專利名稱：一種瓊脂糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多糖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種瓊脂糖的制備方法。
背景技術(shù)：
瓊脂糖是由D-半乳糖和3，6-內(nèi)醚-半乳糖交替連結(jié)而成的線性多糖分子，是 一種重要的生化試劑，在分子生物學(xué)技術(shù)以及其他生化分離分析技術(shù)中得到廣 泛的應(yīng)用，是目前生化分離、基因重組、免疫分析、疾病診斷等高級(jí)生物技術(shù) 中不可或缺的材料。瓊脂糖可以由瓊脂(又稱瓊膠)經(jīng)過分離除去硫瓊膠部分 而制得，目前全球的瓊脂糖生產(chǎn)都是以大型海藻為原料，制得瓊脂，再經(jīng)過脫 硫制得瓊脂糖。我國南方主要是利用江蘺、紫菜等為原料提取瓊脂，再利用瓊 脂提取瓊脂糖。
瓊脂糖在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)方面的用途日益廣泛，隨著生化技術(shù)的日益廣泛
的應(yīng)用，對(duì)瓊脂糖的需求量日增。目前，瓊脂糖主要靠進(jìn)口，瓊脂糖的價(jià)格昂
蟲 貝。
微藻是一類在陸地、海洋分布廣泛、光合利用度高的自養(yǎng)生物，細(xì)胞代謝 產(chǎn)生多糖、蛋白質(zhì)、色素等，使其在食品、醫(yī)藥、基因工程、液體燃料等領(lǐng)域 具有很好的開發(fā)前景，而且微藻生長周期短、繁殖快適合大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)， 以及相關(guān)代謝產(chǎn)品的獲得。
iVeocWon's o/eoakmcfom是綠藻門綠藻綱綠球藻目綠球藻科的一種微藻， 國際專利WO2006/008401引用該藻作為多種微生物和藻類的一部分，描述了 制備至少一種光合作用水和/或淡水微生物的澄清培養(yǎng)基的方法，并將這些培養(yǎng)基用于化妝品領(lǐng)域。中國專利CN101120910也提供一種包含該藻的生物質(zhì) 提取物的美容減肥組合物。
目前尚未有通過工業(yè)化培養(yǎng)微藻生產(chǎn)瓊脂糖的報(bào)道，也沒有利用 iVeoc/z/or/51 。/eo"Z)w"dmw生產(chǎn)瓊月旨糖的相關(guān)石開究手艮道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)效率 高的，利用微藻來制備獲得瓊脂糖的方法。
本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實(shí)現(xiàn)的
一種瓊脂糖的制備方法，該方法是利用微藻可代謝生產(chǎn)瓊脂多糖、蛋白質(zhì) 和色素等產(chǎn)物，且微藻的生長周期短、繁殖快等特點(diǎn)，選擇一種微藻藻種——
A^ocWon、 o/eoWww/ara,通過培養(yǎng)該微藻，讓其大量分泌產(chǎn)生瓊脂糖，收集 分泌產(chǎn)物即可制備得到所需瓊脂糖。
上述制備方法，具體包括如下步驟 (1)微藻培養(yǎng)
將微藻藻種(7Veoc似on、o/eoaZww^ms)接種于含有20 60g/l糖類碳源的 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在25 32"C溫度條件和攪拌、通氣、光照的條件下培養(yǎng)4 6天，待培養(yǎng)液變得很粘稠停止培養(yǎng)；
上述糖類碳源可以選擇任意一種本領(lǐng)域技術(shù)人員在制備培養(yǎng)基時(shí)所采用 的糖類碳源，如乳糖、葡萄糖、半乳糖等等。
微藻培養(yǎng)還可以采取如下方法
將微藻藻種(7Veoc/2/w7》o/eo"Z>wm/"ra)接種于無機(jī)培養(yǎng)基中，通入C02 加富(CO2濃度不要高于20Xv/v)的空氣光照培養(yǎng)1 3天，使培養(yǎng)液中的微藻細(xì)胞含量增長到OD冊(cè)o達(dá)到5 10，再向培養(yǎng)液中添加已經(jīng)過滅菌的乳糖或 葡萄糖溶液，使培養(yǎng)液中糖濃度達(dá)到20 60g/1，繼續(xù)培養(yǎng)3 4天，待培養(yǎng)液 很粘稠停止培養(yǎng)。
上述兩種培養(yǎng)方法中的無機(jī)鹽培養(yǎng)基為本領(lǐng)域技術(shù)人員所常用的基礎(chǔ)培 養(yǎng)基，其配方為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。 (2)瓊脂糖的提取
