專利名稱：一種利用lamp檢測溶珊瑚弧菌的引物組、快速診斷試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的引物組、快速診斷試劑盒及檢測 方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雜色鮑養(yǎng)殖自2001年開始，人工繁殖幼苗在附苗后10-21天陸續(xù)發(fā)白、脫落及 大量死亡，影響種苗來源與成貝價(jià)格，危及整個(gè)鮑養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。養(yǎng)殖鮑苗脫落或成鮑死亡 疫情，不僅發(fā)生于中國南方沿海，中國臺(tái)灣沿海一帶亦發(fā)生類似疾病。經(jīng)過長時(shí)間的監(jiān) 測研究，確定引起此大規(guī)模"掉板癥"的主要病原是溶珊瑚弧菌Vibrio corallilyticus,屬 于弧菌科弧菌屬。 為防止該病原菌的傳染和流行是能夠采取的主要措施，早期快速診斷溶珊瑚弧 菌是減少損失的有效途徑，因此，簡便快速、特異性好、靈敏度高的診斷試劑盒及其檢 測方法對于疾病的預(yù)防意義重大。 目前常用的檢測技術(shù)是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為代表的病原核酸檢測技 術(shù)，但是這些檢測技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中存在一些問題，如普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù) 需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點(diǎn)；熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)雖然較好地解決了交叉污染的問題，并簡化了操作過程，但卻需要更復(fù)雜 的定量測定儀器，不適用于現(xiàn)場快速檢測，而且實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)中熒 光探針的成本較高，加大了推廣應(yīng)用的難度；免疫學(xué)檢測技術(shù)快速簡便成本低廉，但要 求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的單克隆抗體，否則因準(zhǔn)確性不夠，目前只能是輔助檢測手段。
所以及時(shí)運(yùn)用生物技術(shù)發(fā)展的最新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高 具有重要意義。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,簡稱LAMP技術(shù))，
是近年來新出現(xiàn)的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，具有快速、敏感、特異性強(qiáng)等特 點(diǎn)，LAMP主要是利用4種不同的特異性引物識(shí)別靶基因的6個(gè)特定區(qū)段，在聚合酶和等 溫條件下高效、快速、高特異地?cái)U(kuò)增靶序列，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，通常是采用染色劑對反 應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析。LAMP中所用到的聚合酶通常都選用具有鏈置換特性的DNA聚合酶， 如BstDNA聚合酶。 對LAMP來說，4種特異性引物的設(shè)計(jì)是其關(guān)鍵所在，對于引物設(shè)計(jì)有許多的要 求，如各個(gè)引物之間的距離、Tm值以及引物末端穩(wěn)定性等，因此從200 300個(gè)堿基的 靶序列中設(shè)計(jì)四條符合要求的引物存在很大的難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的引物組，該引物組在 很大程度上減少了擴(kuò)增反應(yīng)的背景影響，大大改善了溶珊瑚弧菌檢測的特異性。
本發(fā)明的目的還在于提供利用上述引物組進(jìn)行LAMP檢測溶珊瑚弧菌的快速診 斷試劑盒，該試劑盒檢測靈敏度高、擴(kuò)增時(shí)間短，產(chǎn)率高。 本發(fā)明的目的還在于提供利用上述試劑盒進(jìn)行LAMP檢測溶珊瑚弧菌的方法， 該方法具有快速、高效和高特異性等特點(diǎn)。 為達(dá)到本發(fā)明的第一個(gè)目的，本發(fā)明提供的利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的引物
組，所述的引物組由下述外引物對和內(nèi)引物對組成 所述的外引物對為VCF3 : TGGTTGCAGGTGACATCACVCB3 : TCTACTGGGCTGTACGTAGC 所述的內(nèi)引物對為 其中W = A和T ; R = A和G。 本發(fā)明提供的利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的快速診斷試劑盒，它含有下述引物
組、陽性對照品、LAMP反應(yīng)液、BstDNA聚合酶和顯色液。 所述的引物組由下述外弓I物對和內(nèi)弓I物對組成 所述的外引物對為 VCF3 : TGGTTGCAGGTGACATCAC VCB3 : TCTACTGGGCTGTACGTAGC 所述的內(nèi)引物對為 其中W二A和T; R二A和G。 所述引物組中外引物對和內(nèi)引物對的添加摩爾比為1 : 1 10。所述LAMP反應(yīng)液含有1 X反應(yīng)緩沖液、0 1.0mmol/LdNTPs、 0.2 l.Ommol/
