、3g、3.5g、4g、4.5g處理秸稈顆粒于150mL厭氧瓶中，加入琥珀酸放線桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中的其它營養(yǎng)成分，混合液體積分別約為46mL、45mL、44mL、43mL、42mL、41mL，攪拌均勻后，121℃滅菌15min。冷卻，分別加入4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL里氏綠色木霉CICC40359發(fā)酵酶液，0.1mL售纖維二糖酶，2g MgCO3，接入2.5mL培養(yǎng)好的CGMCC1593種子，在100％CO2的環(huán)境中38℃培養(yǎng)72h。測定丁二酸的產(chǎn)量如下表5 表5底物濃度對同步糖化發(fā)酵的影響
實施例10分次補加秸稈顆粒的同步糖化發(fā)酵產(chǎn)丁二酸 稱取稀堿預(yù)處理干秸稈顆粒2g于150mL厭氧瓶中，加入44mL培養(yǎng)液，其中含酵母膏10g/L，磷酸二氫鈉1.5g/L，磷酸氫二鉀1.5g/L，無水氯化鈣0.2g/L，MgCl2 0.15g/L，乙酸鈉0.5g/L，調(diào)節(jié)pH 6.8，攪拌均勻后121℃滅菌15min，然后接入2.5mL種量琥珀酸放線桿菌CGMCC1593厭氧種子，加入里氏綠色木霉CICC40359發(fā)酵酶液6mL，0.1mL售纖維二糖酶，4g MgCO3，搖勻后在100％CO2條件下，靜置培養(yǎng)48h，補加滅菌過的處理秸稈顆粒1.5g，搖勻后在100％CO2條件下繼續(xù)靜置培養(yǎng)48h，測定發(fā)酵液中含丁二酸40.2g/L，對纖維總量轉(zhuǎn)化率67％。
權(quán)利要求
1，一種以秸稈為原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征是秸稈經(jīng)切割粉碎、稀堿預(yù)處理后，在纖維素酶和琥珀酸放線桿菌共同作用下生成丁二酸；步驟為
(1)秸稈原料與預(yù)處理
以農(nóng)業(yè)廢棄物秸稈為原料，將收割的秸稈烘干后，粉碎成20-60目的秸稈顆粒，秸稈顆粒和質(zhì)量濃度1％-8％稀NaOH堿液，按固液質(zhì)量比1∶5～1∶15的比例混合，在80-130℃下處理0.5-2h，過濾或離心分離固體，固體水洗至中性，烘干得到處理后的秸稈顆粒；
(2)纖維素酶液的制備
里氏綠色木霉CICC40359或其突變株經(jīng)種子培養(yǎng)，以5％-10％的接種量接入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)，發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基為質(zhì)量濃度含蛋白胨0.1％-0.6％，硫酸銨0.1％-0.5％，酵母膏0.01％-0.05％，KH2PO4 0.2％-0.5％，CaCl2·2H2O 0.01％-0.05％，MgSO4·7H2O 0.01％-0.05％，Tween-80 0.01％-0.06％，微晶纖維素0.5％-2.5％，麩皮2％-8％，pH 5.0-6.0；28-30℃震蕩培養(yǎng)4-8天，得到含纖維素酶的發(fā)酵液；發(fā)酵液過濾除菌得到纖維素酶液，并于4℃保存；
(3)同步糖化發(fā)酵
同步糖化培養(yǎng)基以質(zhì)量濃度計組成為處理后秸稈顆粒2％-10％，酵母膏0.3％-1％，K2HPO4·12H2O 0.1％-0.2％，NaH2PO4·2H2O 0.1％-0.2％，MgCl20.01％-0.03％，CaCl2 0.01％-0.03％，乙酸鈉0.05％-0.2％，pH5.0-7.5；
同步糖化培養(yǎng)基滅菌后，加入里氏綠色木霉發(fā)酵生產(chǎn)的纖維素酶液或市售的纖維素酶，添加量為5-35IU濾紙酶活/g處理秸稈顆粒，和添加纖維二糖酶，添加量為1-15IU/g處理后秸稈顆粒；并同時按5％-10％的接種量接入琥珀酸放線桿菌CGMCC1593或其突變株，于30-45℃在充滿CO2的環(huán)境中，靜止或震蕩培養(yǎng)20-72h；并用碳酸鹽或堿溶液調(diào)節(jié)維持發(fā)酵液pH 5.0-7.5；
發(fā)酵過程中，分次補加處理后的秸稈顆粒5-40g/L；
琥珀酸放線桿菌CGMCC1593或其突變株的種子培養(yǎng)基的組成為葡萄糖0.5％-1.5％，酵母膏0.1％-1.0％，K2HPO4·3H2O 0.05％-0.2％，NaH2PO4·2H2O0.02％-2.0％，混合維生素溶液0.1-1mL/100mL，pH 5.0-7.5；
混合維生素溶液組成為B12 5mg，B6 100mg，葉酸20mg，核黃素20mg，硫胺素20mg，煙酸20mg，泛酸50mg，對氨基苯甲酸50mg，去離子水定容至1000mL；
種子培養(yǎng)基配制后用0.2μm微孔濾膜過濾除菌，熱敏性的混合維生素液于接種前加入。
2，根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于里氏綠色木霉CICC40359的突變株是通過傳統(tǒng)或分子育種手段，產(chǎn)酶能力提高的菌株。
3，根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于琥珀酸放線桿菌CGMCC1593的突變株是用傳統(tǒng)或分子育種手段，得到的耐低pH或耐溫性能改善或丁二酸產(chǎn)率提高的菌株。
4，根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于農(nóng)業(yè)廢棄物秸稈原料為玉米秸稈以及麥草、稻草、玉米芯、甘蔗渣。
全文摘要
一種秸稈原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以農(nóng)業(yè)廢棄物秸稈為原料，用微生物同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，秸稈經(jīng)切割粉碎，稀堿預(yù)處理后，在里氏綠色木霉所產(chǎn)的纖維素酶和琥珀酸放線桿菌的共同作用下發(fā)酵生成丁二酸。70g/L的稀堿預(yù)處理后的秸稈經(jīng)38℃厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸35.5g/L。本發(fā)明具有采用廉價的非糧原料、對設(shè)備投資費用和操作費用少，對環(huán)境友好，可以緩解化學(xué)合成丁二酸對石化資源依賴的優(yōu)點。
文檔編號C12P7/40GK101603059SQ20091018225
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月6日
發(fā)明者璞 鄭, 孫志浩, 林 方, 巖 徐 申請人:江南大學(xué)