將上述培養(yǎng)所得培養(yǎng)液加熱至50 100°C ，然后在50°C以上的溫度下離心 分離去除藻細(xì)胞，回收離心上清液，此時(shí)上清液中已經(jīng)含有所需的瓊脂糖，后 續(xù)只需采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的任意一種多糖分離提純方法，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā) 明，得到所需瓊脂糖。
本發(fā)明提供一種從上述上清液中分離純化瓊脂糖的方法，其步驟如下
將上述離心上清液在45 55"C下減壓蒸發(fā)濃縮，將濃縮物冷卻到室溫， 再置于一1(TC以下冷凍凍結(jié)；
將凍結(jié)物取出，切割成小塊，化凍，用濾布過濾，收集濾出的凝膠用清水 清洗后，瀝干水后，得到凝膠，該凝膠即為瓊脂糖。
上述所得瓊脂糖還可以進(jìn)一步精制，去除雜質(zhì)，其操作步驟如下
將上述凝膠再加水并加熱重新溶解，并減壓蒸發(fā)濃縮。
將上述濃縮物再次置于一1(TC以下冷凍凍結(jié)，然后將凍結(jié)物取出化凍，瀝 去水后，壓干、風(fēng)干后制備得到所需的較為純凈的瓊脂糖。
上述制備方法中，根據(jù)實(shí)際用途不同，對(duì)瓊脂糖產(chǎn)品質(zhì)量的要求不同，還 可以對(duì)制備得到的瓊脂糖進(jìn)行后期的堿煮等方法進(jìn)行進(jìn)一步的純化。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明通過工業(yè)化培養(yǎng)微藻生產(chǎn)瓊脂糖，與通過海洋種植江蘺、紫菜等大型海藻生產(chǎn)瓊脂糖相比，本發(fā)明的制備方法生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)效率高，可以在內(nèi)陸用淡水生產(chǎn)，有利于大規(guī)模推廣，具有很好的發(fā)展前景。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何限定。實(shí)施例l
本實(shí)施例的瓊脂糖，其制備方法包括如下步驟-(1 )微藻培養(yǎng)
在l L已經(jīng)滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，接種A^oc/z/w7's 使細(xì)胞數(shù)達(dá)到lxl06，通入含5體積XC02的空氣，通氣量l wm，在28'C光照攪拌培養(yǎng)，光照強(qiáng)度300 pmol/m2;培養(yǎng)采用純種培養(yǎng)的方式，培養(yǎng)60小時(shí)，培養(yǎng)液中的微藻細(xì)胞含量增長到OD6oo為5;向培養(yǎng)液中添加100 ml 50g/100ml的已經(jīng)滅菌的乳糖溶液，使培養(yǎng)液中糖濃度達(dá)到約5g/1，繼續(xù)培養(yǎng)，總培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到120小時(shí)時(shí)，停止培養(yǎng)；
(2)瓊脂糖的提取
將上述微藻培養(yǎng)所得培養(yǎng)液加熱到85"，離心G000rpm， 15min)后收集上清液；
將上述上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中55。C，減壓蒸發(fā)濃縮到原體積的五分之一，將所得濃縮液冷卻到室溫，待其成凝膠后，切成lxlcm的小塊，將切細(xì)的凝膠置于一10。C冰箱中過夜，冷凍凍結(jié)；
將上述凍結(jié)的凝膠取出，在室溫化凍，瀝去融化的水，力口5倍的蒸餾水并加熱使凝膠融化，在55"C下減壓蒸發(fā)濃縮；
在一1(TC冷凍后，從冰箱取出化凍，瀝去融化的水，用15"以下的冷蒸餾水清洗凝膠，瀝干，用冷凍干燥，得到20 g瓊脂糖，瓊脂糖產(chǎn)率為20g/L (對(duì)培養(yǎng)基)。
實(shí)施例2
本實(shí)施例的瓊脂糖，其制備方法包括如下步驟
(1) 微藻培養(yǎng)
在l OL已經(jīng)滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，接種iVeoc/z/on;s ofeo"^m/"ra使細(xì)胞數(shù)達(dá)到lx106，通入含10體積XCO2的空氣，通氣量lvvm，在3(TC光照攪拌培養(yǎng)，光照強(qiáng)度200 nmol/m2;培養(yǎng)采用純種培養(yǎng)的方式，培養(yǎng)60小時(shí)，培養(yǎng)液中的微藻細(xì)胞含量增長到OD6o。為5;向培養(yǎng)液中添加100 ml 40g/100ml的已經(jīng)滅菌的葡萄糖溶液，使培養(yǎng)液中糖濃度達(dá)到約4g/1，繼續(xù)培養(yǎng)，總培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到約120小時(shí)時(shí)，停止培養(yǎng)；