L甜菜堿和0.2 0.8mmol/L MgS04。所述的IX反應(yīng)緩沖液含有20mmol/LpH為8.8的Tris-HCl、 1Ommol/L KCl、 10mmol/L(NH4)2SO4、 2mmol/L MgS04和占反應(yīng)緩沖液體積百分比為0.1 % Triton X-IOO。
所述的顯色液為含熒光染料，所述的熒光染料優(yōu)選SYBR Green I或EvaGreen。
所述的陽性對照品為含有溶珊瑚弧菌的基因組DNA。
上述試劑盒的生產(chǎn)工藝，包括如下步驟 (1)將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測，分裝后 抽樣質(zhì)檢； (2)將LAMP反應(yīng)液無菌分裝，抽樣質(zhì)檢； (3)將BstDNA聚合酶無菌分裝，抽樣質(zhì)檢； (4)將顯色液無菌分裝，抽樣質(zhì)檢； (5)將陽性對照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢； (6)準(zhǔn)備帶有小孔的泡沫板； (7)組裝試劑盒。
作為本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，上述泡沫板的設(shè)計(jì)可以為其大小與本發(fā)明試劑 盒的底面相同，泡沫板上有不少于試劑盒中所裝試劑小管數(shù)量的小孔，這樣試劑盒中所 用試劑分裝成的小管可以分別對應(yīng)放置于這些小孔中，從而使得試劑都能處于小管的下 部，方便取用和吸取，也可以使取用時(shí)殘留在管壁上的液體自動(dòng)回到管底，節(jié)約試劑。
本發(fā)明提供的利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的方法，該方法包括以下步驟提 取待測樣品基因組的DNA，在LAMP反應(yīng)體系中加入上述引物組、LAMP反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶，混勻，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)后進(jìn)行滅活，取滅活后部分產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠 電泳分析，剩余產(chǎn)物加入顯色液，觀察顯色結(jié)果，并同時(shí)對比陽性對照品的顯色結(jié)果， 若顯示結(jié)果一致，則說明待測樣品中含有溶珊瑚弧菌，若顯色結(jié)果不一致，則說明待測 樣品中不含有溶珊瑚弧菌。 所述的引物組由下述外弓|物對和內(nèi)弓|物對組成 所述的外引物對為VCF3 : TGGTTGCAGGTGACATCACVCB3 : TCTACTGGGCTGTACGTAGC 所述的內(nèi)引物對為 其中W二A和T; R二A和G。所述的恒溫反應(yīng)的溫度范圍為56 66°C，反應(yīng)時(shí)間為40 70min。
所述滅活的溫度為8(TC，滅活時(shí)間為10min。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果 (1)本發(fā)明根據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)了溶珊瑚弧菌檢測用引物組，能特異性識(shí)別靶 序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，在BstDNA聚合酶的作用下啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)DNA 區(qū)啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán) DNA混合物，由于LAMP技術(shù)只有在四條引物完全識(shí)別靶序列六個(gè)結(jié)合區(qū)的情況下才能 順利進(jìn)行，所以本發(fā)明的引物組在很大程度上減少了擴(kuò)增反應(yīng)的背景影響，大大改善了 溶珊瑚弧菌檢測的特異性； (2)采用本發(fā)明的引物組對溶珊瑚弧菌進(jìn)行檢測，因?yàn)樘禺愋愿?，所以可以根?jù) 是否擴(kuò)增就能判斷目標(biāo)基因的存在與否； (3)本發(fā)明的快速診斷試劑盒是利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測溶珊瑚弧菌， 檢測靈敏度高，擴(kuò)增模板僅需10拷貝或更少； (4)本發(fā)明的快速診斷試劑盒不但反應(yīng)條件溫和，且所需儀器簡單，也不需要特 殊試劑，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時(shí)間長、容易污染及檢測成本高等缺點(diǎn)；
(5)本發(fā)明的快速診斷試劑盒擴(kuò)增快速且高效，在不到lh即可完成擴(kuò)增，且產(chǎn)率 高； (6)本發(fā)明的快速診斷試劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶 液中的Mg+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物-焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液 后，陰陽性結(jié)果顯色差異顯著，驗(yàn)證率高，更加明顯可靠； (7)本發(fā)明的快速診斷試劑盒操作簡單，對檢測人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，可建立成本低廉的快速篩選體系，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測； (8)本發(fā)明的快速診斷試劑盒建立了一套經(jīng)過優(yōu)化的反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反 應(yīng)(RT-LAMP)體系，不但使得溶珊瑚弧菌定性檢測更加簡便快速、特異性高、靈敏度 高，而且可用于魚、貝類養(yǎng)殖過程中各時(shí)期的溶珊瑚弧菌跟蹤檢測，避免該病原菌傳播 流行，提高科學(xué)管理效率，具有很高的實(shí)用價(jià)值。


圖1是LAMP檢測溶珊瑚弧菌靈敏度的試驗(yàn)結(jié)果；其中M : Marker2000 : 1 : 660ng ; 2 : 66ng ; 3 : 6.6ng ; 4 : 660fg ; 6 :
66fg ; 7 : 6.6fg ; 8 :陰性對照； 圖2是LAMP檢測溶珊瑚弧菌特異性的試驗(yàn)結(jié)果； 其中M: Marker2000 ; 1:菌株NA0301; 2:哈維氏弧菌；3:溶藻弧菌 (1.1883T) ; 4:溶藻弧菌V2; 5、黃桿菌Myroides odoratus ; 6:副溶血弧菌(1.1997);
7 :枯草芽孢桿菌；8 :大腸桿菌；9 :塔式弧菌；10、陰性對照。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于以下實(shí)施 例。所述技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開的內(nèi)容和各參數(shù)所取范圍，均可 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
實(shí)施例1 本實(shí)施例提供的利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的引物組，該引物組由下述外引物
對和內(nèi)引物對組成 其中外引物對為VCF3 : TGGTTGCAGGTGACATCAC，VCB3 : TCTACTGGGCTGTACGTAGC ; 內(nèi)引物對為
G， 其中W二A和T; R二A和G。 實(shí)施例2 本實(shí)施例提供的利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的試劑盒，所采用的引物組參見實(shí) 施例l，其含有以下可分離包裝的試劑 a)含有實(shí)施例l所述的引物組，該引物組中外引物對和內(nèi)引物對的添加摩爾比為 1 : 1 10 ; 其中外引物對為 VCF3 : TGGTTGCAGGTGACATCAC, VCB3 : TCTACTGGGCTGTACGTAGC; 內(nèi)引物對為
VCFIP :
G， VCBIP :
其中W二A和T; R二A和G; b)陽性對照品含有溶珊瑚弧菌的基因組DNA，其濃度為5 20mg/mL ;
c)LAMP反應(yīng)液含有IX反應(yīng)緩沖液、0 1.0mmol/LdNTPs、 0.2 l.Omol/ L甜菜堿和0.2 0.8mmol/L MgS04，所述的IX反應(yīng)緩沖液含有20mM pH為8.8的 Tris-HCl、 10mmol/LKCl、 10mmol/L(NH4)2SO4、 2mmol/L MgS04和占反應(yīng)緩沖液體積百 分含量為0.1% Triton X-100 ;
d)BstDNA聚合酶；e)顯色液含有常規(guī)熒光染料，該熒光染料可選擇SYBR Green I或EvaGreen ; 本發(fā)明的試劑盒里還可以包括一個(gè)泡沫板，該泡沫板的設(shè)計(jì)可以為其大小與
本發(fā)明試劑盒的底面相同，泡沫板上有不少于試劑盒中所裝試劑小管數(shù)量的小孔，這樣 試劑盒中所用試劑分裝成的小管可以分別對應(yīng)放置于這些小孔中，從而使得試劑都能處 于小管的下部，方便取用和吸取，也可以使取用時(shí)殘留在管壁上的液體自動(dòng)回到管底， 節(jié)約試劑。
上述試劑盒的生產(chǎn)工藝，包括如下步驟 (1)將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測，分裝后 抽樣質(zhì)檢； (2)將LAMP反應(yīng)液無菌分裝，抽樣質(zhì)檢； (3)將BstDNA聚合酶無菌分裝，抽樣質(zhì)檢； (4)將顯色液無菌分裝，抽樣質(zhì)檢； (5)將陽性對照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢； (6)準(zhǔn)備帶有小孔的泡沫板； (7)組裝試劑盒。 實(shí)施例3 本實(shí)施例提供的利用LAMP檢測溶珊瑚菌的方法，所采用的快速診斷試劑盒參 見實(shí)施例2。 該LAMP檢測溶珊瑚弧菌的方法為提取待測樣品基因組的DNA，在LAMP反 應(yīng)體系中加入上述引物組、LAMP反應(yīng)液、BstDNA聚合酶，混勻，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)， 8(TC滅活10min后，取滅活后部分液體產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，剩余液體產(chǎn)物加 入顯色液，觀察顯色結(jié)果，并同時(shí)對比陽性對照品的顯色結(jié)果，若顯示結(jié)果一致，則說 明待測樣品中含有溶珊瑚弧菌，若顯色結(jié)果不一致，則說明待測樣品中不含有溶珊瑚弧 菌。 當(dāng)該反應(yīng)體系為每管25iiL時(shí)，每管反應(yīng)體系中外引物對和內(nèi)引物對的添加摩 爾比優(yōu)選為l : 8， MgS04的濃度優(yōu)選為1.2mmol/L，甜菜堿的濃度優(yōu)選為1.0mmol/L， dNTPs的濃度優(yōu)選為1.0mmol/L。 1X反應(yīng)緩沖液包括20mM pH為8.8的Tris-HCl、 10mmol/L KC1、 10mmo1/ L(NH4)2S04、 2mmol/LMgS04和占反應(yīng)緩沖液體積百分比為0.1% TritonX-lOO。