(2) 瓊脂糖的提取
將上述微藻培養(yǎng)所得培養(yǎng)液加熱到90。C，離心(3000rpm， 15min)后收集上清液；
將上述上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中55"C，減壓蒸發(fā)濃縮到原體積的五分之一，將所得濃縮液冷卻到室溫，待其成凝膠后，切成lxlcm的小塊，將切細(xì)的凝膠置于一1(TC冰箱中過夜，冷凍凍結(jié)；
將上述凍結(jié)的凝膠取出，在室溫化凍，瀝去融化的水，
力口5倍的蒸餾水并加熱使凝膠融化，在55"C下減壓蒸發(fā)濃縮；
在—l(TC冷凍后，從冰箱取出化凍，瀝去融化的水，用15。C以下的冷蒸餾水清洗凝膠，瀝干，用冷凍干燥，得到200g瓊脂糖，瓊脂糖產(chǎn)率為20g/L (對(duì)
土廿養(yǎng)基)。
權(quán)利要求
1、一種瓊脂糖的制備方法，其特征在于該方法是以微藻Neochlorisoleoabundans為原料，通過培養(yǎng)該微藻，從而制備得到所需瓊脂糖。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1) 微藻培養(yǎng)將7Veoc/2/w^ o/eo^w^ms接種于含有20 60g/l糖類碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng) 基中，在25 32"C溫度條件和攪拌、通氣、光照的條件下培養(yǎng)4 6天，得到 微藻培養(yǎng)液；或者-將TVeoc/z/o^ 0/eoa6wmfora接種于無機(jī)培養(yǎng)基中，通入C02加富的空氣光 照培養(yǎng)1 3天，使培養(yǎng)液中的微藻細(xì)胞含量增長到OD6(x)達(dá)到5 10，再向培 養(yǎng)液中添加已經(jīng)過滅菌的乳糖或葡萄糖溶液，使培養(yǎng)液中糖濃度達(dá)到20 60 g/1，繼續(xù)培養(yǎng)3 4天，得到微藻培養(yǎng)液；(2) 瓊脂糖的提取將上述培養(yǎng)所得培養(yǎng)液加熱至50 100°C，然后在高于5(TC的溫度條件下 離心分離或過濾去除藻細(xì)胞，回收離心上清液或?yàn)V液，從上清液或?yàn)V液中分離 純化得到所需瓊脂糖。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于所述步驟(1)中，糖類碳 源為乳糖、葡萄糖或半乳糖或含這些糖的碳源原料。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于所述步驟(2)中，回收離 心上清液后，將上清液在45 55。C下減壓蒸發(fā)濃縮，將濃縮物冷卻到室溫， 再置于一1(TC以下冷凍凍結(jié)；將凍結(jié)物取出，切割成小塊，化凍，過濾后收集 濾出的凝膠用清水清洗后，瀝干水，得到所需瓊脂糖。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于制備所得瓊脂糖還可以進(jìn)一步精致純化，其步驟如下將制備所得瓊脂糖加入蒸餾水并加熱重新溶解，減壓蒸發(fā)濃縮；將濃縮物再次置于一1(TC以下冷凍凍結(jié)，然后將凍結(jié)物取出化 凍，瀝去水后，壓干、風(fēng)干后制備得到所需瓊脂糖。
全文摘要
本發(fā)明公開一種瓊脂糖的制備方法，該方法是以微藻Neochlorisoleoabundans為原料，通過培養(yǎng)該微藻，讓其大量分泌產(chǎn)生瓊脂糖，收集分泌產(chǎn)物即可制備得到所需瓊脂糖。本發(fā)明通過工業(yè)化培養(yǎng)微藻生產(chǎn)瓊脂糖，與通過海洋種植江蘺、紫菜等大型海藻生產(chǎn)瓊脂糖相比，本發(fā)明的制備方法生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)效率高、可以在內(nèi)陸用淡水生產(chǎn)，有利于大規(guī)模推廣，具有很好的發(fā)展前景。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101649339SQ20091019249
公開日2010年2月17日 申請(qǐng)日期2009年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月18日
發(fā)明者克里斯托夫·Q·蘭, 李雁群 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)