恒溫反應(yīng)的溫度范圍為56 66t:，反應(yīng)時(shí)間為40 70min ;優(yōu)選的，溫度為 64.5 65°C，反應(yīng)時(shí)間為70min。 其中滅活的溫度為8(TC，滅活時(shí)間為10min。 其中外引物對為 VCF3 : TGGTTGCAGGTGACATCAC， VCB3 : TCTACTGGGCTGTACGTAGC ; 內(nèi)引物對為
G， 其中W = A和T ; R = A和G ; 其中，待測樣品基因組DNA的提取過程如下 (1)取O.lg生物樣品，或lmL水樣離心濃縮，10,000rpm( 11,500Xg)離心 lmin，盡量吸凈上清；(2)向沉淀中加入200 ii L緩沖液GA，振蕩至其徹底懸??； [cms](3)向管中加入20iiL蛋白酶K溶液，混勻； (4)加入220iiL緩沖液GB，振蕩15s， 7(TC放置10min，溶液應(yīng)變清亮，短暫離 心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠； 加入緩沖液GB時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀， 一般7(TC放置時(shí)會(huì)消失，不會(huì)影響后 續(xù)實(shí)驗(yàn)。如溶液未變清亮，說明細(xì)胞裂解不徹底，可能導(dǎo)致提取DNA量少和提取出的 DNA不純； (5)加220iiL無水乙醇，充分振蕩混勻15s，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，短暫離 心以除去管蓋內(nèi)壁的水珠； (6)將步驟(5)所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管 中)，12,000rpm( 13,400Xg)離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；
(7)向吸附柱CB3中加入500 ii L緩沖液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙 醇)，12,000rpm( 13,400Xg)離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；
(8)向吸附柱CB3中加入700 ii L漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙 醇)，12,000rpm( 13,400Xg)離心30s，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中；
(9)向吸附柱CB3中加入500ii L漂洗液PW， 12,000rpm( 13,400 Xg)離心30s， 倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；(10)將吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm( 13,400Xg)離心2min，倒掉廢
液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液； 這一步的目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后
續(xù)的酶反應(yīng)(酶切、PCR等)實(shí)驗(yàn)； (11)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 50-200 ii L洗脫緩沖液TE，室溫放置2 5min， 12,000rpm( 13,400 Xg)離心2min，將
溶液收集到離心管中。 為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2min， 12,000rpm( 13,400 Xg)離心2min，洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50 y L，體積 過小影響回收效率，洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響，若用水做洗脫液應(yīng)保證其 pH值在7.0 8.5范圍內(nèi)(可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍)，pH值低于7.0會(huì)降 低洗脫效率；且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-2(TC，以防DNA降解。 采用上述快速診斷試劑盒和方法進(jìn)行LAMP檢測溶珊瑚弧菌靈敏度和特異性的 試驗(yàn)結(jié)果如附圖l和2所示。 如圖1所示，靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明LAMP擴(kuò)增的特異性良好，無假陽性出 現(xiàn)；溶珊瑚弧菌的基因組DNA最低檢測限約為66fg;細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測限為36cfu/ mL。 如圖2所示，特異性試驗(yàn)結(jié)果表明僅溶珊瑚弧菌株NA0301出現(xiàn)了明顯的 LAMP擴(kuò)增，其余菌株包括弧菌屬細(xì)菌和大腸桿菌等都未有階梯狀的擴(kuò)增特征條帶，表 明特異性強(qiáng)。
序列表 <110>中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 <120> —種利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的引物組、快速診斷試劑盒及檢測方法 <140>200910192203.4 <141>2009-09-09 <160> <210>4 <211>19 <212>DNA <213>Vibirio.coralliilyticus <400>1tggttgcaggtgacatcac 19 <210>2 <211>20 <212>DNA <213>Vibirio.coralliilyticus <400>2tctactgggctgtacgtagc 20 <210>3 <211>45 <212>DNA <213>Vibirio.coralliilyticus <400>3catwgcgatctcagcgttgtcttttgatcgctaacccagaacacg 45
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>Vibirio.coralliilyticus
<400>4tggttacgttccagcttcagctttcaaccagtaggcgaccrat 4權(quán)利要求
一種利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的引物組，其特征在于，所述的引物組由下述外引物對和內(nèi)引物對組成所述的外引物對為VCF3TGGTTGCAGGTGACATCACVCB3TCTACTGGGCTGTACGTAGC所述的內(nèi)引物對為VCFIPCATWGCGATCTCAGCGTTGTCTTTTGATCGCTAACCCAGAACACGVCBIPTGGTTACGTTCCAGCTTCAGCTTTCAACCAGTAGGCGACCRAT其中W＝A和T；R＝A和G。
2. —種利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的快速診斷試劑盒，其特征在于，它含有權(quán)利要 求l所述的引物組、陽性對照品、LAMP反應(yīng)液、BstDNA聚合酶和顯色液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速診斷試劑盒，其特征在于，所述引物組中外引物對和內(nèi) 引物對的添加摩爾比為1 : 1 10。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速診斷試劑盒，其特征在于，所述LAMP反應(yīng)液含有1 X 反應(yīng)緩沖液、0 1.0mmol/LdNTPs、 0.2 1.0mmol/L甜菜堿和0.2 0.8mmol/L MgS04。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的1X反應(yīng)緩沖液含有 20mmol/L pH為8.8的Tris-HCl、 10mmol/L KC1、 10mmol/L(NH4)2SO4、 2mmol/L MgS04 和占反應(yīng)緩沖液體積百分比為0.1% Triton X-IOO。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的顯色液為含熒光染 料，所述的熒光染料為SYBR Green I或EvaGreen。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照品為含有溶 珊瑚弧菌的基因組DNA。
8. —種利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求2-7所述的試 劑盒，該方法包括以下步驟提取待測樣品基因組的DNA，在LAMP反應(yīng)體系中加入上述引物組、LAMP反應(yīng) 液、BstDNA聚合酶，混勻，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)后進(jìn)行滅活，取滅活后部分產(chǎn)物進(jìn)行瓊 脂糖凝膠電泳分析，剩余產(chǎn)物加入顯色液，觀察顯色結(jié)果，并同時(shí)對比陽性對照品的顯 色結(jié)果，若顯示結(jié)果一致，則說明待測樣品中含有溶珊瑚弧菌，若顯色結(jié)果不一致，則 說明待測樣品中不含有溶珊瑚弧菌。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的恒溫反應(yīng)的溫度范圍為56 66°C，反應(yīng)時(shí)間為40 70min。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述滅活的溫度為8(TC，滅活時(shí)間為 10min。
全文摘要
一種利用LAMP檢測溶珊瑚弧菌的引物組、快速診斷試劑盒和檢測方法，該引物組由下述外引物對和內(nèi)引物對組成外引物對為VCF3TGGTTGCAGGTGACATCAC，VCB3TCTACTGGGCTGTACGTAGC；內(nèi)引物對為VCFIPCATWGCGATCTCAGCGTTGTCTTTTGATCGCTAACCCAGAACACG，VCBIPTGGTTACGTTCCAGCTTCAGCTTTCAACCAGTAGGCGACCRAT其中W＝A和T；R＝A和G。還公開了含有上述引物組的快速診斷試劑盒及檢測方法，該引物組、快速診斷試劑盒和檢測方法檢測時(shí)間短、特異性強(qiáng)，檢測靈敏度高。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101691613SQ20091019220
公開日2010年4月7日 申請日期2009年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月9日
發(fā)明者劉廣鋒, 王江勇, 王瑞旋 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所